特許 6974360 多分化能性幹細胞増殖促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6974360

(24)【登録日】2021年11月8日

(45)【発行日】2021年12月1日

(54)【発明の名称】多分化能性幹細胞増殖促進剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20211118BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20211118BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211118BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20211118BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   C12N5/0735

   C12N5/10

   C12N5/0775

【請求項の数】3

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2018-565598(P2018-565598)

(86)(22)【出願日】2018年1月31日

(86)【国際出願番号】JP2018003172

(87)【国際公開番号】WO2018143258

(87)【国際公開日】20180809

【審査請求日】2020年7月14日

(31)【優先権主張番号】特願2017-15313(P2017-15313)

(32)【優先日】2017年1月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000103840

【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】野嶋 純

(72)【発明者】

【氏名】松尾 英典

(72)【発明者】

【氏名】古屋 優里子

(72)【発明者】

【氏名】保田 尚孝

【審査官】 山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１４６０４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１４−５２０５２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／００７２４１６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／０３８０１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ZHAO, Yan et al.，Regenerative Neurogenesis After Ischemic Stroke Promoted by Nicotinamide Phosphoribosyltransferase-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Cascade，Stroke，2015年06月09日，vol. 46, no. 7，p.1966-1974，abstract, Figure 4, p. 1970右欄下から5行−p. 1971左欄14行

【文献】 SON, J, M et al.，Nicotinamide Overcomes Pluripotency Deficits and Reprogramming Barriers，STEM CELLS，2013年，vol. 31，p. 1121-1135，要約、第１１２５頁第２−３段落、第１１２６頁左欄第２段落−右欄、第１１２７頁右欄第２段落

【文献】 WILEY, Christopher et al.，NAD+ controls neural stem cell fate in the aging brain，THE EMBO Journal，2014年，vol. 33, no. 12，p. 1289-1291，全体

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多分化能性幹細胞の培養培地であって、
β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とし、
β−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０５〜５ｍＭであり、
前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記多分化能性幹細胞が、多分化能を維持したまま培養されることを特徴とする、多分化能性幹細胞の培養培地。

【請求項2】

多分化能性幹細胞を、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を含有する培養培地中で、多分化能を維持したまま培養し、
前記培養培地のβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０５〜５ｍＭであり、
前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の培養方法。

【請求項3】

多分化能性幹細胞を、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を含有する培養培地中で、多分化能を維持したまま培養し、
前記培養培地のβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０５〜５ｍＭであり、
前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の増殖促進方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多分化能性幹細胞を、その多分化能性を損なうことなく、増殖をより促進させられる素材、及び当該素材を使用した多分化能性幹細胞の培養方法に関する。
本願は、２０１７年１月３１日に日本に出願された特願２０１７−０１５３１３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

多分化能性幹細胞とは、自己複製能を有する未分化細胞であり、様々な細胞へ分化可能な細胞である。近年、患者の損なわれた組織に多分化能性幹細胞や多分化能性幹細胞から分化誘導させた細胞を移植し、その機能の再生をはかる再生医療が盛んに研究されている。再生医療では、多分化能性幹細胞やその分化細胞を、大量に準備する必要があるため、多分化能性幹細胞を効率よく増殖させる方法の開発も盛んである。特に、多分化能性幹細胞は、培養の過程でその多分化能を失ってしまう場合が多く、このため、多分化能性幹細胞をその多分化能を維持したまま増殖する方法が求められている。

【0003】

多分化能性幹細胞の培養方法としては、例えば、間葉系幹細胞を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）と繊維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）を含む培地中で培養することにより、間葉系幹細胞を効率よく増殖させられることが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、ＮＡＭが、多能性幹細胞の多能性の欠失や、再プログラミングの障害を解消することも報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。その他、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をＮＡＭ存在下で培養すると、ＮＡＭがサーチュイン又はＰＡＲＰの機能を抑制することによって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と遺伝子発現パターンがよく類似したｉＰＳ細胞を効率的に製造できることが報告されている（例えば、特許文献２参照。）。

【0004】

一方で、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、補酵素ＮＡＤ^＋の生合成中間代謝産物である。近年、ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献３参照。）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献４参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２０１５−５０７９２１号公報

【特許文献2】国際公開第２０１１／１０２３３３号

【特許文献3】米国特許第７７３７１５８号明細書

【特許文献4】国際公開第２０１４／１４６０４４号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Son，et al.，STEM CELLS，2013，vol.31，p.1121-1135.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、多分化能性幹細胞を、その多分化能性を損なうことなく、増殖をより促進させられる素材、及び当該素材を使用した多分化能性幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド（β−ＮＭＮ）の存在下では、多分化能性幹細胞の増殖が促進されており、かつその多分化能性も損なわれないことを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の多分化能性幹細胞増殖促進剤、多分化能性幹細胞の培養方法、及び多分化能性幹細胞の増殖促進方法を提供するものである。
［１］ 多分化能性幹細胞の培養培地であって、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とし、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０２〜５ｍＭであり、前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、前記多分化能性幹細胞が、多分化能を維持したまま培養されることを特徴とする、多分化能性幹細胞の培養培地。
［２］ 多分化能性幹細胞を、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を含有する培養培地中で、多分化能を維持したまま培養し、前記培養培地のβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０２〜５ｍＭであり、前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の培養方法。
［３］ 多分化能性幹細胞を、β−ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を含有する培養培地中で、多分化能を維持したまま培養し、前記培養培地のβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド濃度が０．０２〜５ｍＭであり、前記多分化能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び間葉系幹細胞からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の増殖促進方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係る多分化能性幹細胞増殖促進剤は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多分化能性幹細胞に働きかけることにより、その多分化能を維持したまま、増殖を促進させることができる。このため、当該多分化能性幹細胞増殖促進剤を培養培地に含有させることによって、より大量の多分化能性幹細胞を効率よく調製することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１において、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をβ−ＮＭＮを添加した培養培地で培養したウェルについて、ＷＳＴアッセイを行い、培養培地のβ−ＮＭＮ濃度ごとに吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を示した図である。

【図2】実施例２において、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をβ−ＮＭＮ又はＮＡＭを添加した培養培地で培養したウェルについて、ＷＳＴアッセイを行い、培養培地のβ−ＮＭＮ濃度又はＮＡＭ濃度ごとに吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を示した図である。

【図3】実施例３において、ｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株をβ−ＮＭＮ又はＮＡＭを添加した培養培地で培養したウェルについて、ＷＳＴアッセイを行い、培養培地のβ−ＮＭＮ濃度又はＮＡＭ濃度ごとに吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を示した図である。

【図4】実施例４において、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を、ＲＯＣＫ阻害剤とβ−ＮＭＮを共に添加した培養培地で培養したウェルについて、ＷＳＴアッセイを行い、培養培地のβ−ＮＭＮ濃度ごとに吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を示した図である。

【図5】実施例４において、ｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を、ＲＯＣＫ阻害剤とβ−ＮＭＮを共に添加した培養培地で培養したウェルについて、アルカリフォスファターゼ測定試験を行い、培養培地のβ−ＮＭＮ濃度ごとに４０５ｎｍの吸光度値の測定結果を示した図である。

【図6】実施例６において、β−ＮＭＮ無添加培養培地で培養した後、抗ＳＳＥＡ４抗体で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【図7】実施例６において、０．２５ｍＭのβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養した後、抗ＳＳＥＡ４抗体で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【図8】実施例６において、１ｍＭのβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養した後、抗ＳＳＥＡ４抗体で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【図9】実施例６において、β−ＮＭＮ無添加培養培地で培養した後、抗低硫酸化ケラタン硫酸抗体（Ｒ１０Ｇ）で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【図10】実施例６において、０．２５ｍＭのβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養した後、抗低硫酸化ケラタン硫酸抗体（Ｒ１０Ｇ）で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【図11】実施例６において、１ｍＭのβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養した後、抗低硫酸化ケラタン硫酸抗体（Ｒ１０Ｇ）で染色したｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株のフローサイトメーターの結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明及び本願明細書において、多分化能性幹細胞とは、自己複製能を有し、かつ多分化能（多様な細胞種へ分化可能な能力）を備える未分化細胞であり、好ましくは外胚葉、中胚葉、内胚葉のいずれの細胞にも分化しうる多能性幹細胞である。多分化能性幹細胞には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。

【0013】

本発明に係る多分化能性幹細胞増殖促進剤（以下、「本発明の増殖促進剤」ということがある。）は、ＮＭＮ（化学式：Ｃ_１１Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_８Ｐ）を有効成分とし、多分化能性幹細胞を培養する際にその培養培地中に添加されるものである。ＮＭＮの存在下で多分化能性幹細胞を培養することにより、多分化能性幹細胞を、多分化能を維持したまま、より効率よく増殖させることができる。

【0014】

ＮＭＮには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明の増殖促進剤の有効成分となるＮＭＮは、β−ＮＭＮ（ＣＡＳ番号：１０９４−６１−７）である。β−ＮＭＮの構造を下記に示す。

【0015】

【化1】

【0016】

β−ＮＭＮとしては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ−ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β−ＮＭＮは広く生体に存在する成分であるため、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ−ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ−ＮＭＮを使用してもよい。

【0017】

β−ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ＮＡＭとＬ−リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ−ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ＮＡＭと５’−ホスホリボシル−１’−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によりβ−ＮＭＮを製造できる。発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ＮＡＭからβ−ＮＭＮを製造できる。

【0018】

本発明の増殖促進剤の有効成分としては、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩であってもよい。β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。

【0019】

本発明の増殖促進剤の有効成分としては、遊離のβ−ＮＭＮ又はその薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。

【0020】

本発明の増殖促進剤は、β−ＮＭＮに加えてその他の有効成分を含有していてもよい。当該他の有効成分としては、例えば、多分化能性幹細胞の生存効率や増殖効率を高めることが知られている成分や、多分化能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有することが知られている成分等の中から適宜選択して用いることができる。多分化能性幹細胞の生存効率を高める成分としては、例えば、Ｒｈｏ キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が挙げられる。また、多分化能性幹細胞の未分化状態を維持する成分としては、例えば、ＦＧＦ−２やＴＧＦβスーパーファミリーが挙げられる。ＴＧＦβスーパーファミリーとしては、ＴＧＦ−β１、アクチビン、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。β−ＮＭＮと併用するその他の有効成分は、１種類のみであってもよく、２種類以上の組み合わせであってもよい。

【0021】

多分化能性幹細胞を培養する際に、その培養培地に本発明の増殖促進剤を含有させることにより、その多分化能を維持したまま、多分化能性幹細胞の増殖を促進させることができる。培養培地に本発明の増殖促進剤を含有させる量としては、当該増殖促進剤を含有させていない培養培地で培養した場合と比較して多分化能性幹細胞の増殖を促進させるために充分な濃度となる量であれば特に限定されるものではなく、多分化能性幹細胞の種類や、培養培地のその他の成分とのバランス等を考慮して適宜調整することができる。培養培地のβ−ＮＭＮ濃度が低すぎる場合には、多分化能性幹細胞に対する増殖促進効果が弱いおそれがあり、また、β−ＮＭＮを過剰量含有させた場合には、却って増殖が抑えられる可能性がある。培養培地の本発明の増殖促進剤の含有量としては、β−ＮＭＮ濃度が０．０１〜５ｍＭとなる量であることが好ましく、０．０５〜２ｍＭとなる量であることがより好ましく、０．１〜１ｍＭとなる量であることがさらに好ましい。β−ＮＭＮ濃度が前記範囲内であることにより、多分化能性を維持させながら、多分化能性幹細胞の増殖を充分に促進することができる。なお、β−ＮＭＮによるこの増殖促進効果は、ＮＡＭやニコチン酸、ニコチンアミドリボシドといった他のＮＡＭ関連物質よりも優れている。

【0022】

本発明の増殖促進剤の存在下での多分化能性幹細胞の培養は、培養培地に本発明の増殖促進剤を含有させる以外は、常法により行うことができる。例えば、培養培地としては、一般的に、多分化能性幹細胞の維持又は増殖のために用いられる培地や、動物細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。また、市販されている各種の多能性幹細胞のための培養培地を用いることもできる。本発明において、本発明の増殖促進剤を含有させて多分化能性幹細胞の培養に使用される培地としては、例えば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、αイーグル最小必須培地（αＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｆ−１２培地、Ｆ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｅ８（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８）培地、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地、ｍＴｅＳＲ１培地等が挙げられる。これらの培地に、必要に応じて、アミノ酸、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等を添加してもよい。

【0023】

これらの培養培地には、本発明の増殖促進剤のほかに、多分化能性幹細胞の生存効率や増殖効率を高めることが知られている成分や、多分化能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有することが知られている成分等を適宜含有させてもよい。これらの成分としては、前述のものを用いることができる。

【0024】

また、培養条件は、一般的に動物細胞を培養する培養条件とすることができ、必要に応じて適宜改変してもよい。例えば、培養温度が３０〜４０℃、ＣＯ_２濃度が１〜１０体積％、Ｏ_２濃度が０．１〜２５体積％で培養できる。

【0025】

本発明の増殖促進剤によって増殖促進される多分化能性幹細胞としては、哺乳類に由来する多分化能性幹細胞が好ましく、ヒト由来の多分化能性幹細胞がさらに好ましく、ヒト由来の多能性幹細胞が特に好ましい。また、本発明の増殖促進剤によって増殖促進される多分化能性幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞であることが好ましく、ヒト由来のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞であることがより好ましく、ヒト由来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞がさらに好ましい。

【実施例】

【0026】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0027】

［実施例１］
ｉＰＳ細胞をβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養し、増殖に対するβ−ＮＭＮの効果を調べた。
ｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７株を用いた。また、ｉＰＳ細胞の基本培養培地としては、基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２に１９．４ｍｇ／Ｌのインスリン、１０．７ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、１００μｇ／ＬのｂＦＧＦ、２μｇ／ＬのＴＧＦβ、１４μｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、６４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、５４３ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ_３を含有するＥ８培地（ＬＴＣ）を用いた。

【0028】

まず、基本培養培地で培養しておいたｉＰＳ細胞を細胞剥離液によって培養容器から剥離させて回収した。回収した細胞を計数し、１０００〜２０００個／ウェルとなるように、マトリゲルでコーティングしておいた９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。このとき、各ウェルには、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した。当該９６ウェルプレートを３７℃で１日培養して細胞を接着させた後、各ウェルからＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を除去し、基本培養培地にβ−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）を終濃度が０〜２ｍＭとなるように添加した培養培地に交換して３〜４日間培養した。

【0029】

その後、ＷＳＴ（Water soluble Tetrazolium salts) アッセイにより、各ウェル内に生存している細胞増殖能を測定した。具体的には、各ウェルにＷＳＴ−１（ナカライテスク社製）を添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー〔ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社製〕を用いて、吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）を測定した。なお、「吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）」とは、５９５ｎｍの吸光度値を参照値とした４５０ｎｍの吸光度値であり、具体的には、４５０ｎｍの吸光度値から５９５ｎｍの吸光度値を差し引いた値である。

【0030】

培養培地のβ−ＮＭＮ濃度ごとの吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を図１に示す。ｉＰＳ細胞を、β−ＮＭＮ無添加の培養培地（β−ＮＭＮ：０ｍＭ）で培養したウェルよりも、β−ＮＭＮを０．１ｍＭ以上となるように添加した培養培地で培養したウェルのほうが、吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）が大きく、β−ＮＭＮ存在下でｉＰＳ細胞の増殖が促進されていることがわかった。特に、β−ＮＭＮ濃度が０．１〜０．２ｍＭでは濃度依存的に当該吸光度値が大きくなり、０．２〜０．６ｍＭでは当該吸光度値は同程度であり、０．８ｍＭ以上ではβ−ＮＭＮ濃度依存的に当該吸光度値がやや低下する傾向が観察された。

【0031】

［実施例２］
ｉＰＳ細胞をβ−ＮＭＮ又はＮＡＭを含有させた培養培地で培養し、増殖に対するβ−ＮＭＮとＮＡＭの作用を比較した。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。

【0032】

具体的には、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を除去した後に添加する培養培地を、β−ＮＭＮを終濃度が０、０．２、若しくは０．４ｍＭとなるように添加した培養培地又はＮＡＭを終濃度が０、０．２、若しくは０．４ｍＭとなるように添加した培養培地とした以外は、実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞を培養し、ＷＳＴアッセイを行った。

【0033】

各培養培地の吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を図２に示す。図２中、「Ｅ８＋ＮＭＮ」は、各濃度のβ−ＮＭＮを添加した培養培地の結果であり、「Ｅ８＋ＮＡＭ」は、各濃度のＮＡＭを添加した培養培地の結果である。図２に示すように、β−ＮＭＮを添加した培養培地で培養したウェルとＮＡＭを添加した培養培地で培養したウェルのいずれも、基本培地で培養したウェルよりも当該吸光度値が高く、β−ＮＭＮとＮＡＭの両方ともｉＰＳ細胞の増殖促進効果を有していたが、培養培地の終濃度が０．２ｍＭと０．４ｍＭのいずれにおいても、β−ＮＭＮ添加培地で培養したウェルのほうがＮＡＭ添加培地で培養したウェルよりも有意に当該吸光度値が高く、β−ＮＭＮのほうがＮＡＭよりも増殖促進効果が高いことが確認された。

【0034】

［実施例３］
ｉＰＳ細胞をβ−ＮＭＮ又はＮＡＭを含有させた培養培地で培養し、増殖に対するβ−ＮＭＮとＮＡＭの作用を比較した。ｉＰＳ細胞としては、２５３Ｇ１株を用いた。
具体的には、２０１Ｂ７株に代えて２５３Ｇ１株を用いた以外は実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞を培養し、ＷＳＴアッセイを行った。

【0035】

各培養培地の吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を図３に示す。図３中、「Ｅ８＋ＮＭＮ」は、各濃度のβ−ＮＭＮを添加した培養培地の結果であり、「Ｅ８＋ＮＡＭ」は、各濃度のＮＡＭを添加した培養培地の結果である。０ｍＭのグラフは、Ｅ８培地での結果である。図３に示すように、β−ＮＭＮを添加した培養培地で培養したウェルでは基本培地で培養したウェルよりも当該吸光度値が高く、β−ＮＭＮは２５３Ｇ１株に対しても増殖促進効果を有していた。一方で、ＮＡＭを添加した培養培地で培養したウェルでは、基本培地で培養したウェルよりもやや吸光度値は高いものの、β−ＮＭＮのような明らかな増殖促進効果は確認できず、ＮＡＭによる増殖促進効果は、株によっては充分な増殖促進効果が得られないことがわかった。また、実施例２の結果と同様に、培養培地の終濃度が０．２ｍＭと０．４ｍＭのいずれにおいても、β−ＮＭＮ添加培地で培養したウェルのほうがＮＡＭ添加培地で培養したウェルよりも有意に当該吸光度値が高く、２５３Ｇ１株に対しても、β−ＮＭＮのほうがＮＡＭよりも増殖促進効果が高いことが確認された。これらの結果から、β−ＮＭＮは様々なｉＰＳ細胞に対して、ＮＡＭよりも有意に優れた増殖促進作用を有することが明らかである。

【0036】

［実施例４］
ｉＰＳ細胞をβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養した後、多分化能性と増殖に対するβ−ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。多分化能性は、未分化性のマーカーであるアルカリフォスファターゼの酵素活性を指標にして調べた。

【0037】

＜増殖に対する効果＞
実施例１で用いた基本培養培地で培養しておいたｉＰＳ細胞を細胞剥離液によって培養容器から剥離させて回収した。回収した細胞を計数し、１０００〜２０００個／ウェルとなるように、マトリゲルでコーティングしておいた９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。このとき、各ウェルには、ＲＯＣＫ阻害剤と終濃度が０〜１ｍＭとなるβ−ＮＭＮを添加した。当該９６ウェルプレートを３７℃で１日培養して細胞を接着させた後、各ウェルからＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を除去し、基本培養培地にβ−ＮＭＮを終濃度が０〜１ｍＭとなるように添加した培養培地に交換して３〜４日間培養した。

【0038】

その後、実施例１と同様にしてＷＳＴアッセイを行った。ＲＯＣＫ阻害剤とβ−ＮＭＮを共に添加した培地で培養したウェルの各培養培地の吸光度値（４５０−５９５ｎｍ）の測定結果を図４に示す。図４に示すように、β−ＮＭＮの添加時期にかかわらず、β−ＮＭＮの濃度依存的にｉＰＳ細胞の増殖促進効果が得られた。

【0039】

＜アルカリフォスファターゼ測定試験＞
まず、実施例１で用いた基本培養培地で培養しておいたｉＰＳ細胞を細胞剥離液によって培養容器から剥離させて回収した。回収した細胞を計数し、２０００個／ウェルとなるように、マトリゲルでコーティングしておいた９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。このとき、各ウェルには、ＲＯＣＫ阻害剤と終濃度が０〜１ｍＭとなるβ−ＮＭＮを添加した。当該９６ウェルプレートを３７℃で１日培養して細胞を接着させた後、各ウェルからＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を除去し、基本培養培地にβ−ＮＭＮを終濃度が０〜１ｍＭとなるように添加した培養培地に交換して３〜４日間培養した。この間、培地交換は毎日行った。

【0040】

次いで、各ウェルの培養培地を除去した後、エタノール・アセトン固定液を添加して、各ウェル内の細胞を固定した。ウェルを乾燥させた後、アルカリフォスファターゼ測定試薬であるｐ−ニトロフェニルリン酸（p-Nitrophenol tryphosphate acid）を含有する重炭酸バッファー（Bicarbonate buffer）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。

【0041】

ＲＯＣＫ阻害剤とβ−ＮＭＮを共に添加した培地で培養したウェルの各培養培地の４０５ｎｍの吸光度値の測定結果を図５に示す。図５に示すように、β−ＮＭＮの添加時期にかかわらず、β−ＮＭＮを添加した培養培地で培養したウェルは、β−ＮＭＮ無添加の培養培地で培養したウェルよりも４０５ｎｍの吸光度値が高く、未分化性を維持したままｉＰＳ細胞が増殖できていることが確認された。

【0042】

［実施例５］
ヒト間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ）をβ−ＮＭＮを含有させた培養培地で培養し、増殖に対するβ−ＮＭＮの効果を調べた。
ヒトＭＳＣとしては、Ｌｏｎｚａ社製の細胞を用いた。また、ヒトＭＳＣの基本培養培地としては、Ｌｏｎｚａ社製の専用維持培地を用いた。

【0043】

ヒトＭＳＣを２×１０^３個／ウェルとなるように９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に播種した（ｎ＝３〜４）。当該９６ウェルプレートを３７℃、ＣＯ_２インキュベーター内で培養して細胞を接着させた後、β−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）を最終濃度が１．０、０．１、０．０１又は０．００１ｍＭとなるように添加し、さらに３７℃、ＣＯ_２インキュベーター内で７２時間培養した。

【0044】

その後、ＷＳＴアッセイにより、各ウェル内に生存している細胞増殖能を測定した。具体的には、各ウェルに生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社製）を用いて、吸光度値（４５０−６２０ｎｍ）を測定した。なお、「吸光度値（４５０−６２０ｎｍ）」とは、６２０ｎｍの吸光度値を参照値とした４５０ｎｍの吸光度値であり、具体的には、４５０ｎｍの吸光度値から６２０ｎｍの吸光度値を差し引いた値である。

【0045】

培養培地のβ−ＮＭＮ濃度ごとの吸光度値（４５０−６２０ｎｍ）の測定結果を表１に示す。ｉＰＳ細胞と同様に、ヒトＭＳＣにおいても、β−ＮＭＮ添加によって当該吸光度値が高くなっており、細胞増殖が促進されていた。

【0046】

【表1】

【0047】

［実施例６］
β−ＮＭＮ存在下で維持・増殖させたｉＰＳ細胞の多能性を確認した。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。

【0048】

具体的には、マトリゲル（コーニング社）でコーティングした３５ｍｍディッシュに、ｉＰＳ細胞を１．５×１０^４個／ディッシュとなるように播種した。培養培地は、ｉＰＳ細胞の基本培養培地（Ｅ８培地）にβ−ＮＭＮを終濃度が０、０．２５、又は１ｍＭとなるように添加した培養培地を用いた。ただし、播種時には、さらに終濃度１０μＭになるようＲｏｃｋ阻害剤を添加した培養培地を用いて、Ｒｈｏ依存的アポトーシスを抑制した。培地交換は毎日実施し、５〜６日目に継代した。β−ＮＭＮを添加した培養培地で５継代以上培養したｉＰＳ細胞を、未分化マーカーであるＳＳＥＡ４及び低硫酸化ケラタン硫酸に対する抗体でそれぞれ染色し、各未分化マーカーが発現している細胞をフローサイトメーターで分析した。

【0049】

図６〜８はそれぞれ、０、０．２５、及び１ｍＭのβ−ＮＭＮ濃度で培養した後、抗ＳＳＥＡ４抗体で染色したｉＰＳ細胞のフローサイトメーターの結果を示した図である。図９〜１１はそれぞれ、０、０．２５、及び１ｍＭのβ−ＮＭＮ濃度で培養した後、抗低硫酸化ケラタン硫酸抗体（Ｒ１０Ｇ）で染色したｉＰＳ細胞のフローサイトメーターの結果を示した図である。０．２５ｍＭ又は１ｍＭのβ−ＮＭＮ存在下で培養したｉＰＳ細胞は、β−ＮＭＮ非存在下（β−ＮＭＮ濃度０ｍＭ）で培養したｉＰＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ４及び低硫酸化ケラタン硫酸の発現が維持されていた。これらの結果から、ｉＰＳ細胞をβ−ＮＭＮ存在下で培養することにより、多分化能性を保持したまま細胞増殖を促進できることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】