特許 6980219 がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6980219

(24)【登録日】2021年11月19日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6872 20180101AFI20211202BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20211202BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6872 Z

   C12N15/113 ZZNA

【請求項の数】8

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2016-162203(P2016-162203)

(22)【出願日】2016年8月22日

(65)【公開番号】特開2018-29494(P2018-29494A)

(43)【公開日】2018年3月1日

【審査請求日】2019年8月21日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591146239

【氏名又は名称】いであ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100118371

【弁理士】

【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】石井 秀始

(72)【発明者】

【氏名】森 正樹

(72)【発明者】

【氏名】今野 雅允

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５２２９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／１８７７２７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１０−５３４４８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２９２４２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLoS ONE (2015) Vol.10, No.2, e0118438, pp.1-13

【文献】 廣川順一、質量分析装置を用いたmiRNAの測定データ紹介、東レリサーチセンター The TRC News No.120 (Feb. 2015), pp.37-38

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織検体又は細胞におけるがんを検出、又は組織検体又は細胞におけるがんの進行期を判定する方法であって、
（１）前記組織検体又は細胞における、以下のｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する工程；及び
（２−１）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度が正常部位と比べて高い場合、当該組織検体が、がん組織由来であると判定し、若しくは、前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度が正常部位と比べてより高いほど、当該組織検体のがんの進行期がより後期である、と判定する工程；又は
（２−２）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度が正常部位と比べて高い場合、当該細胞が、がん細胞であると判定し、若しくは、前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度が正常部位と比べて高いほど、当該細胞のがんの進行期がより後期である、と判定する工程
を含み：
ｍｉＲ−２１；
Ｌｅｔ−７ａ；及び
ｍｉＲ−１７
前記工程（１）で測定するｍｉＲＮＡのメチル化の程度が、以下のｍｉＲＮＡ上の塩基からなる群より選択される少なくとも一種の塩基におけるメチル化の程度である、方法：
ｍｉＲ−２１の第９番目のシトシン；
Ｌｅｔ−７ａの第１９番目のアデニン；及び
ｍｉＲ−１７の第１３番目のアデニン。

【請求項2】

前記少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化が、ｍｉＲ−２００ｃの第９番目のシトシンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程（１）における、メチル化の程度の測定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ）を利用して行う、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記組織検体として、血清又は血漿を用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記がんが、上皮性腫瘍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記上皮性腫瘍が、消化器がんまたは乳がんである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記がんが、大腸がん、直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がんまたは肝臓がんである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記がんが、大腸がん、直腸がん、胃がんまたは膵がんである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

通常、患者の症状や診察結果、又はスクリーニング検査の結果を元に、医師はがんを疑う。そして、さらに進んでがんの存在を確定するには、他の検査（いわゆる診断検査）が必要になる。がんであることが確定したら、病期の診断（ステージング）が行われる。病期とは、がんの大きさや隣接する組織への広がり方、又はより遠く離れたリンパ節や臓器に転移しているかどうか、といった基準でがんを分類し、進行の程度を示すものである。

【0003】

スクリーニング検査とは、症状がまだ現れない段階で、がんがあるかどうかの可能性を調べる検査である。スクリーニング検査の結果は、通常決定的なものではないとされる。その後の診察や診断検査によってがんの診断が確定ないし否定される。診断検査は医師ががんを疑っている場合に行うものをいう。

【0004】

各種の腫瘍マーカーが、スクリーニング検査において利用されている。特定の腫瘍が血液中に分泌する種々の物質が、腫瘍マーカーとして利用されている。しかし、がんでない生体の血液中にも、しばしばある程度の腫瘍マーカーが存在していることが明らかになってきており、腫瘍マーカーが検出されたとしてもその生体ががんを患っているとは限らないため、がんのスクリーニング検査において、この種の腫瘍マーカーが果たす役割は限定的であるとされる。

【0005】

一方、がんが疑われる場合、通常、医師は最初にＸ線検査、超音波検査及びコンピュータ断層撮影等の画像検査を行う。これらの検査により異常な組織の塊の存在や位置、大きさを明らかにすることができる。しかし、そのような異常な組織塊が発見されたとしても、その原因ががんだとは確定できない。がんが確定するのは、例えば、疑わしい領域から採取した組織検体を顕微鏡で検査して、がん細胞の存在を見つけた時とされる。通常、この組織検体としては組織片、又は、場合により血液検体が用いられる。血液中の腫瘍マーカーの値を測定すると、診察所見又は画像検査等によるがんの診断を支持するデータやそれに反するデータが得られることがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、がんを検出、又はがんの進行期を判定する、新しい方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分子修飾をがんの検出、及びがんの進行期のバイオマーカーとして利用できるのではないかとの独自の着想に基づいて検討を行い、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１７の四種のｍｉＲＮＡのメチル化の程度が、がんの存在、及びがんの進行期と関連していることを突き止めた。本発明者らは、かかる知見に基づき、さらに試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法であって、
（１）組織検体又は細胞における、以下のｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する工程；及び
（２−１）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度に基づいて、当該組織検体が、がん組織由来である、若しくは、特定のがん進行期の組織由来である、と判定する工程；又は
（２−２）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度に基づいて、当該細胞が、がん細胞である、若しくは、特定のがん進行期の細胞である、と判定する工程
を含む方法：
ｍｉＲ−２００ｃ；
ｍｉＲ−２１；
Ｌｅｔ−７ａ；及び
ｍｉＲ−１７。
項２．
前記工程（１）で測定するｍｉＲＮＡのメチル化の程度が、以下のｍｉＲＮＡ上の塩基からなる群より選択される少なくとも一種の塩基におけるメチル化の程度である、項１に記載の方法：
ｍｉＲ−２００ｃの第９番目のシトシン；
ｍｉＲ−２１の第９番目のシトシン；
Ｌｅｔ−７ａの第１９番目のアデニン；及び
ｍｉＲ−１７の第１３番目のアデニン。
項３．
前記工程（１）における、メチル化の程度の測定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ）を利用して行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記組織検体として、血清又は血漿を用いる、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、がんを検出、又はがんの進行期を判定する、新しい方法を提供できる。特に、例えばステージＩ等のような早期のがんも診断できる方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の方法の一態様の概略図である。

【図2】本発明の方法による、ｍｉＲ−２００ｃについての測定結果の一例である。

【図3】大腸がんに関し、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１７について、正常部位及びがん部位それぞれにおけるメチル化率（％）と、ｍｉＲＮＡ発現量（ｌｏｇ １０）とを測定した結果を示す図面である。

【図4】直腸がんにおいて、ステージＩとＩＶにおけるメチル化率を、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１７について測定した結果を示す図面である。

【図5】胃がんに関し、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１７について、正常部位及びがん部位それぞれにおけるメチル化率（％）と、ｍｉＲＮＡ発現量（ｌｏｇ １０）とを測定した結果を示す図面である。

【図6】膵がん患者から採取した血清検体を用いて、ｍｉＲＮＡメチル化を定量化した結果を示す図面である。

【図7】既存の膵がんマーカーであるＣＡ１９−９及びＣＥＡによる判定結果と、ｍｉＲ−１７のメチル化による判定結果とを、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線により比較した結果を示す図面である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

１． 組織検体又は細胞
組織検体又は細胞は、特に限定されず、哺乳動物由来のものを幅広く使用することができる。組織検体又は細胞は、好ましくは、ヒト由来である。

【0012】

組織検体としては、特に限定されず、幅広く使用できる。組織検体としては、非侵襲的に採取できるという点で、好ましくは、血清、血漿、唾液、尿、胆汁及び糞便等を用いることができる。これらの中でも、血清及び血漿が好ましい。血清及び血漿は、例えば末梢血由来のものを使用できる。

【0013】

血清、血漿、唾液、尿、胆汁及び糞便等において、本発明の方法によりがんが検出された場合には、画像検査等の別の診断方法の結果と照らし合わせることにより、どの部位のがんであるのかを判定することができる。

【0014】

がんが疑われる組織に由来する組織検体を使用して本発明の判定を行うことにより、その組織ががんであるか否か、及び／又はその組織のがん進行期を判定することができる。

【0015】

２ ｍｉＲＮＡ
本発明では、以下のｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する。括弧内にそれぞれの塩基配列を示した配列番号を示す。
ｍｉＲ−２００ｃ（配列番号１）
ｍｉＲ−２１（配列番号２）
Ｌｅｔ−７ａ（配列番号３）
ｍｉＲ−１７（配列番号４）

【0016】

より具体的には、以下のｍｉＲＮＡ上の塩基からなる群より選択される少なくとも一種の塩基におけるメチル化の程度を測定する。特に限定されないが、一例として、以下が挙げられる。括弧内にそれぞれどの位置がメチル化されているのかを示す。

【0017】

ｍｉＲ−２００ｃの第９番目のシトシン［シトシン５位のメチル化（ｍ５Ｃ）］
ｍｉＲ−２１の第９番目のシトシン［シトシン５位のメチル化（ｍ５Ｃ）］
Ｌｅｔ−７ａの第１９番目のアデニン［アデニン６位のＮのメチル化（ｍ６Ａ）］
ｍｉＲ−１７の第１３番目のアデニン［アデニン６位のＮのメチル化（ｍ６Ａ）］

【0018】

上記４種のｍｉＲＮＡ群の全てについてメチル化の程度を測定してもよいし、一部のみについて測定してもよい。一般に、検出及び判定における高い精度が求められる場合には、より多くのｍｉＲＮＡについて測定を行うことが好ましい。複数種のｍｉＲＮＡについて測定を行う場合、検出及び判定の精度、並びに作業効率等を考慮し、例えば、上記４種のｍｉＲＮＡ群から選択される２〜４種、又は２〜３種におけるメチル化の程度を測定することができる。

【0019】

３． メチル化の程度の測定方法
ｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する方法は、特に限定されず、幅広い手法の中から選択することができる。

【0020】

測定方法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ）を利用する方法の他、バイサルファイトシークエンスや、メチル化ＲＮＡ免疫沈降シークエンス等が利用できる。

【0021】

測定方法としては、ｍ５Ｃとｍ６Ａという複数種の分子修飾、すなわち、特定部位のメチル化、を一度に検出できるという点、プロセスが簡素であるという点、及び低コストである点において、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳを利用する方法が好ましい。

【0022】

本発明において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳを利用する方法は、具体的には以下のようにして行うことができる。

【0023】

まず、組織検体又は細胞から、適当な方法を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。続いて、目的のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（相補塩基オリゴ）を表面に有するビーズを用いて、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの中から目的のｍｉＲＮＡを捕捉する。

【0024】

次に、単離されたｍｉＲＮＡを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳを利用して分析する。メチル化された塩基は、メチル化されていない場合と比べ、マススペクトル上のピークが＋１４ｋＤａシフトする。このことを利用してメチル化の程度を測定することできる。具体的には、標的塩基について、メチル化されていない塩基由来のピークに対する、メチル化されている塩基由来のピーク（これらは互いにマススペクトル上１４ｋＤａ離間している）の比率を算出することにより、単離されたｍｉＲＮＡ全体における、メチル化されているｍｉＲＮＡの割合を算出することができる。

【0025】

４． 判定工程
本発明者らの検討により、メチル化の程度と、がんの進行期との間に正の相関がみられることが明らかとなっている。このため、本発明の方法に供した組織検体が、がん組織由来である、若しくは、特定のがん進行期の組織由来である、と判定することが可能となる。あるいは、本発明の方法に供した細胞が、がん細胞である、若しくは、特定のがん進行期の細胞である、と判定することも可能となる。この場合、メチル化の程度がより高いほど、がんの進行期がより後期であることが示唆されているといえる。

【0026】

本発明の方法は、特に、例えばステージＩ等のような、早期のがんを診断できるという点で有用である。

【0027】

本発明の方法により判定が可能ながんは、特に限定されず、上皮性腫瘍又は非上皮性腫瘍であってもよい。

【0028】

上皮性腫瘍としては、特に限定されず、例えば、消化器がん及び一部の乳がん等が挙げられる。

【0029】

消化器がんとしては、特に限定されず、例えば、大腸がん、直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん及び肝臓がん等が挙げられる。

【0030】

非上皮性腫瘍としては、特に限定されず、例えば、白血病、悪性リンパ腫、脳腫瘍、（骨）肉腫及び一部の乳がん等が挙げられる。

【実施例】

【0031】

以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

【0032】

Ａ．実施例１
１．組織検体の調製
事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者より大腸がんの組織検体を手術時に採取した。なお、悪性腫瘍領域から５ｃｍ超離間した領域から、健常組織として組織検体を同時に採取した。また、直腸がんについても同様に組織検体を一組用意した。

【0033】

２．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社）を用い、製品プロトコールに沿って各組織検体からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。

【0034】

続いて、目的のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴＤＮＡを表面に有するビーズを用いて、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの中から目的のｍｉＲＮＡを捕捉した。このオリゴＤＮＡは、５’末端がＣ６リンカーを介してアミンで修飾されている。ＲＮＡとオリゴＤＮＡを混合後、９５℃まで加熱した後、ゆっくりと３０℃まで冷却した。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）とともに４℃にて１時間インキュベートした。

【0035】

インキュベート後、熱で複合体を抽出し、磁性分離を経て捕捉されたｍｉＲＮＡを含む上清を得た。これを凍結乾燥後、以後の操作に用いた。

【0036】

目的のｍｉＲＮＡを捕捉する工程のイメージを図１（上段部分）に示した。

【0037】

３．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析
Ｚｉｐ Ｔｉｐ Ｃ１８（ミリポア社）を用い、製品プロトコールに沿って、捕捉されたｍｉＲＮＡを精製した。これを、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ；ブルカーダルトニクス社）と、容積比１：１で混合し、ＭＴＰ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ３８４ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ（ブルカーダルトニクス社）上にアプライし、室温で風乾させた。

【0038】

ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ マススペクトロメーター（ブルカーダルトニクス社）を用い、ネガティブイオン・モード、レフレクション・モードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を行った。ソフトウエアＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ（ヴァージョン３．4．１３５．０）（ブルカーダルトニクス社）を用い、マニュアルでスペクトルデータを収集した。メチル化シトシンに関しては、ハイドラジン処理されたＲＮＡを用いてさらなる分析を行い、ピークがｍ５Ｃを含むことを確認した。メチル化アデニンに関しては、硫酸ジメチル処理されたＲＮＡを用いたシークエンシャルＭＳ解析により、ｍ６Ａであることを確認した。

【0039】

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析のイメージを図１（下段部分）に示した。

【0040】

一例として、ｍｉＲ−２００ｃについての測定結果を図２に示す。このように、単離されたｍｉＲＮＡについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ解析を行うと、メチル化された塩基は、メチル化されていない場合と比べ、マススペクトル上のピークが＋１４ｋＤａシフトすることが判った。同様の現象が、他のｍｉＲＮＡについても確認されている。このことを利用してメチル化の程度を測定することできることが判った。具体的には、標的塩基について、メチル化されていない塩基由来のピークに対する、メチル化されている塩基由来のピーク（これらは互いにマススペクトル上１４ｋＤａ離間している）の比率（以下「メチル化率」ということがある。）を算出することにより、単離されたｍｉＲＮＡ全体における、メチル化されているｍｉＲＮＡの割合を算出することができることが判った。

【0041】

網羅的に解析した結果、メチル化率が、正常部位に比べ、がん部位において有意に高くなっているｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−２００ｃ（配列番号１）、ｍｉＲ−２１（配列番号２）、Ｌｅｔ−７ａ（配列番号３）及びｍｉＲ−１７（配列番号４）が見出された。

【0042】

これら四種のｍｉＲＮＡについて、正常部位及びがん部位それぞれにおけるメチル化率（％）と、ｍｉＲＮＡ発現量（ｌｏｇ １０）とを測定した結果を図３に示す（^＊Ｐ＜０．０５）。ｍｉＲＮＡ発現量は、ｑＲＴ−ＰＣＲ法により求めた。

【0043】

ｑＲＴ−ＰＣＲ法は以下のようにして行った。ＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ及びＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙｓ（ともにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、製品プロトコールに沿って操作を行った。ＰＣＲマスターミックスとしてはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を用いた。

【0044】

使用プライマーを以下に示す。

【0045】

ＧＡＰＤＨ：
Forward 5′-agccacatcgctcagacac-3′（配列番号５）
Reverse 5′-gcccaatacgaccaaatcc-3′（配列番号６）
ＭＥＴＴＬ３：
Forward 5′- cgtactacaggatgatggctttc -3′（配列番号７）
Reverse 5′- tttcatctacccgttcataccc -3′（配列番号８）
ＤＮＭＴ１：
Forward 5′- caaacccctttccaaacctc -3′（配列番号９）
Reverse 5′- taatcctggggctaggtgaa -3′（配列番号１０）
ＤＮＭＴ２：
Forward 5′- gacattgttcagcccacttgta -3′（配列番号１１）
Reverse 5′- taacacagaccctgtcccttct -3′（配列番号１２）
ＤＮＭＴ３Ａ：
Forward 5′- accagcattttcctgtcttcat -3′（配列番号１３）
Reverse 5′- actgggaaaccaaatacccttt -3′（配列番号１４）
ＤＮＭＴ３Ｂ：
Forward 5′- gataaactcgagctgcaggact -3′（配列番号１５）
Reverse 5′- tcatgacaacagggaaaagttg -3′（配列番号１６）
ＮＳＵＮ２：
Forward 5′- aagaaaaggcagctctacatgg -3′（配列番号１７）
Reverse 5′- caccgctgttatttctacacca -3′（配列番号１８）
ＭＹＣ：
Forward 5′- gctgcttagacgctggattt -3′（配列番号１９）
Reverse 5′- taacgttgaggggcatcg -3′（配列番号２０）

【0046】

また、がん進行期と、メチル化率との間に正の相関があることも判った。一例として、直腸がんにおいて、ステージＩとＩＶにおけるメチル化率を、上記４種のｍｉＲＮＡにおいて測定した結果を図４に示す。ステージＩＶにおけるメチル化率のほうが、ステージＩにおけるよりも高くなっている傾向があることが判った。

【0047】

Ｂ．実施例２
実施例１と同様に、胃がんの組織検体におけるｍｉＲＮＡメチル化を定量化した。コントロールとして、同一患者から採取した健常組織を用いた。

【0048】

結果を図５に示す。正常部位に比べ、がん部位においてｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２１、Ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１７のメチル化の程度がいずれも有意に高くなっていることが判った。

【0049】

Ｃ．実施例３
膵がん患者から採取した血清検体を用いて、実施例１と同様の方法によりｍｉＲＮＡメチル化を定量化した。コントロールとして、健常者の血清検体を用いた。

【0050】

ｍｉＲ−１７について定量化した結果を図６に示す。ｍｉＲ−１７のメチル化は、膵がんの全ての血清検体において検出されたが、健常検体においては検出されないか、メチル化の程度が低かった。

【0051】

また、既存の膵がんマーカーであるＣＡ１９−９及びＣＥＡによる判定結果（図６）と比較して、ｍｉＲ−１７のメチル化の程度は、膵がんの検出という意味ではより正確な指標となりうることが判った（図７）。なお、図７は、横軸に偽陽性率（１−特異度）、縦軸に真陽性率（感度）をプロットした、いわゆるＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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