特開 2022-132160 がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022132160

(43)【公開日】2022-09-07

(54)【発明の名称】がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20220831BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220831BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 31/525 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20220831BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220831BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/06

A61K31/525

A61K31/519

C12N15/12 ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022026434

(22)【出願日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】P 2021029585

(32)【優先日】2021-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(71)【出願人】

【識別番号】509346689

【氏名又は名称】学校法人都築学園

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】大塩 貴子

(72)【発明者】

【氏名】園下 将大

(72)【発明者】

【氏名】市川 聡

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 悠介

(72)【発明者】

【氏名】藤井 清永

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084AA19

4C084AA20

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZC202

4C084ZC412

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB09

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】新規の作用機序による、すなわち、リボフラビン経路の阻害を介した、がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせを提供する。
【解決手段】がんの治療又は予防剤は、ＲＦ経路阻害剤を有効成分として含有する。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＦ経路阻害剤を有効成分として含有する、がんの治療又は予防剤。

【請求項2】

前記がんは、膵がんである、
ことを特徴とする請求項１に記載のがんの治療又は予防剤。

【請求項3】

前記ＲＦ経路阻害剤は、ロゼオフラビンである、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のがんの治療又は予防剤。

【請求項4】

さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有する、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のがんの治療又は予防剤。

【請求項5】

前記ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブである、
ことを特徴とする請求項４に記載のがんの治療又は予防剤。

【請求項6】

がんの治療又は予防のための、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせ。

【請求項7】

前記がんは、膵がんである、
ことを特徴とする請求項６に記載の組み合わせ。

【請求項8】

前記ＲＦ経路阻害剤は、ロゼオフラビンである、
ことを特徴とする請求項６又は７に記載の組み合わせ。

【請求項9】

前記ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブである、
ことを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせに関する。

【背景技術】

【0002】

膵がんは、早期発見が困難で、かつ有効な治療法がほとんど存在しない代表的な難治がんである。膵がん死は今後も世界的に増加することが確実視されており、その発症機序の解明や新規治療法の開発は喫緊の福祉課題である（非特許文献１）。

【0003】

膵がんでは、がん遺伝子ＫＲＡＳの活性化変異や、がん抑制遺伝子群ＴＰ５３・Ｐ１６・ＳＭＡＤ４の不活性化変異がそれぞれ４０～９０％の患者に観察され、最も予後の悪い患者群はこれら４遺伝子全ての変異を有する（非特許文献２、３）。

【0004】

リボフラビンは、ビタミンＢ２とも呼ばれ、水溶性ビタミンに分類される生理活性物質である。哺乳類はリボフラビンを体内で産生できないため、食物等を介してこれを取り入れる必要があり、これが欠乏すると成長の停止、角膜炎、皮膚炎、口内炎等が生じる。リボフラビンには様々な類縁体が存在するが、リボフラビン類縁体の一つであるロゼオフラビンは、抗菌薬として知られている（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｒａｈｉｂ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｎ １；７４（１１）：２９１３－２１．

【非特許文献2】Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；４（３）：ｅ１７３４２０．

【非特許文献3】Ｍａｋｏｈｏｎ－Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ Ｓｅｐ；１６（９）：５５３－６５．

【非特許文献4】Ｐｅｄｒｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ １５；８２（１２）：１８５３－９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

がんの死亡数及び罹患数は、人口の高齢化を主な要因として、ともに増加し続けており、特に、膵がんをはじめとする予後が不良な難治がんに対する有効な治療法の開発が待たれている状況にあった。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、新規の作用機序による、すなわち、リボフラビン経路の阻害を介した、がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るがんの治療又は予防剤は、
ＲＦ経路阻害剤を有効成分として含有する。

【0009】

例えば、前記がんは、膵がんである。

【0010】

例えば、前記ＲＦ経路阻害剤は、ロゼオフラビンである。

【0011】

例えば、さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有する。

【0012】

例えば、前記ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブである。

【0013】

本発明の第２の観点に係る組み合わせは、
がんの治療又は予防のための、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせである。

【0014】

例えば、前記がんは、膵がんである。

【0015】

例えば、前記ＲＦ経路阻害剤は、ロゼオフラビンである。

【0016】

例えば、前記ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブである。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、新規の作用機序による、すなわち、リボフラビン経路の阻害を介した、がんの治療又は予防剤、及びがんの治療又は予防のためのＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】４－ｈｉｔハエにキナーゼ遺伝子のヘテロ接合性変異を導入して、キナーゼヘテロ接合性変異４－ｈｉｔハエを作出するプロトコールの概略を示す図である。

【図2】ＲＦＫ（リボフラビンキナーゼ）ヘテロ接合性変異の導入による４－ｈｉｔハエの生存率の回復を示すグラフ図である。

【図3】特定の遺伝子をノックダウンした４－ｈｉｔハエを作出するプロトコールの概略を示す図である。

【図4】ＲＦ経路関連遺伝子ノックダウンによる４－ｈｉｔハエの生存率の回復を示すグラフ図である。

【図5】培養ヒト膵がん細胞株におけるロゼオフラビンによる相対生存率への影響を示すグラフ図であり、（ａ）はＭＩＡＰａＣａ－２、（ｂ）ＰＡＮＣ－１、（ｃ）Ｃａｐａｎ－１のグラフ図である。

【図6】ロゼオフラビンによるＲＦ経路阻害の概略を示す図である。

【図7】ロゼオフラビンとトラメチニブとの併用による培養ヒト膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１）におけるスフェロイド形成の抑制を示すグラフ図であり、（ａ）は培養２１日目の各群の写真図であり、（ｂ）は培養２１日目の各群におけるスフェロイドの数をサイズごとに計測したグラフ図である。

【図8】ロゼオフラビンとトラメチニブとの併用による培養ヒト膵がん細胞株（Ｃａｐａｎ－１）におけるスフェロイド形成の抑制を示すグラフ図であり、（ａ）は培養２１日目の各群の写真図であり、（ｂ）は培養２１日目の各群におけるスフェロイドの数をサイズごとに計測したグラフ図である。

【図9】ロゼオフラビンとトラメチニブとの併用による４－ｈｉｔハエ生存率の回復を示すグラフ図である。

【図10】ロゼオフラビンとトラメチニブとの併用によるヒト膵がん細胞同所移植マウスにおける腫瘍抑制を示すグラフ図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

（１．がんの治療又は予防剤）
本発明によるがんの治療又は予防剤は、ＲＦ経路阻害剤を有効成分として含有する。

【0020】

本明細書において「がんの治療」は、がんの進行の遅延又は停止、がんの寛解又は一時的寛解、がん病変の退縮又は消失、がん細胞の増殖抑制、がんの再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される治療的介入を包含する。また、「がんの治療剤」とは、がんの進行を遅延又は停止する剤、がんを寛解させる剤又は一時的に寛解させる剤、がん病変を退縮又は消失する剤、がん細胞の増殖を抑制させる剤、がんの再発を防止する剤等を指す。

【0021】

本明細書において「がんの予防」は、がんの発症又は罹患の予防、がん病変の発生の予防、前がん状態の発生の予防等を含む、種々の目的の医学的に許容される予防的介入を包含する。また、「がんの予防剤」とは、がんの発症又は罹患を予防する剤、がん病変の発生を予防する剤、前がん状態の発生を予防する剤等を指す。

【0022】

本明細書において「がん」とは、例えば、膵がん、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病）、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、成人Ｔ細胞白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫））、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、頭頸部癌、消化管癌（例えば、食道癌、食道腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、胆嚢・胆管癌、胆道癌、甲状腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（例えば、扁平上皮非小細胞肺癌、非扁平上皮非小細胞肺癌）、小細胞肺癌）、乳癌、泌尿生殖器癌（例えば、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、子宮頚癌、子宮体癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰部癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、尿路上皮癌（例えば、膀胱癌、上部尿路癌）、前立腺癌、精巣腫瘍（例えば、胚細胞腫瘍））、骨・軟部肉腫、皮膚癌（例えば、ブドウ膜悪性黒色腫、メラノーマ、メルケル細胞癌）、神経膠腫、脳腫瘍（例えば、膠芽腫）、胸膜中皮腫及び原発不明癌）等が挙げられるが、これらに限定されない。がんは、好ましくは膵がんである。膵がんとしては、外分泌腫瘍、例えば浸潤性膵管がん、膵腺房細胞がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍等、及び内分泌腫瘍、例えば神経内分泌腫瘍等を挙げることができる。

【0023】

本明細書において、ＲＦ経路とは、ＲＦ（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ：リボフラビン）代謝経路を指す。ＲＦは食物に含まれる栄養素（別名：ビタミンＢ２）であって、細胞膜に局在するＲＦＴ（ＲＦトランスポーター）を介して細胞内に取り込まれ、ＲＦＫ（ＲＦキナーゼ）によってリン酸化されてＦＭＮ（Ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）となる。ＲＦＫは、ＲＦ代謝の律速酵素である。ＦＭＮはさらに、ＦＬＡＤ１（ＦＡＤ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ １）によってＦＡＤ（Ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）に変換される。ＦＭＮ及びＦＡＤは補酵素として様々なフラボタンパクと結合し、エネルギー産生や酸化還元反応など恒常性の維持に重要な各種代謝反応を調節する（Ｌｉｅｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０１３ Ｊｕｌ １５；５３５（２）：１５０－６２．）。

【0024】

本明細書において「ＲＦ経路阻害剤」とは、ＲＦ経路に関与する物質のうち１種以上に作用することによって、ＲＦ経路を阻害する剤を意味する。したがって、ＲＦ経路阻害剤が作用するのは、ＲＦ、ＲＦＴ、ＲＦＫ、ＦＭＮ、ＦＬＡＤ１、ＦＡＤのいずれであってもよく、これら以外の物質に作用してＲＦ経路を阻害してもよい。すなわち、「ＲＦ経路阻害剤」のＲＦ経路「阻害」の形態は、例えば、（ｉ）ＲＦと競合する、（ｉｉ）直接的にＲＦＴ、ＲＦＫ、ＦＭＮ、ＦＬＡＤ１又はＦＡＤの機能を阻害する、（ｉｉｉ）ＲＦ経路上の上記以外の物質の機能に必要な物質を捕捉するなどして間接的にＲＦ経路を阻害する等、特に制限はない。

【0025】

「ＲＦ経路阻害剤」は、例えば、ＲＦ類縁体（リボフラビン類縁体）である。本明細書において「ＲＦ類縁体」とは、リボフラビンと構造が類似しており、リボフラビン中の一部の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置換された化合物であって、ＲＦ経路阻害能を有する化合物を指す。ＲＦ類縁体として、例えば、ロゼオフラビン、Ｔ３０８４７１を挙げることができる。ＲＦ類縁体は、好ましくはロゼオフラビンである。

【0026】

本発明によるがんの治療又は予防剤は、ＲＦ経路阻害剤の他に、さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有していてもよい。

【0027】

ＭＥＫ（ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）／ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）キナーゼ）は、ＭＡＰＫカスケードを構成するプロテインキナーゼの１種である。ＭＡＰＫカスケードは、細胞増殖、成長、分化及びアポトーシスといった多種多様な細胞プロセスを制御する複雑なシグナル伝達ネットワークを形成している。ＭＥＫを阻害することにより細胞増殖が停止してアポトーシスが誘導されることから、ＭＥＫは抗がん剤のターゲット分子として注目されており、様々なＭＥＫ阻害剤が報告されている。

【0028】

本発明において用いられるＭＥＫ阻害剤の例としては、トラメチニブ（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ（Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）、ビニメチニブ（Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）、セルメチニブ（Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）、ピマセルチブ（Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）、ミルダメチニブ（Ｍｉｒｄａｍｅｔｉｎｉｂ）、レファメチニブ（Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ＢＩＸ０２１８８、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ３１８０８８、Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ、ＢＩ－８４７３２５、ＧＤＣ－０６２３、Ｒｏ５１２６７６６、ＰＤ３３４５８１、ＰＤ１９８３０６、ＲＯ４９８７６５５、ＨＩ ＴＯＰＫ ０３２等を挙げることができる。ＭＥＫ阻害剤は、好ましくはトラメチニブである。

【0029】

本発明によるがんの治療又は予防剤が、ＲＦ経路阻害剤の他に、さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有する場合、ＲＦ経路阻害剤及びＭＥＫ阻害剤は１つの化合物に限定されない。例えば、１つのＲＦ経路阻害剤と１つのＭＥＫ阻害剤との組み合わせに限られず、１つのＲＦ経路阻害剤と２つ以上のＭＥＫ阻害剤との組み合わせ、２つ以上のＲＦ経路阻害剤と１つのＭＥＫ阻害剤との組み合わせ、及び２つ以上のＲＦ経路阻害剤と２つ以上のＭＥＫ阻害剤との組み合わせを包含する。

【0030】

本発明によるがんの治療又は予防剤が、ＲＦ経路阻害剤の他に、さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有する場合、ＲＦ経路阻害剤は好ましくはロゼオフラビンであり、ＭＥＫ阻害剤は好ましくはトラメチニブである。

【0031】

本発明によるがんの治療又は予防剤が、ＲＦ経路阻害剤の他に、さらにＭＥＫ阻害剤を有効成分として含有する場合、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを共に含有する製剤の形態であってもよく、両者を別個の製剤として組み合わせた形態であってもよい。ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを別個の製剤として組み合わせた形態である場合、それぞれの製剤の投与順序及び投与時期は特に制限されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に又は異なる日に投与されてもよい。

【0032】

本発明によるがんの治療又は予防剤は、がんに罹患した対象、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物といった哺乳動物に投与される。好ましい対象は、ヒトである。

【0033】

本発明によるがんの治療又は予防剤の投与方法は、経口投与、局所投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。投与剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。これらの剤形は、有効成分を常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択でき、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。

【0034】

本発明によるがんの治療又は予防剤の投与量及び投与回数は、有効量が患者に投与されるように、がんの種類、患者の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。

【0035】

（２．組み合わせ）
本発明のがんの治療又は予防のための組み合わせは、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせである。

【0036】

「がん」、「治療」、「予防」、「ＲＦ経路阻害剤」及び「ＭＥＫ阻害剤」の各用語の詳細については、前述同様である。

【0037】

本発明の組み合わせが適用されるがんは、好ましくは膵がんである。膵がんとしては、外分泌腫瘍、例えば浸潤性膵管がん、膵腺房細胞がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍等、及び内分泌腫瘍、例えば神経内分泌腫瘍等を挙げることができる。

【0038】

本発明の組み合わせに用いられるＲＦ経路阻害剤は、好ましくはロゼオフラビンである。

【0039】

本発明の組み合わせに用いられるＭＥＫ阻害剤は、好ましくはトラメチニブである。

【0040】

「組み合わせ」とは、その必要がある、すなわちがんの治療が望まれる対象に、一緒に又は別々に、同時に又は逐次的に投与することを意図した組み合わせを意味する。組み合わせは、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを共に含有する製剤の形態であってもよく、両者を別個の製剤として組み合わせた形態であってもよい。ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを別個の製剤として組み合わせた形態である場合、それぞれの製剤の投与順序及び投与時期は特に制限されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に又は異なる日に投与されてもよい。

【0041】

本発明の組み合わせを構成するＲＦ経路阻害剤及びＭＥＫ阻害剤は、１つの化合物には限定されない。例えば、１つのＲＦ経路阻害剤と１つのＭＥＫ阻害剤との組み合わせに限られず、１つのＲＦ経路阻害剤と２つ以上のＭＥＫ阻害剤との組み合わせ、２つ以上のＲＦ経路阻害剤と１つのＭＥＫ阻害剤との組み合わせ、及び２つ以上のＲＦ経路阻害剤と２つ以上のＭＥＫ阻害剤との組み合わせを包含する。

【0042】

本発明の組み合わせにおいて、ＲＦ経路阻害剤は好ましくはロゼオフラビンであり、ＭＥＫ阻害剤は好ましくはトラメチニブである。

【0043】

本発明の組み合わせが適用される対象、並びに本発明の組み合わせの投与方法、投与剤型、製剤化の方法、投与量及び投与回数については、前述同様である。

【0044】

（３．まとめ）
以上説明したように、本発明によるがんの治療又は予防剤は、ＲＦ経路阻害剤を有効成分として含有し、新規の作用機序を介して膵がんをはじめとするがんを治療又は予防する剤である。ＲＦ経路阻害剤にＭＥＫ阻害剤を組み合わせることで、さらに有効ながんの治療又は予防剤を提供することができる。

【0045】

また、本発明によるがんの治療又は予防のための組み合わせは、ＲＦ経路阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせであり、膵がんをはじめとしたがんに対する新規の治療又は予防薬となる。

【実施例0046】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0047】

（実施例１）
ヒト膵がんショウジョウバエモデルを以下のとおり作出した。

【0048】

ショウジョウバエｗ^－（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から常法にてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｒａｓ８５Ｄ遺伝子を増幅するように設計されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、Ｒａｓ８５Ｄ遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ断片を得た。さらに、Ｒａｓ８５Ｄのアミノ酸配列の１２番目のグリシンをコードするコドンをアスパラギン酸をコードするコドンに置換するための部位特異的変異導入用プライマーＤＮＡを設計、合成し、前記ＤＮＡ断片を鋳型としたＰＣＲを行って、Ｒａｓ８５Ｄ変異体（Ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ）をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片をショウジョウバエのノックダウン用ベクターであるｐＷＡＬＩＵＭベクター（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）に挿入し、ｐＷＡＬＩＵＭ．ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄベクターを作製した。これをショウジョウバエｙ^１ｗ^{６７ｃ２３}；Ｐ｛ＣａｒｙＰ｝ａｔｔＰ２にマイクロインジェクションし、相同組換えにより３番染色体Ｌ領域にＲａｓＧ１２ＤをコードするＤＮＡが挿入されたＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄハエを作出した。

【0049】

また、ＲａｓＧ１２ＤをコードするＤＮＡ断片と共にｐ５３遺伝子ノックダウン配列（センス鎖ＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＣＣＡＣＣＧＡ（配列番号１）、ヘアピンループＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡ（配列番号５）及びアンチセンス鎖ＴＣＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡ（配列番号２）を連結した配列）を含むＤＮＡ断片をｐＷＡＬＩＵＭベクターに挿入して、ｐＷＡＬＩＵＭ．ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡベクターを作製した。これを同様にショウジョウバエｙ^１ｗ^{６７ｃ２３}；Ｐ｛ＣａｒｙＰ｝ａｔｔＰ２にマイクロインジェクションすることで、３番染色体Ｌ領域にＲａｓＧ１２ＤをコードするＤＮＡ及びｐ５３遺伝子に対するｓｈＲＮＡが挿入されたＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡハエを作出した。

【0050】

さらに、ショウジョウバエｗ^－のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（ＣｙｃＥ）遺伝子を増幅するように設計されたプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＣｙｃＥ遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、Ｍｅｄ遺伝子ノックダウン配列（センス鎖ＴＴＣＡＧＴＧＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＧＣＴ（配列番号３）、ヘアピンループＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡ（配列番号５）及びアンチセンス鎖ＡＧＣＡＡＴＧＴＴＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＡＡ（配列番号４）を連結した配列）を含むＤＮＡ断片と共にｐＷＡＬＩＵＭベクターに挿入して、ｐＷＡＬＩＵＭ．ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡベクターを作製した。これをショウジョウバエＰＢａｃ｛ｙｅｌｌｏｗ［＋］－ａｔｔＰ－９Ａ｝ＶＫ０００２７にマイクロインジェクションし、相同組換えにより３番染色体Ｒ領域にＣｙｃＥ遺伝子をコードするＤＮＡ及びＭｅｄ遺伝子に対するｓｈＲＮＡが挿入されたＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエを作出した。

【0051】

次いで、ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡハエとＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエを２５℃で３日間交配し、ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエを作出した。

【0052】

ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエのそれぞれをＳｅｒ－ｇａｌ４，ＵＡＳ－ＧＦＰハエ（Ｓｅｒ＞ＧＦＰハエ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）と２５℃で３日間交配し、Ｓｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエ（４－ｈｉｔハエ（Ｓｅｒ＞ＧＦＰ）と表す）を作出した。これらのハエにおいては、Ｓｅｒプロモーターの制御下で翅原基の限局した上皮細胞に導入遺伝子の発現が誘導された（図示せず）。

【0053】

このようにして得られた４－ｈｉｔハエを、ヒト膵がんショウジョウバエモデルとして、以下の試験に用いた。

【0054】

（実施例２）
リボフラビンキナーゼ（ＲＦＫ）のヘテロ接合性変異の４－ｈｉｔハエを作出し、ＲＦ経路阻害による４－ｈｉｔハエの生存率への影響について検証した。

【0055】

Ｓｏｎｏｓｈｉｔａら（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１７，１２１，２８７－３０９）の方法に従って、図１に示されるように交配を行って、リボフラビンキナーゼ（ＲＦＫ）のヘテロ接合性変異による４－ｈｉｔハエの生存率への影響を検証した。具体的には、実施例１で作出したＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエをＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂバランサーハエ（Ｄｒ．Ｒｏｓｓ Ｃａｇａｎ，Ｉｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ，ＮＹ，ＵＳＡ）と交配し、ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエを作出した。次いでこれをＳｅｒ＞ＧＦＰハエ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）と交配し、Ｓｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエを作出した。

【0056】

また、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（米国）から、ＲＦＫ変異系統（ＢＤＳＣ Ｎｏ．３００８１）を入手し、これを、２７℃で３日間、Ｓｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエと交配し、ＲＦＫのヘテロ接合性変異４－ｈｉｔハエの卵を得た。対照として、ｗ^－ハエをＳｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエと交配し、キナーゼ野生型４－ｈｉｔハエの卵を得た。これらのハエを２７℃で１３日間飼育した後、羽化した個体の数を蛹の総数で割り、生存率を算出した。

【0057】

結果を図２に示す。ＲＦＫのヘテロ接合性変異４－ｈｉｔハエでは、対照に比して、致死性が抑制されることが示された。このことから、ＲＦ経路の阻害が膵がんの予防又は治療に有効であることが示された。

【0058】

（実施例３）
リボフラビン（ＲＦ）経路関連遺伝子のノックダウンによる４－ｈｉｔハエを作出し、ＲＦ経路阻害による４－ｈｉｔハエの生存率への影響について検証した。

【0059】

ＲＦ代謝経路に関わる遺伝子として、ヒトでは、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＲＦＴ：ＳＬＣ５２Ａ１，ＳＬＣ５２Ａ２，ＳＬＣ５２Ａ３の３種）、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＲＦＫ）、ＦＡＤ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＦＬＡＤ１）が報告されている。一方、ハエでは、ＲＦＴ及びＲＦＫが１種類ずつ、ＦＬＡＤ１のオルソログとしてＣＧ１６８４８及びＦＡＤＳの２種類が知られている。

【0060】

図３に示されるように交配を行って以下８種類のＲＦ経路関連遺伝子のノックダウンによる４－ｈｉｔハエを作出し、各々の生存率への影響を検証した。
ＲＦＴノックダウン：ＫＤ♯１、ＫＤ♯２
ＲＦＫノックダウン：ＫＤ♯１、ＫＤ♯２
ＣＧ１６８４８ノックダウン：ＫＤ♯１、ＫＤ♯２
ＦＡＤＳノックダウン：ＫＤ♯１、ＫＤ♯２

【0061】

これらのノックダウンに必要なハエは、以下に示すようにＢｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＤＳＣ、米国）、Ｆｌｙ Ｓｔｏｃｋｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＮＩＧ、国立遺伝学研究所）及びＶｉｅｎｎａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＲＮＡｉ Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＤＲＣ、オーストリア ウィーン）より入手した。
ＲＦＴ ＫＤ♯１：ＢＤＳＣ ２９５３１
ＲＦＴ ＫＤ♯２：ＮＩＧ １１５７６Ｒ－３
ＲＦＫ ＫＤ♯１：ＢＤＳＣ ５７４０５
ＲＦＫ ＫＤ♯２：ＶＤＲＣ １００２６６
ＣＧ１６８４８ ＫＤ♯１：ＢＤＳＣ ６１９３８
ＣＧ１６８４８ ＫＤ♯２：ＮＩＧ １６８４８Ｒ－１
ＦＡＤＳ ＫＤ♯１：ＢＤＳＣ ４４０５５
ＦＡＤＳ ＫＤ♯２：ＮＩＧ ４４０７Ｒ－４

【0062】

ＲＦＴ ＫＤ♯１については、ＢＤＳＣから入手したＵＡＳ－ＲＦＴ（Ｒｉｆｔ） ｓｈＲＮＡ／ＴＭ３（ＢＤＳＣ ２９５３１）をＭＫＲＳ／ＴＭ６Ｂのハエと交配して、ＵＡＳ－ＲＦＴ ｓｈＲＮＡ／ＴＭ６Ｂのハエを作出した。このハエを、２７℃で２日間、Ｓｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエと交配し、ＵＡＳ－ＲＦＴ ｓｈＲＮＡを持つ４－ｈｉｔハエの卵を得た。

【0063】

ＲＦＴ ＫＤ♯２、ＲＦＫ ＫＤ♯１、ＣＧ１６８４８ ＫＤ♯１、ＦＡＤＳ ＫＤ♯１については、ＦＭ７Ｃ－Ｔｂ－ＲＦＰ／Ｙ（ＢＤＳＣ ３６３３７）のハエと交配して、ＵＡＳ－ＲＦＴ ｓｈＲＮＡ／ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰ、ＵＡＳ－ＲＦＫ ｓｈＲＮＡ／ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰ、ＵＡＳ－ＣＧ１６８４８ ｓｈＲＮＡ／ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰ、ＵＡＳ－ＦＡＤＳ ｓｈＲＮＡ／ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰのハエを作出した。

【0064】

ＦＡＤＳ ＫＤ♯２については、ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰ／aｐ（ＢＤＳＣ ３６３３６）のハエと交配して、ＵＡＳ－ＦＡＤＳ ｓｈＲＮＡ／ＣｙO－Ｔｂ－ＲＦＰのハエを作出した。

【0065】

上記のハエ及びＲＦＫ ＫＤ♯２、ＣＧ１６８４８ ＫＤ♯２のハエを、２７℃で２日間、Ｓｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエと交配し、ＵＡＳ－ＲＦ経路関連遺伝子 ｓｈＲＮＡを持つ４－ｈｉｔハエの卵を得た。

【0066】

対照として、ｗ－ハエをＳｅｒ＞ＧＦＰ；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ／ＳＭ５ｔｕｂｇａｌ８０－ＴＭ６Ｂハエと交配し、キナーゼ野生型４－ｈｉｔハエの卵を得た。これらのハエを２７℃で１３日間飼育した後、羽化した個体の数を蛹の総数で割り、生存率を算出した。

【0067】

結果を図４に示す。ＲＦ経路関連遺伝子ノックダウンによる４－ｈｉｔハエでは、対照に比して、致死性が著しく抑制されることが示された。このことから、ＲＦ経路の阻害が膵がんの予防又は治療に有効であることが示された。

【0068】

（実施例４）
ヒト膵がん細胞をロゼオフラビン（ＲｏＦ）で処理し、ミトコンドリア呼吸鎖の活性を生存率と仮定し、相対生存率を算出した。

【0069】

ヒト膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１及びＣａｐａｎ－１を用いてＲｏＦによるＭＴＳアッセイを行った。いずれの細胞株も、ＡＴＣＣより入手した。各細胞株を以下に示す培地を用い、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養した。
・ＭＩＡＰａＣａ－２：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）に１０％ウシ胎児血清（ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地
・ＰＡＮＣ－１：ＲＰＭＩ １６４０培地（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）に１０％ウシ胎児血清（ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地
・Ｃａｐａｎ－１：ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）に２０％ウシ胎児血清（ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地

【0070】

ロゼオフラビン（ＲｏＦ）を０μＭ（ＤＭＳＯのみ）、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭに各々調製し、培地で１０００倍に希釈して薬剤液とした（ＲｏＦ最終濃度：０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ）。

【0071】

９６ウェルプレートに、ＭＩＡＰａＣａ－２を５００細胞／ウェル、ＰＡＮＣ－１を２，０００細胞／ウェル、Ｃａｐａｎ－１を１０，０００細胞／ウェル播種した（１００μＬ培地中）。１日培養した後、各濃度のＲｏＦの薬剤液を１０μＬずつ９６ウェルプレートの細胞に添加した（ＤＭＳＯの最終濃度０．１％）。各組み合わせは３ウェルずつ試験した。薬剤液添加後、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２４、４８、７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存率を測定した。生存率は、対照（溶媒のみ）７２時間に対する割合で表記した。

【0072】

結果を図５に示す。各ヒト膵がん細胞株において、ロゼオフラビン（ＲｏＦ）は用量依存的にミトコンドリア呼吸鎖の活性を低下させ、相対生存率を減少させることが示された。このことから、ＲＦ経路阻害剤であるＲｏＦは、膵がんの予防又は治療に有効であることが示された。

【0073】

なお、ロゼオフラビン（ＲｏＦ）１０μＭ又は対照としてＤＭＳＯ（最終濃度０．１％）で４８時間処置したヒト膵がん細胞（ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１、Ｃａｐａｎ－１）を回収し、細胞内でのＲｏＦ、ＲＦ（リボフラビン）、ＦＭＮ（Ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＦＡＤ（Ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）の量を液体クロマトグラフィー質量分析法にて測定すると、ＲｏＦ処置細胞でのみＲｏＦが検出され、ＲＦ、ＦＭＮ、ＦＡＤ量が対照に比べて減少していた（図示せず）。したがって、ＲｏＦは、ＲＦと競合することで、ＦＭＮ及びＦＡＤを抑制し、ＲＦ経路を阻害することが示された（図６）。

【0074】

（実施例５）
ＲＦ経路阻害剤であるロゼオフラビンとＭＥＫ阻害薬であるトラメチニブの併用による膵がん抑制効果について、膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１）を用いて検証した。

【0075】

４－ｈｉｔの変異を有する膵がん細胞株（ＡｓＰＣ－１、Ｃａｐａｎ－１）を用いて、メチルセルロース含有培地で３次元培養を行った。メチルセルロースは粘性が高く、細胞が自由に動けなくなるため、細胞同士が凝集して塊になってスフェロイドを形成する。

【0076】

２４ウェルプレート（上層：１．８％メチルセルロース、下層：０．４８％アガロース）にＡｓＰＣ－１を５×１０^３細胞／ウェル播種した（１００μＬ培地中）。１日培養した後（１日目）、ＤＭＳＯ（コントロール）、１０μＭのロゼオフラビン（ＲｏＦ）、１ｎＭのトラメチニブ（Ｔｒ）、１０μＭのＲｏＦ＋１ｎＭのＴｒとなるように２４ウェルプレートに各々添加した（ＤＭＳＯの最終濃度０．１％）。薬剤液添加後、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養し、１４日目に培養液を追加した。さらに培養後、２１日目に各群を撮影し、スフェロイドの大きさ及び数を測定した。なお、各細胞株の培養において以下に示す培地を用いた。
・ＡｓＰＣ－１：ＲＰＭＩ １６４０培地（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）に１０％ウシ胎児血清（ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地
・Ｃａｐａｎ－１：ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）に２０％ウシ胎児血清（ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地

【0077】

ＡｓＰＣ－１における結果を図７、Ｃａｐａｎ－１における結果を図８に示す。ＡｓＰＣ－１において、０．１－０．２ｍｍ及び０．２ｍｍより大きいスフェロイドのサイズでは、ロゼオフラビン（ＲｏＦ）単独、トラメチニブ（Ｔｒ）単独及びＲｏＦ＋Ｔｒ併用のいずれにおいてもスフェロイド形成が抑制され、０．１ｍｍより小さいスフェロイドのサイズでは、ＲｏＦ＋Ｔｒ併用によってスフェロイド形成がさらに抑制されることが示された（図７（ｂ））。Ｃａｐａｎ－１においても、０．１－０．２ｍｍ及び０．２ｍｍより大きいスフェロイドのサイズでは、ＲｏＦ単独、Ｔｒ単独及びＲｏＦ＋Ｔｒ併用のいずれにおいてスフェロイド形成が抑制された。一方、ＲｏＦ単独及びＴｒ単独処置では０．１ｍｍ以下のスフェロイドの数を増加させたが、ＲｏＦ＋Ｔｒ併用ではその増加が抑えられ、全体のスフェロイドの数が減少した（図８（ｂ）。これらのことから、トラメチニブとロゼオフラビンとの併用は、膵がんの予防又は治療に非常に有効であることが示された。

【0078】

（実施例６）
ＲＦ経路阻害剤であるロゼオフラビンとＭＥＫ阻害薬であるトラメチニブの併用による膵がん抑制効果について、４－ｈｉｔハエを用いて検証した。

【0079】

ロゼオフラビン及びトラメチニブをＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）に溶解し、－２０℃で保存した。

【0080】

ａｇａｒ（Ｗａｋｏ）、ｂｒｅｗｅｒｓ’ｙｅａｓｔ（ＭＰＢｉｏ）、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｂａｃｔｏ ｃａｓｉｔｏｎｅ （ＢＤ）、ｓｕｃｒｏｓｅ（Ｗａｋｏ）、ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ）、ＭｇＣｌ_２（Ｗａｋｏ）、ＣａＣｌ_２（Ｗａｋｏ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ （Ｗａｋｏ）、Ｍｏｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０％ Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ Ｂｅｎｚｏａｔｅ ｉｎ ９５％ Ｅｔｈａｎｏｌ；Ｗａｋｏ）を超純水に溶解して標準餌を作製した。これを５０℃に保温しながら、ＤＭＳＯに溶解した薬剤（トラメチニブ単独、又はロゼオフラビンとトラメチニブとの組み合わせ）を添加混合し、冷却して薬餌を調製した。各化合物の餌中最終濃度は、トラメチニブ０．５μＭ、ロゼオフラビン５０μＭとした。

【0081】

実施例１で作出したＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡハエをＳｅｒ－ｇａｌ４ハエ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）と交配したのち、親ハエに標準餌又は薬餌上で２日間産卵させ、１バイアルあたり２０～５０個のＳｅｒ－ｇａｌ４；ＵＡＳ－ＲａｓＧ１２Ｄ，ＵＡＳ－ｐ５３ ｓｈＲＮＡ，ＵＡＳ－ＣｙｃＥ，ＵＡＳ－Ｍｅｄ ｓｈＲＮＡ ４－ｈｉｔハエ（ｎｏｎ－ＧＦＰ）の卵を得た。これを２５℃で１３日間飼育した後、羽化した個体の数を蛹の総数で割り、各餌上で飼育した４－ｈｉｔハエ（ｎｏｎ－ＧＦＰ）の生存率を算出した。

【0082】

結果を図９に示す。トラメチニブは単独で４－ｈｉｔハエ（ｎｏｎ－ＧＦＰ）の生存率を約１０％向上させた。一方で、トラメチニブにロゼオフラビンを組み合わせると、該生存率は約５０％も向上し、両者の併用により生存率向上の相乗効果が得られることが示された。このことから、トラメチニブとロゼオフラビンとの併用は、膵がんの予防又は治療に非常に有効であることが示された。

【0083】

（実施例７）
ＲＦ経路阻害剤であるロゼオフラビンとＭＥＫ阻害薬であるトラメチニブの併用による膵がん抑制効果について、膵がん移植マウスを用いて検証した。

【0084】

ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ ｎｕ／ｎｕマウスの膵臓にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を組み込んだ膵がん細胞（ＡｓＰＣ－１）を１×１０^６ｃｅｌｌｓずつ移植した。経時的にマウスにＬｕｃｉｆｅｒｉｎ（１５μｇ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／ｇ ｍｏｕｓｅ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）を投与し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて計測した。同所移植から約２週間後、マウスを下記のとおり４群に分けた。なお、ロゼオフラビン（ＲｏＦ）については３ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与、トラメチニブ（Ｔｒ）については１ｍｇ／ｋｇを経口投与した。
（１）コントロール（溶媒（ＤＭＳＯ）のみ投与）（ｎ＝７）
（２）ロゼオフラビン（ＲｏＦ）投与（ｎ＝６）
（３）トラメチニブ（Ｔｒ）投与（ｎ＝５）
（４）ロゼオフラビン（ＲｏＦ）＋トラメチニブ（Ｔｒ）併用（ｎ＝５）

【0085】

結果を図１０に示す。トラメチニブ（Ｔｒ）は単独でマウスの腫瘍の成長を抑制したが、トラメチニブ（Ｔｒ）にロゼオフラビン（ＲｏＦ）を組み合わせると、腫瘍抑制効果は著しく向上し、両者の併用により腫瘍抑制の相乗効果が得られることが示された。このことから、トラメチニブとロゼオフラビンとの併用は、膵がんの予防又は治療に非常に有効であることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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