(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022010412
(43)【公開日】2022-01-14
(54)【発明の名称】抗老化剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/889 20060101AFI20220106BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20220106BHJP
A61K 8/9794 20170101ALI20220106BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20220106BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220106BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A61K36/889
A61P17/16
A61K8/9794
A61Q17/04
A61Q19/08
A23L33/105
【審査請求】有
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021188607
(22)【出願日】2021-11-19
(62)【分割の表示】P 2017046799の分割
【原出願日】2017-03-10
(71)【出願人】
【識別番号】591082421
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100108833
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 裕司
(74)【代理人】
【識別番号】100162156
【弁理士】
【氏名又は名称】村雨 圭介
(74)【代理人】
【識別番号】100201606
【弁理士】
【氏名又は名称】田岡 洋
(72)【発明者】
【氏名】橋井 洋子
(72)【発明者】
【氏名】岩橋 弘恭
【テーマコード（参考）】
4B018
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018MD52
4B018ME10
4B018MF01
4C083AA111
4C083CC02
4C083CC31
4C083DD21
4C083DD22
4C083DD23
4C083DD31
4C083DD41
4C083EE17
4C083EE29
4C083FF01
4C088AB83
4C088AC01
4C088AC04
4C088CA04
4C088MA16
4C088MA27
4C088MA34
4C088MA41
4C088MA43
4C088MA52
4C088MA63
4C088NA14
4C088ZA89
(57)【要約】
【課題】安全性の高い天然物の中から、優れた抗老化作用を有するものを見出し、それを有効成分とする抗老化剤を提供する。
【解決手段】本発明の抗老化剤の有効成分として、アサイーからの抽出物および／またはクプアスからの抽出物を含有させる。アサイーからの抽出物は、紫外線ダメージ抑制作用を有することが好ましく、クプアスからの抽出物は、ラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、ＴＧ－１産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用、ＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用、および角層タンパク質カルボニル化抑制作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用を有することが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の抗老化剤の有効成分として、アサイーからの抽出物および／またはクプアスからの抽出物を含有させる。アサイーからの抽出物は、紫外線ダメージ抑制作用を有することが好ましく、クプアスからの抽出物は、ラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、ＴＧ－１産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用、ＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用、および角層タンパク質カルボニル化抑制作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用を有することが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アサイーからの抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗老化剤。
【請求項2】
紫外線ダメージ抑制用途に用いられることを特徴とする請求項１に記載の抗老化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗老化剤に関するものであり、特に天然物に由来する成分を有効成分とする抗老化剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素やフリーラジカル（以下単に「ラジカル」ということがある。）が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、活性酸素としては、スーパーオキサイド（すなわち酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキサイドアニオン：・Ｏ２
－）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等が挙げられる。通常、生体内で生産される活性酸素は、細胞内に含まれている各種の抗酸化酵素の触媒作用により逐次消去されているが、活性酸素の産生が過剰である場合、または抗酸化酵素の作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分となり、スーパーオキサイド濃度が高くなる。過剰なスーパーオキサイドは、他の活性酸素種やフリーラジカルが生成する原因となる。
【0003】
また、フリーラジカルは、活性酸素以外にも、大気汚染物質、放射線、紫外線、たばこ等の環境因子に晒されることで生成する。これらの活性酸素やフリーラジカルが過剰に生成すると、生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、その結果、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、各種動脈硬化症（虚血性心疾患，心筋梗塞，脳虚血，脳梗塞等）、神経変性疾患（アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病等）、癌、喫煙等が原因の肺疾患、白内障、糖尿病、しわ、肩凝り、冷え性等の様々な疾患を誘発する。
【0004】
特に、皮膚は、紫外線等の環境因子の刺激を直接受けることから、活性酸素やフリーラジカルが生成しやすい器官であるため、これらの化学種の濃度が上昇することにより、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解し、変性し又は架橋したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素やフリーラジカル等の酸化ストレスによって引き起こされる障害が、皮膚のしわ形成や皮膚の弾力低下等の老化の原因になるものと考えられている（非特許文献１参照）。したがって、生体内ラジカルの生成を阻害・抑制することにより、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、活性酸素やフリーラジカル等による酸化ストレスが原因となって誘発される上記の疾患群を予防、治療又は改善できるものと考えられる。ラジカル消去作用を有するものとして、スターフルーツの果実からの抽出物（特許文献１参照）等が知られている。
【0005】
皮膚の表皮および真皮は、表皮細胞、線維芽細胞ならびにこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスにより構成されている。また、皮膚を構成する表皮と真皮との境界部には、基底膜が存在する。基底膜は、表皮と真皮とを繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献２参照）。基底膜の主要骨格は、ＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。基底膜と表皮との境界に存在し、基底膜と表皮とを繋ぎとめているのがラミニン５を主成分とする各種糖蛋白質で、かかるラミニン５は、表皮に存在する表皮角化細胞より産生される。若い皮膚においては表皮細胞、線維芽細胞、基底膜、細胞外マトリックス成分等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【0006】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるＩ型コラーゲンや、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ラミニン５等の産生量が減少するとともに、分解や変質を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が生じるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。そのため、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン５等の産生を促進することは、皮膚の老化を予防、治療または改善する上で重要である。
【0007】
また、コラーゲンは、骨、腱、靱帯等にも多く存在し、加齢等によるコラーゲン産生の低下が、骨粗鬆症等の原因になることが知られている。さらに、創傷の治癒過程において、コラーゲンの産生量が亢進し、線維芽細胞等の足場となることで、創傷の治癒を促進することが知られている。そのため、コラーゲンの産生を促進することは、骨粗鬆症等の予防又は治療、創傷治癒の促進といった観点からも重要である。コラーゲン産生促進作用を有するものとしては、例えば、クスノハガシワからの抽出物（特許文献２）等が知られている。
【0008】
ラミニンは、α鎖、β鎖及びγ鎖の種々の組み合わせからなり、現在のところ１５種類（ラミニン１～ラミニン１５）が知られている。このうちラミニン５（α３β３γ２）は、皮膚、消化器、腎臓、肺等の上皮組織の基底膜に多量に存在する。ラミニン５の各鎖をコードする遺伝子の先天的な異常に起因する遺伝子疾患（致死型先天性表皮水疱症，Herlitz junctional epidermolysis bullosa）においては、全身の表皮が剥離する致死性の症状を示すことが知られている。そして、ラミニン５は、他の細胞外マトリックス分子と比べ、強度に細胞を接着させ（細胞接着活性が高く）、細胞運動を強く促進する（細胞運動活性が高い）こと、そのため損傷皮膚中の細胞移動を促進し、損傷治癒を促すことが知られている（特許文献３参照）。すなわち、ラミニン５の産生を促進することは、基底膜の構造が破壊されるような皮膚損傷の治癒を促す上で重要である。
【0009】
表皮は、外部刺激を緩和し、水分等の体内成分の逸失を制御する働きをしており、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造から構成されている。各層に存在する大部分の細胞は、基底層から分化した角化細胞である。基底層で分裂、増殖した角化細胞は、有棘層、顆粒層を通過しながら分化し角質細胞となって、強固な架橋結合をもったケラチン蛋白線維で構成された角質層を構成し、最終的には垢として角質層から脱落する。
【0010】
角質層は皮膚の最外殻に存在しており、外界からの刺激に対する物理的なバリアとしての役割を果たしている。皮膚ではこのバリア機能を持たせるため、角化細胞が基底層で産生されてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層も加齢によって新陳代謝機能が衰え、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚トラブルを発生することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、肌の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着等の皮膚の老化を改善できるものと考えられる。従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、土貝母抽出物（特許文献４参照）等が知られている。
【0011】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンは、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、異物代謝、各種酵素のＳＨ供与体としての機能を果たすものであり、活性酸素等に対する抗酸化成分としても知られている。その作用発現は、システイン残基に由来すると考えられている。しかしながら、過剰な酸化ストレスや異物の付加、加齢などにより、細胞内のグルタチオン量が欠乏又は低下することが報告されており、このことが細胞の酸化ストレスに対する防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質等の構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
【0012】
このような、細胞内のグルタチオン量の低下又は欠乏が病態と関連することが知られている疾患として、酸化ストレスが原因となって誘発される前述した疾患群のほか、肝障害（アルコールの多飲、又は重金属や化学物質等の異物の摂取が原因となる）等が知られている。すなわち、グルタチオンの産生を促進することは、細胞の酸化ストレスに対する防御能を高め、細胞内のグルタチオン量が低下又は欠乏することに起因する上記の疾患群を予防・治療することができると考えられる。グルタチオン産生促進作用を有するものとして、リクイリチゲニン（特許文献５参照）等が知られている。
【0013】
表皮を構成する基底層、有棘層、顆粒層、および角質層のうち、特に、顆粒層においては、細胞膜が肥厚して肥厚細胞膜を形成するとともに、トランスグルタミナーゼ－１の作用により、蛋白分子間がグルタミル－リジン架橋され、強靭なケラチン蛋白線維が形成される。さらに、その一部にセラミド等が共有結合し、疎水的な構造をとることで、細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し、角質バリア機能の基礎が形成される。
【0014】
しかし、加齢とともに表皮におけるトランスグルタミナーゼ－１の産生量が減少すると、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下するため、肌荒れ、乾燥肌等の皮膚の老化症状を呈したり、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）を発症したりするようになる。そのため、表皮におけるトランスグルタミナーゼ－１の産生を促進することにより、皮膚の老化症状や乾燥性皮膚疾患等を予防、治療又は改善することができると考えられる。トランスグルタミナーゼ－１産生促進作用を有するものとして、湖南甜茶からの抽出物（特許文献６参照）等が知られている。
【0015】
フィラグリンは、皮膚の構成成分であり、皮膚におけるバリア機能に関与し、アレルゲン、毒素、感染性生物の侵入を防ぐ機能を有していると考えられている。フィラグリンの遺伝子の変異等による機能の低下は、アトピー性皮膚炎（湿疹、皮膚の炎症、皮膚のかゆみ等）、アレルギー、喘息等を包含するアトピー性疾患の発症リスクと関連し、さらに重篤な場合は尋常性魚鱗癬等の皮膚疾患につながることが知られている（非特許文献３参照）。
【0016】
一方、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献４参照）。近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、および乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献５参照）。
【0017】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの発現を促進することにより、アトピー性皮膚炎（湿疹、皮膚の炎症、皮膚のかゆみ等）、アレルギー、喘息等を包含するアトピー性疾患を予防・治療または改善できると考えられる。また、プロフィラグリンの発現を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
【0018】
従来、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するものとして、ガイヨウ抽出物（特許文献７参照）等が知られている。
【0019】
皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０～ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。
【0020】
しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持機能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献６参照）。ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、スターフルーツの葉部からの抽出物（特許文献８参照）等が知られている。
【0021】
従来は、皮膚のバリア機能は角質層のみが担っていると考えられていたが、近年、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション（以下「ＴＪ」と表記することがある。）の構成タンパク質を遺伝子レベルで欠損させると皮膚のバリア機能が崩壊することが見いだされ、ＴＪも皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられるようになっている（非特許文献７参照）。ＴＪは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞との隙間をシールすることで物質の透過を制御する細胞間接着構造である。ＴＪを構成しているのは、細胞膜タンパク質であるクローディン等であり、これらのタンパク質はＴＪストランドの骨格を構成し、ＴＪのバリア機能を制御すると考えられている（非特許文献８参照）。ここで、クローディンの発現が何らかの原因で減少した場合、ＴＪの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状の一因になると考えられる。
【0022】
そのため、表皮においてクローディンの産生を促進することにより表皮角化細胞のＴＪ形成を促すことで、皮膚のバリア機能および水分保持機能を高め、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状を予防または改善することができると考えられる。クローディン産生促進作用を有するものとして、アスパラサスリネアリス抽出物（特許文献９）等が知られている。
【0023】
ＳＩＲＴ１は、サーチュインと呼ばれるファミリーに包含されるタンパク質であり、細胞核内および細胞質に存在し、ＮＡＤ依存性タンパク質脱アセチル化酵素として機能することが知られている。近年、このＳＩＲＴ１が、細胞老化を抑制するという面で重要な役割を演じており、特に皮膚組織において発現し皮膚老化の抑制に関与していることが明らかになっている（非特許文献９参照）。また、ＳＩＲＴ１は、細胞老化のほか、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、炎症性サイトカイン産生の抑制作用、神経保護作用等、様々な機能を有することが明らかになっている。そのため、ＳＩＲＴ１を活性化することができれば、皮膚老化等の老化、糖尿病、心血管疾患、神経系疾患、炎症性疾患などの各種疾患の予防・治療または改善に有用であると考えられている。
【0024】
皮膚が伸縮する性質（弾性）には、真皮に存在する弾性線維が必須である。この弾性線維は、細胞外線維であるミクロフィブリルに沿ってエラスチンタンパク質が沈着し架橋することによって形成されるが、この架橋反応において重要な役割をはたしているのがリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）である。ＬＯＸは、ペプチド鎖中のリシン残基が有するアミノ基またはヒドロキシリシン残基が有する水酸基を、反応性の高いアルデヒド基に変換する酵素であり、かかるアルデヒド基が架橋反応に寄与する。
【0025】
また、コラーゲンは、３本のポリペプチドが会合してらせん構造を有するコラーゲン分子（トロポコラーゲン）を形成し、これが細胞外で自己会合してコラーゲン原線維、さらにはコラーゲン線維（膠原線維）を形成する。コラーゲン線維の強度には、コラーゲンの分子内または分子外の架橋構造が寄与しているが、かかる架橋構造の形成にもＬＯＸが関与している。
【0026】
そのため、かかるＬＯＸの発現量を高めることは、しっかりとした弾性線維の形成を導くとともに、膠原線維の強度を高め、皮膚における張りの消失やシワの形成といった皮膚の老化の予防、治療または改善につながるものと考えられる。
【0027】
近年、皮膚の加齢に伴う老化や光老化との関係で、角層カルボニル化タンパク質の研究が盛んに行われている。カルボニル化タンパク質としては、一般に、タンパク質におけるＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏといったアミノ酸残基のＮＨ２基が直接酸化されてカルボニル基となった結果生成されるものと、脂質が酸化して過酸化脂質、さらには分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それがタンパク質と結合することで生成されるものとがある（特許文献１０参照）。皮膚においては、タンパク質が直接的に酸化される場合、また皮膚表面の皮脂がフリーラジカルによって酸化し、過酸化脂質が生成されることでタンパク質の酸化は開始される場合があると考えられる。いったん過酸化脂質が生成されると、酸化は連鎖的に進行し、肌表面に刺激を与えるだけにとどまらず、角質層の奥まで入り込んで細胞にダメージを与える。
【0028】
また、皮膚の最表層である角層は角質細胞からなり、その８５％がタンパク質であるケラチンから構成されている。近年、このケラチンが、日常的に皮膚が受ける酸化的ストレス（紫外線、タバコの煙）等によってカルボニル化されることが知られている（非特許文献１０参照）。通常、ケラチンは水分子を多く取り込んでいるが、カルボニル化されることによって水分子を排除してしまい、カルボニル化された後のケラチンは水分子を取り込むことができなくなり、さらに、このことが皮膚を乾燥させ、皮膚の外観を損なうことが知られている（特許文献１１参照）。
【0029】
このように角層中のカルボニル化タンパク質が増加することによって、肌の保水性が失われるとともに（特許文献１２参照）、肌の柔軟性・弾力性が失われてしまうことが知られている（特許文献１３参照）。したがって、表皮の角層タンパク質のカルボニル化を予防したり、そのカルボニル化度を低減させたりすることにより、角質細胞の保水性の向上や、肌の柔軟性・弾力性の向上に有用であると考えられる。
【0030】
皮膚に紫外線が照射されると、皮膚の細胞は障害を受けたり、細胞死が引き起こされたりし、肌は張りや弾力を失い、肌荒れ、シワ等の老化症状を呈する、いわゆる光老化と呼ばれる状態となる。したがって、紫外線の照射によるダメージ（例えば、細胞障害、細胞死等のほか、これらをもたらす遺伝子の発現変動等が挙げられる）を抑制・回復することによって、皮膚の老化の予防又は改善が期待できる。紫外線照射によるダメージ回復作用を有する植物抽出物としては、油溶性甘草抽出物（特許文献１４参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0031】
【特許文献1】特開２００３－３００８９３号公報
【特許文献2】特開２００３－１４６８３７号公報
【特許文献3】特開２００６－０６３０３３号公報
【特許文献4】特開２００６－０５６８５４号公報
【特許文献5】特開２００９－２６９８８９号公報
【特許文献6】特開２００７－０９９６９８号公報
【特許文献7】特開２０１２－２１９０４７号公報
【特許文献8】特開２００９－１９１０３９号公報
【特許文献9】特開２００９－２５６２４４号公報
【特許文献10】特開２００４－３４０９３５号公報
【特許文献11】特開２００４－１０７２６９号公報
【特許文献12】特開２００５－２４９６７２号公報
【特許文献13】特開２００６－３４９３７２号公報
【特許文献14】特開２００４－２５０３６８号公報
【非特許文献】
【0032】
【非特許文献1】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，1995年，No.14，p.156
【非特許文献2】J. Cell. Biol.，1992年，Vol.119，No.3，p.695‐703
【非特許文献3】"Nat Genet."，２００６年，Vol.38，No.4，p.441-446
【非特許文献4】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，２０００年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献5】"Arch. Dermatol. Res."，１９９６年，Vol.288，p.442-446
【非特許文献6】「フレグランスジャーナル」，2006年，Vol.34，No.10，p.19-23
【非特許文献7】J. Cell Biol.，2002年，vol.156，pp.1099-1111
【非特許文献8】日本香粧品科学会誌，2007年，vol.31，pp.296-301
【非特許文献9】Cosmetics & Toiletries，2008年，Vol.123，No.1，p.69-72
【非特許文献10】Jens J. Thiele et al., THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, Vol.113, No.3, 1999年, p.335, 339
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0033】
本発明は、安全性の高い天然物の中から、優れた抗老化作用を有するものを見出し、それを有効成分とする抗老化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0034】
上記課題を解決するために、本発明の抗老化剤は、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【0035】
前記クプアスからの抽出物は、ラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ－１産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、アクアポリン３ ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、サーチュイン１ ｍＲＮＡ発現促進作用、リシルオキシダーゼｍＲＮＡ発現促進作用、および角層タンパク質カルボニル化抑制作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用を有することが好ましく、前記アサイーからの抽出物は、紫外線ダメージ抑制作用を有することが好ましい。
【発明の効果】
【0036】
本発明によれば、天然物に由来するクプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物を有効成分とさせることにより、作用効果に優れ、かつ安全性の高い抗老化剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態の抗老化剤は、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物を有効成分とするものである。
本実施形態の抗老化剤は、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物を有効成分とするものである。
【0038】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、上記植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【0039】
本実施形態において使用する抽出原料は、クプアス（学名：Theobroma grandiflorum）およびアサイー（学名：Euterpe oleracea，Euterpe precatoria）である。
【0040】
クプアス（Theobroma grandiflorum）は、アオイ科カカオ属に属する常緑低木であって、南米アマゾン地域に自生しているほか、これらの地域においてアグロフォレストリーにより栽培されており、容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るクプアスの構成部位としては、例えば、果実部、花部、葉部、幹部、樹皮部、根部またはこれらの混合物が挙げられるが、好ましくは果実部である。
【0041】
アサイー（Euterpe oleracea，Euterpe precatoria，別名：ワカバキャベツヤシ）は、ヤシ科エウテルペ属に属する常緑高木であって、南米アマゾン地域に自生しているほか、これらの地域においてアグロフォレストリーにより栽培されており、容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るアサイーの構成部位としては、例えば、果実部、葉部、幹部、樹皮部、根部またはこれらの混合物が挙げられるが、好ましくは果実部である。
【0042】
上記クプアスおよびアサイーからの抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、上記抽出原料の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【0043】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【0044】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【0045】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２～５の多価アルコール等が挙げられる。
【0046】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を抽出溶媒として使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比が９：１～１：９（容量比）であることが好ましく、７：３～２：８（容量比）であることがさらに好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比が９：１～２：８（容量比）であることが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水と多価アルコールとの混合比が８：２～１：９（容量比）であることが好ましい。
【0047】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５～１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【0048】
以上のようにして得られるクプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物は、優れた抗老化作用を有しているため、抗老化剤の有効成分として用いることができる。本実施形態の抗老化剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等、飲食品の幅広い用途に使用することができる。
【0049】
ここで、クプアスからの抽出物が有する抗老化作用は、例えば、ラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧ－１）産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、アクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）ｍＲＮＡ発現促進作用、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）ｍＲＮＡ発現促進作用、および角層タンパク質カルボニル化抑制作用からなる群より選択される１または２以上の作用に基づいて発揮される。ただし、クプアスからの抽出物が有する抗老化作用は、上記作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。
【0050】
また、クプアスからの抽出物は、そのラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、ＴＧ－１産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用、ＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用、または角層タンパク質カルボニル化抑制作用を利用して、それぞれラジカル消去剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン５産生促進剤、表皮角化細胞増殖促進剤、グルタチオン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧ－１）産生促進剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進剤、クローディン－１産生促進剤、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）ｍＲＮＡ発現促進剤、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）ｍＲＮＡ発現促進剤、または角層タンパク質カルボニル化抑制剤の有効成分として使用してもよい。
【0051】
なお、本明細書において「ラジカル」とは、不対電子を１つ又はそれ以上有する分子又は原子を意味し、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、ＤＰＰＨ等が含まれる。
【0052】
アサイーからの抽出物が有する抗老化作用は、例えば、紫外線ダメージ抑制作用に基づいて発揮され、中でも紫外線（ＵＶＡ）照射による遺伝子発現変動の抑制作用、特にＭＭＰ－１（Matrix Metalloprotease-1）遺伝子および／またはＩＬ－１α（Interleukin-1α）遺伝子のＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現上昇の抑制作用、またはＣＯＬ１Ａ１（Collagen，TypeＩ，α1）遺伝子のＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現低下の抑制作用に基づいて発揮される。ただし、アサイーからの抽出物が有する抗老化作用は、上記作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。また、アサイーからの抽出物は、その紫外線ダメージ抑制作用を利用して、紫外線ダメージ抑制剤の有効成分として使用してもよい。
【0053】
本実施形態の抗老化剤は、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物のみからなるものでもよいし、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物を製剤化したものでもよい。
【0054】
本実施形態の抗老化剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。抗老化剤は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【0055】
本実施形態の抗老化剤を製剤化した場合、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【0056】
なお、本実施形態の抗老化剤は、必要に応じて、抗老化作用を有する他の天然抽出物等を、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【0057】
本実施形態の抗老化剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本実施形態の抗老化剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【0058】
本実施形態の抗老化剤は、有効成分であるクプアスからの抽出物またはアサイーからの抽出物が有するラジカル消去作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン５産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、グルタチオン産生促進作用、ＴＧ－１産生促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用、クローディン－１産生促進作用、ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用、ＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用、角層タンパク質カルボニル化抑制作用、または紫外線ダメージ抑制作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化を予防、治療または改善できる。ただし、本実施形態の抗老化剤は、これらの用途以外にも上記作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【0059】
例えば、本実施形態の抗老化剤または前述したラジカル消去剤は、クプアスからの抽出物が有するラジカル消去作用を通じて、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、各種動脈硬化症（虚血性心疾患，心筋梗塞，脳虚血，脳梗塞等）、神経変性疾患（アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病等）、癌、喫煙等が原因の肺疾患、白内障、糖尿病、肩凝り、冷え性等の活性酸素やフリーラジカルが関与する各種疾患；などを予防、治療または改善することができる。
【0060】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＩ型コラーゲン産生促進剤もしくはＩＶ型コラーゲン産生促進剤は、クプアスからの抽出物が有するＩ型コラーゲン産生促進作用またはＩＶ型コラーゲン産生促進作用を通じて、骨粗鬆症等のコラーゲン産生の低下に起因する疾患の予防、治療又は改善；損傷した腱や靱帯の再生促進；創傷又は熱傷の治癒の促進；等の用途に用いることができる。
【0061】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したラミニン５産生促進剤はクプアスからの抽出物が有するラミニン５産生促進作用を通じて、基底膜構造の再構築を誘導し、皮膚における創傷を治療・改善することができる。また、本実施形態の抗老化剤または前述したラミニン５産生促進剤は、ラミニン５の欠乏（欠損）に起因する疾患（表皮水疱症等）の予防又は治療剤として用いることができる。
【0062】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述した表皮角化細胞増殖促進剤は、クプアスからの抽出物が有する表皮角化細胞増殖促進作用を通じて、肌の新陳代謝を回復させ、こじわ、くすみ、色素沈着等の予防、治療または改善；再生医療；などの用途に使用することができる。
【0063】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したグルタチオン産生促進剤は、クプアスからの抽出物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、肝障害（アルコールの多飲，または重金属や化学物質等の異物の摂取が原因となる）等の細胞内グルタチオン量の低下又は欠乏が病態と関連することが知られている疾患などを予防、治療または改善することができる。
【0064】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＴＧ－１産生促進剤もしくはプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、クプアスからの抽出物が有するＴＧ－１産生促進作用またはプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、皮膚のバリア機能を強化し、肌荒れ、乾燥肌等のほか、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）を予防、治療または改善することができる。また、本実施形態の抗老化剤または前述したプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤もしくはＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進剤は、そのプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用またはＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、加齢による水分保持能やバリア機能等を改善することができる。
【0065】
前述した用途のほか、本実施形態の抗老化剤または前述したクローディン－１産生促進剤は、クプアスからの抽出物が有するクローディン－１産生促進作用を通じて、表皮角化細胞におけるタイトジャンクションの形成を促すことができ、これにより、皮膚のバリア機能および水分保持機能を高め、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状を予防または改善することができる。
【0066】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進剤は、クプアスからの抽出物が有するＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、糖尿病、心血管疾患、神経系疾患、炎症性疾患などの各種疾患を予防・治療または改善することができるとともに、細胞の寿命を延長することができる。
【0067】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進剤は、クプアスからの抽出物が有するＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、皮膚において弾性線維および膠原線維の適切な架橋構造を形成し、しっかりとした弾性線維の形成を導くとともに膠原繊維の強度を高め、これにより、張り消失やシワ形成を予防、治療または改善することができる。
【0068】
前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述した角質タンパク質カルボニル化抑制剤は、クプアスからの抽出物が有する角層タンパク質カルボニル化抑制作用を通じて、角層タンパク質のカルボニル化を抑制することができ、これにより、肌のくすみを抑制して美肌効果を得ることができる。
【0069】
本実施形態の抗老化剤または前述した紫外線ダメージ抑制剤は、アサイーからの抽出物が有する紫外線ダメージ抑制作用、より具体的には、ＵＶＡ照射による遺伝子発現変動の抑制作用、特にＭＭＰ－１遺伝子および／またはＩＬ－１α遺伝子のＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現上昇の抑制作用、またはＣＯＬ１Ａ１遺伝子のＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現低下の抑制作用を通じて、紫外線照射により細胞が受けるダメージを抑制し、これにより、皮膚の光老化を効果的に予防、治療または改善することができる。
【0070】
また、本実施形態の抗老化剤は、優れた抗老化作用を有するため、例えば、皮膚外用剤や飲食品に配合するのに好適である。この場合に、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物をそのまま配合してもよいし、クプアスからの抽出物および／またはアサイーからの抽出物から製剤化した抗老化剤を配合してもよい。
【0071】
ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、美容液、ローション、ジェル、美容オイル、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、シャンプー、リンス、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【0072】
飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品等の区分に制限されるものではない。したがって、本実施形態における「飲食品」は、経口的に摂取される一般食品、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品）、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【0073】
また、本実施形態の抗老化剤は、優れた抗老化作用を有するので、これらの作用機構に関する研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【0074】
なお、本実施形態の抗老化剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例0075】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、本試験例においては、被験試料としてクプアス果実抽出物（丸善製薬社製，試料１）およびアサイー果実抽出物（丸善製薬社製，試料２）を使用した。
【0076】
〔試験例１〕ラジカル消去作用試験（ＤＰＰＨ法）
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてラジカル消去作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてラジカル消去作用を試験した。
【0077】
１５０μｍｏｌ／Ｌ ＤＰＰＨ（diphenyl-p-picrylhydrazyl）エタノール溶液３ｍＬに被験試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）３ｍＬを加え密栓した後、振り混ぜて３０分間放置した。放置後、波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクとして、エタノールに被験試料溶液を３ｍＬ加えた後、直ちに波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、コントロールとして、被験試料溶液に代えて試料の溶解に使用した溶媒のみを加えて同様の操作を行い、波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式によりラジカル消去率（％）を算出した。
【0078】
ラジカル消去率（％）＝｛Ａ－（Ｂ－Ｃ）｝／Ａ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加での波長５２０ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料添加での波長５２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験試料添加直後（ブランク）の波長５２０ｎｍにおける吸光度
結果を表１に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加での波長５２０ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料添加での波長５２０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験試料添加直後（ブランク）の波長５２０ｎｍにおける吸光度
結果を表１に示す。
【0079】
【表1】
【0080】
表１に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたラジカル消去作用を有していると認められた。
【0081】
〔試験例２〕Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＩ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＩ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
【0082】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【0083】
培養終了後、培地を除去し、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、各ウェルの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。測定結果から、下記式によりＩ型コラーゲン産生促進率（％）を算出した。
【0084】
Ｉ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのＩ型コラーゲン量
Ｂ：試料無添加でのＩ型コラーゲン量
結果を表２に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのＩ型コラーゲン量
Ｂ：試料無添加でのＩ型コラーゲン量
結果を表２に示す。
【0085】
【表2】
【0086】
表２に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を有することが確認された。
【0087】
〔試験例３〕ＩＶ型コラーゲン産生促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
【0088】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【0089】
培養終了後、培地を除去し、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、３日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、各ウェルの培地中のＩＶ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。測定結果から、下記式によりＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）を算出した。
【0090】
ＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのＩＶ型コラーゲン量
Ｂ：試料無添加でのＩＶ型コラーゲン量
結果を表３に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのＩＶ型コラーゲン量
Ｂ：試料無添加でのＩＶ型コラーゲン量
結果を表３に示す。
【0091】
【表3】
【0092】
表３に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが確認された。
【0093】
〔試験例４〕ラミニン５産生促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてラミニン５産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてラミニン５産生促進作用を試験した。
【0094】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、８０ｃｍ２フラスコにて正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０5 cell/ｍＬの細胞密度となるようにＫＧＭからＢＰＥを除いた培地（ＫＧＭ－ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μＬずつ播種し、一日間培養した。
【0095】
培養終了後、培地を除去し、ＫＧＭ－ＢＰＥ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに５００μＬずつ添加し、４８時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ－ＢＰＥ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、上清１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し換え、３７℃で２時間プレートに吸着させた後、吸着させたラミニン５の量をＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定結果から、下記式によりラミニン５産生促進率（％）を算出した。
【0096】
ラミニン５産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのラミニン５量
Ｂ：試料無添加でのラミニン５量
結果を表４に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのラミニン５量
Ｂ：試料無添加でのラミニン５量
結果を表４に示す。
【0097】
【表4】
【0098】
表４に示すように、クプアス抽出物（試料１）は優れたラミニン５産生促進作用を有することが確認された。
【0099】
〔試験例５〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【0100】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理にて細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０4 cells/ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表５を参照）を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。
【0101】
表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。すなわち、３日間培養後、培地を除去し、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（－）緩衝液に溶解したＭＴＴを各ウェル１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２－プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。得られた結果から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【0102】
表皮角化細胞増殖促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：試料無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表５に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：試料無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表５に示す。
【0103】
【表5】
【0104】
表５に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【0105】
〔試験例６〕グルタチオン産生促進作用試験（線維芽細胞）
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【0106】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【0107】
培養後、１％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表６を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、被験試料無添加の１％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、各ウェルから培地を除去し、４００μＬのＰＢＳ（－）緩衝液にて洗浄した後、１５０μＬのＭ－ＰＥＲ（PIERCE社製）を使用して細胞を溶解した。
【0108】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに、溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１mol/Ｌリン酸緩衝液５０μＬ、２mmol/Ｌ ＮＡＤＰＨ２５μＬ、およびグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５unit/ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０mmol/Ｌ 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式によりグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【0109】
グルタチオン産生促進率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表６に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表６に示す。
【0110】
【表6】
【0111】
表６に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、線維芽細胞において優れたグルタチオン産生促進作用を有していると認められた。
【0112】
〔試験例７〕グルタチオン産生促進作用試験（表皮角化細胞）
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【0113】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理にて細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、コラーゲンコートした２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【0114】
培養終了後、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表７を参照）を各ウェルに４００μＬ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、各ウェルから培地を除去し、１ｍＬのＰＢＳ（－）緩衝液にて洗浄した後、１５０μＬのＭ－ＰＥＲ（PIERCE社製）を使用して細胞を溶解した。
【0115】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに、溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１mol/Ｌリン酸緩衝液５０μＬ、２mmol/Ｌ ＮＡＤＰＨ２５μＬ、およびグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５unit/ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０mmol/Ｌ 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式によりグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【0116】
グルタチオン産生促進率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表７に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表７に示す。
【0117】
【表7】
【0118】
表７に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたグルタチオン産生促進作用を有していると認められた。
【0119】
〔試験例８〕トランスグルタミナーゼ－１産生促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてトランスグルタミナーゼ－１産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてトランスグルタミナーゼ－１産生促進作用を試験した。
【0120】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、２日間培養した。
【0121】
培養終了後、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表８を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、培地を除去し、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ－１の量を、モノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ－１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定結果から、下記式によりトランスグルタミナーゼ－１産生促進率（％）を算出した。
【0122】
トランスグルタミナーゼ－１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのトランスグルタミナーゼ－１量
Ｂ：試料無添加でのトランスグルタミナーゼ－１量
結果を表８に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのトランスグルタミナーゼ－１量
Ｂ：試料無添加でのトランスグルタミナーゼ－１量
結果を表８に示す。
【0123】
【表8】
【0124】
表８に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたトランスグルタミナーゼ－１産生促進作用を有していると認められた。
【0125】
〔試験例９〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【0126】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２０×１０4 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２ｍＬずつ播種し（４０×１０4 cells/シャーレ）、２４時間培養した。
【0127】
培養後に培地を除去し、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表９を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ II（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-07361）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ng/μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0128】
この総ＲＮＡを鋳型とし、プロフィラグリンおよび内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２ Step ＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プロフィラグリンｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【0129】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表９に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表９に示す。
【0130】
【表9】
【0131】
表９に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有していた。
【0132】
〔試験例１０〕アクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【0133】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２０×１０4 cells/ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２ｍＬずつ播種し（４０×１０4 cells/シャーレ）、２４時間培養した。
【0134】
培養後に培地を除去し、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１０を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ II（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-07361）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ng/μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0135】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２ Step ＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。ＡＱＰ３ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【0136】
ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１０に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１０に示す。
【0137】
【表10】
【0138】
表１０に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【0139】
〔試験例１１〕クローディン－１産生促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてクローディン－１産生促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてクローディン－１産生促進作用を試験した。
【0140】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【0141】
培養終了後、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１１を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、培地を除去し、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したクローディン－１の量を、ポリクローナル抗ヒトクローディン－１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。得られた測定結果から、下記式によりクローディン－１産生促進率（％）を算出した。
【0142】
クローディン－１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのクローディン－１量
Ｂ：試料無添加でのクローディン－１量
結果を表１１に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのクローディン－１量
Ｂ：試料無添加でのクローディン－１量
結果を表１１に示す。
【0143】
【表11】
【0144】
表１１に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたクローディン－１産生促進作用を有していると認められた。
【0145】
〔試験例１２〕サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【0146】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、６０ｍｍシャーレに５ｍＬずつ播種し（１０×１０5 cells/シャーレ）、一晩培養した。培養終了後、培地を除去し、５ｍＬのＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。
【0147】
培養終了後、培地を除去し、ＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１２を参照）を各シャーレに５ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ II（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-07361）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ng/μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0148】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＳＩＲＴ１および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２ Step ＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【0149】
ＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１２に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１２に示す。
【0150】
【表12】
【0151】
表１２に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたＳＩＲＴ１ ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【0152】
〔試験例１３〕リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにしてＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【0153】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、６０ｍｍシャーレに５ｍＬずつ播種し（１０×１０5 cells/シャーレ）、一晩培養した。培養終了後、培地を除去し、５ｍＬのＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。
【0154】
培養終了後、培地を除去し、ＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１３を参照）を各シャーレに５ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＦＢＳ不含有α－ＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ II（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-07361）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ng/μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0155】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＬＯＸおよび内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２ Step ＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。ＬＯＸ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
【0156】
ＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１３に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表１３に示す。
【0157】
【表13】
【0158】
表１３に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、優れたＬＯＸ ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【0159】
〔試験例１４〕排気ガスによる角層タンパク質カルボニル化の抑制作用試験
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、排気ガスによる角層タンパク質カルボニル化の抑制作用を試験した。
クプアス抽出物（試料１）について、以下のようにして、排気ガスによる角層タンパク質カルボニル化の抑制作用を試験した。
【0160】
非露光部である上腕内側部の角層を、角質チェッカー（アサヒバイオメッド社製）を用いてテープストリッピング法により剥離・回収した。角層が付着した角質チェッカー（サンプル）を、被験試料（試料１，試料濃度は下記表１４を参照）の水溶液１ｍＬに浸漬し、３７℃で、１６時間処理した。なお、コントロールとして、試料無添加の水を用いて同様に処理した。処理後、サンプルを取り出して風乾させた。次いで、チャック付きのビニール袋に採取したガソリンエンジンの排気ガスに曝露させ、室温にて２４時間反応させた。なお、ブランクとして、室内空気に曝露させたサンプルも用意した。得られたサンプルについて、角層カルボニル化のレベルを以下の方法で評価した。
【0161】
０．１mol/Ｌ ＭＥＳ（2-morpholinoethane sulfonic acid-Na）緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍＬにてサンプルを２回洗浄し、次いで、２０μmol/Ｌ蛍光ヒドラジド（fluorescein-5-thiosemicarbazide，AnaSpec社製）を含有する０．１mol/Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）にサンプルを浸漬し、室温・遮光条件下で１時間反応させ、角層タンパク質のカルボニル基をラベル化した。反応終了後、ＰＢＳ（－）緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７１，オリンパス社製）にて画像撮影した。得られた画像を画像解析ソフト（ImageJ，National Institute of Health製）を用いて解析し、角層面積あたりの蛍光輝度をカルボニル化レベルとした。得られた結果から、下記式により角層タンパク質カルボニル化抑制率（％）を算出した。
【0162】
角層タンパク質カルボニル化抑制率(％)＝{１－(Ａ－Ｃ)／(Ｂ－Ｃ)}×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：排気ガス処理・被験試料添加でのカルボニル化レベル
Ｂ：排気ガス処理・試料無添加（コントロール）でのカルボニル化レベル
Ｃ：排気ガス非処理・試料無添加（ブランク）でのカルボニル化レベル
結果を表１４に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：排気ガス処理・被験試料添加でのカルボニル化レベル
Ｂ：排気ガス処理・試料無添加（コントロール）でのカルボニル化レベル
Ｃ：排気ガス非処理・試料無添加（ブランク）でのカルボニル化レベル
結果を表１４に示す。
【0163】
【表14】
【0164】
表１４に示すように、クプアス抽出物（試料１）は、排気ガスによる角層のカルボニル化を効果的に抑制した。
【0165】
〔試験例１５〕紫外線照射による遺伝子発現変動の抑制作用試験
アサイー抽出物（試料２）について、以下のようにして、紫外線（ＵＶＡ）による遺伝子発現変動の抑制作用を試験した。
アサイー抽出物（試料２）について、以下のようにして、紫外線（ＵＶＡ）による遺伝子発現変動の抑制作用を試験した。
【0166】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０5 cells/ｍＬの細胞密度になるように２％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で希釈した後、１２ウェルプレートに１．０ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【0167】
培養終了後、培地を除去し、ＦＢＳ不含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料２，試料濃度は下記表１５を参照）を各ウェルに１．０ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＦＢＳ不含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去して１．０ｍＬのＨＢＳＳ（＋）溶液に交換し、１０J/cm2の紫外線（ＵＶＡ）を照射した。
【0168】
ＵＶＡの照射後、直ちにＨＢＳＳ（＋）溶液を除去してＦＢＳ不含有ダルベッコＭＥＭ培地を各ウェルに１．０ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ II（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-07361）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、５０ng/μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0169】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＭＭＰ－１（Matrix Metalloprotease-1）、ＩＬ－１α（Interleukin-1α）、ＣＯＬ１Ａ１（Collagen，TypeＩ，α1）、および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、ＭＭＰ－１およびＩＬ－１αは、ＵＶＡの照射によりｍＲＮＡ発現が上昇する遺伝子であり、一方ＣＯＬ１Ａ１はＵＶＡ照射によりｍＲＮＡ発現が低下する遺伝子である。ｍＲＮＡ発現量の検出は、リアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２ Step ＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式により各遺伝子のｍＲＮＡ発現変動抑制率（％）を算出した。
【0170】
ｍＲＮＡ発現変動抑制率（％）＝｛（Ａ－Ｂ）－（Ａ－Ｃ）｝／（Ａ－Ｂ）×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：紫外線非照射・試料無添加での補正値
Ｂ：紫外線照射・試料無添加（コントロール）での補正値
Ｃ：紫外線照射・被験試料添加での補正値
結果を表１５に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：紫外線非照射・試料無添加での補正値
Ｂ：紫外線照射・試料無添加（コントロール）での補正値
Ｃ：紫外線照射・被験試料添加での補正値
結果を表１５に示す。
【0171】
【表15】
【0172】
表１５に示すように、ＭＭＰ－１およびＩＬ－１αの各遺伝子において、ＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現の上昇をアサイー抽出物（試料２）が抑制した。また、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子において、ＵＶＡ照射によるｍＲＮＡ発現の低下をアサイー抽出物（試料２）は抑制した。そのため、アサイー抽出物は、ＵＶＡ照射により引き起こされる光老化の予防または改善に有効であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0173】
本発明の抗老化剤は、皮膚の老化症状の予防、治療または改善；創傷又は熱傷の治癒の促進；乾燥性皮膚疾患の予防、治療または改善；などに大きく貢献できる。