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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022131357
(43)【公開日】2022-09-07
(54)【発明の名称】蛍光色素及びこれを用いた標識生体物質
(51)【国際特許分類】
C09B 57/00 20060101AFI20220831BHJP
G01N 33/58 20060101ALI20220831BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220831BHJP
【ＦＩ】
C09B57/00 Z
G01N33/58 A
G01N33/58 Z
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021030260
(22)【出願日】2021-02-26
(71)【出願人】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002631
【氏名又は名称】弁理士法人イイダアンドパートナーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100076439
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 敏三
(74)【代理人】
【識別番号】100161469
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 修一
(72)【発明者】
【氏名】金澤 吉憲
【テーマコード（参考）】
2G043
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA16
2G043DA02
2G043FA01
2G043KA01
2G043KA02
2G043MA01
2G043NA01
2G045AA25
2G045FB07
(57)【要約】
【課題】溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる蛍光色素及び標識生体物質を提供する。
【解決手段】
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素及び標識生体物質。
式中、Ｍはｔ価の連結基を示し、ｔは３以上の整数である。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
【選択図】なし
【解決手段】
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素及び標識生体物質。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素。
式中、Ｍはｔ価の連結基を示し、ｔは３以上の整数である。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
【化1】
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
【請求項2】
前記Ｒが、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素のうちの少なくとも１種の色素からなる構造部である、請求項１に記載の蛍光色素。
【請求項3】
前記蛍光色素が前記一般式（Ｉ）で表され、前記ｔが３であり、前記Ｍが下記いずれかの構造の連結基である、請求項１又は２に記載の蛍光色素。
上記構造式中、＊はＬとの結合位置を示す。
【化2】
【請求項4】
前記蛍光色素が前記一般式（Ｉ）で表され、前記ｔが４であり、前記Ｍが下記構造の連結基である、請求項１又は２に記載の蛍光色素。
上記構造式中、＊はＬとの結合位置を示す。
【化3】
【請求項5】
前記Ｒのうちの少なくとも１つがカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光色素。
【請求項6】
前記Ｌ及びＭのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の蛍光色素。
【請求項7】
前記水溶性置換基が、カルボキシ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホノオキシ基、スルファモイル基及びポリオキシアルキレン基のうちの少なくとも１種である、請求項６に記載の蛍光色素。
【請求項8】
前記Ｒがシアニン色素からなる構造部である、請求項１～７のいずれか１項に記載の蛍光色素。
【請求項9】
前記シアニン色素が下記一般式（ＩＩＩ）で表される、請求項８に記載の蛍光色素。
式中、Ｒ１～Ｒ４は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であり、Ｒ２１はアルキル基を示す。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、前記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
前記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、前記Ｘと結合する。
前記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
【化4】
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、前記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
前記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、前記Ｘと結合する。
前記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
【請求項10】
前記Ｒ１１～Ｒ１３のうちのいずれか１つにより前記Ｘと結合する、請求項９に記載の蛍光色素。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の蛍光色素と生体物質とが結合してなる標識生体物質。
【請求項12】
前記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである請求項１１に記載の標識生体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光色素及びこれを用いた標識生体物質に関する。
【背景技術】
【0002】
様々な刺激（病気、環境変化など）に対する生体内の変化を観察するために、目的の検出対象物質に対して結合性の生体分子（抗体等）を蛍光性化合物（蛍光色素）で標識した蛍光標識生体物質が多用されている。
例えば、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出するウエスタンブロッティング（以下、ＷＢとも略す。）でも、上記特定のタンパク質の有無ないし存在量を、このタンパク質に対して結合性の蛍光標識抗体を用いて検出する蛍光法が利用されている。
また、生体中の生体分子、細胞及び組織等の動態及び機能等を解析するバイオイメージング技術においては、蛍光標識により可視化した生体の特定の部位を観察する生体蛍光イメージングが、生体観察の技術の一つとして利用されている。
例えば、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出するウエスタンブロッティング（以下、ＷＢとも略す。）でも、上記特定のタンパク質の有無ないし存在量を、このタンパク質に対して結合性の蛍光標識抗体を用いて検出する蛍光法が利用されている。
また、生体中の生体分子、細胞及び組織等の動態及び機能等を解析するバイオイメージング技術においては、蛍光標識により可視化した生体の特定の部位を観察する生体蛍光イメージングが、生体観察の技術の一つとして利用されている。
【0003】
上記蛍光標識では、通常、複数の蛍光色素分子を結合させた蛍光標識生体物質を用いることにより、輝度（蛍光強度）を高めている。しかし、シアニン色素、ローダミン色素等の蛍光性を示す有機色素の大部分は、高い平面性を有する芳香族発色団を有するため、色素間での相互作用を生じやすく、その結果、標識後の色素間における自己会合等の相互作用による蛍光強度の低下が生じやすい。特に、生体分子１分子あたりの蛍光色素の分子数（蛍光標識率：ＤＯＬ）が増加するにつれて、自己会合等による蛍光強度がより低下する傾向にある。
この問題に対処した技術として、例えば、特許文献１には、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミノ化合物又はポリチオ化合物からなるコア部分を有する分岐鎖状ポリエーテル骨格により蛍光色素を多量体化することにより、高い蛍光強度を実現し、また、自己消光によるＤＯＬの低下も抑制したことが記載されている。
この問題に対処した技術として、例えば、特許文献１には、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミノ化合物又はポリチオ化合物からなるコア部分を有する分岐鎖状ポリエーテル骨格により蛍光色素を多量体化することにより、高い蛍光強度を実現し、また、自己消光によるＤＯＬの低下も抑制したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１７－２２８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
蛍光標識に用いられる色素は、溶液、メンブレン又はドットプロット等の多様な状態において優れた蛍光強度を示すことが求められる。しかし、本発明者が蛍光強度について更なる検討を重ねたところ、上記特許文献１に開示された分岐鎖状ポリエーテル骨格により多量体化した蛍光色素を用いた蛍光標識では、溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても、十分なレベルの蛍光強度を得ることができないことがわかってきた。
本発明は、溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる蛍光色素を提供することを課題とする。また本発明は、この蛍光色素と生体物質とを結合してなる標識生体物質を提供することを課題とする。
本発明は、溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる蛍光色素を提供することを課題とする。また本発明は、この蛍光色素と生体物質とを結合してなる標識生体物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
すなわち、本発明の上記課題は、下記の手段によって解決された。
〔１〕
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素。
式中、Ｍはｔ価の連結基を示し、ｔは３以上の整数である。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
〔２〕
上記Ｒが、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素のうちの少なくとも１種の色素からなる構造部である、〔１〕に記載の蛍光色素。
〔３〕
上記蛍光色素が上記一般式（Ｉ）で表され、上記ｔが３であり、上記Ｍが下記いずれかの構造の連結基である、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光色素。
上記構造式中、＊はＬとの結合位置を示す。
〔４〕
上記蛍光色素が上記一般式（Ｉ）で表され、上記ｔが４であり、上記Ｍが下記構造の連結基である、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光色素。
上記構造式中、＊はＬとの結合位置を示す。
〔５〕
上記Ｒのうちの少なくとも１つがカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する、〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔６〕
上記Ｌ及びＭのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有する、〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔７〕
上記水溶性置換基が、カルボキシ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホノオキシ基、スルファモイル基及びポリオキシアルキレン基のうちの少なくとも１種である、〔６〕に記載の蛍光色素。
〔８〕
上記Ｒがシアニン色素からなる構造部である、〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔９〕
上記シアニン色素が下記一般式（ＩＩＩ）で表される、〔８〕に記載の蛍光色素。
式中、Ｒ１～Ｒ４は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であり、Ｒ２１はアルキル基を示す。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
上記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、上記Ｘと結合する。
上記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
〔１０〕
上記Ｒ１１～Ｒ１３のうちのいずれか１つにより上記Ｘと結合する、〔９〕に記載の蛍光色素。
〔１１〕
〔１〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の蛍光色素と生体物質とが結合してなる標識生体物質。
〔１２〕
上記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである〔１１〕に記載の標識生体物質。
〔１〕
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素。
【化1】
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
〔２〕
上記Ｒが、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素のうちの少なくとも１種の色素からなる構造部である、〔１〕に記載の蛍光色素。
〔３〕
上記蛍光色素が上記一般式（Ｉ）で表され、上記ｔが３であり、上記Ｍが下記いずれかの構造の連結基である、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光色素。
【化2】
〔４〕
上記蛍光色素が上記一般式（Ｉ）で表され、上記ｔが４であり、上記Ｍが下記構造の連結基である、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光色素。
【化3】
〔５〕
上記Ｒのうちの少なくとも１つがカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する、〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔６〕
上記Ｌ及びＭのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有する、〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔７〕
上記水溶性置換基が、カルボキシ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホノオキシ基、スルファモイル基及びポリオキシアルキレン基のうちの少なくとも１種である、〔６〕に記載の蛍光色素。
〔８〕
上記Ｒがシアニン色素からなる構造部である、〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の蛍光色素。
〔９〕
上記シアニン色素が下記一般式（ＩＩＩ）で表される、〔８〕に記載の蛍光色素。
【化4】
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
上記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、上記Ｘと結合する。
上記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
〔１０〕
上記Ｒ１１～Ｒ１３のうちのいずれか１つにより上記Ｘと結合する、〔９〕に記載の蛍光色素。
〔１１〕
〔１〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の蛍光色素と生体物質とが結合してなる標識生体物質。
〔１２〕
上記生体物質がタンパク質、アミノ酸、核酸、糖鎖及びリン脂質のいずれかである〔１１〕に記載の標識生体物質。
【発明の効果】
【0007】
本発明の蛍光色素は、溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる。また、本発明の標識生体物質は優れた蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明において、特定の符号又は式で表示された置換基もしくは連結基等（以下、置換基等という）が複数あるとき、又は、複数の置換基等を同時に規定するときには、特段の断りがない限り、それぞれの置換基等は互いに同一でも異なっていてもよい。このことは、置換基等の数の規定についても同様である。また、複数の置換基等が近接するとき（特に、隣接するとき）には、特段の断りがない限り、それらが互いに連結して環を形成していてもよい。また、特段の断りがない限り、環、例えば脂環、芳香族環及びヘテロ環は、さらに縮環して縮合環を形成していてもよい。
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にＥ型及びＺ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。また、特段の断りがない限り、化合物としてジアステレオマー及びエナンチオマーが存在する場合には、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。
本明細書において、特段の断りがない限り、二重結合については、分子内にＥ型及びＺ型が存在する場合、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。また、特段の断りがない限り、化合物としてジアステレオマー及びエナンチオマーが存在する場合には、そのいずれであっても、またこれらの混合物であってもよい。
【0009】
本発明において、化合物及び置換基の表示については、化合物そのもの及び置換基そのもののほか、その塩、そのイオンを含む意味に用いる。例えば、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）等は、水素原子が解離してイオン構造を取っていてもよく、塩構造を取っていてもよい。すなわち、本発明において、「カルボキシ基」はカルボン酸イオン又はその塩を、「スルホ基」はスルホン酸イオン又はその塩を、「ホスホノ基」はホスホン酸イオン又はその塩を、それぞれ含む意味で使用する。上記塩構造を構成する際の１価若しくは多価のカチオンとしては、特に制限されず、無機カチオン、有機カチオン等が挙げられ、具体的には、Ｎａ＋、Ｌｉ＋及びＫ＋等のアルカリ金属のカチオン、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋等のアルカリ土類金属のカチオン、並びに、トリアルキルアンモニウムカチオン、テトラアルキルアンモニウムカチオン等の有機アンモニウムカチオンが挙げられる。
塩構造の場合、その塩の種類は１種類でもよく、２種類以上混在していてもよく、化合物中で塩型と遊離酸構造の基が混在していてもよく、また、塩構造の化合物と遊離酸構造化合物が混在していてもよい。
本発明の化合物は、いずれも中性の化合物である。例えば、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部において、Ｒ４２が結合する窒素原子の形式電荷は＋１であり、この形式電荷と対となるようにして、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素中のスルホ基等の解離性基がスルホン酸イオン等のイオン構造を有することによって、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有する本発明の化合物は、化合物全体として電荷０の化合物となる。
本発明で規定する一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素においては、化合物が有する正電荷を、特定の窒素原子が有する構造として便宜上特定して示している。ただし、一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素は共役系を有するため、実際には、上記窒素原子以外の他の原子が正電荷を採りうることもあり、化学構造の１つとして一般式（ＩＩＩ）等で表される構造を取りうる化合物であれば、一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素に包含される。このことは負電荷についても同様である。
また、本発明の効果を損なわない範囲で、構造の一部を変化させたものを含む意味である。更に、置換又は無置換を明記していない化合物については、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。このことは、置換基（例えば、「アルキル基」、「メチル基」、「メチル」などのように表現される基）及び連結基（例えば、「アルキレン基」、「メチレン基」、「メチレン」などのように表現される基）についても同様である。このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Ｔから選択される置換基である。
本発明において、ある基の炭素数を規定する場合、この炭素数は、本発明ないし本明細書において特段の断りのない限りは、基全体の炭素数を意味する。つまり、この基がさらに置換基を有する形態である場合、この置換基を含めた全体の炭素数を意味する。
塩構造の場合、その塩の種類は１種類でもよく、２種類以上混在していてもよく、化合物中で塩型と遊離酸構造の基が混在していてもよく、また、塩構造の化合物と遊離酸構造化合物が混在していてもよい。
本発明の化合物は、いずれも中性の化合物である。例えば、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部において、Ｒ４２が結合する窒素原子の形式電荷は＋１であり、この形式電荷と対となるようにして、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素中のスルホ基等の解離性基がスルホン酸イオン等のイオン構造を有することによって、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有する本発明の化合物は、化合物全体として電荷０の化合物となる。
本発明で規定する一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素においては、化合物が有する正電荷を、特定の窒素原子が有する構造として便宜上特定して示している。ただし、一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素は共役系を有するため、実際には、上記窒素原子以外の他の原子が正電荷を採りうることもあり、化学構造の１つとして一般式（ＩＩＩ）等で表される構造を取りうる化合物であれば、一般式（ＩＩＩ）等で表されるシアニン色素に包含される。このことは負電荷についても同様である。
また、本発明の効果を損なわない範囲で、構造の一部を変化させたものを含む意味である。更に、置換又は無置換を明記していない化合物については、本発明の効果を損なわない範囲で、任意の置換基を有していてもよい意味である。このことは、置換基（例えば、「アルキル基」、「メチル基」、「メチル」などのように表現される基）及び連結基（例えば、「アルキレン基」、「メチレン基」、「メチレン」などのように表現される基）についても同様である。このような任意の置換基のうち、本発明において好ましい置換基は、後述の置換基群Ｔから選択される置換基である。
本発明において、ある基の炭素数を規定する場合、この炭素数は、本発明ないし本明細書において特段の断りのない限りは、基全体の炭素数を意味する。つまり、この基がさらに置換基を有する形態である場合、この置換基を含めた全体の炭素数を意味する。
【0010】
また、本発明において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0011】
本発明の蛍光色素は、下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される。本発明の蛍光色素が、溶液、メンブレン及びドットプロットのいずれの状態においても優れた蛍光強度を示す標識生体物質を得ることができる理由の詳細については定かではないが、次のように考えられる。
本発明の蛍光色素は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるように、２つ以上の蛍光体部Ｒを－Ｘ－Ｌ－Ｘ－又は－Ｘ－Ｌ－Ｍ－Ｌ－Ｘ－で表される特定の連結基で結合した化合物であって、上記Ｌが－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる剛直な２価の連結基であることにより、蛍光体部Ｒ同士の相互作用が抑制され、本発明の蛍光色素の自己会合による蛍光強度の低下を抑制することができると考えられる。また、上記Ｌと蛍光体部Ｒとを、π共役性を有しないＸ、すなわち、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合により結合することにより、蛍光体部Ｒが有する吸収発光波長を所望の範囲に維持しつつ、蛍光強度の低下を抑制することができる。また、本発明の蛍光色素の自己会合が効果的に抑制される結果、高いＤＯＬを示す標識生体物質を用いた場合にも優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。
本発明の蛍光色素は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるように、２つ以上の蛍光体部Ｒを－Ｘ－Ｌ－Ｘ－又は－Ｘ－Ｌ－Ｍ－Ｌ－Ｘ－で表される特定の連結基で結合した化合物であって、上記Ｌが－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる剛直な２価の連結基であることにより、蛍光体部Ｒ同士の相互作用が抑制され、本発明の蛍光色素の自己会合による蛍光強度の低下を抑制することができると考えられる。また、上記Ｌと蛍光体部Ｒとを、π共役性を有しないＸ、すなわち、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合により結合することにより、蛍光体部Ｒが有する吸収発光波長を所望の範囲に維持しつつ、蛍光強度の低下を抑制することができる。また、本発明の蛍光色素の自己会合が効果的に抑制される結果、高いＤＯＬを示す標識生体物質を用いた場合にも優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。
【0012】
以下、本発明の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素について詳述する。
【0013】
＜一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素＞
本発明の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素（以下、「本発明の化合物」とも称す。）は、下記の通りである。
本発明の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される蛍光色素（以下、「本発明の化合物」とも称す。）は、下記の通りである。
【0014】
【化5】
【0015】
式中、Ｍはｔ価の連結基を示し、ｔは３以上の整数である。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合を示す。
Ｒは、蛍光体部を示す。
【0016】
一般式（Ｉ）で表される化合物においては、Ｌが２価の連結基であって、Ｍがｔ価の多分枝構造を有し、かつ、Ｍを構成する原子数が最小となるように、Ｍを解釈する。
【0017】
１）Ｍ、ｎ
Ｍはｔ価の連結基を示す。
Ｍとしては、本発明の効果を奏する限り、特に制限されることはなく、例えば、鎖状もしくは環状構造を有するｔ価の脂肪族基、ｔ価の芳香族基、又は、鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなるｔ価の基が挙げられる。これらの基は置換基で置換されていてもよく、採り得る置換基としては、後述の置換基群Ｔにおける基が挙げられ、後述の水溶性置換基が好ましい。ただし、蛍光体部を含まないことが好ましい。なお、鎖状のｔ価の脂肪族基には、ｔ価の結合手を有する１つの原子からなる基を含むものとする。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する脂肪族基としては、後述する置換基群Ｔにおける１価の脂肪族基（アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基）の記載を、対応するｔ価の脂肪族基に置き換えた基が挙げられる。この脂肪族基を構成する炭素原子及び水素原子の一部又は全部が、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子等のヘテロ原子で置き換えられていてもよく、構成する原子は炭素原子及び水素原子であることが好ましい。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する芳香族基としては、芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基のいずれであってもよく、後述する置換基群Ｔにおける１価の芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基の記載を、対応するｔ価の芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基に置き換えた基が挙げられる。
上記芳香族ヘテロ環基としては、環構成原子は炭素原子及び窒素原子であることが好ましい。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する芳香族基としては、単環又は縮環のいずれの基であってもよいが、単環の基であることが好ましく、１、３及び５位、又は、２、４及び６位に結合手を有する３価の６員環芳香族基がより好ましい。
また、Ｍとして採り得る鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなるｔ価の基を構成する脂肪族基又は芳香族基については、Ｍとしてｔ価の基となる限り特に制限されず、上述の脂肪族基又は芳香族基を組合わせてなる基が挙げられる。
Ｍとしては、鎖状もしくは環状構造を有するｔ価の脂肪族基、又は、ｔ価の芳香族基が好ましく、ｔ価の鎖状の脂肪族基、又は、ｔ価の芳香族基がより好ましく、ｔ価の結合手を有する１つの原子からなる基、又は、ｔ価の単環の芳香族基がさらに好ましい。
ｔは、３以上の整数であり、３～６の整数が好ましく、３～５の整数がより好ましく、３又は４の整数がさらに好ましい。
Ｍを構成する原子数としては、１～２４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～６がさらに好ましい。なお、Ｍを構成する原子数には、水素原子及びＭとしてのｔ価の基が有する置換基を構成する原子数を含めないものとする。
Ｍとしては、例えば、下記に示す３価の基又は４価の基、また、鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなる６価の基を好ましく挙げることができる。下記構造式中における芳香族基は、それぞれ、無置換の基であってもよく、置換基によって置換されていてもよい。下記構造において＊は結合手を意味する。
Ｍはｔ価の連結基を示す。
Ｍとしては、本発明の効果を奏する限り、特に制限されることはなく、例えば、鎖状もしくは環状構造を有するｔ価の脂肪族基、ｔ価の芳香族基、又は、鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなるｔ価の基が挙げられる。これらの基は置換基で置換されていてもよく、採り得る置換基としては、後述の置換基群Ｔにおける基が挙げられ、後述の水溶性置換基が好ましい。ただし、蛍光体部を含まないことが好ましい。なお、鎖状のｔ価の脂肪族基には、ｔ価の結合手を有する１つの原子からなる基を含むものとする。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する脂肪族基としては、後述する置換基群Ｔにおける１価の脂肪族基（アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基）の記載を、対応するｔ価の脂肪族基に置き換えた基が挙げられる。この脂肪族基を構成する炭素原子及び水素原子の一部又は全部が、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子等のヘテロ原子で置き換えられていてもよく、構成する原子は炭素原子及び水素原子であることが好ましい。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する芳香族基としては、芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基のいずれであってもよく、後述する置換基群Ｔにおける１価の芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基の記載を、対応するｔ価の芳香族炭化水素環基又は芳香族ヘテロ環基に置き換えた基が挙げられる。
上記芳香族ヘテロ環基としては、環構成原子は炭素原子及び窒素原子であることが好ましい。
Ｍとして採り得るｔ価の基を構成する芳香族基としては、単環又は縮環のいずれの基であってもよいが、単環の基であることが好ましく、１、３及び５位、又は、２、４及び６位に結合手を有する３価の６員環芳香族基がより好ましい。
また、Ｍとして採り得る鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなるｔ価の基を構成する脂肪族基又は芳香族基については、Ｍとしてｔ価の基となる限り特に制限されず、上述の脂肪族基又は芳香族基を組合わせてなる基が挙げられる。
Ｍとしては、鎖状もしくは環状構造を有するｔ価の脂肪族基、又は、ｔ価の芳香族基が好ましく、ｔ価の鎖状の脂肪族基、又は、ｔ価の芳香族基がより好ましく、ｔ価の結合手を有する１つの原子からなる基、又は、ｔ価の単環の芳香族基がさらに好ましい。
ｔは、３以上の整数であり、３～６の整数が好ましく、３～５の整数がより好ましく、３又は４の整数がさらに好ましい。
Ｍを構成する原子数としては、１～２４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～６がさらに好ましい。なお、Ｍを構成する原子数には、水素原子及びＭとしてのｔ価の基が有する置換基を構成する原子数を含めないものとする。
Ｍとしては、例えば、下記に示す３価の基又は４価の基、また、鎖状もしくは環状構造を有する脂肪族基と芳香族基とを組合わせてなる６価の基を好ましく挙げることができる。下記構造式中における芳香族基は、それぞれ、無置換の基であってもよく、置換基によって置換されていてもよい。下記構造において＊は結合手を意味する。
【0018】
【化6】
【0019】
２）Ｌ
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
Ｌは、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基を示す。
【0020】
Ｌを構成するアリーレン基としては、後述の置換基群Ｔにおけるアリール基の記載を、対応する２価の基に置き換えた基が挙げられ、フェニレン基が好ましく、１，４－フェニレン基がより好ましい。
Ｌを構成するヘテロアリーレン基としては、後述の置換基群Ｔにおけるヘテロアリール基の記載を、対応する２価の基に置き換えた基が挙げられ、環構成原子は炭素原子及び窒素原子であることが好ましい。また、単環の基であることが好ましく、パラ位の位置に結合手を有する２価の６員環ヘテロアリーレン基がより好ましく、２，５－ピラジンジイル基、１，４－トリアジンジイル基又は１，２，４，５－テトラジンジイル基がさらに好ましい。
Ｌを構成し得るアリーレン基又はヘテロアリーレン基は置換基で置換されていてもよい。上記のアリーレン基又はヘテロアリーレン基が採り得る置換基としては、後述の置換基群Ｔにおける基が挙げられ、後述の水溶性置換基が好ましい。ただし、上記のアリーレン基及びヘテロアリーレン基は、蛍光体部を含まないことが好ましい。
Ｌを構成するヘテロアリーレン基としては、後述の置換基群Ｔにおけるヘテロアリール基の記載を、対応する２価の基に置き換えた基が挙げられ、環構成原子は炭素原子及び窒素原子であることが好ましい。また、単環の基であることが好ましく、パラ位の位置に結合手を有する２価の６員環ヘテロアリーレン基がより好ましく、２，５－ピラジンジイル基、１，４－トリアジンジイル基又は１，２，４，５－テトラジンジイル基がさらに好ましい。
Ｌを構成し得るアリーレン基又はヘテロアリーレン基は置換基で置換されていてもよい。上記のアリーレン基又はヘテロアリーレン基が採り得る置換基としては、後述の置換基群Ｔにおける基が挙げられ、後述の水溶性置換基が好ましい。ただし、上記のアリーレン基及びヘテロアリーレン基は、蛍光体部を含まないことが好ましい。
【0021】
Ｌを構成する、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基の合計数は、少なくとも２つであればよく、２～１２が好ましく、２～１０がより好ましく、２～７がさらに好ましい。
Ｌを構成する、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基の種類は、１種以上であればよく、２種以上が好ましく、－Ｃ≡Ｃ－とアリーレン基又はヘテロアリーレン基との組み合わせがより好ましい。上限値に特に制限はなく、例えば、４種以下とすることができ、３種以下が好ましい。
なお、アリーレン基及びヘテロアリーレン基の種類については、結合部位を含め、化学構造が異なる場合には違う種類の基として解釈する。例えば、Ｌがフェニレン基とナフタレンジイル基により構成されている場合には、共にアリーレン基であるが、Ｌを構成する基の種類としては２種類として数える。結合部位の異なる、１，４－フェニレン基と１，３－フェニレン基についても、異なる種類の基として数える。
Ｌとしては、例えば、下記に示す骨格構造を有する基を上げることができる。ただし、これらの骨格構造を有する基に限定されるものではない。また、下記構造式中におけるアリーレン基及びヘテロアリーレン基は、それぞれ、無置換の基であってもよく、置換基によって置換されていてもよい。下記構造において＊は結合手を意味し、一般式（Ｉ）で表される化合物においては、いずれの側でＭと結合してもよい。
Ｌを構成する、－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン基及びヘテロアリーレン基の種類は、１種以上であればよく、２種以上が好ましく、－Ｃ≡Ｃ－とアリーレン基又はヘテロアリーレン基との組み合わせがより好ましい。上限値に特に制限はなく、例えば、４種以下とすることができ、３種以下が好ましい。
なお、アリーレン基及びヘテロアリーレン基の種類については、結合部位を含め、化学構造が異なる場合には違う種類の基として解釈する。例えば、Ｌがフェニレン基とナフタレンジイル基により構成されている場合には、共にアリーレン基であるが、Ｌを構成する基の種類としては２種類として数える。結合部位の異なる、１，４－フェニレン基と１，３－フェニレン基についても、異なる種類の基として数える。
Ｌとしては、例えば、下記に示す骨格構造を有する基を上げることができる。ただし、これらの骨格構造を有する基に限定されるものではない。また、下記構造式中におけるアリーレン基及びヘテロアリーレン基は、それぞれ、無置換の基であってもよく、置換基によって置換されていてもよい。下記構造において＊は結合手を意味し、一般式（Ｉ）で表される化合物においては、いずれの側でＭと結合してもよい。
【0022】
【化7】
【0023】
本発明の蛍光色素においては、Ｌ及びＭのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有することが好ましい。すなわち、一般式（Ｉ）で表される蛍光色素においては、Ｍ及びｔ個のＬのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有することが好ましく、一般式（ＩＩ）で表される蛍光色素においては、Ｌが水溶性置換基を有することが好ましい。本発明の蛍光色素において、Ｌ及びＭのうちの少なくとも１つが水溶性置換基を有することによって、蛍光色素の自己会合が抑制され、溶液、メンブレン及びドットプロットの状態における蛍光強度をより向上させることができると考えられる。
水溶性置換基としては、カルボキシ基、スルホ基（－ＳＯ２（ＯＨ））、ホスホノ基（ホスホン酸基、－ＰＯ（ＯＨ）２）、ホスホノオキシ基（リン酸基、－ＯＰＯ（ＯＨ）２）、スルファモイル基（－ＳＯ２ＮＨ２）又はポリオキシアルキレン基（－（アルキレン－Ｏ）ｍ－Ｒ２１、ｍ及びＲ２１は後述の一般式（ＩＩＩ）におけるｍ及びＲ２１の記載を好ましく適用することができる。）が好ましく挙げられる。
上記のＬ又はＭが水溶性置換基を置換基として有する場合、Ｌ又はＭ上に水溶性置換基を直接有していてもよく、連結基を介して有していてもよい。連結基を介する場合、連結基は特に制限されないが、例えば、アルキレン基を挙げることができる。
本発明においては、水溶性の観点から、少なくとも１つのＬが上記水溶性置換基を有することが好ましく、少なくとも１つのＬが、カルボキシ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホノオキシ基、スルファモイル基及びポリオキシアルキレン基のうちの少なくとも１種を有することがより好ましい。ここで、「少なくとも１つのＬ」とは、一般式（Ｉ）で表される蛍光色素においては、ｔ個のＬのうちの少なくとも１つを意味し、一般式（ＩＩ）で表される蛍光色素においてはＬを意味する。
水溶性置換基としては、カルボキシ基、スルホ基（－ＳＯ２（ＯＨ））、ホスホノ基（ホスホン酸基、－ＰＯ（ＯＨ）２）、ホスホノオキシ基（リン酸基、－ＯＰＯ（ＯＨ）２）、スルファモイル基（－ＳＯ２ＮＨ２）又はポリオキシアルキレン基（－（アルキレン－Ｏ）ｍ－Ｒ２１、ｍ及びＲ２１は後述の一般式（ＩＩＩ）におけるｍ及びＲ２１の記載を好ましく適用することができる。）が好ましく挙げられる。
上記のＬ又はＭが水溶性置換基を置換基として有する場合、Ｌ又はＭ上に水溶性置換基を直接有していてもよく、連結基を介して有していてもよい。連結基を介する場合、連結基は特に制限されないが、例えば、アルキレン基を挙げることができる。
本発明においては、水溶性の観点から、少なくとも１つのＬが上記水溶性置換基を有することが好ましく、少なくとも１つのＬが、カルボキシ基、スルホ基、ホスホノ基、ホスホノオキシ基、スルファモイル基及びポリオキシアルキレン基のうちの少なくとも１種を有することがより好ましい。ここで、「少なくとも１つのＬ」とは、一般式（Ｉ）で表される蛍光色素においては、ｔ個のＬのうちの少なくとも１つを意味し、一般式（ＩＩ）で表される蛍光色素においてはＬを意味する。
【0024】
Ｌが水溶性置換基を有する場合、Ｌが有する水溶性置換基の数としては、下記関係を満たすことが好ましい。
Ｌが有する水溶性置換基の数＋１≧Ｌを構成する芳香環の数
また、Ｌが水溶性置換基を有する場合、Ｌが有する水溶性置換基の数の上限値に特に制限はないが、下記関係を満たすことが好ましい。
Ｌが有する水溶性置換基の数≦２×［Ｌを構成する芳香環の数］
Ｌが有する水溶性置換基の数＋１≧Ｌを構成する芳香環の数
また、Ｌが水溶性置換基を有する場合、Ｌが有する水溶性置換基の数の上限値に特に制限はないが、下記関係を満たすことが好ましい。
Ｌが有する水溶性置換基の数≦２×［Ｌを構成する芳香環の数］
【0025】
３）Ｘ
Ｘは、エーテル結合（－Ｏ－）、チオエーテル結合（－Ｓ－）、アルキレン基、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）又はアミノ結合（－ＮＨ－）を示す。
アルキレン基としては、後述の置換基群Ｔにおけるアルキル基から水素原子を１つ除いて得られるアルキレン基を適用することができる。
Ｘは、エーテル結合又はアミド結合が好ましく、エーテル結合がより好ましい。
Ｘは、エーテル結合（－Ｏ－）、チオエーテル結合（－Ｓ－）、アルキレン基、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）又はアミノ結合（－ＮＨ－）を示す。
アルキレン基としては、後述の置換基群Ｔにおけるアルキル基から水素原子を１つ除いて得られるアルキレン基を適用することができる。
Ｘは、エーテル結合又はアミド結合が好ましく、エーテル結合がより好ましい。
【0026】
４）Ｒ
Ｒは、蛍光体部を示す。
化合物中に複数存在するＲは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
Ｒとして採り得る蛍光体部としては、Ｘを介してＬと結合することが可能な、蛍光を示す有機化合物からなる構造部である限り、特に制限することなく用いることができる。
Ｒとしては、例えば、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素のうちの少なくとも１種の色素からなる構造部が挙げられ、好ましい。
上記のキサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素としては、これらの式として通常知られている色素を特に制限することなく用いることができる。
Ｒは、蛍光体部を示す。
化合物中に複数存在するＲは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
Ｒとして採り得る蛍光体部としては、Ｘを介してＬと結合することが可能な、蛍光を示す有機化合物からなる構造部である限り、特に制限することなく用いることができる。
Ｒとしては、例えば、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素のうちの少なくとも１種の色素からなる構造部が挙げられ、好ましい。
上記のキサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素としては、これらの式として通常知られている色素を特に制限することなく用いることができる。
【0027】
Ｒのうちの少なくとも１つは、バイオイメージングにおける汎用性の観点から、カルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有することが好ましい。
本発明の化合物は、上記のカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基により、生体物質と結合し、目的とする標識生体物質を得ることができる。なお、カルボキシ基は、生体物質に結合可能な置換基を常法により容易に誘導することができる。
本発明において、「生体物質に結合可能な置換基」は、カルボキシ基から誘導される生体物質に結合可能な置換基を含む。
本発明の化合物が有するカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基の数は、合計で、少なくとも１つ以上であることが好ましく、検出対象物質の定量の観点から、１～３つがより好ましく、１つ又は２つがさらに好ましく、１つが特に好ましい。
本発明の化合物は、上記のカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基により、生体物質と結合し、目的とする標識生体物質を得ることができる。なお、カルボキシ基は、生体物質に結合可能な置換基を常法により容易に誘導することができる。
本発明において、「生体物質に結合可能な置換基」は、カルボキシ基から誘導される生体物質に結合可能な置換基を含む。
本発明の化合物が有するカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基の数は、合計で、少なくとも１つ以上であることが好ましく、検出対象物質の定量の観点から、１～３つがより好ましく、１つ又は２つがさらに好ましく、１つが特に好ましい。
【0028】
上記Ｒはシアニン色素からなる構造部であることが好ましく、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部であることがより好ましい。
【0029】
【化8】
【0030】
式中、Ｒ１～Ｒ４は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。ｍは１～５０であり、Ｒ２１はアルキル基を示す。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
上記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、上記Ｘと結合する。
上記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
Ｒ１１～Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示し、隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ４１及びＲ４２は、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
ｎは、１～３の整数である。
上記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより、上記Ｘと結合する。
上記蛍光色素中における少なくとも１つの式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
【0031】
上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、共役二重結合によって結ばれた繰り返し数２ｎ＋３のメチン鎖の長さに依存して、ｎ＝１の場合に５８５ｎｍ付近に、ｎ＝２の場合に６８５ｎｍ付近に、ｎ＝３の場合に７８５ｎｍ付近に、それぞれ励起吸収波長を有する。そのため、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を蛍光体部Ｒとして有する本発明の化合物は、それぞれ、励起光源として６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ付近のものを使用する蛍光標識において、優れた蛍光強度を示す化合物として使用できる。
【0032】
多色ＷＢでは、可視領域から近赤外領域までの範囲内において、複数の発光色を検出する。そのため、色素を励起発光させた際に互いに干渉してクロストークが起こらないように、複数の色素の吸収発光波形が適切な波長関係となるように選択する必要がある。ある励起光では１つの色素だけが光り、他の色素が光らないように調整されるのが理想的である。この観点で、例えば、多色ＷＢの近赤外領域の発光には、７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近という、ある程度波長の離れた２種類の励起光源が用いられている。
近赤外光励起による蛍光検出は、可視光励起による検出に比べてメンブレンの自家蛍光、すなわちバックグラウンド蛍光を抑制できるため、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を高めやすく、目的のタンパク質を高感度に検出することが可能となる。そのため、近年、微量タンパク質の解析研究において、近赤外領域の発光を利用した蛍光検出ＷＢの必要性が増してきている。
しかし、近赤外領域では、一般的に蛍光色素の蛍光量子収率が低く、高いシグナル量を得ることが難しい。一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を蛍光体部Ｒとして有する本発明の化合物のうちｎ＝２又は３である化合物は、上記の７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近の２種類のものを有する多色ＷＢにおいても、優れた蛍光強度を示す化合物として使用でき、特に、タンパク質をより高感度に観察、検出するという要望に対しても、従来のシアニン色素を用いた蛍光標識と比較して、優れた蛍光強度を示すことができる。
近赤外光励起による蛍光検出は、可視光励起による検出に比べてメンブレンの自家蛍光、すなわちバックグラウンド蛍光を抑制できるため、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を高めやすく、目的のタンパク質を高感度に検出することが可能となる。そのため、近年、微量タンパク質の解析研究において、近赤外領域の発光を利用した蛍光検出ＷＢの必要性が増してきている。
しかし、近赤外領域では、一般的に蛍光色素の蛍光量子収率が低く、高いシグナル量を得ることが難しい。一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を蛍光体部Ｒとして有する本発明の化合物のうちｎ＝２又は３である化合物は、上記の７００ｎｍ付近と８００ｎｍ付近の２種類のものを有する多色ＷＢにおいても、優れた蛍光強度を示す化合物として使用でき、特に、タンパク質をより高感度に観察、検出するという要望に対しても、従来のシアニン色素を用いた蛍光標識と比較して、優れた蛍光強度を示すことができる。
【0033】
（ｉ）Ｒ１～Ｒ４
Ｒ１～Ｒ４は、各々独立に、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
Ｒ１～Ｒ４は、各々独立に、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。
【0034】
Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基と同義である。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～２がさらに好ましい。
アルキル基が置換基を有する場合、置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数としては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、２～５が特に好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数としては、３～３５が好ましく、３～２５がより好ましく、３～１５がさらに好ましく、３～１１が特に好ましい。
本発明において、「置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数」とは、アルキル基が有する置換基部分を除く炭素数を意味する。
本発明において、「置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数（すなわち、全原子数から、最長鎖を構成しない分子鎖の原子数を引いた原子数）を意味する。なお、スルホ基、カルボキシ基等の解離性の水素原子を有する置換基が最長鎖を構成する場合、解離の有無にかかわらず、水素原子を含めて計算する。また、後述する生体物質に結合可能な置換基部分における原子数は含めない。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～２がさらに好ましい。
アルキル基が置換基を有する場合、置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数としては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、２～６がさらに好ましく、２～５が特に好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数としては、３～３５が好ましく、３～２５がより好ましく、３～１５がさらに好ましく、３～１１が特に好ましい。
本発明において、「置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数」とは、アルキル基が有する置換基部分を除く炭素数を意味する。
本発明において、「置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数」とは、置換基部分を含む原子数（すなわち、全原子数から、最長鎖を構成しない分子鎖の原子数を引いた原子数）を意味する。なお、スルホ基、カルボキシ基等の解離性の水素原子を有する置換基が最長鎖を構成する場合、解離の有無にかかわらず、水素原子を含めて計算する。また、後述する生体物質に結合可能な置換基部分における原子数は含めない。
【0035】
Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基、ホスホノ基及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１、並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質に結合可能な置換基を挙げることができる。なお、上記のアルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基におけるアルキル基部分が、後述する生体物質に結合可能な置換基を有していてもよい。
Ｒ１～Ｒ４として採りうる置換基を有するアルキル基としては、上記置換基を有するアルキル基であれば特に制限はないが、末端にカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基であることが好ましい。この場合、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基がアルキル基に直接置換していてもよく、アルコキシ基とカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基との組み合わせからなる基として置換していてもよい。
Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基としては、無置換のアルキル基が好ましい。
Ｒ１～Ｒ４として採りうる置換基を有するアルキル基としては、上記置換基を有するアルキル基であれば特に制限はないが、末端にカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基であることが好ましい。この場合、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基がアルキル基に直接置換していてもよく、アルコキシ基とカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基との組み合わせからなる基として置換していてもよい。
Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基としては、無置換のアルキル基が好ましい。
【0036】
（－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１）
Ｒ１～Ｒ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１において、ｍは１～５０であり、Ｒ２１はアルキル基を示す。
ｍは平均繰り返し数（単に、繰り返し数とも称す。）を意味し、１～２４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～１０がさらに好ましく、４～１０が特に好ましく、４～８が最も好ましい。
上記平均繰り返し数は、化合物について１Ｈ－ＮＭＲ測定を行い、平均積分値より算出することができる。本発明において規定する平均繰り返し数は、上記方法により算出される平均繰り返し数の小数第一位を四捨五入して得られる数を意味する。
Ｒ２１におけるアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基の記載を適用することができる。
Ｒ１～Ｒ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１及びＲ１～Ｒ４としてのアルキル基が置換基として有しうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１としては、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－無置換のアルキル基が好ましい。
Ｒ１～Ｒ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１において、ｍは１～５０であり、Ｒ２１はアルキル基を示す。
ｍは平均繰り返し数（単に、繰り返し数とも称す。）を意味し、１～２４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～１０がさらに好ましく、４～１０が特に好ましく、４～８が最も好ましい。
上記平均繰り返し数は、化合物について１Ｈ－ＮＭＲ測定を行い、平均積分値より算出することができる。本発明において規定する平均繰り返し数は、上記方法により算出される平均繰り返し数の小数第一位を四捨五入して得られる数を意味する。
Ｒ２１におけるアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ４として採りうるアルキル基の記載を適用することができる。
Ｒ１～Ｒ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１及びＲ１～Ｒ４としてのアルキル基が置換基として有しうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１としては、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－無置換のアルキル基が好ましい。
【0037】
Ｒ１～Ｒ４の少なくとも１つが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことが好ましく、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことがより好ましい。Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことによって、蛍光色素の自己会合が抑制され、溶液、メンブレン及びドットプロットの状態における蛍光強度をより向上させることができると考えられる。
本発明の化合物中における全てのＲが一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部であって、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことがさらに好ましい。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造は、Ｒ１～Ｒ４として－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を採ることにより導入されていることが好ましい。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－におけるｍは、上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１におけるｍと同義である。
Ｒ１～Ｒ４の置換基はシアニン色素骨格（平面）に対し垂直方向へ張り出すため、この置換基として－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことにより、縮環部分がπ－π相互作用しにくくなり（会合抑制効果が強まり）、会合による蛍光強度の低下を抑制できると推定している。
本発明の化合物中における全てのＲが一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部であって、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことがさらに好ましい。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造は、Ｒ１～Ｒ４として－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を採ることにより導入されていることが好ましい。
上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－におけるｍは、上記－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１におけるｍと同義である。
Ｒ１～Ｒ４の置換基はシアニン色素骨格（平面）に対し垂直方向へ張り出すため、この置換基として－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことにより、縮環部分がπ－π相互作用しにくくなり（会合抑制効果が強まり）、会合による蛍光強度の低下を抑制できると推定している。
【0038】
（ii）Ｒ１１～Ｒ１３
Ｒ１１～Ｒ１３は、各々独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示す。隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ１１～Ｒ１３として採りうるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子と同義であり、好ましい範囲も同じである。
Ｒ１１～Ｒ１３におけるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基及びアミノ基が有していてもよい置換基としては、後述する置換基群Ｔにおける置換基が挙げられる。
Ｒ１１～Ｒ１３は、各々独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基又はハロゲン原子を示す。隣接する基同士が互いに結合して５又は６員環を形成していてもよい。
Ｒ１１～Ｒ１３として採りうるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アミノ基及びハロゲン原子と同義であり、好ましい範囲も同じである。
Ｒ１１～Ｒ１３におけるアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基及びアミノ基が有していてもよい置換基としては、後述する置換基群Ｔにおける置換基が挙げられる。
【0039】
Ｒ１１～Ｒ１３のうち、隣接する基同士が互いに結合して形成される５又は６員環は、芳香族性又は脂肪族性のいずれであってもよく、脂肪族性であることが好ましい。また、６員環を形成することが好ましい。化合物中における上記の５又は６員環の数は特に制限されないが、１又は２個が好ましく、１個がより好ましい。
例えば、ｎ＝３の場合を例にすると、Ｒ１１～Ｒ１３のうち隣接する基同士が結合して形成される環を有する構造としては、下記構造が好ましく挙げられる。なお、下記例においては、環構造を形成していないＲ１１～Ｒ１３は水素原子であり、環構造は置換基を有しない構造を記載しているが、これらに限定されるものではない。また、下記において、波線の先の構造は省略して記載する。
例えば、ｎ＝３の場合を例にすると、Ｒ１１～Ｒ１３のうち隣接する基同士が結合して形成される環を有する構造としては、下記構造が好ましく挙げられる。なお、下記例においては、環構造を形成していないＲ１１～Ｒ１３は水素原子であり、環構造は置換基を有しない構造を記載しているが、これらに限定されるものではない。また、下記において、波線の先の構造は省略して記載する。
【0040】
【化9】
【0041】
Ｒ１１及びインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３は、水素原子が好ましい。
Ｒ１２及び上記以外のＲ１３は、水素原子又はアルキル基が好ましい。
Ｒ１１～Ｒ１３のうち、Ｒ１１及びインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１２～Ｒ１３における隣接する基同士が、互いに結合して５又は６員環を形成していることが好ましく、６員環を形成していることがより好ましい。また、インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に上記５又は６員環を形成していることが好ましい。インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に形成される環とは、インドリン環及びインドレニン環からの結合原子数が等しくなる炭素原子を環構成原子として含む環を意味する。
Ｒ１２及び上記以外のＲ１３は、水素原子又はアルキル基が好ましい。
Ｒ１１～Ｒ１３のうち、Ｒ１１及びインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１２～Ｒ１３における隣接する基同士が、互いに結合して５又は６員環を形成していることが好ましく、６員環を形成していることがより好ましい。また、インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に上記５又は６員環を形成していることが好ましい。インドリン環及びインドレニン環を結ぶ結合の中心部分に形成される環とは、インドリン環及びインドレニン環からの結合原子数が等しくなる炭素原子を環構成原子として含む環を意味する。
【0042】
上記Ｒは、上記のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２のうちのいずれか１つにより上記Ｘと結合する。
具体的には、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２として採り得る置換基から水素原子が１つ除かれた状態で上記Ｘと結合するか、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２として採り得る水素原子が除かれ、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５又はＲ３２～Ｒ３５が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合する。
なかでも、上記Ｒは、上記Ｒ１１～Ｒ１３のいずれか１つにより上記Ｘと結合することが好ましく、Ｒ１１～Ｒ１３として採り得る水素原子のうちのいずれか１つが除かれ、Ｒ１１～Ｒ１３が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合することがより好ましく、Ｒ１２及び上記のインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３として採り得る水素原子のうちのいずれか１つが除かれ、Ｒ１２又は上記のインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合することがさらに好ましく、上述のインドリン環及びインドレニン環からの結合原子数が等しくなる炭素原子と上記Ｘとが直接結合することが特に好ましい。
具体的には、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２として採り得る置換基から水素原子が１つ除かれた状態で上記Ｘと結合するか、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２として採り得る水素原子が除かれ、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５又はＲ３２～Ｒ３５が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合する。
なかでも、上記Ｒは、上記Ｒ１１～Ｒ１３のいずれか１つにより上記Ｘと結合することが好ましく、Ｒ１１～Ｒ１３として採り得る水素原子のうちのいずれか１つが除かれ、Ｒ１１～Ｒ１３が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合することがより好ましく、Ｒ１２及び上記のインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３として採り得る水素原子のうちのいずれか１つが除かれ、Ｒ１２又は上記のインドレニン環に結合する炭素原子が有するＲ１３以外のＲ１３が結合していた炭素原子と上記Ｘとが直接結合することがさらに好ましく、上述のインドリン環及びインドレニン環からの結合原子数が等しくなる炭素原子と上記Ｘとが直接結合することが特に好ましい。
【0043】
（iii）Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。これらＲ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５として採りうるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子は、それぞれ、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子と同義である。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５のうち隣接する基同士が互いに結合して形成される縮合環としては、特に制限はないが、例えば、ナフタレン環が挙げられる。なお、会合抑制の観点から、Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５のうち隣接する基同士が互いに結合しておらず、縮合環を形成していないことが好ましい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基又はハロゲン原子を示す。これらＲ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、隣接する基同士が互いに結合して縮合環を形成していていてもよい。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５として採りうるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子は、それぞれ、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基、アルコキシ基、アリール基、スルホ基、スルファモイル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、ニトロ基及びハロゲン原子と同義である。
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５のうち隣接する基同士が互いに結合して形成される縮合環としては、特に制限はないが、例えば、ナフタレン環が挙げられる。なお、会合抑制の観点から、Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５のうち隣接する基同士が互いに結合しておらず、縮合環を形成していないことが好ましい。
【0044】
水溶性の向上および会合抑制の観点から、Ｒ２２～Ｒ２５の少なくとも１つとＲ３２～Ｒ３５の少なくとも１つとが親水性基を有することが好ましく、Ｒ２２～Ｒ２５が結合する環及びＲ３２～Ｒ３５が結合する環の数１つに付き少なくとも１つの親水性基を有することがより好ましい。例えば、Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５うち隣接する基同士が互いに結合して縮合環としてナフタレン環をそれぞれ形成している場合、Ｒ２２～Ｒ２５が結合する環の数は２つ、Ｒ３２～Ｒ３５が結合する環の数は２つとなり、Ｒ２２～Ｒ２５の少なくとも２つ及びＲ３２～Ｒ３５の少なくとも２つが親水性基を有することがより好ましいことを意味する。上限値は、構造として可能な限り特に制限されず、後述する化合物全体としての親水性基の数にあわせて、適宜調整することができる。
親水性基としては、特に制限されないが、例えば、置換基を有するアルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基が挙げられ、スルホ基が好ましい。
親水性基としては、特に制限されないが、例えば、置換基を有するアルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基が挙げられ、スルホ基が好ましい。
【0045】
Ｒ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５は、水素原子、アルキル基、スルホ基、ニトロ基又はハロゲン原子が好ましく、水素原子、アルキル基、スルホ基又はハロゲン原子がより好ましく、水素原子、アルキル基又はスルホ基がさらに好ましい。
【0046】
（iv）Ｒ４１及びＲ４２
Ｒ４１及びＲ４２は、各々独立に、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。
Ｒ４１及びＲ４２におけるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質に結合可能な置換基を挙げることができる。なお、上記のアルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基におけるアルキル基部分が、後述する生体物質に結合可能な置換基を有していてもよい。
Ｒ４１及びＲ４２は、各々独立に、アルキル基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１を示す。Ｒ２１及びｍは、上記のＲ２１及びｍと同義である。
Ｒ４１及びＲ４２におけるアルキル基が有していてもよい置換基としては、アルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。また、後述する生体物質に結合可能な置換基を挙げることができる。なお、上記のアルコキシ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、スルホ基及びホスホノ基並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基におけるアルキル基部分が、後述する生体物質に結合可能な置換基を有していてもよい。
【0047】
Ｒ４１及びＲ４２として採りうるアルキル基は、後述する置換基群Ｔにおけるアルキル基と同義である。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましい。
置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６がさらに好ましく、１～５がさらに好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数は、３～１４が好ましく、３～１２がより好ましく、３～１０がさらに好ましい。
無置換のアルキル基の炭素数は、１～６が好ましく、１～４がより好ましく、１～３がさらに好ましい。
置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６がさらに好ましく、１～５がさらに好ましい。また、置換基を有するアルキル基の最長鎖を構成する原子数は、３～１４が好ましく、３～１２がより好ましく、３～１０がさらに好ましい。
【0048】
Ｒ４１及びＲ４２として採り得る置換基を有するアルキル基としては、水溶性をより向上させる観点からは、アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基が好ましく、カルボキシ基及びスルホ基の少なくとも１つを置換基として有するアルキル基がより好ましい。なお、上記の好ましい置換基（アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基及びホスホノ基）と、これらの置換基以外の基との組合わせからなる置換基を有するアルキル基であってもよい。
また、上記Ｒ１～Ｒ４が採り得る、置換基を有するアルキル基の形態も好ましく適用できる。
また、上記Ｒ１～Ｒ４が採り得る、置換基を有するアルキル基の形態も好ましく適用できる。
【0049】
Ｒ４１及びＲ４２として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１は、上記Ｒ１～Ｒ４における－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１の記載を好ましく適用することができる。
Ｒ４１及びＲ４２として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１としては、Ｒ２１は無置換のアルキル基であるか、末端にカルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基であることが好ましい。末端にカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基がアルキル基に直接置換していてもよく、アルコキシカルボニル基とカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基との組み合わせからなる基として置換していてもよい。
Ｒ４１及びＲ４２として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１としては、Ｒ２１は無置換のアルキル基であるか、末端にカルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基であることが好ましい。末端にカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有するアルキル基である場合、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基がアルキル基に直接置換していてもよく、アルコキシカルボニル基とカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基との組み合わせからなる基として置換していてもよい。
【0050】
Ｒ４１及びＲ４２は互いに結合して環を形成していてもよい。
上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素のうち、Ｒ４１及びＲ４２が互いに結合して環を形成した構造としては、下記一般式（ＩＶ）で表されるシアニン色素が好ましく挙げられる。
上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素のうち、Ｒ４１及びＲ４２が互いに結合して環を形成した構造としては、下記一般式（ＩＶ）で表されるシアニン色素が好ましく挙げられる。
【0051】
【化10】
【0052】
式中、Ｌ３及びＬ４はアルキレン基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊を示す。＊はＵとの結合位置を示す。
連結基Ｕは原子数１～１００の２価の連結基を示す。
Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ２５、ｍ及びｎは上記一般式（ＩＩＩ）におけるＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ２５、ｍ及びｎと同義であり、特段の断りのない限り、好ましい範囲も同じである。
Ｒ１～Ｒ６、Ｌ１、Ｒ３１及びＬ３～Ｌ６の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは、上記ｍと同義である。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
連結基Ｕは原子数１～１００の２価の連結基を示す。
Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ２５、ｍ及びｎは上記一般式（ＩＩＩ）におけるＲ１～Ｒ４、Ｒ１１～Ｒ１３、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ２５、ｍ及びｎと同義であり、特段の断りのない限り、好ましい範囲も同じである。
Ｒ１～Ｒ６、Ｌ１、Ｒ３１及びＬ３～Ｌ６の少なくとも１つは－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む。ｍは、上記ｍと同義である。
ただし、式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部は、中性の構造部である。
【0053】
Ｌ３及びＬ４として採りうるアルキレン基は、Ｒ４１及びＲ４２として採りうる置換基を有するアルキル基から水素原子又は置換基を１つ除いて得られるアルキレン基に相当する。
Ｌ３及びＬ４として採りうるアルキレン基のアルキレン基部分の炭素数は、Ｒ４１及びＲ４２における置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。
Ｌ３及びＬ４として採りうるアルキレン基のアルキレン基部分の炭素数は、Ｒ４１及びＲ４２における置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。
【0054】
Ｌ３及びＬ４として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊は、Ｒ４１及びＲ４２として採りうる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－Ｒ２１（Ｒ２１は置換基を有するアルキル基を示す。）のうち、Ｒ２１としてのアルキル基から水素原子又は置換基を１つ除いて得られる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレンに相当する。
Ｌ３及びＬ４として採り得うる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊において、ｍは１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、アルキレン基部分の炭素数は、Ｒ４１及びＲ４２における置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。
Ｌ３及びＬ４として採り得うる－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキレン－＊において、ｍは１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、アルキレン基部分の炭素数は、Ｒ４１及びＲ４２における置換基を有するアルキル基のアルキル基部分の炭素数の記載を好ましく適用することができる。
【0055】
蛍光強度をより向上させる観点から、Ｌ３及びＬ４はいずれも、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことが好ましい。
【0056】
連結基Ｕを構成する総原子数は、１～１００であり、１０～９０が好ましく、２０～９０がより好ましく、３０～８０がさらに好ましい。
連結基Ｕは、アルキレン基、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－ＳＯ2ＮＲ50－から選ばれる３つ以上が結合して形成される２価の連結基であることが好ましい。Ｒ50は、水素原子又はアルキル基を示す。
連結基Ｕとして採り得るアルキレン基のアルキレン部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６が特に好ましく、１～５が最も好ましい。
Ｒ50として採り得るアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ４におけるアルキル基の記載を好ましく適用することができる。
Ｒ50としては水素原子が好ましい。
連結基Ｕを構成する上記のアルキレン基、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－ＳＯ2ＮＲ50－の数は、３～１１が好ましく、３～７がより好ましく、３～５がさらに好ましく、３が特に好ましい。
連結基Ｕは、Ｌ３及びＬ４との連結部が－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－であることが好ましい。すなわち、連結基Ｕは、連結基Ｕを構成する、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－を介して、Ｌ３及びＬ４のアルキレン基に対して結合していることが好ましい。連結基Ｕは、Ｌ３及びＬ４との連結部が－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－であって、上記の連結部同士がアルキレン基で結ばれた２価の連結基であることがより好ましい。
連結基Ｕは、カルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有する２価の連結基であることが好ましい。連結基Ｕにおいて、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する箇所としては、アルキレン基又はＲ50としてのアルキル基が挙げられ、アルキレン基が好ましい。
連結基Ｕにおいて、アルキレン基又はＲ50としてのアルキル基に対して、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基は直接結合していてもよく、連結基ＺＺＺを介して結合していてもよい。
上記連結基ＺＺＺとしては、アルキレン基、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－、並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。組み合わせる数は、例えば、２～７が好ましく、２～５がより好ましい。
Ｒ６０は上記Ｒ６０と同義であるが、Ｒ６０がカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有することはない。
ｐは繰り返し数を表し、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～４がさらに好ましい。
連結基Ｕは、アルキレン基、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－ＳＯ2ＮＲ50－から選ばれる３つ以上が結合して形成される２価の連結基であることが好ましい。Ｒ50は、水素原子又はアルキル基を示す。
連結基Ｕとして採り得るアルキレン基のアルキレン部分の炭素数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～７がさらに好ましく、１～６が特に好ましく、１～５が最も好ましい。
Ｒ50として採り得るアルキル基は、上記Ｒ１～Ｒ４におけるアルキル基の記載を好ましく適用することができる。
Ｒ50としては水素原子が好ましい。
連結基Ｕを構成する上記のアルキレン基、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－ＳＯ2ＮＲ50－の数は、３～１１が好ましく、３～７がより好ましく、３～５がさらに好ましく、３が特に好ましい。
連結基Ｕは、Ｌ３及びＬ４との連結部が－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－であることが好ましい。すなわち、連結基Ｕは、連結基Ｕを構成する、－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－を介して、Ｌ３及びＬ４のアルキレン基に対して結合していることが好ましい。連結基Ｕは、Ｌ３及びＬ４との連結部が－Ｏ－、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－又は－ＳＯ2ＮＲ50－であって、上記の連結部同士がアルキレン基で結ばれた２価の連結基であることがより好ましい。
連結基Ｕは、カルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有する２価の連結基であることが好ましい。連結基Ｕにおいて、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する箇所としては、アルキレン基又はＲ50としてのアルキル基が挙げられ、アルキレン基が好ましい。
連結基Ｕにおいて、アルキレン基又はＲ50としてのアルキル基に対して、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基は直接結合していてもよく、連結基ＺＺＺを介して結合していてもよい。
上記連結基ＺＺＺとしては、アルキレン基、－ＮＲ50－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＲ50－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｐ－、並びにこれらの置換基の組み合わせからなる基が挙げられる。組み合わせる数は、例えば、２～７が好ましく、２～５がより好ましい。
Ｒ６０は上記Ｒ６０と同義であるが、Ｒ６０がカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有することはない。
ｐは繰り返し数を表し、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～４がさらに好ましい。
【0057】
（ｖ）ｎ
ｎは、１～３の整数であって、２又は３の整数が好ましい。
ｎは、１～３の整数であって、２又は３の整数が好ましい。
【0058】
本発明の化合物が、Ｒとして上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有する場合、化合物中における少なくとも１つの上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、カルボキシ基又は後述する生体物質に結合可能な置換基を有する。
一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素において、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する位置に特に制限はないが、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ４１又はＲ４２のいずれかの位置に少なくとも１つ有することが好ましく、Ｒ４１又はＲ４２に少なくとも１つ有することがより好ましく、Ｒ４１とＲ４２とが連結して形成した環上に少なくとも１つ有することがさらに好ましい。
本発明の化合物中におけるカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基を有する基の数については、前述の通りである。
一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素において、カルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基を有する位置に特に制限はないが、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ４１又はＲ４２のいずれかの位置に少なくとも１つ有することが好ましく、Ｒ４１又はＲ４２に少なくとも１つ有することがより好ましく、Ｒ４１とＲ４２とが連結して形成した環上に少なくとも１つ有することがさらに好ましい。
本発明の化合物中におけるカルボキシ基または生体物質に結合可能な置換基を有する基の数については、前述の通りである。
【0059】
上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素において、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ４１及びＲ４２の少なくとも１つは、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含むことが好ましい。ｍは上記ｍと同義である。これにより、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有する本発明の化合物は適度な親水性と、適度な排除体積効果を有することができ、得られる標識生体物質は優れた蛍光強度を示すことができると考えられる。
【0060】
また、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素は、本発明の化合物として十分な親水性を付与する観点から、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素１分子あたりの親水性基の数は、２個以上であることが好ましく、２～８個であることがより好ましく、２～６個であることがさらに好ましく、３～６個であることが特に好ましい。
親水性基としては、前述のＲ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５が採りうる親水性基の記載を適用することができる。
親水性基の位置は、特段の断りがない限り特に制限されず、上記親水性基を有する基としては、例えば、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２が好ましく挙げられる。
なお、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素が、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基として上記親水性基を有する場合、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基の他に、親水性基を１個以上有することが実際的であり、好ましい。具体例としては、カルボキシ基又はスルホ基が挙げられる。
親水性基としては、前述のＲ２２～Ｒ２５及びＲ３２～Ｒ３５が採りうる親水性基の記載を適用することができる。
親水性基の位置は、特段の断りがない限り特に制限されず、上記親水性基を有する基としては、例えば、Ｒ２２～Ｒ２５、Ｒ３２～Ｒ３５、Ｒ４１又はＲ４２が好ましく挙げられる。
なお、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素が、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基として上記親水性基を有する場合、上記のカルボキシ基又は生体物質に結合可能な置換基の他に、親水性基を１個以上有することが実際的であり、好ましい。具体例としては、カルボキシ基又はスルホ基が挙げられる。
【0061】
以下に、本発明の化合物の具体例を示すが、本発明はこれらの化合物に限定されない。下記具体例において、スルホ基は、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。下記具体例において、ＥＯｍ、ｍＰＥＧ４及びＰＥＧ４は以下の構造を示し、ＥＯｍにおけるｍは平均繰り返し数であり、Ｍｅはメチル基を示す。ただし、ＥＯｍ及びＰＥＧ４は、窒素原子もしくは酸素原子に対して炭素原子側で結合する。
【0062】
【化11】
【0063】
【化12】
【0064】
【化13】
【0065】
【化14】
【0066】
【化15】
【0067】
本発明の化合物が生体物質に結合可能な置換基を有する場合、化合物が有する少なくとも１つの生体物質に結合可能な置換基によって、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質などの生体物質に結合させることができ、標識生体物質として用いることができる。
生体物質に結合可能な置換基としては、生体物質に作用（付着を含む）もしくは結合するための基であれば、特に制限することなく用いることができ、国際公開第２００２／０２６８９１号等に記載の置換基を挙げることができる。なかでも、ＮＨＳエステル構造（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スクシンイミド構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造（ポリアミノ酸構造）、長鎖アルキル基（好ましくは、炭素数１２～３０）、４級アンモニウム基が好ましく挙げられる。
生体物質に結合可能な置換基としては、生体物質に作用（付着を含む）もしくは結合するための基であれば、特に制限することなく用いることができ、国際公開第２００２／０２６８９１号等に記載の置換基を挙げることができる。なかでも、ＮＨＳエステル構造（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スクシンイミド構造、マレイミド構造、アジド基、アセチレン基、ペプチド構造（ポリアミノ酸構造）、長鎖アルキル基（好ましくは、炭素数１２～３０）、４級アンモニウム基が好ましく挙げられる。
【0068】
本発明の化合物のうち、生体物質に結合可能な置換基を少なくとも１つ有する化合物の具体例としては、例えば、本発明の化合物の例示化合物におけるカルボキシ基を後述する生体物質に結合可能な置換基に適宜置き換えた形態を、具体例として挙げられる。なお、本発明はこれらの化合物に限定されない。例えば、これらの具体例において、カルボキシ基及びスルホ基等の解離性の水素原子を有する基については、水素原子が解離して塩構造を採っていてもよい。
【0069】
本発明の化合物は、化合物構造を一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｍ、Ｌ及びＸの構造の合成については、Ａｃｉｄｏｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｓａｒｙｌｅｔｈｙｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓ： Ｈｙｄｒｏｘｙ ｖｅｒｓｕｓ Ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００９， ７４， ８９０９－８９１３及びＦｏｕｒｆｏｌｄ Ｓｕｚｕｋｉ－Ｍｉｙａｕｒａ ａｎｄ Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ Ｃｒｏｓｓ－Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｌ Ｍｅｔｈａｎｅ ａｎｄ Ａｄａｍａｎｔａｎｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１１， １７４３－１７５４等に記載の方法が挙げられ、シアニン色素の合成については、国際公開第２００５／０００２１８号、国際公開第２００６／０４７４５２号及び国際公開第２０１２／０１２５９５号等に記載の方法が挙げられる。
生体物質に結合可能な置換基を有する化合物は、化合物構造を一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著）を参照することができる。
生体物質に結合可能な置換基を有する化合物は、化合物構造を一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で規定する構造とすること以外は、公知の方法で合成できる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著）を参照することができる。
【0070】
＜＜標識生体物質＞＞
本発明の標識生体物質は、本発明の化合物と生体物質とが結合した物質である。本発明の化合物は蛍光性を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示すため、標識生体物質に好ましく用いることができる。一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と生体物質との結合は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と生体物質とが直接結合した形態でもよいし、連結基を介して連結した形態でもよい。
本発明の標識生体物質は、本発明の化合物と生体物質とが結合した物質である。本発明の化合物は蛍光性を有し、近赤外領域の発色用として適した吸収波長ピークと優れた蛍光強度を示すため、標識生体物質に好ましく用いることができる。一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と生体物質との結合は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物と生体物質とが直接結合した形態でもよいし、連結基を介して連結した形態でもよい。
【0071】
上記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖及び脂質が好ましく挙げられる。タンパク質としては抗体が好ましく挙げられ、脂質としてはリン脂質、脂肪酸及びステロールが好ましく挙げられ、リン脂質がより好ましい。
上記生体物質のうち、臨床病理的に有用な物質としては、特に制限されるものではないが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン、補体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、フェリチン、α１マイクログロブリン、β２マイクログロブリン等の血漿タンパク及びそれらの抗体、α－フェトプロテイン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立線性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ‐１２５等の腫瘍マーカー及びそれらの抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリン等のホルモン類及びそれらの抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原（ＨＢｓ、ＨＢｅ、ＨＢｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のウイルス感染関連物質及びそれらの抗体、等が挙げられる。
さらに、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ等のバクテリア及びそれらの抗体、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫等の原虫類及びそれらの抗体、ＥＬＭ３、ＨＭ１、ＫＨ２、ｖ６．５、ｖ１７．２、ｖ２６．２（由来マウス１２９、１２９／ＳＶ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ）等のＥＳ細胞及びそれらの抗体、フェニトイン、フェノバルビタール等の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキニシン等の心血管薬、テオフィリン等の抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン等の抗生物質等の薬物類及びそれらの抗体、その他の酵素、菌体外毒素（スチレリジンＯ等）及びそれらの抗体等も挙げられる。また、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の抗体断片も用いる事ができる。
上記生体物質のうち、臨床病理的に有用な物質としては、特に制限されるものではないが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン、補体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、フェリチン、α１マイクログロブリン、β２マイクログロブリン等の血漿タンパク及びそれらの抗体、α－フェトプロテイン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立線性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ‐１２５等の腫瘍マーカー及びそれらの抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）、エストロゲン、インスリン等のホルモン類及びそれらの抗体、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）関連抗原（ＨＢｓ、ＨＢｅ、ＨＢｃ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のウイルス感染関連物質及びそれらの抗体、等が挙げられる。
さらに、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ等のバクテリア及びそれらの抗体、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリバノゾーマ、マラリア原虫等の原虫類及びそれらの抗体、ＥＬＭ３、ＨＭ１、ＫＨ２、ｖ６．５、ｖ１７．２、ｖ２６．２（由来マウス１２９、１２９／ＳＶ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ）等のＥＳ細胞及びそれらの抗体、フェニトイン、フェノバルビタール等の抗てんかん薬、キニジン、ジゴキニシン等の心血管薬、テオフィリン等の抗喘息薬、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン等の抗生物質等の薬物類及びそれらの抗体、その他の酵素、菌体外毒素（スチレリジンＯ等）及びそれらの抗体等も挙げられる。また、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の抗体断片も用いる事ができる。
【0072】
本発明の化合物と生体物質が相互作用して結合した具体的な形態としては、例えば、下記に記載する形態が挙げられる。
ｉ）本発明の化合物中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合（例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合）又は共有結合、
ｉｉ）本発明の化合物中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜及び脂質などとのファンデルワールス力、
ｉｉｉ）本発明の化合物中のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
ｉｖ）本発明の化合物中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基（－ＳＨ）との反応によるチオエーテル結合、
ｖ）本発明の化合物中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのＣｌｉｃｋ反応又は本発明の化合物中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのＣｌｉｃｋ反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
上記ｉ）～ｖ）の形態以外にも、例えば、Ｌｕｃａｓ Ｃ． Ｄ． ｄｅ Ｒｅｚｅｎｄｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｉｏ ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｅｒｙ，． Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＢＯＤＩＰＹ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｏｒｂｉｔａｌ： Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， Ｖｏｌ ５， Ｎｏ． １， ｐ．６２－８３に記載の形態により結合することができる。また、本発明の標識生体物質の作製においても、同文献に記載の方法等を適宜参照することができる。
ｉ）本発明の化合物中のペプチドと生体物質中のペプチドとの非共有結合（例えば、水素結合、キレート形成を含むイオン結合）又は共有結合、
ｉｉ）本発明の化合物中の長鎖アルキル基と生体物質中の脂質二重膜及び脂質などとのファンデルワールス力、
ｉｉｉ）本発明の化合物中のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）と生体物質中のアミノ基との反応によるアミド結合、
ｉｖ）本発明の化合物中のマレイミド基と生体物質中のスルファニル基（－ＳＨ）との反応によるチオエーテル結合、
ｖ）本発明の化合物中のアジド基と生体物質中のアセチレン基とのＣｌｉｃｋ反応又は本発明の化合物中のアセチレン基と生体物質中のアジド基とのＣｌｉｃｋ反応によるトリアゾール環の形成、
が挙げられる。
上記ｉ）～ｖ）の形態以外にも、例えば、Ｌｕｃａｓ Ｃ． Ｄ． ｄｅ Ｒｅｚｅｎｄｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｉｏ ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｅｒｙ，． Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＢＯＤＩＰＹ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｏｒｂｉｔａｌ： Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， Ｖｏｌ ５， Ｎｏ． １， ｐ．６２－８３に記載の形態により結合することができる。また、本発明の標識生体物質の作製においても、同文献に記載の方法等を適宜参照することができる。
【0073】
本発明の化合物のうち、生体物質に結合可能な置換基を有する化合物と、これと相互作用により結合する生体物質とから得られる本発明の標識生体物質については、特開２０１９－１７２８２６号公報の段落００３８の化合物例及び生成物の記載において、生体物質に結合可能な置換基以外の部分を本発明の化合物における色素部分に置き換えた化合物ならびにその生成物が挙げられる。ただし、本発明はこれらの化合物等に限定されない。
【0074】
＜標識生体物質を含む試薬＞
本発明の標識生体物質を含む試薬において、本発明の標識生体物質は、例えば、生理食塩水及びリン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液形態、並びに、微粒子状粉末及び凍結乾燥粉末等の固形形態等、特に制限されることなく、使用目的等に応じてその形態を適宜選択することができる。
例えば、蛍光標識試薬として本発明の標識生体物質を用いる場合に、上記いずれかの形態の標識生体物質を含む試薬として使用することもできる。
本発明の標識生体物質を含む試薬において、本発明の標識生体物質は、例えば、生理食塩水及びリン酸緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液形態、並びに、微粒子状粉末及び凍結乾燥粉末等の固形形態等、特に制限されることなく、使用目的等に応じてその形態を適宜選択することができる。
例えば、蛍光標識試薬として本発明の標識生体物質を用いる場合に、上記いずれかの形態の標識生体物質を含む試薬として使用することもできる。
【0075】
＜標識生体物質の用途＞
本発明の化合物から得られる本発明の標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができ、光照射により励起された標識生体物質から放出される蛍光を安定的に検出することができる。このため、本発明の標識生体物質は、蛍光標識を用いた種々の技術に適用することができ、例えば、多色ＷＢ若しくはドットブロッティングにおける蛍光標識試薬又は生体蛍光イメージング試薬として好適に用いることができる。
本発明の化合物から得られる本発明の標識生体物質は、優れた蛍光強度を示すことができ、光照射により励起された標識生体物質から放出される蛍光を安定的に検出することができる。このため、本発明の標識生体物質は、蛍光標識を用いた種々の技術に適用することができ、例えば、多色ＷＢ若しくはドットブロッティングにおける蛍光標識試薬又は生体蛍光イメージング試薬として好適に用いることができる。
【0076】
本発明の標識生体物質を用いて行う蛍光検出は、通常、以下（ｉ）～（ｉｉｉ）または（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む。（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した一次抗体を用いる直接法に該当し、（ｉｖ）～（ｖｉｉ）の工程を含む蛍光検出は、本発明の化合物で蛍光標識した二次抗体を用いる間接法に該当する。
（ｉ）下記（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ用意する工程
（ａ）標的とする生体物質（以下、「標的生体物質」とも称す。）を含む試料
（ｂ）上記（ａ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ａ」とも称す。）
（ｉｉ）上記（ａ）における標的生体物質と、上記（ｂ）の本発明の標識生体物質Ａにおける一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ａ」とも称す。）を用意する工程
（ｉｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ａに、本発明の標識生体物質Ａが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ａが発する蛍光を検出する工程
（ｉｖ）下記（ｃ）～（ｅ）をそれぞれ用意する工程
（ｃ）標的生体物質を含む試料
（ｄ）上記（ｃ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）
（ｅ）上記（ｄ）の一次生体物質と結合可能な生体物質（以下、「二次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ｂ」とも称す。）
（ｖ）上記（ｃ）における標的生体物質と、上記（ｄ）の一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「結合体ｂ」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉ）上記結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の標識生体物質Ｂにおける二次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ｂ２」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ｂ２に、本発明の標識生体物質Ｂが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ｂが発する蛍光を検出する工程
（ｉ）下記（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ用意する工程
（ａ）標的とする生体物質（以下、「標的生体物質」とも称す。）を含む試料
（ｂ）上記（ａ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ａ」とも称す。）
（ｉｉ）上記（ａ）における標的生体物質と、上記（ｂ）の本発明の標識生体物質Ａにおける一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ａ」とも称す。）を用意する工程
（ｉｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ａに、本発明の標識生体物質Ａが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ａが発する蛍光を検出する工程
（ｉｖ）下記（ｃ）～（ｅ）をそれぞれ用意する工程
（ｃ）標的生体物質を含む試料
（ｄ）上記（ｃ）における標的生体物質と結合可能な生体物質（以下、「一次生体物質」とも称す。）
（ｅ）上記（ｄ）の一次生体物質と結合可能な生体物質（以下、「二次生体物質」とも称す。）と、本発明の化合物と、が結合した本発明の標識生体物質（以下、「本発明の標識生体物質Ｂ」とも称す。）
（ｖ）上記（ｃ）における標的生体物質と、上記（ｄ）の一次生体物質と、が結合した結合体（以下、「結合体ｂ」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉ）上記結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の標識生体物質Ｂにおける二次生体物質と、が結合した結合体（以下、「蛍光標識された結合体Ｂ２」とも称す。）を用意する工程
（ｖｉｉ）上記の蛍光標識された結合体Ｂ２に、本発明の標識生体物質Ｂが吸収する波長域の光を照射し、本発明の標識生体物質Ｂが発する蛍光を検出する工程
【0077】
上記の標的生体物質と結合可能な生体物質（一次生体物質）、及び、一次生体物質と結合可能な生体物質（二次生体物質）としては、上記本発明の標識生体物質における生体物質が挙げられる。標的生体物質（被検体中の生体物質）又は一次生体物質にあわせて適宜選択することができ、被検体中の生体物質又は一次生体物質に対して特異的に結合可能な生体物質を選択することができる。
【0078】
上記標的生体物質としては、タンパク質、いわゆる疾患マーカーが挙げられる。疾患マーカーとしては、特に制限はされるものではないが、例えば、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＢＣＡ２２５、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＤＵＰＡＮ－２、エラスターゼ１、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９、γ－セミノプロテイン（γ－Ｓｍ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｉｂａ１、アミロイドβ、タウ、フロチリン、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、シアリルＬｅＸ－ｉ抗原（ＳＬＸ）、ＳＰａｎ－１、組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、シリアルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、シフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＹＦＲＡ）ペプシノゲン（ＰＧ）、Ｃ－反応性タンパク（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡタンパク（ＳＡＡ）、ミオグロビン、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ等が挙げられる。
【0079】
上記標的生体物質は細菌でもよく、この細菌としては、細胞微生物学的検査の対象とされる細菌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌、公衆衛生に問題の生じる菌等が挙げられる。
【0080】
上記標的生体物質はウイルスでもよく、このウイルスとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原等の肝炎ウイルス抗原、ＨＩＶウイルスのｐ２４タンパク抗原、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）のｐｐ６５タンパク抗原、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）のＥ６及びＥ７タンパク等が挙げられる。
【0081】
上記（ｉ）または（ｉｖ）において、標的生体物質を含む試料は、特に制限されることなく、常法に従って調製することができる。
また、本発明の標識生体物質も、特に制限されることなく、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の化合物とを常法に従って結合させて調製することができる。結合の形態及び結合を形成する反応は、上記本発明の標識生体物質で説明した通りである。
また、本発明の標識生体物質も、特に制限されることなく、標的生体物質と結合可能な生体物質と本発明の化合物とを常法に従って結合させて調製することができる。結合の形態及び結合を形成する反応は、上記本発明の標識生体物質で説明した通りである。
【0082】
上記（ｖ）において、標的生体物質と一次生体物質とは、直接結合させても、標的生体物質及び一次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。また、上記（ｖｉ）において、結合体ｂにおける一次生体物質と、本発明の標識生体物質Ｂにおける二次生体物質とは、直接結合させても、一次生体物質及び二次生体物質とは異なるその他の生体物質を介して結合させてもよい。
本発明の標識生体物質は、直接法及び間接法のいずれにおける蛍光標識抗体としても用いることができるが、間接法における蛍光標識抗体として用いることが好ましい。
上記（ｉｉ）または（ｖ）及び（ｖｉ）において、本発明の標識生体物質等と標的生体物質との結合は、特に制限されることなく、常法に従って行うことができる。
本発明の標識生体物質は、直接法及び間接法のいずれにおける蛍光標識抗体としても用いることができるが、間接法における蛍光標識抗体として用いることが好ましい。
上記（ｉｉ）または（ｖ）及び（ｖｉ）において、本発明の標識生体物質等と標的生体物質との結合は、特に制限されることなく、常法に従って行うことができる。
【0083】
上記（ｉｉｉ）または（ｖｉｉ）において、本発明の標識生体物質を励起するための波長は、本発明の標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）であれば特に限定されない。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが１である化合物を用いた標識生体物質は、５８５ｎｍ付近（５６０～６２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は５３０～６５０ｎｍが好ましく、５５０～６３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、可視領域における６００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが２である化合物を用いた標識生体物質は、６８５ｎｍ付近（６６０～７２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は６３０～７５０ｎｍが好ましく、６５０～７３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における７００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが３である化合物を用いた標識生体物質は、７８５ｎｍ付近（７６０～８２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は７３０～８５０ｎｍが好ましく、７５０～８３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における８００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが１である化合物を用いた標識生体物質は、５８５ｎｍ付近（５６０～６２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は５３０～６５０ｎｍが好ましく、５５０～６３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、可視領域における６００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが２である化合物を用いた標識生体物質は、６８５ｎｍ付近（６６０～７２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は６３０～７５０ｎｍが好ましく、６５０～７３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における７００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
本発明の化合物のうち、蛍光体部Ｒとして前述の一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部を有し、ｎが３である化合物を用いた標識生体物質は、７８５ｎｍ付近（７６０～８２０ｎｍ）に吸収極大波長を有するため、照射する光の波長域は７３０～８５０ｎｍが好ましく、７５０～８３０ｎｍがより好ましい。この化合物を用いた標識生体物質は、多色ＷＢ等の近赤外領域における８００ｎｍ付近の励起光源に対して、優れた蛍光強度を示す標識生体物質として、好適に用いることができる。
【0084】
本発明に用いられる蛍光励起光源としては、本発明の標識生体物質を励起可能な発光波長（波長光）を発光するものであれば特に限定されず、例えば、各種レーザー光源を用いることができる。また、各種光学フィルターを用いて、好ましい励起波長を得たり、蛍光のみを検出したりする事ができる。
【0085】
上記（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるその他の事項については、特に制限されることなく、蛍光標識を用いる蛍光検出において通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
また、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）以外の工程についても、蛍光標識を用いる種々の手法にあわせて、通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
また、上記（ｉ）～（ｖｉｉ）以外の工程についても、蛍光標識を用いる種々の手法にあわせて、通常用いられる手法、試薬、装置等の条件を適宜選択することができる。
【0086】
例えば、本発明の標識生体物質を用いた多色ＷＢは、標的生体物質として通常用いられる手法（電気泳動によるタンパク質の分離、メンブレンへのブロッティング、メンブレンのブロッキング）によりブロットメンブレンを作製し、本発明の標識生体物質を標識抗体（好ましくは、二次抗体）として用いることにより、優れた蛍光強度で標的生体物質を検出することができる。本発明の標識生体物質を用いたドットブロッティングについても、多色ＷＢと同様、標的生体物質として通常用いられる手法によりブロットニトロセルロース膜又はブロットＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜等を作製し、本発明の標識生体物質を標識抗体（好ましくは、二次抗体）として用いることにより、優れた蛍光強度で標的生体物質を検出することができる。
【0087】
－ 置換基群Ｔ －
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Ｔから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本発明において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Ｔを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Ｔの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状（シクロ）アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）を含む基（アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等）、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、３以上であり、５以上が好ましい。
下記置換基群Ｔの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。
本発明において、好ましい置換基としては、下記置換基群Ｔから選ばれる置換基が挙げられる。
また、本発明において、単に置換基としてしか記載されていない場合は、この置換基群Ｔを参照するものであり、各々の基、例えば、アルキル基、が記載されているのみの場合は、この置換基群Ｔの対応する基が好ましく適用される。
さらに、本明細書において、アルキル基を環状（シクロ）アルキル基と区別して記載している場合、アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基を包含する意味で用いる。一方、アルキル基を環状アルキル基と区別して記載していない場合、及び、特段の断りがない場合、アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基及びシクロアルキル基を包含する意味で用いる。このことは、環状構造を採りうる基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）を含む基（アルコキシ基、アルキルチオ基、アルケニルオキシ基等）、環状構造を採りうる基を含む化合物についても同様である。基が環状骨格を形成しうる場合、環状骨格を形成する基の原子数の下限は、この構造を採りうる基について下記に具体的に記載した原子数の下限にかかわらず、３以上であり、５以上が好ましい。
下記置換基群Ｔの説明においては、例えば、アルキル基とシクロアルキル基のように、直鎖又は分岐構造の基と環状構造の基とを明確にするため、これらを分けて記載していることもある。
【0088】
置換基群Ｔに含まれる基としては、下記の基を含む。
アルキル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０、さらに好ましくは炭素数１～１２、さらに好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～６、特に好ましくは炭素数１～３）、アルケニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、アルキニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、シクロアルキル基（好ましくは炭素数３～２０）、シクロアルケニル基（好ましくは炭素数５～２０）、アリール基（単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。縮環の基である場合、５～７員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～３０、さらに好ましくは炭素数６～２６、特に好ましくは炭素数６～１０）、ヘテロ環基（環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。単環の基である場合、その環員数は５～７員が好ましく、５員又は６員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは２～４０、より好ましくは２～２０である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基（ヘテロアリール基）及び脂肪族ヘテロ環基（脂肪族複素環基）が包含される。）、アルコキシ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、アルケニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、アルキニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、シクロアルキルオキシ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールオキシ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは炭素数２～２０）、ポリアルキレンオキシ基（好ましくは炭素数２～４０、より好ましくは炭素数２～２０）、
アルキル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０、さらに好ましくは炭素数１～１２、さらに好ましくは炭素数１～８、さらに好ましくは炭素数１～６、特に好ましくは炭素数１～３）、アルケニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、アルキニル基（好ましくは炭素数２～３０、より好ましくは炭素数２～２０、さらに好ましくは炭素数２～１２、さらに好ましくは炭素数２～６、さらに好ましくは炭素数２～４）、シクロアルキル基（好ましくは炭素数３～２０）、シクロアルケニル基（好ましくは炭素数５～２０）、アリール基（単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。縮環の基である場合、５～７員環等からなる。アリール基は好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～３０、さらに好ましくは炭素数６～２６、特に好ましくは炭素数６～１０）、ヘテロ環基（環構成原子として少なくとも１つの窒素原子、酸素原子、硫黄原子、リン原子、ケイ素原子又はセレン原子を有し、単環の基であってもよく、縮環の基（好ましくは２～６環の縮環の基）であってもよい。単環の基である場合、その環員数は５～７員が好ましく、５員又は６員がより好ましい。ヘテロ環基の炭素数は好ましくは２～４０、より好ましくは２～２０である。ヘテロ環基は芳香族ヘテロ環基（ヘテロアリール基）及び脂肪族ヘテロ環基（脂肪族複素環基）が包含される。）、アルコキシ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、アルケニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、アルキニルオキシ基（好ましくは炭素数２～２０、より好ましくは炭素数２～１２）、シクロアルキルオキシ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールオキシ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは炭素数２～２０）、ポリアルキレンオキシ基（好ましくは炭素数２～４０、より好ましくは炭素数２～２０）、
【0089】
アルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数２～２０）、シクロアルコキシカルボニル基（好ましくは炭素数４～２０）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは炭素数６～２０）、アミノ基（好ましくは炭素数０～２０で、無置換アミノ基（－ＮＨ２）、（モノ－又はジ－）アルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アルキニルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルキルアミノ基、（モノ－又はジ－）シクロアルケニルアミノ基、（モノ－又はジ－）アリールアミノ基、（モノ－又はジ－）ヘテロ環アミノ基を含む。無置換アミノ基を置換する上記各基は置換基群Ｔの対応する基と同義である。）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのスルファモイル基が好ましい。）、アシル基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数２～１５）、アシルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０）、カルバモイル基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールのカルバモイル基が好ましい。）、
【0090】
アシルアミノ基（好ましくは炭素数１～２０）、アルキルチオ基（好ましくは炭素数１～２０、より好ましくは炭素数１～１２）、シクロアルキルチオ基（好ましくは炭素数３～２０）、アリールチオ基（好ましくは炭素数６～４０、より好ましくは炭素数６～２６、さらに好ましくは炭素数６～１４）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２～２０）、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基（好ましくは炭素数１～２０）、
【0091】
シリル基（好ましくは炭素数１～３０、より好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリル基が好ましい。）、シリルオキシ基（好ましくは炭素数１～２０で、アルキル、アリール、アルコキシもしくはアリールオキシが置換したシリルオキシ基が好ましい。）、ヒドロキシ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、酸素原子（具体的には、環を構成する＞ＣＨ２を＞Ｃ＝Ｏに置き換える）、カルボキシ基（－ＣＯ２Ｈ）、ホスホノ基〔－ＰＯ（ＯＨ）２〕、ホスホリル基〔－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）２〕、スルホ基（－ＳＯ３Ｈ）、ホウ酸基〔－Ｂ（ＯＨ）２〕、オニオ基（環状アンモニオを含むアンモニオ基、スルホニオ基、ホスホニオ基を含み、好ましくは炭素数０～３０、より好ましくは１～２０）、スルファニル基（－ＳＨ）、アミノ酸残基、又は、ポリアミノ酸残基が挙げられる。
また、カルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキル基（ｍはＲ１～Ｒ６におけるｍと同義である。）を置換基として有する上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノ基、スルファモイル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、アルキルチオ基、シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基が挙げられる。
また、カルボキシ基、ホスホノ基、スルホ基、オニオ基、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－アルキル基（ｍはＲ１～Ｒ６におけるｍと同義である。）を置換基として有する上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノ基、スルファモイル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバモイル基、アシルアミノ基、アルキルチオ基、シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、アルキル、シクロアルキルもしくはアリールスルホニル基が挙げられる。
【0092】
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、より好ましくは、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、アルコキシカルボニル基、シクロアルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基、シアノ基又はハロゲン原子であり、特に好ましくは、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロ環基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、アシルアミノ基又はシアノ基である。
【0093】
置換基群Ｔから選ばれる置換基は、特段の断りがない限り、上記の基を複数組み合わせてなる基をも含む。例えば、化合物又は置換基等がアルキル基、アルケニル基等を含むとき、これらは置換されていても置換されていなくてもよい。また、アリール基、ヘテロ環基等を含むとき、それらは単環でも縮環でもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。
【実施例0094】
以下に実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。なお、室温とは２５℃を意味する。
【0095】
実施例で用いた化合物（１－ＮＨＳ）～（５－ＮＨＳ）のカルボキシ体である化合物（１）～（５）、及び、比較化合物（１－ＮＨＳ）～（３－ＮＨＳ）を、以下に示す。
なお、実施例化合物において、特に記載しない場合にも、スルホ基は塩構造（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩あるいはＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）塩）を含んでいてもよい。ＥＯ３及びＥＯ４は、前述の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の具体例におけるＥＯ３及びＥＯ４と同義である。ｍは、平均繰り返し数を意味する。いずれの化合物も、平均繰り返し数の小数第一位が０である化合物を原料として用いて合成した。
なお、実施例化合物において、特に記載しない場合にも、スルホ基は塩構造（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、ＴＥＡ（トリエチルアミン）塩あるいはＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）塩）を含んでいてもよい。ＥＯ３及びＥＯ４は、前述の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の具体例におけるＥＯ３及びＥＯ４と同義である。ｍは、平均繰り返し数を意味する。いずれの化合物も、平均繰り返し数の小数第一位が０である化合物を原料として用いて合成した。
【0096】
【化16】
【0097】
【化17】
【0098】
【化18】
【0099】
以下に、各化合物の合成方法を詳しく説明するが、出発物質、色素中間体及び合成ルートはこれらに限定されるものではない。
以下の合成ルートにおいて、室温とは２５℃を意味する。
以下の合成ルートにおいて、室温とは２５℃を意味する。
【0100】
なお、以下に示す各成分の合成に用いた略語は下記の通りである。
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｐｄ／ＳＰｈｏｓ Ｇ３：ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（商品名）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、クロスカップリング用Ｐｄ触媒
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ａｃ：アセチル基
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチル基
Ｅｔ：エチル基
ＴＭＳ：トリメチルシリル基
Ｔｓ：ｐ－トルエンスルホニル基
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｐｄ／ＳＰｈｏｓ Ｇ３：ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（商品名）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、クロスカップリング用Ｐｄ触媒
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ａｃ：アセチル基
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチル基
Ｅｔ：エチル基
ＴＭＳ：トリメチルシリル基
Ｔｓ：ｐ－トルエンスルホニル基
【0101】
特に記載のない場合、逆相カラムクロマトグラフィーにおける担体は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８（商品名、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）またはＳｆａｒ Ｃ１８（商品名、Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を使用し、順相カラムクロマトグラフィーにおける担体は、Ｈｉ－Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎ（商品名、山善社製）を使用した。
逆相カラムクロマトグラフィー又は順相カラムクロマトグラフィーにおいて使用する溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「アセトニトリル：水＝０：１００→２０：８０」は、「アセトニトリル：水＝０：１００」の溶離液を「アセトニトリル：水＝２０：８０」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、２７６７（商品名、ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
逆相カラムクロマトグラフィー又は順相カラムクロマトグラフィーにおいて使用する溶離液における混合比は、容量比である。例えば、「アセトニトリル：水＝０：１００→２０：８０」は、「アセトニトリル：水＝０：１００」の溶離液を「アセトニトリル：水＝２０：８０」の溶離液へ変化させたことを意味する。
分取ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、２７６７（商品名、ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
【0102】
ＭＳスペクトルは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ〔商品名、Ｗａｔｅｒｓ社製、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）〕又はＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ〔商品名、島津製作所社製、イオン化法：ＥＳＩ及びＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＣｈｅｍｉｃａｌＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）を同時に行うイオン化法〕を用いて測定した。
【0103】
＜化合物（１－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）を合成した。
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）を合成した。
【0104】
【化19】
【0105】
【化20】
【0106】
【化21】
【0107】
１）化合物（１－Ｂ）の合成
１Ｌ容の三ツ口フラスコに化合物（１－Ａ）２０ｇ及び蒸留水１５０ｍｌを入れ、攪拌しているところへ、３０％塩酸水溶液７５ｍｌを滴下した。塩氷浴で冷却し、３℃以下を維持しながら、亜硝酸ナトリウム７ｇを蒸留水８０ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、その後０～３℃で４５分間攪拌した。続いて、塩化スズ（ＩＩ）３８ｇを蒸留水９０ｍｌと３０％ＨＣｌ ３０ｍｌに溶解した溶液をゆっくり滴下し、その後４０分間７℃以下で攪拌した。溶媒を濃縮して、残渣をイソプロパノールで洗浄し、化合物（１－Ｂ）１４ｇを得た。
１Ｌ容の三ツ口フラスコに化合物（１－Ａ）２０ｇ及び蒸留水１５０ｍｌを入れ、攪拌しているところへ、３０％塩酸水溶液７５ｍｌを滴下した。塩氷浴で冷却し、３℃以下を維持しながら、亜硝酸ナトリウム７ｇを蒸留水８０ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、その後０～３℃で４５分間攪拌した。続いて、塩化スズ（ＩＩ）３８ｇを蒸留水９０ｍｌと３０％ＨＣｌ ３０ｍｌに溶解した溶液をゆっくり滴下し、その後４０分間７℃以下で攪拌した。溶媒を濃縮して、残渣をイソプロパノールで洗浄し、化合物（１－Ｂ）１４ｇを得た。
【0108】
２）化合物（１－Ｄ）の合成
２００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｂ）１．９ｇ、酢酸（ＡｃＯＨ）２０ｍｌ、化合物（１－Ｃ）１．３ｇ及び酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）０．９８ｇを入れ、窒素雰囲気下１４０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→３５／６５）で精製し、化合物（１－Ｄ）０．９９ｇを得た。
２００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｂ）１．９ｇ、酢酸（ＡｃＯＨ）２０ｍｌ、化合物（１－Ｃ）１．３ｇ及び酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）０．９８ｇを入れ、窒素雰囲気下１４０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→３５／６５）で精製し、化合物（１－Ｄ）０．９９ｇを得た。
【0109】
３）化合物（１－Ｅ）の合成
化合物（１－Ｄ）４７８ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、ブタンスルトン６８０ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）０．１３２ｍｌを５０ｍｌ容のナスフラスコに入れ、１２０℃にて６時間加熱撹拌した。反応液へ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｅ）３４４ｍｇを得た。
化合物（１－Ｄ）４７８ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、ブタンスルトン６８０ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）０．１３２ｍｌを５０ｍｌ容のナスフラスコに入れ、１２０℃にて６時間加熱撹拌した。反応液へ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｅ）３４４ｍｇを得た。
【0110】
４）化合物（１－Ｆ）の合成
化合物（１－Ｄ）４７８ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、６－ブロモヘキサン酸７７２ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）０．１３２ｍｌを５０ｍｌ容のナスフラスコに入れ、１２０℃にて６時間加熱撹拌した。反応液へ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｆ）２９６ｍｇを得た。
化合物（１－Ｄ）４７８ｍｇ、スルホラン２ｍｌ、６－ブロモヘキサン酸７７２ｍｇ及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）０．１３２ｍｌを５０ｍｌ容のナスフラスコに入れ、１２０℃にて６時間加熱撹拌した。反応液へ、酢酸エチルを加え、沈殿を生じさせた。沈殿物を逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２０／１００）にて精製し、化合物（１－Ｆ）２９６ｍｇを得た。
【0111】
５）化合物（１－Ｈ）の合成
試験管に化合物（１－Ｅ）１８７ｍｇ、化合物（１－Ｇ）４３ｍｇ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）４９ｍｇ及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）２ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０℃で２時間攪拌した。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（１－Ｈ）１４１ｍｇを得た。
試験管に化合物（１－Ｅ）１８７ｍｇ、化合物（１－Ｇ）４３ｍｇ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）４９ｍｇ及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）２ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０℃で２時間攪拌した。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（１－Ｈ）１４１ｍｇを得た。
【0112】
６）化合物（１－Ｉ）の合成
試験管に化合物（１－Ｅ）９４ｍｇ、化合物（１－Ｆ）８８ｍｇ、化合物（１－Ｇ）４３ｍｇ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）４９ｍｇ及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）２ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０℃で２時間攪拌した。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（１－Ｉ）６３ｍｇを得た。
試験管に化合物（１－Ｅ）９４ｍｇ、化合物（１－Ｆ）８８ｍｇ、化合物（１－Ｇ）４３ｍｇ、酢酸カリウム（ＡｃＯＫ）４９ｍｇ及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）２ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０℃で２時間攪拌した。反応収束後、蒸留水を加え、逆相カラムクロマトグラフィー（溶離液：アセトニトリル／水＝０／１００→２５／７５）にて精製し、化合物（１－Ｉ）６３ｍｇを得た。
【0113】
７）化合物（１－Ｋ）の合成
２００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｊ）１０ｇ、塩化メチレン５０ｍＬ、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）６．３２ｍＬを加え、トリエチルアミン９．３ｍＬを室温でゆっくり滴下した。室温にて１時間撹拌したのち、溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→２５／７５）で精製し、化合物（１－Ｋ）１１．５ｇを得た。
２００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｊ）１０ｇ、塩化メチレン５０ｍＬ、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）６．３２ｍＬを加え、トリエチルアミン９．３ｍＬを室温でゆっくり滴下した。室温にて１時間撹拌したのち、溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→２５／７５）で精製し、化合物（１－Ｋ）１１．５ｇを得た。
【0114】
８）化合物（１－Ｌ）の合成
１００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｋ）２．４ｇ、トリメチルシリルアセチレン１．９ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）５００ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）８６ｍｇ、トリエチルアミン３０ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０ｍＬを加え、氷水で０℃まで冷却した。１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のＴＨＦ溶液１０ｍＬをゆっくり滴下し、０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→８０／２０）で精製し、化合物（１－Ｌ）１．１ｇを得た。
１００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｋ）２．４ｇ、トリメチルシリルアセチレン１．９ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）５００ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）８６ｍｇ、トリエチルアミン３０ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０ｍＬを加え、氷水で０℃まで冷却した。１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のＴＨＦ溶液１０ｍＬをゆっくり滴下し、０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→８０／２０）で精製し、化合物（１－Ｌ）１．１ｇを得た。
【0115】
９）化合物（１－Ｏ）の合成
３００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｍ）７ｇ、化合物（１－Ｎ）８．３ｇ、ＴＨＦ７０ｍＬを加えた。氷水で冷却しながら、ｔＢｕＯＫ５．４ｇをゆっくり加えた。窒素気流下、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去したのち、酢酸エチル５０ｍＬを加え、ろ過したのち、ろ液を溶媒を減圧留去した。順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→０／１００→酢酸エチル／メタノール５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｏ）７．８ｇを得た。
３００ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｍ）７ｇ、化合物（１－Ｎ）８．３ｇ、ＴＨＦ７０ｍＬを加えた。氷水で冷却しながら、ｔＢｕＯＫ５．４ｇをゆっくり加えた。窒素気流下、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去したのち、酢酸エチル５０ｍＬを加え、ろ過したのち、ろ液を溶媒を減圧留去した。順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→０／１００→酢酸エチル／メタノール５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｏ）７．８ｇを得た。
【0116】
１０）化合物（１－Ｐ）の合成
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｌ）２００ｍｇ、化合物（１－Ｏ）１．２ｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）１００ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）１２ｍｇ、トリエチルアミン１０ｍＬ、ＴＨＦ５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｐ）８５０ｍｇを得た。
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｌ）２００ｍｇ、化合物（１－Ｏ）１．２ｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）１００ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）１２ｍｇ、トリエチルアミン１０ｍＬ、ＴＨＦ５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｐ）８５０ｍｇを得た。
【0117】
１１）化合物（１－Ｑ）の合成
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｐ）８５０ｍｇ、トリメチルシリルアセチレン０．４８ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）８０ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）１１ｍｇ、トリエチルアミン５ｍＬ、ＴＨＦ２．５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０ｍＬを加え、氷水で０℃まで冷却した。１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液１ｍＬをゆっくり滴下し、０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｑ）５５０ｍｇを得た。
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｐ）８５０ｍｇ、トリメチルシリルアセチレン０．４８ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）８０ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）１１ｍｇ、トリエチルアミン５ｍＬ、ＴＨＦ２．５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０ｍＬを加え、氷水で０℃まで冷却した。１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドのＴＨＦ溶液１ｍＬをゆっくり滴下し、０℃にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｑ）５５０ｍｇを得た。
【0118】
１２）化合物（１－Ｒ）の合成
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｐ）１１０ｍｇ、化合物（１－Ｑ）１０２ｍｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）２０ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）２．８ｍｇ、トリエチルアミン５ｍＬ、ＴＨＦ２．５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬ、ＭｅＯＨ１ｍＬ、３Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液４４０μＬを加え、室温にて１時間撹拌した。酢酸エチル、飽和食塩水で分液後、有機層を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｒ）２８ｍｇを得た。
５０ｍｌ容のナスフラスコに化合物（１－Ｐ）１１０ｍｇ、化合物（１－Ｑ）１０２ｍｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）２０ｍｇ、ヨウ化銅（Ｉ）２．８ｍｇ、トリエチルアミン５ｍＬ、ＴＨＦ２．５ｍＬを加えた。真空脱気したのち、窒素気流下、８０℃で３時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、セライトろ過後、溶媒を減圧留去した。残渣に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍＬ、ＭｅＯＨ１ｍＬ、３Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液４４０μＬを加え、室温にて１時間撹拌した。酢酸エチル、飽和食塩水で分液後、有機層を減圧留去し、順相カラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／酢酸エチル＝０／１００→５０／５０）で精製し、化合物（１－Ｒ）２８ｍｇを得た。
【0119】
１３）化合物（１）の合成
試験管に化合物（１－Ｈ）８．９ｍｇ、化合物（１－Ｉ）８．６ｍｇ、化合物（１－Ｒ）７．７ｍｇ及び蒸留水３００μＬ、アセトニトリル３００μＬを加え、９５℃で攪拌した。この溶液へ、水酸化ナトリウム１ｍｇを蒸留水１００μＬに溶解した溶液を滴下して、９５℃で３０分撹拌した。反応液を室温に冷却し、分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施して、化合物（１）７．１ｍｇを得た。化合物（１）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２９７０、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２９６８
試験管に化合物（１－Ｈ）８．９ｍｇ、化合物（１－Ｉ）８．６ｍｇ、化合物（１－Ｒ）７．７ｍｇ及び蒸留水３００μＬ、アセトニトリル３００μＬを加え、９５℃で攪拌した。この溶液へ、水酸化ナトリウム１ｍｇを蒸留水１００μＬに溶解した溶液を滴下して、９５℃で３０分撹拌した。反応液を室温に冷却し、分取ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥を施して、化合物（１）７．１ｍｇを得た。化合物（１）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２９７０、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２９６８
【0120】
１４）化合物（１－ＮＨＳ）の合成
化合物（１）３．０ｍｇに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．３０ｍｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート １ｍｇを溶解させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液、及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を加えて１時間攪拌させた。その後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチル１．５ｍＬを加えて上澄みを除去、真空乾燥を施すことで化合物（１－ＮＨＳ）を得た。
化合物（１）３．０ｍｇに、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．３０ｍｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート １ｍｇを溶解させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液、及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）を加えて１時間攪拌させた。その後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチル１．５ｍＬを加えて上澄みを除去、真空乾燥を施すことで化合物（１－ＮＨＳ）を得た。
【0121】
＜化合物（２－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（２－ＮＨＳ）を合成した。化合物（２）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝３１９７、（Ｍ－Ｈ＋）－＝３１９５
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（２－ＮＨＳ）を合成した。化合物（２）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝３１９７、（Ｍ－Ｈ＋）－＝３１９５
【0122】
【化22】
【0123】
【化23】
【0124】
【化24】
【0125】
【化25】
【0126】
＜化合物（３－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（３－ＮＨＳ）を合成した。化合物(３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝３６１０、（Ｍ－Ｈ＋）－＝３６０８
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（３－ＮＨＳ）を合成した。化合物(３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝３６１０、（Ｍ－Ｈ＋）－＝３６０８
【0127】
【化26】
【0128】
【化27】
【0129】
＜化合物（４－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（４－ＮＨＳ）を合成した。化合物(４）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝４１７８、（Ｍ－Ｈ＋）－＝４１７６
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（４－ＮＨＳ）を合成した。化合物(４）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝４１７８、（Ｍ－Ｈ＋）－＝４１７６
【0130】
【化28】
【0131】
＜化合物（５－ＮＨＳ）の合成＞
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（５－ＮＨＳ）を合成した。化合物(５）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝８７２８、（Ｍ－Ｈ＋）－＝８７２６
下記のスキームに基づき、化合物（１－ＮＨＳ）と同様に化合物（５－ＮＨＳ）を合成した。化合物(５）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝８７２８、（Ｍ－Ｈ＋）－＝８７２６
【0132】
【化29】
【0133】
【化30】
【0134】
【化31】
【0135】
比較化合物（１－ＮＨＳ）はＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（商品名）である。
比較化合物（２－ＮＨＳ）は、Ｎ－（ａｃｉｄ－ＰＥＧ３）－Ｎ－ｂｉｓ（ＰＥＧ３－ａｍｉｎｅ） （ＢＲＯＡＤＰＨＡＲＭ社製、商品名：ＢＰ－２３８６８）と比較化合物（１－ＮＨＳ）とから得られた、比較化合物（２－ＮＨＳ）のカルボキシ体である化合物を用いて、上記の各ＮＨＳエステル体の合成と同様にして合成した。比較化合物（２－ＮＨＳ）のカルボキシ体である化合物のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２５４１、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２５３９
比較化合物（３－ＮＨＳ）は、下記スキームに基づき合成した比較化合物（３）を用いて、上記の各ＮＨＳエステル体の合成と同様にして合成した。比較化合物（３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２０４２、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２０４０
比較化合物（２－ＮＨＳ）は、Ｎ－（ａｃｉｄ－ＰＥＧ３）－Ｎ－ｂｉｓ（ＰＥＧ３－ａｍｉｎｅ） （ＢＲＯＡＤＰＨＡＲＭ社製、商品名：ＢＰ－２３８６８）と比較化合物（１－ＮＨＳ）とから得られた、比較化合物（２－ＮＨＳ）のカルボキシ体である化合物を用いて、上記の各ＮＨＳエステル体の合成と同様にして合成した。比較化合物（２－ＮＨＳ）のカルボキシ体である化合物のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２５４１、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２５３９
比較化合物（３－ＮＨＳ）は、下記スキームに基づき合成した比較化合物（３）を用いて、上記の各ＮＨＳエステル体の合成と同様にして合成した。比較化合物（３）のＭＳ測定の結果は以下の通りであった。
ＭＳ（ＥＳＩ ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ＋）＋＝２０４２、（Ｍ－Ｈ＋）－＝２０４０
【0136】
【化32】
【0137】
＜実施例１＞
上記の各化合物のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）体について、蛍光標識率、メンブレン上蛍光強度及びドットブロットを評価した。
なお、以降においては、各化合物のＮＨＳエステル体を単に「化合物」と略して称す。すなわち、化合物（１－ＮＨＳ）については化合物１と略して称し、化合物（２－ＮＨＳ）～（５－ＮＨＳ）並びに比較化合物（１－ＮＨＳ）～（３－ＮＨＳ）についても同様に、それぞれ化合物２～５並びに比較化合物１～３と略して称す。
上記の各化合物のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）体について、蛍光標識率、メンブレン上蛍光強度及びドットブロットを評価した。
なお、以降においては、各化合物のＮＨＳエステル体を単に「化合物」と略して称す。すなわち、化合物（１－ＮＨＳ）については化合物１と略して称し、化合物（２－ＮＨＳ）～（５－ＮＨＳ）並びに比較化合物（１－ＮＨＳ）～（３－ＮＨＳ）についても同様に、それぞれ化合物２～５並びに比較化合物１～３と略して称す。
【0138】
［０］蛍光標識抗体の作製
マイクロチューブに、抗ウサギＩｇＧ抗体（２．３ｍｇ／ｍｌ）２１７μＬ及び炭酸塩バッファー２１．７μＬを入れ、振とう撹拌を施した後、化合物１のジメチルスルホキシド溶液を、抗体に対して表１に示すモル当量比になるように加え、さらに振とう撹拌を行った。４℃にて２４間静置させ、反応液を遠心限外ろ過フィルター アミコンウルトラＵＦＣ５１００９６（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）とＰＢＳ溶液（リン酸緩衝食塩水）を用いて精製を施し、標識抗体１を得た。得られた標識抗体について、下記に示す方法により蛍光標識率を算出した。この蛍光標識率は、ＤＯＬ（抗体１分子あたりに結合した蛍光色素の分子数）を意味する。
同様にして、各化合物及び比較化合物の標識抗体を得た。表Ａに結果をまとめて示す。
マイクロチューブに、抗ウサギＩｇＧ抗体（２．３ｍｇ／ｍｌ）２１７μＬ及び炭酸塩バッファー２１．７μＬを入れ、振とう撹拌を施した後、化合物１のジメチルスルホキシド溶液を、抗体に対して表１に示すモル当量比になるように加え、さらに振とう撹拌を行った。４℃にて２４間静置させ、反応液を遠心限外ろ過フィルター アミコンウルトラＵＦＣ５１００９６（商品名、Ｍｅｒｃｋ社製）とＰＢＳ溶液（リン酸緩衝食塩水）を用いて精製を施し、標識抗体１を得た。得られた標識抗体について、下記に示す方法により蛍光標識率を算出した。この蛍光標識率は、ＤＯＬ（抗体１分子あたりに結合した蛍光色素の分子数）を意味する。
同様にして、各化合物及び比較化合物の標識抗体を得た。表Ａに結果をまとめて示す。
【0139】
蛍光標識率の算出方法は、下記に示すような一般的な手法を用いた。［ ］の中の記載は単位を示し、［－］は単位がないことを意味する。本試験においては、タンパク質は抗ウサギＩｇＧ抗体を意味する。
蛍光標識率＝蛍光色素の濃度／タンパク質の濃度
蛍光色素の濃度とは、標識されている蛍光色素の総モル濃度［Ｍ］を意味し、タンパク質の濃度とは、蛍光標識したタンパク質のモル濃度［Ｍ］を意味し、それぞれ、下記式により算出される。
蛍光色素の濃度＝Ｄｙｅｍａｘ／εｄｙｅ
タンパク質の濃度＝（ＩｇＧ２８０－（Ｄｙｅｍａｘ×ＣＦ））／εｐｒｏｔｅｉｎ
上記式中の各符号は、下記の通りである。
Ｄｙｅｍａｘ；蛍光色素の最大吸収波長における吸収［－］
εｄｙｅ；蛍光色素のモル吸光係数［Ｍ－１ｃｍ－１］
ＩｇＧ２８０；蛍光標識タンパク質の２８０ｎｍにおける吸収［－］
Ｄｙｅ２８０；蛍光色素の２８０ｎｍにおける吸収［－］
εｐｒｏｔｅｉｎ；タンパク質のモル吸光係数［Ｍ－１ｃｍ－１］
ＣＦ（Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）；Ｄｙｅ２８０／Ｄｙｅｍａｘ［－］
蛍光標識率＝蛍光色素の濃度／タンパク質の濃度
蛍光色素の濃度とは、標識されている蛍光色素の総モル濃度［Ｍ］を意味し、タンパク質の濃度とは、蛍光標識したタンパク質のモル濃度［Ｍ］を意味し、それぞれ、下記式により算出される。
蛍光色素の濃度＝Ｄｙｅｍａｘ／εｄｙｅ
タンパク質の濃度＝（ＩｇＧ２８０－（Ｄｙｅｍａｘ×ＣＦ））／εｐｒｏｔｅｉｎ
上記式中の各符号は、下記の通りである。
Ｄｙｅｍａｘ；蛍光色素の最大吸収波長における吸収［－］
εｄｙｅ；蛍光色素のモル吸光係数［Ｍ－１ｃｍ－１］
ＩｇＧ２８０；蛍光標識タンパク質の２８０ｎｍにおける吸収［－］
Ｄｙｅ２８０；蛍光色素の２８０ｎｍにおける吸収［－］
εｐｒｏｔｅｉｎ；タンパク質のモル吸光係数［Ｍ－１ｃｍ－１］
ＣＦ（Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）；Ｄｙｅ２８０／Ｄｙｅｍａｘ［－］
【0140】
【表A】
【0141】
（表の注）
標識抗体の欄において、化合物Ｚ－ＩｇＧ又は比較化合物Ｚ－ＩｇＧとの表記は、それぞれ、化合物ＺのＩｇＧ標識抗体又は比較化合物ＺのＩｇＧ標識抗体を意味する。Ｚは、各化合物の番号を意味する。以降の表においても同義である。
標識抗体の欄において、化合物Ｚ－ＩｇＧ又は比較化合物Ｚ－ＩｇＧとの表記は、それぞれ、化合物ＺのＩｇＧ標識抗体又は比較化合物ＺのＩｇＧ標識抗体を意味する。Ｚは、各化合物の番号を意味する。以降の表においても同義である。
【0142】
上記表Ａの結果から、以下のことがわかる。
本発明の化合物である化合物１～５は、抗体に対して３当量、５当量、１０当量及び２５当量のいずれのモル当量で添加した場合にも、市販の標識化合物である比較化合物１を用いた場合と同程度又はそれ以上の蛍光標識率を示しており、抗体への結合性としては、実用上問題のない十分なレベルを示していた。このことは、Ｎｏ．ｃＡ１１とＮｏ．Ａ１～Ａ５との対比から読み取ることができる。
なかでも、化合物２～５は、蛍光体部Ｒとして有する一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素のうちの少なくとも１つのシアニン色素が、Ｒ４１及びＲ４２が互いに結合してなる置換基上に生体物質に結合可能な置換基を有し、より高い蛍光標識率を示すことがわかる（Ｎｏ．Ａ１に対するＮｏ．Ａ２～Ａ５）。
本発明の化合物である化合物１～５は、抗体に対して３当量、５当量、１０当量及び２５当量のいずれのモル当量で添加した場合にも、市販の標識化合物である比較化合物１を用いた場合と同程度又はそれ以上の蛍光標識率を示しており、抗体への結合性としては、実用上問題のない十分なレベルを示していた。このことは、Ｎｏ．ｃＡ１１とＮｏ．Ａ１～Ａ５との対比から読み取ることができる。
なかでも、化合物２～５は、蛍光体部Ｒとして有する一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素のうちの少なくとも１つのシアニン色素が、Ｒ４１及びＲ４２が互いに結合してなる置換基上に生体物質に結合可能な置換基を有し、より高い蛍光標識率を示すことがわかる（Ｎｏ．Ａ１に対するＮｏ．Ａ２～Ａ５）。
【0143】
［１］溶液蛍光強度の評価
上記で作製した標識抗体の溶液を、タンパク質濃度０．００５ｍｇ／ｍＬに調整し、分光蛍光強度計（商品名：ＲＦ－５３００、島津製作所社製）を用いて、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表１に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
上記で作製した標識抗体の溶液を、タンパク質濃度０．００５ｍｇ／ｍＬに調整し、分光蛍光強度計（商品名：ＲＦ－５３００、島津製作所社製）を用いて、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度の積分値を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表１に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
【0144】
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
【0145】
【表1】
【0146】
上記表１の結果から、以下のことがわかる。
比較化合物２は、蛍光体部を連結する基がポリオキシアルキレン基である点で、本発明で規定する構造ではなく、比較化合物３は、蛍光体部を連結する基がフェニレン基とポリオキシアルキレン基とからなる点で、本発明で規定する構造ではない。これらの比較化合物２又は３を用いた標識抗体の溶液での蛍光強度は、低かった（Ｎｏ．ｃ１２及びｃ１３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ１１に対するＮｏ．１０１～１０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．１０１～１０５、ｃ１１～ｃ１３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、溶液の状態においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．１０１及び１０２に対するＮｏ．１０３～１０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、溶液の状態においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．１０３及び１０４に対するＮｏ．１０５）。
比較化合物２は、蛍光体部を連結する基がポリオキシアルキレン基である点で、本発明で規定する構造ではなく、比較化合物３は、蛍光体部を連結する基がフェニレン基とポリオキシアルキレン基とからなる点で、本発明で規定する構造ではない。これらの比較化合物２又は３を用いた標識抗体の溶液での蛍光強度は、低かった（Ｎｏ．ｃ１２及びｃ１３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ１１に対するＮｏ．１０１～１０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．１０１～１０５、ｃ１１～ｃ１３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、溶液の状態においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．１０１及び１０２に対するＮｏ．１０３～１０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、溶液の状態においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．１０３及び１０４に対するＮｏ．１０５）。
【0147】
［２］メンブレン上蛍光強度評価
抗ウサギＩｇＧ溶液をタンパク質濃度５．０ｎｇ／ｍＬに調整し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。膜を室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。ブロッキング溶液を取り除き、標識抗体のＰＢＳ溶液をＴＢＳ緩衝液で２００００倍希釈した。メンブレンを希釈した溶液に浸し、１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ緩衝液で１０分間、３回洗浄し、最後にＴＢＳ緩衝液で１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表２に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
抗ウサギＩｇＧ溶液をタンパク質濃度５．０ｎｇ／ｍＬに調整し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。膜を室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。ブロッキング溶液を取り除き、標識抗体のＰＢＳ溶液をＴＢＳ緩衝液で２００００倍希釈した。メンブレンを希釈した溶液に浸し、１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ緩衝液で１０分間、３回洗浄し、最後にＴＢＳ緩衝液で１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表２に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
【0148】
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
【0149】
【表2】
【0150】
上記表２の結果から、以下のことがわかる。
上述の通り、本発明で規定する構造を有しない比較化合物２又は３を用いた標識抗体のメンブレン上における蛍光強度は、いずれも低かった（Ｎｏ．ｃ２２及びｃ２３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ２１に対するＮｏ．２０１～２０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．２０１～２０５、ｃ２１～ｃ２３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、メンブレン上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．２０１及び２０２に対するＮｏ．２０３～２０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、メンブレン上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．２０３及び２０４に対するＮｏ．２０５）。
上述の通り、本発明で規定する構造を有しない比較化合物２又は３を用いた標識抗体のメンブレン上における蛍光強度は、いずれも低かった（Ｎｏ．ｃ２２及びｃ２３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ２１に対するＮｏ．２０１～２０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．２０１～２０５、ｃ２１～ｃ２３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、メンブレン上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．２０１及び２０２に対するＮｏ．２０３～２０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、メンブレン上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．２０３及び２０４に対するＮｏ．２０５）。
【0151】
［３］ドットブロット評価
トランスフェリン（２０ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳ－Ｔ緩衝液で５０ｎｇ／ｍＬに調整し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。続いて、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液３０ｍＬにウサギ抗ヒトトランスフェリンのポリクローナル抗体６μＬを加え、メンブレンを浸して１時間振とうした。その後、メンブレンを取り出し、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で４回洗浄した。その後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液３０ｍＬに標識抗体（抗ウサギＩｇＧ）１５μＬを加え、そこにメンブレンを浸し、室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ緩衝液で１０分間、３回洗浄し、最後にＴＢＳ緩衝液で１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表３に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
トランスフェリン（２０ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳ－Ｔ緩衝液で５０ｎｇ／ｍＬに調整し、２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。メンブレンを乾燥後、次いでＴＢＳ－Ｔ中、Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎブロッキング緩衝液でブロックした。続いて、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液３０ｍＬにウサギ抗ヒトトランスフェリンのポリクローナル抗体６μＬを加え、メンブレンを浸して１時間振とうした。その後、メンブレンを取り出し、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で４回洗浄した。その後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液３０ｍＬに標識抗体（抗ウサギＩｇＧ）１５μＬを加え、そこにメンブレンを浸し、室温で１時間攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ緩衝液で１０分間、３回洗浄し、最後にＴＢＳ緩衝液で１０分洗浄した。得られたメンブレンを４０℃のホットプレートで１時間乾燥させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨＣ社製）を用いて画像化し、７８５ｎｍの励起光で、露光条件を統一して、蛍光波長８１０～８４０ｎｍの範囲の蛍光強度を算出した。比較化合物１－ＩｇＧのＤＯＬ２．１の蛍光強度を基準値とし、この基準値に対する比を算出し、以下の評価基準に基づき評価した。表３に結果をまとめて示す。
本試験において、蛍光強度は、評価ランク「Ｄ」以上が合格である。
【0152】
－ 蛍光強度の評価基準 －
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
Ａ：基準値に対する蛍光強度の比が７．０倍以上
Ｂ：基準値に対する蛍光強度の比が４．０倍以上７．０倍未満
Ｃ：基準値に対する蛍光強度の比が２．５倍以上４．０倍未満
Ｄ：基準値に対する蛍光強度の比が１．５倍以上２．５倍未満
Ｅ：基準値に対する蛍光強度の比が１．２倍以上１．５倍未満
Ｆ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍以上１．２倍未満
Ｇ：基準値に対する蛍光強度の比が０．８倍未満
【0153】
【表3】
【0154】
上記表３の結果から、以下のことがわかる。
上述の通り、本発明で規定する構造を有しない比較化合物２又は３を用いた標識抗体のドットブロット上における蛍光強度は、いずれも低かった（Ｎｏ．ｃ３２及びｃ３３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ３１に対するＮｏ．３０１～３０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．３０１～３０５、ｃ３１～ｃ３３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、ドットブロット上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．３０１及び３０２に対するＮｏ．３０３～３０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、ドットブロット上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．３０３及び３０４に対するＮｏ．３０５）。
上述の通り、本発明で規定する構造を有しない比較化合物２又は３を用いた標識抗体のドットブロット上における蛍光強度は、いずれも低かった（Ｎｏ．ｃ３２及びｃ３３）。
これに対して、本発明の化合物１～５の標識抗体は、いずれも、上記比較標識抗体１の蛍光強度に対して１．５倍以上の蛍光強度を有し、優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．ｃ３１に対するＮｏ．３０１～３０５）。また、比較化合物１～３を用いた場合には、ＤＯＬの増加に伴って、自己会合による蛍光強度の低下がみられたのに対し、本発明の化合物１～５の標識抗体では、ＤＯＬの増加に伴う自己会合による蛍光強度の低下が効果的に抑制されていることがわかった（各Ｎｏ．３０１～３０５、ｃ３１～ｃ３３における、ａ～ｄ間の蛍光強度の参照）。
なかでも、蛍光体部Ｒ間を結ぶ連結基上に親水性基を有し、さらに、一般式（ＩＩＩ）で表されるシアニン色素からなる構造部として、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つとＲ３及びＲ４の少なくとも１つとが、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－で表される構造を含む構造部を有する本発明の化合物３～５は、ドットブロット上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．３０１及び３０２に対するＮｏ．３０３～３０５）。特に、蛍光体部Ｒ間を３価以上の連結基Ｍを用いて結合している本発明の化合物５を用いた標識抗体は、蛍光色素１分子中における蛍光体部Ｒの数に応じ、ドットブロット上においてより優れた蛍光強度を示していた（Ｎｏ．３０３及び３０４に対するＮｏ．３０５）。
【0155】
このように、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、２つ以上の蛍光体部Ｒを－Ｘ－Ｌ－Ｘ－又は－Ｘ－Ｌ－Ｍ－Ｌ－Ｘ－で表される連結基で結合した化合物であって、上記Ｌが－Ｃ≡Ｃ－、アリーレン及びヘテロアリーレン基のうちの少なくとも２つを組合わせてなる２価の連結基であって、Ｘがエーテル結合、チオエーテル結合、アルキレン基、アミド結合、エステル結合又はアミノ結合であることにより、得られる標識生体物質に、溶液、メンブレン、ドットプロットのいずれの状態においても、優れた蛍光強度を付与することができる。