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特許6978199体重あたりの肝重量を減少させる肝重量減少剤の製造方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6978199

(24)【登録日】2021年11月15日

(45)【発行日】2021年12月8日

(54)【発明の名称】体重あたりの肝重量を減少させる肝重量減少剤の製造方法

(51)【国際特許分類】

A61K 31/085 20060101AFI20211125BHJP

A61K 35/618 20150101ALI20211125BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20211125BHJP

A61P 3/06 20060101ALI20211125BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20211125BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20211125BHJP

A61P 39/06 20060101ALI20211125BHJP

【ＦＩ】

A61K31/085

A61K35/618

A61P1/16

A61P3/06

A61P3/10

A61P29/00

A61P39/06

【請求項の数】13

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2016-534096(P2016-534096)

(86)(22)【出願日】2015年6月23日

(86)【国際出願番号】JP2015003141

(87)【国際公開番号】WO2016009594

(87)【国際公開日】20160121

【審査請求日】2018年6月14日

【審判番号】不服2020-14193(P2020-14193/J1)

【審判請求日】2020年10月9日

(31)【優先権主張番号】特願2014-144824(P2014-144824)

(32)【優先日】2014年7月15日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】596161031

【氏名又は名称】株式会社渡辺オイスター研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100082658

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤儀一郎

(72)【発明者】

【氏名】渡辺貢

(72)【発明者】

【氏名】千葉仁志

(72)【発明者】

【氏名】布田博敏

【合議体】

【審判長】前田佳与子

【審判官】穴吹智子

【審判官】渕野留香

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／１０２０４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平１１−２２２４３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０−１６８３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２年，Ｖｏｌ．１３４，ｐ．２０８６−２０８９

【文献】渡辺貢，カキ肉エキスの自然発症糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａに対する抗酸化作用と食後血糖に及ぼす影響，日本未病システム学会学術総会抄録集，２００７年，Ｖｏｌ．１４ｔｈ，ｐ．５６

【文献】薬理と臨床，２００７年，Ｖｏｌ．１７，ｐ．７−３８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ３５／６１８

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、以下の動物実験を行ってマウスのHF+群の体重当たりの肝重量がHF-群の体重当たりの肝重量より減少する肝重量減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝重量減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝重量減少剤の製造方法。

（動物実験）
マウスのNC群には普通食（MF）の餌料を与え、マウスのHF+群には高脂肪食（HFD-60）と3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコールを高濃度含有するマガキの抽出物が5%含有された餌料を与え、マウスのHF-群には高脂肪食（HFD-60）のみの餌料を与えた。なお、餌料はマウスが自由に食べる分だけ与えるものとした。
生後４週目のマウスを実験開始時とし、実験開始２０週目から２日おきに尾静脈に0.2mgの酸化LDLの注射を計８回注射する。最終の酸化LDLの注射後、１２時間後に屠殺する。屠殺の１６時間前に餌止めを行い、ジエチルエーテルにより麻酔し、脱血後、サンプルを採取した。
分析項目として、餌料は摂餌量(g)を、外観はマウスの体重(g)、肝重量(g)及び体重当たりの肝重量(%)を、肝臓の組織学的観察は脂肪蓄積度、バルーニング度、炎症度及び線維化度を、肝臓の中性脂肪(mg/dl)、総コレステロール(mg/dl)、遊離脂肪酸(mEq/L)及びTBARS（μM）を、血漿はAST（U/L）、ALT（U/L）、グルコース(mg/dL)、インスリン(μg/L)、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR）、中性脂肪(mg/dL)、総コレステロール(mg/dL)及び遊離脂肪酸(mEq/L)を挙げて分析した。

【請求項2】

【請求項3】

【請求項4】

【請求項5】

【請求項6】

【請求項7】

【請求項8】

【請求項9】

【請求項10】

【請求項11】

【請求項12】

【請求項13】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は抗酸化剤である3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を含む体重あたりの肝重量を減少させる肝重量減少剤の製造方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

活性酸素の生成は好気性の生活に起因し、脂質、タンパク質、核酸の酸化を生じ、細胞に障害を与えることが一般に知られている。

【0003】

通常、生体の酸化レベルは活性酸素産生系と抗酸化物質による消去系のバランスでほぼ一定に保たれているが、薬物、放射線、虚血などの様々な要因によりこのバランスが崩れ、活性酸素産生系へ傾くのが酸化ストレスといわれている。

【0004】

この酸化ストレスの蓄積が、がん、動脈硬化性疾患、虚血/再灌流障害、慢性関節リウマチ、糖尿病、アルツハイマー病やパーキンソン病の神経障害などの様々な疾患や老化の一因であると考えられているのである。

【0005】

いわゆる抗酸化物質は構造から大きく二群に分類される。酵素性抗酸化物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ(superoxidedismutase、SOD)、カタラーゼ(catalase、CAT)、グルタチオンペルオキシダーゼ(glutathioneperoxidase、GPx)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathioneS-transferase、GST)、グルタチオンリダクターゼ(glutathionereductase)、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin、Prx)などが挙げられる。一方、非酵素性抗酸化物としては、アスコルビン酸(ascorbicacid)、α-トコフェロール(α-tocopherol)、グルタチオン(glutathione、GSH)、カロテノイド(carotenoids)、フラボノイド(flavonoids)、メタロチオネイン(metallothionein)などを含む。

【0006】

ところで、カキ、たとえばマガキ(Crassostreagigas)はウグイスガイ目イタボガキ科に属する二枚貝で、その生息地は日本を初めとして東アジア全域に及んでいる。近年では、フランスやオーストラリアでもマガキが養殖されており、世界で最も食用に供さるカキとして名高い。

【0007】

カキは、栄養価が高いことから古代より食用にされてきたが、前述したとおりグリコーゲンやタンパク質のほか、カルシウム、亜鉛、セレニウム、銅、マンガンなどのミネラルを多量に含むといわれている。

【0008】

また、カキ由来の抗酸化物として報告されているのは、酵素性抗酸化物質としてSOD、CAT、GPx、及びPrx6があり、非酵素性抗酸化物質としてはメタロチオネイン、uncouplingprotein5(UCP5)、アスコルビン酸、α-トコフェロール、β-カロテンがあった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２０１０−１９３７５６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかして、本件発明の発明者らは、カキからの優れたいわゆる新規抗酸化物質を見出すことに成功し、さらにその化学構造を決定し、なおかつ前記抗酸化物質の化学合成を行うことにも成功し、そして、カキに由来しない、あるいはカキに由来する場合の双方での優れたいわゆる新規抗酸化剤及び抗酸化剤組成物の提供が行えることにも成功した。

【0011】

さらに、ヒト低比重リポ蛋白（low-densitylipoproteins、LDL)の酸化実験と、肝臓の株化細胞の酸化実験における当該物質の抗酸化能をも確認でき、さらには、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として、肝細胞保護作用、抗アポトーシス作用、抗脂肪肝作用、抗非アルコール性脂肪肝炎（NASH）作用、肝臓における抗炎症作用、肝臓における抗線維化作用を含む肝臓保護作用を確認でき、よって3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を含んで優れた肝細胞保護作用、抗アポトーシス作用、抗脂肪肝作用、抗NASH作用、抗炎症作用、抗線維化作用を含む肝臓保護作用を有するいわゆる肝臓保護剤、糖代謝改善剤及び抗肥満剤の提供を目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

（１）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、以下の動物実験を行ってマウスのHF+群の体重当たりの肝重量がHF-群の体重当たりの肝重量より減少する肝重量減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝重量減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝重量減少剤の製造方法。

（動物実験）
マウスのNC群には普通食（MF）の餌料を与え、マウスのHF+群には高脂肪食（HFD-60）と3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコールを高濃度含有するマガキの抽出物が5%含有された餌料を与え、マウスのHF-群には高脂肪食（HFD-60）のみの餌料を与えた。なお、餌料はマウスが自由に食べる分だけ与えるものとした。
生後４週目のマウスを実験開始時とし、実験開始２０週目から２日おきに尾静脈に0.2mgの酸化LDLの注射を計８回注射する。最終の酸化LDLの注射後、１２時間後に屠殺する。屠殺の１６時間前に餌止めを行い、ジエチルエーテルにより麻酔し、脱血後、サンプルを採取した。
分析項目として、餌料は摂餌量(g)を、外観はマウスの体重(g)、肝重量(g)及び体重当たりの肝重量(%)を、肝臓の組織学的観察は脂肪蓄積度、バルーニング度、炎症度及び線維化度を、肝臓の中性脂肪(mg/dl)、総コレステロール(mg/dl)、遊離脂肪酸(mEq/L)及びTBARS（μM）を、血漿はAST（U/L）、ALT（U/L）、グルコース(mg/dL)、インスリン(μg/L)、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR）、中性脂肪(mg/dL)、総コレステロール(mg/dL)及び遊離脂肪酸(mEq/L)を挙げて分析した。

（２）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１の動物実験を行ってマウスのHF+群の肝臓における脂肪蓄積度がHF-群の肝臓における脂肪蓄積度より減少する肝臓における脂肪蓄積度減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓における脂肪蓄積度減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓における脂肪蓄積度減少剤の製造方法。

（３）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の肝臓におけるバルーニング度がHF-群の肝臓におけるバルーニング度より減少する肝臓におけるバルーニング度減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓におけるバルーニング度減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓におけるバルーニング度減少剤の製造方法。

（４）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の肝臓における炎症度がHF-群の肝臓における炎症度より減少する肝臓における炎症度減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓における炎症度減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓における炎症度減少剤の製造方法。

（５）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の肝臓における線維化度がHF-群の肝臓における線維化度より減少する肝臓における線維化度減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓における線維化度減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓における線維化度減少剤の製造方法。

（６）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の血漿におけるグルコースの値がHF-群の血漿におけるグルコースの値より減少する減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として血漿におけるグルコース減少剤を製造する、
ことを特徴とする血漿におけるグルコース減少剤の製造方法。

（７）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の血漿におけるインスリン濃度の値がHF-群の血漿におけるインスリン濃度の値より減少する減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする血漿におけるインスリン濃度減少剤を製造する、
ことを特徴とする血漿におけるインスリン濃度減少剤の製造方法。

（８）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の血漿におけるインスリン抵抗性指数の値がHF-群の血漿におけるインスリン抵抗性指数の値より減少する減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として血漿におけるインスリン抵抗性指数減少剤を製造する、
ことを特徴とする血漿におけるインスリン抵抗性指数減少剤の製造方法。

（９）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の血漿における中性脂肪、総コレステロール及び遊離脂肪酸の値がHF-群の血漿における中性脂肪、総コレステロール及び遊離脂肪酸の値より減少する減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として血漿における中性脂肪、総コレステロール及び遊離脂肪酸の減少剤を製造する、
ことを特徴とする血漿における中性脂肪、総コレステロール及び遊離脂肪酸の減少剤の製造方法。

（１０）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスのHF+群の炎症反応に関する肝臓のTNF-αの遺伝子、IL-6の遺伝子、F4/80の遺伝子、CD3の遺伝子の発現が、マウスのHF-群と比べて低下し、炎症反応に関する肝臓のTNF-αの遺伝子、IL-6の遺伝子、F4/80の遺伝子、CD3の遺伝子発現の減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として炎症反応に関する肝臓のTNF-αの遺伝子、IL-6の遺伝子、F4/80の遺伝子、CD3の遺伝子減少剤を製造する、
ことを特徴とする炎症反応に関する肝臓のTNF-αの遺伝子、IL-6の遺伝子、F4/80の遺伝子、CD3の遺伝子の遺伝子発現減少剤の製造方法。

（１１）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスHF+群の肝臓におけるアポトーシスに関するBax遺伝子の発現が、マウスのHF-群と比べて低下し、肝臓におけるアポトーシスに関するBax遺伝子の減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓におけるアポトーシスに関するBax遺伝子発現減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓におけるアポトーシスに関するBax遺伝子の遺伝子発現減少剤の製造方法。

（１２）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスHF+群の肝臓におけるアポトーシスに関するBcl-xl遺伝子, Bcl2遺伝子, p53遺伝子の発現が、マウスのHF-群と比べて上昇し、肝臓におけるアポトーシスに関するBcl-xl遺伝子, Bcl2遺伝子, p53遺伝子の増加作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓におけるアポトーシスに関するBcl-xl遺伝子, Bcl2遺伝子, p53遺伝子の遺伝子発現増加剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓におけるアポトーシスに関するBcl-xl遺伝子, Bcl2遺伝子, p53遺伝子の遺伝子発現増加剤の製造方法。

（１３）
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した、ORAC値が1.24±0.3、5μmolTE/μmolである3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)につき、請求項１記載の動物実験を行ってマウスHF+群の肝臓における線維化を促進する遺伝子COL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの発現が、マウスのHF-群と比べて低下し、肝臓における線維化を促進する遺伝子COL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの減少作用を確認し、前記作用が確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分として肝臓における線維化を促進する遺伝子COL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの遺伝子発現減少剤を製造する、
ことを特徴とする肝臓における線維化を促進する遺伝子COL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの遺伝子発現減少剤の製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、カキに由来しない、あるいはカキに由来する
3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする肝細胞保護作用、抗アポトーシス作用、抗脂肪肝作用、抗NASH作用、抗炎症作用、抗線維化作用、糖代謝改善作用、抗肥満作用を有するいわゆる肝臓保護剤、糖代謝改善剤及び抗肥満剤を提供できるとの優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の実験計画を説明する説明図である。

【図2】本発明の分析項目を示す説明図である。

【図3】各マウスのHF+群とHF-群の摂餌量を示す説明図である。

【図4】マウスの外観と肝臓の色調を分析した結果を示す説明図である。

【図5】実験開始１〜２３週間のNC群、HF-群及びHF+群の各マウスにおける体重の変化を分析した結果を示す説明図である。

【図6】NC群、HF-群及びHF+群の各マウスの体重と肝重量を分析した結果を示す説明図である。

【図7】病理学的観察におけるスコアの基準を説明する説明図である。

【図8】各判定の正常細胞及び病的細胞の写真を示す説明図である。

【図9】NC群、HF-群及びHF+群の各マウスの肝臓の病理学的観察の結果を示す説明図である。

【図10】NC群、HF-群及びHF+群の各マウスの肝臓の各脂質の濃度と脂質の過酸化度(TBARS)を分析した結果を示す説明図である。

【図11】NC群、HF-群及びHF+群の各マウス血漿中のAST活性、ALT活性について分析した結果を示す説明図である。

【図12】NC群、HF-群及びHF+群の各マウス血漿中のグルコース、インスリン濃度及びインスリン抵抗性指数について分析した結果を示す説明図である。

【図13】NC群、HF-群及びHF+群の各マウスの血漿の各脂質の濃度を分析した結果を示す説明図である。

【図14】肝臓における炎症反応に関する遺伝子について分析した結果を示す説明図である。

【図15】肝臓における炎症反応に関する遺伝子について説明する説明図である。

【図16】肝臓におけるアポトーシスに関する遺伝子について分析した結果を示す説明図である。

【図17】肝臓におけるアポトーシスに関する遺伝子について説明する説明図である。

【図18】肝臓における線維化に関する遺伝子について分析した結果を示す説明図である。

【図19】肝臓における線維化に関する遺伝子について説明する説明図である。

【図20】分析項目の結果のまとめを示す説明図である。

【図21】本発明の実験の結語を示す説明図である。

【図22】本発明で効果の得られる作用について説明する説明図である。

【図23】本発明の概略構成を示す概略構成説明図（１）である。

【図24】本発明の概略構成を示す概略構成説明図（２）である。

【図25】本発明のフローチャートを説明する説明図である。

【図26】3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)抽出のための有機溶媒の極性を段階的に高めていく状態を説明する説明図である。

【図27】各抽出物の抗酸化活性試験の結果を示す説明図である。

【図28】シリカオープンカラムによる抽出を説明する説明図である。

【図29】酢酸エチル分画抽出を説明する説明図である。

【図30】本発明により抽出された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の構造を説明する説明図である。

【図31】ORAC法の測定原理を説明する説明図である。

【図32】本発明による3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の抗酸化能を説明する説明図である。

【図33】LDLの酸化度をTBARS法により定量した状態を説明する説明図である。

【図34】diphenyl-1-pyrenlphosphine（DPPP）の蛍光発色の原理を説明する説明図である。

【図35】本発明における3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を添加した細胞の酸化抑制状態を説明する説明図である。

【図36】本発明による3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の構造解析を説明する説明図（１）である。

【図37】本発明による3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の構造解析を説明する説明図（２）である。

【図38】3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の化学合成を説明する説明図である。

【図39】肝臓の炎症反応の特徴であるリンパ球とマクロファージの浸潤を抗-CD3抗体(リンパ球に特異的な抗体)と抗-F4/80 (マクロファージに特異的な抗体)を用いたNC、HF+、HF-群の代表的な染色像を説明する説明図である。

【図40】両免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量化したグラフを説明する説明図である。

【図41】TUNEL assayにおける代表的な染色像と染色数のグラフを説明する説明図である。

【図42】抗-コラーゲン抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像、及びImageJを用いて定量化したグラフを説明する説明図である。

【図43】肝臓における酸化の状態をDNAの酸化マーカーである8OHｄGの抗体を用いて、タンパク質マーカーであるdityrosineの抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像を説明する説明図である。

【図44】抗-8OHｄG抗体と抗-dityrosine抗体での免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量したグラフ、並びに脂質の酸化状態であるTBARS量のグラフを説明する説明図である。

【図45】マガキの抽出物によりNASHモデルマウスの肝臓におけるDNA、脂質、及びタンパク質における抗酸化性を説明する説明図である。

【図46】脂肪肝やインスリン抵抗性に関わる転写因子PPARγと受容体CD36を説明する説明図である。

【図47】肝臓での転写因子PPARγを抗- PPARγ抗体、受容体CD36を抗- CD36抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像を説明する説明図である。

【図48】免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量化したグラフを説明する説明図である。

【図49】肝臓での転写因子PPARγ、受容体CD36の遺伝子発現量を説明する説明図である。

【図50】図３９から図４９における分析項目の結果のまとめを説明する説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を図に示す一実施例に基づいて説明する。

【実施例】

【0016】

図２３、図２４において、符号１は、抽出容器であり、該抽出容器１内には、カキ肉から抽出物を抽出するための抽出用溶液２が貯留される。そして、該抽出用溶液２が貯留されている抽出容器１内に生ガキ肉３を収納し、カキ肉の各種有効成分を含有する抽出物を抽出する工程が行われる。

【0017】

ところで、従来では、カキ肉抽出物抽出時に、抽出容器１内のカキ肉３が収納された抽出用溶液２を攪拌し、抽出をより効率化することが従来行われていたことがあったが、カキ肉３自体を痛めることにもなり、この抽出工程時点での攪拌作業は行わない方が好ましい。

【0018】

前述のようにしてカキ肉抽出物が抽出された抽出用溶液２を次は濃縮工程によって濃縮されるものとなる。

【0019】

次に、この濃縮液６に、エタノール溶液４を加え、70%程度のエタノール濃度の溶液とする。その後、攪拌すると共に、沈殿物７と上澄み液８とに分離する。

【0020】

そして、図２３から理解されるように、沈殿物７は乾燥させ、打錠し、最終的に健康食品などに供される。

【0021】

ところで、従来では前記上澄み液８は、何らカキ肉抽出物の有効成分が入っていない、あるいは入っていてもきわめて微量であるとして廃棄していたことがある。しかし、その後、実験や研究の結果、この上澄み液８内にもカキ肉抽出物に関する多くの有効成分が存在していることが判明し、現在ではこの上澄み液８も廃棄することなく利用している。

【0022】

近年では、この上澄み液８を再度濃縮するとともに、その濃縮液を最終的に乾燥させる。そして、その乾燥物は、完全な固形物状にはならないが、ペースト状には形成することができ、もってペースト状の健康食品とするなどして製造している。そして、このペースト状の健康食品は、需要者側において白湯などで溶いて飲料用健康食品に供されるのである。

【0023】

まず、本実施例では、前記の上澄み液８を使用して後述する3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)入りのカキ肉抽出物を回収するものである。

【0024】

すなわち、前記のごとく沈殿物７と上澄み液８に分離した後、該上澄み液８につき、まず、エバポレータなどで前記上澄み液８のエタノール分を除去し、約半分の量になるまで濃縮する。

【0025】

たとえば40mL分の上澄み液８を濃縮して20mLの上澄み液８の濃縮液９を確保するがごときである。

【0026】

次いで、その20mLの濃縮液を約５倍になるよう希釈して希釈液１０を生成する。たとえば100mLの希釈液１０の量にするがごときである。このような工程を経るのはなるべく不純物を除去するためである。

【0027】

その後、たとえばこの100mLの希釈液１０の溶液に、たとえば酢酸エチル５を200mL程度投入する。そして、その後攪拌するなどして、あるいは分離器を使用して水層１０ａと酢酸エチル層１１とに分離させる。すると、時間の経過と共に、この混合溶液は、水層１０ａ、そして酢酸エチル層１１とに分離して形成されるものとなる。

【0028】

すると、この酢酸エチル層１１内に後述する3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が存在していることが確認できた。

【0029】

ここで、その確認できた3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の量であるが、具体的には、約2L分収集した酢酸エチル層１１から約3mgの3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)があることが確認できた。

【0030】

次に、前記3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)がどの様な工程でカキ肉抽出物から分離精製でき、もってカキ肉抽出物内での存在が確認できたのか、また3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)はどのような構造から構成されているのか、さらには3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の抗酸化作用がどの様に確認できたのかなどを以下に説明する。

【0031】

まず、図２５に示すフローチャートに従って説明する。

【0032】

たとえば、エタノール溶液４を含んだ抽出用溶液２内にカキ肉３を投入してカキ肉有効成分抽出物の抽出を行なう（ステップ１００、ステップ１０２）。

【0033】

抽出後はその抽出液を濃縮する（ステップ１０４）。そして、該濃縮液６にたとえば、エタノール溶液４を加え、70%程度のエタノール濃度の溶液とする（ステップ１０６）。その後、攪拌し、沈殿物７と上澄み液８とに分離する（ステップ１０８）。

【0034】

そして、前記上澄み液８を用い、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)抽出のための酢酸エチルを用いた抽出作業を行う。

【0035】

図２５から理解されるように、前記エタノール分をなくし（ステップ１１０）、かつ約５倍に希釈した上澄み液８におのおのヘキサンからクロロホルム、酢酸エチル、そしてブタノールを投入し、おのおのの分画を生成する。

【0036】

例えば、ロータリーエバポレーターなどで100mLまで濃縮し、該濃縮液20mLに例えば蒸留水80mLを加えて分液ロートに移し、ヘキサン抽出を行う。

【0037】

ヘキサン層(200mL)を除去後に、水層からクロロホルム200mL、酢酸エチル200mL、ブタノール200mLの順で段階的に抽出する。

【0038】

すなわち、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)抽出のための有機溶媒の極性を段階的に高めていってそれらをそれぞれ投入した分画を生成し、おのおのの分画に3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が抽出されているかを確認する（図２６参照）。

【0039】

次いで、前記それぞれの有機溶媒を投入した分画をたとえばエバポレータで濃縮した後、Thin-Layer-Chromatography（以下、TLCと称する。TLC:薄層クロマトグラフィー）により観察すると共に、いわゆるORAC法（OxygenRadicalAbsorbanceCapacity法）による抗酸化力の検索を行うのである。

【0040】

すると、その結果、TLC像では、ヘキサンからクロロホルム、酢酸エチル、そしてブタノールにかけて極性の低いものから高いものへと溶出されていくことが確認できた。

【0041】

また、ORAC法により酢酸エチル分画においてプラトーの部分が観察されて、当該酢酸エチル分画に高い抗酸化能が認められ、よって、この酢酸エチル分画に3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)が存在していると判断されるのである（図２７参照、ステップ１１２）。

【0042】

次いで、この酢酸エチル分画をエバポレータによりやはり濃縮した後、いわゆるシリカオープンカラムによる抽出を行い（図２８、ステップ１１２６）、酢酸エチル：クロロホルムが３：２の割合での抽出分画を選択し（図２９参照）、最終的にその分画をHPLC（逆相カラム）によって、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)を分離精製することができたのである（ステップ１１６）。

【0043】

このように、カキ肉抽出物を抽出した上澄み液８から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を分離精製することができた。

【0044】

なお、以下の操作によっても3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を分離精製することができる。

【0045】

まず、0.075mol/Lリン酸緩衝液2.3、5mL、6.3x10^-7mol/LFluorescein(蛍光プローブ)0.3mL、7％(w/v)methylatedβ-cyclodextrin(Wako)の混合溶液に溶解したトロロックス(Wako)または被験試料0.05mLを37℃で10分間加温する。

【0046】

予め37℃に加温した1.28x10^-1mol/L2、2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH、Wako)0.3mLを加え、例えばスターラ―で撹拌しながら、分光蛍光光度計(FP-6500、JASCO、東京)で10秒おきに5,000秒まで蛍光強度(励起波長493nm、蛍光波長515nm)を測定する。

【0047】

抗酸化活性は測定開始時点の蛍光測定値（例えば図２７中の縦軸）が維持される時間（同横軸）の長さで示され、その時間が長いほど抗酸化活性が強いことを意味するものである。

【0048】

すると、やはり前記４種類の抽出画分の中では酢酸エチル抽出画分に抗酸化活性が確認された。

【0049】

次いで、抗酸化活性が示された酢酸エチル抽出物について順相のシリカゲル薄層分取クロマトグラフィーを行う。シリカゲル薄層プレート（200×200mm、厚さ0.5mm、Merck、Darmstadt）を用い、移動相として酢酸エチル-クロロホルム(2:1、v/v)を用いた。展開後のプレートに紫外線ランプ（254nm）を照射し、紫外線吸収性の11画分を得た。各画分の試料をゲル担体とともに分離し、例えばメタノールで溶出後に抗酸化活性を測定すると、低極性側から6番目の画分に抗酸化活性が観察された。

【0050】

さらに、前記薄層クロマトグラフィーで抗酸化活性を示した画分を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製する。HPLCシステム（ポンプ：L-2130、UV検出器：L-2420、HITACHI、東京）、逆相カラム(APCELLPACC18、250×4.6mmI.D.、SHISEIDO、東京)、及び移動相5%アセトニトリル水溶液（流速1.0mL/min）を使用して室温で分離した。

【0051】

しかして、この操作によっても原料の160mLエタノール抽出液から最終的に3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)3.0mgが得られるものとなった。

【0052】

ところで、前記3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)の存在は、紫外線吸収スペトル（V-530、JASCO）、核磁気共鳴スペクトル（NMR：AMX-500、Bruker、Karlsruhe）、マススペクトル（JMS-T100CS、JEOL、東京）を測定して、構造解析を行い(図３６、図３７)。その結果、前記の分離精製物の構造が、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)と推定されるのである(図３７)。

【0053】

条件
UV（EtOH）、λ_max270nm；¹H-NMR(500MHz、Acetone-d₆)δ_H:7.82(2H、br.s、aromatic-OH)、6.40(2H、s、H-2、6)、4.42(2H、s、H-1’)、3.94(1H、br.s、-OH)、3.79(3H、s、-OMe)；¹³C-NMR(125MHz、Acetone-d₆)δ_C:151.1(C-3、5)、139.4(C-1)、13、5.1(C-4)、106.5(C-2、6)、64.5(C-1’)、60.6(-OMe)；ESI-TOFMS、m/z153.05451[M-OH]⁺(calc.forC₈H₈O₃、153.05517)、171.06911[M+H]⁺(calc.forC₈H₁₁O₄、171.06573)。

【0054】

ここで、分離精製された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)の性状を説明すると、その性状は黄淡色の粉末で、脂溶性及び水溶性を示している。

【0055】

また、当該3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)は、図３０に示すようなフェノール性化合物であることが確認された。

【0056】

なお、ここで、食品の抗酸化物質の測定法については、これまでに様々報告されてきているが、どれも一長一短があり、統一または公定法化(分析値の妥当性確認)された方法はなかった。しかしながら、米国では、すでにORAC値を表記したサプルメントや飲料が上市されており、世界標準となりつつある。

【0057】

よって、本実施例では、ORAC法により抗酸化力を測定することとしている。

【0058】

ところで、日本ではすでにORAC法の公定法化の研究を行う研究会(AntioxidantUnit研究会)が出来ている。ORAC法の利点としては水溶性、脂溶性のどちらのサンプルも測定でき、前述したどの有機溶媒分画も測定できることがあげられる。

【0059】

また一回の測定で抗酸化作用の持続時間とその力価を合わせて評価でき、実験操作が容易であるなどから本実施例での測定に有利であったと考える。

【0060】

ここで、ORAC法の測定原理について若干説明する。まず、一定の活性酸素種を発生させ、それによって分解される蛍光強度を測定し、経時的に減少する蛍光強度の曲線を描いた場合、この反応系に抗酸化物質が共存すると蛍光物質の蛍光強度の減少速度が遅延する。よって、この原理により抗酸化物質の存在が確認できるものとなるのである（図３１参照）。

【0061】

しかして、本発明における3、5-ジヒドロキシ-4-メトｃキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記ORAC法によりその抗酸化能を観察したところ、いわゆる標準物質（Trolox）と同じように延滞期が存在し、強い抗酸化活性が観察できたのである（図３２参照）。

【0062】

本実施例では、前述した上澄み液８から探査すべく、ORAC法を用い、酢酸エチル分画において高い抗酸化力を有する3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)を発見できたのである。

【0063】

次に、培養肝細胞の酸化実験と低密度リポタンパク質（LDL）の酸化実験の両者において、当該3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)の抗酸化活性を明らかにすることとする。

【0064】

（当該物質の正常ヒトLDLの金属酸化に対する抗酸化活性について）
硫酸銅により正常ヒトLDLを酸化する際に、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)を添加し、LDLの酸化度をTBARS法により定量した(図３３参照)。すると、当該物質の180μM添加時にはControl(0μM)と同様に、lag-timeは観察されなかった。Lag-timeとは曲線の立ち上がりが見られない時間を指し、この時間が長くなるほど抗酸化活性があると判断される。しかし、270μM添加時には２時間、360μMでは４時間、450μM及び540μMでは５時間と、用量依存性にlag-timeは延長し、当該3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)によるLDLの金属酸化の抑制が確認されたのである。

【0065】

（肝細胞培養系を用いた抗酸化能の観察について）
diphenyl-1-pyrenlphosphine（DPPP）はそれ自体、蛍光を発生しないが、酸化されると蛍光を発生する。ここで、diphenyl-1-pyrenlphosphine（DPPP）の蛍光発色の原理を図３４に示す。この蛍光色素を用い、肝臓の株化細胞(C3A)の酸化度を観察したものである。

【0066】

そして、本発明における3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を添加した細胞を５日間培養し、その後、DPPPで標識した細胞を2、2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloideにより酸化し、各細胞のDPPPの蛍光強度を測定した。その結果、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)を細胞に添加しなかったものと比較し、添加した細胞は濃度依存的に蛍光強度が低く、当該抗酸化物質3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)による酸化抑制が観察されたのである(図３５参照)。

【0067】

以上により、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)は、抗酸化性能を有することが明らかとされた。

【0068】

そして、当該3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)は、本発明によって効率よくカキ肉抽出物より抽出できるものであり、もって該カキ肉抽出物により抗酸化剤組成物や抗酸化剤が効率よく多量に回収、製造できることとなる。

【0069】

なお、本発明の発明者らは、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)の構造を確認するために、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)の化学合成を行い、これに成功した。

【0070】

該合成の全工程を図３８に示す。

【0071】

合成された物質につき核磁気共鳴スペクトル（NMR：AMX-500、Bruker、Karlsruhe）、マススペクトル（LXQ、ThermoScientific、Waltham）を測定して、その構造確認を行うものである。

【0072】

まず、没食子酸メチル（5.00g、27.2mmol）のジメチルホルムアミド（DMF）溶液（45mL）に炭酸カリウム（4.50g、32.6mmol）を加え85℃で１時間撹拌した。その後、氷浴中でヨウ化メチル（4.00g、28.2mmol）3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
を徐々に滴下し30分間撹拌し、さらに室温で24時間撹拌した。反応液をろ過して精製水を加え、酢酸エチルで抽出を行い、分離した酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。

【0073】

抽出液は、濃縮後にシリカゲル・カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム→クロロホルム-酢酸エチル（3:1、v/v））で精製し、4位メトキシ体を2.79g（収率51.9%）得た。

【0074】

条件
¹H-NMR(500MHz、CD₃OD)δ_H:7.01(2H、s、H-2、6)、3.85(3H、s、-OMe)、3.82(3H、s、-OMe)；¹³C-NMR(125MHz、CD₃OD)δ_C:168.5(-C=O)、151.7(C-3、5)、141.2(C-1)、126.5(C-4)、110.1(C-2、6)、60.7(-OMe)、52.5(-OMe)；ESI-ITMS、m/z199[M+H]⁺、197[M-H]^-.

【0075】

次いで、氷浴中（0℃）で、水素化リチウムアルミニウム（469mg、12.4mmol）のテトラヒドロフラン（THF）溶液（6mL）に、没食子酸メチルの４位メトキシ体（560mg、2.8mmol）のテトラヒドロフラン溶液（4mL）を注意深く滴下した。その後、混合液を60〜65℃で6時間撹拌し、酢酸エチルと10%硫酸水溶液を加えて反応を停止した。反応液に精製水を加え、酢酸エチルで抽出を行い、分離した酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後に硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液は、濃縮後に、シリカゲル・カラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム-メタノール（50：1、v/v）→クロロホルム-メタノール(50：3、v/v)）で精製し、還元体、すなわち合成3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)を175.9mg（収率36.6%）得たのである。

【0076】

条件
¹H-NMR(500MHz、Acetone-d₆)δ_H:7.82(2H、br.s、aromatic-OH)、6.40(2H、s、H-2、6)、4.42(2H、s、H-1’)、3.94(1H、br.s、-OH)、3.79(3H、s、-OMe)；¹³C-NMR(125MHz、Acetone-d₆)δ_C:151.1(C-3、5)、139.4(C-1)、13、5.1(C-4)、106.5(C-2、6)、64.5(C-1’)、60.6(-OMe)；ESI-ITMS、m/z171[M+H]⁺、153[M-OH]⁺.

【0077】

（3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)とその合成品の物性パラメータの比較）
3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)とその合成品との間では、上記の¹H-NMR、¹³C-NMR、ESI-MSの各種スペクトルデータが一致し、HPLCの保持時間及び薄層クロマトグラフィーの移動度が一致したことにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)であることが確認できる。

【0078】

前述のごとく、カキより得られた抗酸化物質、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)、は、高度に水酸化された芳香族化合物といいうる。

【0079】

これまでにも、水酸化された芳香族、即ちフェノール化合物においては、コーヒー酸に代表されるようなクロロゲン酸、ニグニン類やフラボノイドなど、多くの物質が抗酸化活性を有することが報告されている。

【0080】

これらの物質は、ペルオキシド、特にペルオキシラジカル（ROO・）の捕捉剤として働くことにより抗酸化活性を発揮することが知られている。しかして、本発明で同定された抗酸化物質は、ラジカル消去能を観察するORACやAAPHを用いる細胞実験で高い抗酸化活性を示している。

【0081】

このことは、当該物質がラジカル捕捉剤として抗酸化能を発揮する可能性を強く示唆したものともいいうる。

【0082】

本発明によって精製された当該物質は、両親媒性であるが、数少ない水溶性抗酸化剤の一つとして広く用いられるL(+)-アスコルビン酸と比較してORAC値が３倍大きかったことは、当該物質の抗酸化剤としての効果を強く期待させるものである。当該物質が用量依存的にLDLの酸化を抑制したことは、同物質がLDLの酸化防止を通じて抗動脈硬化作用を発揮する効果を示唆している。

【0083】

一方、生細胞の酸化をリアルタイムに観察する目的で、cis-parinaricacid(PnA)、fluoresceinatedphosphoethanolamine、undecylamine-fluoresceinなどのプローブが開発されてきた。中でもPnAが生細胞の酸化を観察するプローブとしてよく使われているが、PnAはしばしば細胞毒性があり、細胞の生理学的活性に影響を及ぼすことが報告されている。

【0084】

本発明で使用したDPPPは、細胞増殖や細胞毒性などに少なくとも3日間は影響を与えず、DPPP及び酸化されたDPPPは生細胞の細胞膜に局在し、少なくても２日間は安定であることが報告されている。このDPPP自体は蛍光を発しないが、酸化されたDPPPは蛍光を発する。このDPPPを用い、従来、生細胞の過酸化脂質を観察する方法が確立し、ヒト単球系の浮遊細胞(U937)を用いて、ビタミンＥの抗酸化力を確認している。

【0085】

本発明において、当該抗酸化物質が肝臓由来の株化細胞であるC3A細胞の酸化を有意に抑制したことは、本発明による当該物質が少なくとも肝細胞内においても抗酸化活性を発揮できることを示唆するのである。この結果は、上述のLDL酸化抑制と併せて、本発明物質の抗酸化剤としての効果を大きく期待させる。

【0086】

酸化ストレスが関連する疾患として、従来は動脈硬化性疾患に大きな関心が向けられてきたが、近年では非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの異所性脂肪蓄積症にも注目が集まりつつある。NASHでは、活性酸素が肝細胞壊死や炎症性サイトカイン生産、肝線維化に関係することが知られている。またNASHでは血中の酸化LDL濃度が高いことが報告されている。さらに、NASHの炎症性サイトカイン産生亢進やコラーゲン産生亢進に関与する肝星細胞は、酸化LDLにより活性化されることが報告されている。

【0087】

本発明で見出されたカキの新規抗酸化物質がNASHの予防に貢献できるものと大きく期待できる。

【0088】

このように、本発明では、カキより新規抗酸化物質を見出し、その化学構造を3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)と決定した。さらには、その化学合成法をも確定した。

【0089】

さらに、本発明による当該物質のORAC値は、その精製物が1.24±0.3、5μmolTE/μmol、その合成物が1.47±0.40μmolTE/μmolであり、水溶性抗酸化物質のクロロゲン酸とL(+)-アスコルビン酸の中間の抗酸化能の強さであった。

【0090】

また、ヒトLDLの金属酸化に対して、本発明による当該物質3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4- methoxybenzyl alcohol)は用量依存的に抗酸化能を示し、C3A細胞を用いた抗酸化能実験においても、当該物質は用量依存的に抗酸化能を示したことを付言する。

【0091】

次に、本件発明者らは、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を高濃度含有するマガキの抽出物をNASHモデルマウスに投与し、肝臓の保護作用を有するか否かの実験を行った。

【0092】

しかして、図１乃至図２２に本発明を説明する実験データなどを示す。

【0093】

図１から理解されるように、マウスのNC群には普通食（MF）の餌料を与え、マウスのHF+群には高脂肪食（HFD-60）と3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコールを高濃度含有するマガキの抽出物が5%含有された餌料を与え、マウスのHF-群には高脂肪食（HFD-60）のみの餌料を与えた。
なお、餌料はマウスが自由に食べる分だけ与えるものとした。

【0094】

生後４週目のマウスを実験開始時とし、実験開始２０週目から２日おきに尾静脈に0.2mgの酸化LDLの注射を計８回注射する。最終の酸化LDLの注射後、１２時間後に屠殺する。屠殺の１６時間前に餌止めを行い、ジエチルエーテルにより麻酔し、脱血後、サンプルを採取する。

【0095】

次に、図２に分析項目を示す。

【0096】

分析項目として、餌料は摂餌量(g)を、外観はマウスの体重(g)、肝重量(g)及び体重当たりの肝重量(%)を、肝臓の組織学的観察は脂肪蓄積度、バルーニング度、炎症度及び線維化度を、肝臓は中性脂肪(mg/dl)、総コレステロール(mg/dl)、遊離脂肪酸(mEq/L)及びTBARS（μM）を、血漿はAST（U/L）、ALT（U/L）、グルコース(mg/dL)、インスリン(μg/L)、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR）、中性脂肪(mg/dL)、総コレステロール(mg/dL)及び遊離脂肪酸(mEq/L)を挙げて分析する。

【0097】

図３に各マウスのHF+群とHF-群の摂餌量(g)を示す。

【0098】

摂餌量は、最初に与えた餌量と３、４日後の餌量を計測して、最初に与えた餌量から３、４日後の餌量を引いた量が摂餌量となる。

【0099】

図３の（ａ）は実験開始１〜２３週間の摂餌量を表し、図３の（ｂ）は各マウスのHF+群とHF-群における生涯の摂餌量を表している。ここで、図３の（ａ）は実験開始１〜１０週目ごろまではHF-群、HF+群の各マウスにおいて、標準時偏差が大きく出ているが、これはマウスがエサを容器の外に出し、まき散らすためである。しかしながら、図３の（ｂ）より各マウスのHF+群とHF-群における生涯の摂餌量は統計的に有意ではなく、生涯の摂餌量は同じと考えられる。

【0100】

図４にマウスの外観と肝臓の色調を分析した結果を示す。

【0101】

マウスのNC群とマウスのHF+群又はマウスのHF-群の外観と肝臓の色調を比較してみると、HF+群とHF-群の生涯の摂餌量は同じであるにもかかわらず、HF+群の外観と肝臓の色調はNC群に近いことが確認された。すなわち、マウスのHF+群に抗肥満作用が確認できた。

【0102】

図５に実験開始１〜２３週間のNC群、HF-群及びHF+群の各マウスにおける体重の変化を分析した結果を示す。

【0103】

摂餌後６週目よりHF-群のマウスの体重とHF+群のマウスの体重では、HF+群のマウスの体重の方が軽くなっていることが確認された。すなわち、摂餌後６週目よりマウスのHF+群に抗肥満作用が確認できた。

【0104】

NC群、HF-群及びHF+群の各マウスにおける、図６の（ａ）はマウスの体重、図６の（ｂ）は肝重量、図６の（ｃ）は体重当たりの肝重量を分析した結果を示す。

【0105】

図６の（ｃ）よりHF+群の体重当たりの肝重量がHF-群の体重当たりの肝重量より減少していることが確認された。すなわち、マウスのHF+群に抗肥満作用が確認できたのである。

【0106】

図７は病理学的観察におけるスコアの基準について、図８は各判定の正常細胞及び病的細胞の写真を示す。

【0107】

図７の表中のスコア0は図８に示す正常細胞に該当し、スコア２−３は図８に示す病的細胞に該当する。スコアの判断基準は「脂肪蓄積度」、「バルーニング度」、「炎症度」及び「線維化度」で判定する。

【0108】

「脂肪蓄積度」においては脂肪染色で赤く染まる占有率を画像解析ソフトによって求め、それぞれの占有率で判定する。

【0109】

「バルーニング度」はHE染色で膨れている細胞が１視野中にどのくらいの頻度か(点在か、汎細葉性か)を数え判定する。

【0110】

「炎症度」はHE染色で炎症があると青色に染まるリンパ球やマクロファージの浸潤が肝臓にみられるので、１視野中にどのくらいの病巣があるかを数え判定する。

【0111】

「線維化度」は線維を青く染めるマッソントリクローム染色で細胞周辺と静脈だけなのか、又はそれらが繋がっているかの病態で判定する。

【0112】

図９にNC群、HF-群及びHF+群の各マウスの肝臓の病理学的観察の結果を示す。

【0113】

各判定結果より、HF+群の肝臓において脂肪蓄積度、バルーニング度、炎症度及び線維化度の減少が確認できた。

【0114】

図１０にNC群、HF-群及びHF+群の各マウスの肝臓の各脂質の濃度を分析した結果を示す。

【0115】

各判定結果より、HF+群の肝臓において中性脂肪、総コレステロール、遊離脂肪酸及び脂質の過酸化度(TBARS)の減少が確認できた。

【0116】

図１１にNC群、HF-群及びHF+群の各マウス血漿中のAST活性、ALT活性について分析した結果を示す。

【0117】

AST活性、ALT活性の判定結果より、HF+群の血漿においてAST活性、ALT活性の減少が確認できた。

【0118】

図１２にNC群、HF-群及びHF+群の各マウス血漿中のグルコース、インスリン濃度及びインスリン抵抗性指数について分析した結果を示す。

【0119】

ここで、インスリン抵抗性指数は、
インスリン抵抗性指数＝空腹時インスリン値（ｍU/ml）×空腹時血糖値(mmol/L)／22.5
の数式が使用される。

【0120】

各判定結果より、HF+群の血漿においてグルコース、インスリン濃度及びインスリン抵抗性指数の減少が確認できた。

【0121】

図１３にNC群、HF-群及びHF+群の各マウスの血漿の各脂質の濃度を分析した結果を示す。

【0122】

各判定結果より、HF+群の血漿において中性脂肪、総コレステロール及び遊離脂肪酸の減少が確認できた。

【0123】

図１４、図１５に肝臓における炎症反応に関する遺伝子について示す。

【0124】

図１５を参照して説明すると、NASHモデルマウスの肝臓において、活性酸素種（ROS）により肝細胞が炎症を受けると、そこにマクロファージやリンパ球が集合してくるので、マクロファージの遊走を促進するサイトカインのIL-6やTNF-αの遺伝子が上昇するのである。またマクロファージやリンパ球を特異的に認識するマーカーであるF4/80やCD3の遺伝子が上昇する。

【0125】

図１４はNC群、HF-群及びHF+群の各マウスの炎症反応に関する肝臓の遺伝子を、図１４（ａ）はTNF-αの遺伝子について、図１４（ｂ）はIL-6の遺伝子について、図１４（ｃ）はマクロファージのマーカーであるF4/80の遺伝子について、図１４（ｄ）はリンパ球のマーカーであるCD3の遺伝子について分析した結果である。

【0126】

各判定結果より、HF+群はHF-群と比べて、これらの遺伝子の発現が低下していた。すなわち、HF+群の肝臓において炎症反応に関連する遺伝子の減少が確認できた。

【0127】

図１６、図１７に肝臓におけるアポトーシスに関する遺伝子について示す。

【0128】

図１７を参照して説明すると、NASHモデルマウスの肝臓において、活性酸素種（ROS）により肝細胞が炎症を受けると、アポトーシスによる細胞死が観察される。これに伴い、肝臓において、アポトーシスを促進する遺伝子であるBaxの上昇し、アポトーシスを抑制する遺伝子であるBcl2, Bcl-xl, p53 の減少が観察される。

【0129】

図１６はNC群、HF-群及びHF+群の各マウスのアポトーシスに関する肝臓の遺伝子を、図１６（ａ）はBax遺伝子について、図１６（ｂ）はBcl-xl遺伝子について、図１６（ｃ）はBcl2遺伝子について、図１６（ｄ）はp53遺伝子について分析した結果である。

【0130】

各判定結果より、HF+群はHF-群と比べて、Baxの低下やBcl2, Bcl-xl, p53の上昇がみられた。すなわち、HF+群の肝臓においてアポトーシスに関連する遺伝子の減少及び抗アポトーシスに関連する遺伝子の増加が確認できた。

【0131】

図１８、図１９に肝臓におけるアポトーシスに関する遺伝子について示す。

【0132】

図１９を参照して説明すると、NASHモデルマウスの肝臓において、活性酸素種（ROS）により肝細胞が炎症を受けると、線維化が観察される。これに伴い、肝臓において、線維化を促進する遺伝子であるCOL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの上昇が観察される。

【0133】

図１８はNC群、HF-群及びHF+群の各マウスの線維化に関する肝臓の遺伝子を、図１８（ａ）はCOL1a2の遺伝子について、図１８（ｂ）はCOL3の遺伝子について、図１８（ｃ）はCOL4の遺伝子について、図１８（ｄ）はTGFβ1の遺伝子について、図１８（ｅ）はTGFβ2の遺伝子について、図１８（ｆ）はTIMP1の遺伝子について、図１８（ｇ）はαSMAの遺伝子について分析した結果である。

【0134】

各判定結果より、HF+群はHF-群と比べて、COL1a2，COL3，COL4，TGFβ1，TGFβ2，TIMP1，αSMAの低下がみられた。すなわち、HF+群の肝臓において線維化に関連する遺伝子の減少が確認できた。

【0135】

図２０に分析項目の結果のまとめを示す。

【0136】

図２１、図２２に示すように、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコールを高濃度含有するマガキからの抽出物は、NASHモデルマウスにおいて、抗肥満、抗脂肪肝、抗炎症、抗線維化、抗アポトーシス、抗酸化、血糖値低下、血漿脂質低下などの優れた効果が確認できたのである。

【0137】

さらに、実験データの説明図（図３９乃至図５０）を示して説明する。

【0138】

肝臓の炎症反応の特徴であるリンパ球とマクロファージの浸潤を抗-CD3抗体(リンパ球に特異的な抗体)と抗-F4/80 (マクロファージに特異的な抗体)を用いて免疫組織化学的観察を行った。

【0139】

図３９には両抗体を用いたNC、HF+、HF-群の代表的な染色像を示す。HF+においては、両抗体により点在している染色像が見られた。HF-群ではNC群と比較し、リンパ球とマクロファージの肝臓への浸潤が観察された。一方、HF+群ではHF-群と比較し、両血球とも浸潤はほとんど認められなかった。

【0140】

図４０では図３９で行った両免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量化したグラフを示す。HF-群ではNC群と比較し、統計学的に優位に染色像の増加が観察されたが、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な減少が観察された。これらの結果より、前述のマガキの抽出物によるNASHモデルマウスの抗炎症作用が観察された。

【0141】

肝臓のアポトーシスの特徴であるDNAの断片化をTUNEL assayを用いて観察を行った。図４１ではTUNEL assayにおける代表的な染色像と染色数のグラフを示す。HF-群においては、細胞の核が染色している像が見られた。染色細胞数のグラフから、HF-群ではNC群と比較し、統計学的に優位にDNAの断片化を起こしている細胞数の増加が観察されたが、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な減少が観察された。これらの結果より、前述のマガキの抽出物によりNASHモデルマウスの抗アポトーシス作用が観察された。

【0142】

肝臓の線維化の特徴であるコラーゲンの蓄積を抗-コラーゲン抗体を用いて観察を行った。図４２では抗-コラーゲン抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像、及びImageJを用いて定量化したグラフを示す。HF-群においては、細静脈周囲に顕著なコラーゲンの染色像が見られた。HF-群ではNC群と比較し、統計学的に優位にコラーゲンの蓄積を起こしている領域の増加が観察されたが、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な減少が観察された。これらの結果より、マガキの抽出物によりNASHモデルマウスの抗線維化作用が観察された。

【0143】

肝臓における酸化の状態をDNAの酸化マーカーである8OHｄGの抗体を用いて、タンパク質マーカーでるdityrosineの抗体を用いて観察を行った。図４３には両抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像を示す。抗-8OHｄG抗体を用いた染色像では細胞の核に、抗-dityrosine抗体を用いた染色像では細胞質に染色像が見られた。HF-群ではNC群と比較し、両抗体とも染色領域の増加が観察された。一方、HF+群ではHF-群と比較し、両抗体とも染色領域の減少が観察された。

【0144】

図４４では図４３で行った抗-8OHｄG抗体と抗-dityrosine抗体での免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量したグラフ、並びに脂質の酸化状態であるTBARS量のグラフを示す。両抗体での免疫染色像の占有率、及びTBARS量とも、HF-群ではNC群と比較し、統計学的に優位な増加が観察された。一方、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な減少が観察された。

【0145】

図４５のイラストに示すように、前記マガキの抽出物によりNASHモデルマウスの肝臓におけるDNA、脂質、及びタンパク質における抗酸化性が観察された。

【0146】

図４６のイラストに示すように、脂肪肝やインスリン抵抗性に関わる転写因子PPARγ・と受容体CD36を示す。先行研究により、以下の報告がある。
１．ヒトの脂肪肝におけるPPARγの主な転写産物はCD36であった。
２．NAFLD患者において、インスリン抵抗性や高インスリン血症にCD36が深く関与していた。

【0147】

これらのことから、PPARγ、CD36の発現量を観察することは脂肪肝やインスリン抵抗性を観察するうえでも大変重要である。

【0148】

肝臓での転写因子PPARγを抗- PPARγ・抗体、受容体CD36を抗- CD36抗体を用いて観察を行った。図４７には両抗体を用いたNC、HF+、HF+群の代表的な免疫組織化学染色像を示す。抗- PPARγ抗体を用いた染色像では細胞の核に、抗-CD36抗体を用いた染色像では細胞質に染色像が見られた。HF-群の肝臓ではNC群と比較し、両抗体とも染色領域の増加が観察された。一方、HF+群ではHF-群と比較し、両抗体とも染色領域の減少が観察された。

【0149】

図４８では図４７で行った免疫染色像の占有率をImageJを用いて定量化したグラフを示す。HF-群ではNC群と比較し、占有率の増加が観察されたが、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な占有率の減少が観察された。これらの結果より、前記したマガキの抽出物によりNASHモデルマウスの肝臓において、統計学的に優位な両タンパク質発現量の減少が観察された。

【0150】

図４９では肝臓での転写因子PPARγ、受容体CD36の遺伝子発現量を示す。HF-群ではNC群と比較し、両遺伝子発現量の増加が観察されたが、HF+群ではHF-群と比較し、統計学的に優位な両遺伝子発現量の減少が観察された。図47-49の結果より、マガキの抽出物によりNASHモデルマウスの肝臓において、統計学的に優位なPPARγ、CD36の発現量の減少が観察された。

【0151】

図５０に図３９乃至図４９における分析項目の結果のまとめを示す。

【符号の説明】

【0152】

１抽出容器
２抽出用溶液
３生カキ肉
４エタノール溶液
５酢酸エチル
６濃縮液
７沈殿物
８上澄み液
９上澄み液の濃縮液
１０希釈液
１０ａ水層

【図1】