特開 2022-141426 クロロフィル分解酵素阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022141426

(43)【公開日】2022-09-29

(54)【発明の名称】クロロフィル分解酵素阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/99 20060101AFI20220921BHJP

   A23B 9/30 20060101ALI20220921BHJP

【ＦＩ】

C12N9/99

A23B9/30

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021041725

(22)【出願日】2021-03-15

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 寿

(72)【発明者】

【氏名】前仲 勝実

(72)【発明者】

【氏名】乙黒 聡子

【テーマコード（参考）】

4B169

【Ｆターム（参考）】

4B169AA04

4B169HA01

4B169KA07

4B169KC16

(57)【要約】

【課題】クロロフィル分解酵素への阻害効果を有するクロロフィル分解酵素阻害剤を提供する。
【解決手段】本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩を有効成分として含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩を有効成分として含む、クロロフィル分解酵素阻害剤。

【請求項2】

前記金属が、亜鉛、銅またはコバルトである、請求項１に記載のクロロフィル分解酵素阻害剤。

【請求項3】

前記金属の塩を有効成分として含み、
前記金属の塩が、前記金属の硫酸塩、酢酸塩またはアンモニウム塩である、請求項１または２に記載のクロロフィル分解酵素阻害剤。

【請求項4】

前記金属の塩が硫酸塩である、請求項３に記載のクロロフィル分解酵素阻害剤。

【請求項5】

前記金属イオンの錯体または前記金属の塩を有効成分として含み、
前記金属が亜鉛である、請求項１に記載のクロロフィル分解酵素阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はクロロフィル分解酵素阻害剤に関する。

【背景技術】

【0002】

植物体は、クロロフィルが分解されることで黄化することが知られている。植物体に含まれる緑色光合成色素クロロフィルは、成熟した植物体内で発現するクロロフィル分解酵素によって分解されることが分かっている（非特許文献１）。

【0003】

これに関し、クロロフィルの分解を抑制するための様々な方法が検討されている。例えば、低温に保つことでクロロフィル分解酵素の活性を抑制する方法、およびクロロフィル分解酵素の発現を誘導するエチレンを除去することでクロロフィル分解酵素の発現を抑制する方法が挙げられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Shimoda Y, Ito H, Tanaka A (2016) Arabidopsis STAY-GREEN, Mendel’s green cotyledon gene, encodes magnesium-dechelatase. The Plant Cell 28: 2147-2160

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、実際の植物への適用を考慮した場合、低温に保つ方法およびエチレンを除去する方法は、特別な設備を要するうえ、屋外の植物には利用できないといった問題がある。また、クロロフィル分解酵素は近年発見されたばかりであり、その立体構造、作用機構などはいずれも未解明である。特に、クロロフィル分解酵素に対する阻害剤は知られていない。

【0006】

そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、クロロフィル分解酵素への阻害効果を有するクロロフィル分解酵素阻害剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するために、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩を有効成分として含む。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、クロロフィル分解酵素への阻害効果を有するクロロフィル分解酵素阻害剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明に係る実施例の結果を示す図である。

【図2】本発明に係る実施例の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

＜クロロフィル分解酵素阻害剤＞
本実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩を有効成分として含む。

【0011】

本明細書において、「クロロフィル分解酵素」とは、クロロフィルの分解反応を触媒する酵素を指す。このクロロフィル分解酵素が触媒するクロロフィルの分解反応は、クロロフィルの分子の中心に位置するマグネシウム原子が脱離してプロトンと置換されることによって、クロロフィルがフェオフィチンに変換される反応である。

【0012】

また、本明細書において、「クロロフィル分解酵素阻害剤」とは、クロロフィル分解酵素の機能を阻害する活性（以下、「クロロフィル分解酵素阻害活性」と記載する）を有する阻害剤を意図する。

【0013】

〔有効成分〕
本実施形態における有効成分は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩である。

【0014】

本実施形態における金属イオンを形成する金属元素は、上に挙げた中でも亜鉛、銅またはコバルトであることが好ましく、亜鉛または銅であることがより好ましく、亜鉛であることがさらに好ましい。有効成分が金属イオンの錯体または金属の塩である場合には特に、金属イオンを形成する金属元素は、亜鉛であることが好ましい。

【0015】

本実施形態における「金属イオンの錯体」は、金属イオンを中心原子とした錯体を指す。なお、本明細書における「錯体」には、錯イオンおよび錯塩（錯化合物）のいずれも含まれる。

【0016】

本実施形態における錯体において、中心原子に配位する配位子としては例えば、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、リン原子およびハロゲン原子のイオン；水分子；アミン化合物；ニトリル化合物；炭素数１～２０の炭化水素化合物；芳香族化合物；縮合環化合物；複素環化合物；ホスフィン化合物；カルボニル化合物；およびシアン化合物などを挙げることができるが、これに限られない。

【0017】

本実施形態において、金属の塩は硫酸塩、酢酸塩またはアンモニウム塩であることが好ましく、硫酸塩または酢酸塩であることがより好ましく、硫酸塩であることがさらに好ましい。

【0018】

さらに、本実施形態における金属の塩は、上述の化合物の誘導体であってもよい。本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。

【0019】

上記他の官能基の例としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリールアルキル基、アリールアルコキシ基、アリールアルキルチオ基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、アリル基、アミノ基、置換アミノ基、シリル基、置換シリル基、シリルオキシ基、置換シリルオキシ基、アリールスルフォニルオキシ基、アルキルスルフォニルオキシ基およびニトロ基などが挙げられる。上記他の原子の例としては、炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、リン原子およびハロゲン原子などが挙げられる。

【0020】

本実施形態における有効成分として特に好ましい金属の塩としては、例えば、硫酸亜鉛、硫酸ニッケル、硫酸銅（ＩＩ）、硫酸コバルトおよび酢酸亜鉛などを挙げることができるが、これに限らない。

【0021】

本実施形態における有効成分の特に好ましい金属イオンの錯体としては、例えば、ジンクピリチオン、（トルエン－３，４－ジチオラト）亜鉛（ＩＩ）、銅（ＩＩ）アセチルアセトナート、フタロシアニン銅およびビス（８－キノリノラトラト）亜鉛（ＩＩ）などを挙げることができるが、これに限らない。

【0022】

上記クロロフィル分解酵素阻害剤中に含まれる有効成分の濃度は、特に限定されないが、例えば、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましく、１００μＭ以上であることがさらに好ましい。なお、シロイヌナズナ由来のクロロフィル分解酵素を阻害する場合においては、当該濃度は、１０μＭ以上であることが好ましく、１００μＭ以上であることがより好ましく、１０００μＭ以上であることがさらに好ましい。また、有効成分の濃度は、製剤のしやすさの観点からは、１Ｍ以下であることが好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、１０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。特に、有効成分の濃度が１０００μＭ以上１０ｍＭ以下の場合には、特に優れた阻害効果が得られるため好ましい。

【0023】

本実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、有効成分として、上述したものの中の１つを含んでいてもよいし、当該クロロフィル分解酵素阻害剤のクロロフィル分解酵素阻害活性が妨げられなければ、複数を含んでいてもよい。

【0024】

〔その他の成分〕
本実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、当該クロロフィル分解酵素阻害剤のクロロフィル分解酵素阻害活性が妨げられなければ、上述の有効成分とは異なる成分が含まれていてもよい。上記異なる成分としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤および安定化剤などを挙げることができる。これらは、クロロフィル分解酵素阻害剤の剤型または用途に応じて、１つまたはそれ以上を組み合わせて選択することができる。

【0025】

典型的には、本実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤には、有効成分のほか、固体担体または液体担体（希釈剤）が含まれる。

【0026】

液体担体としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール）、ケトン類（例えば、アセトン）、炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）、エステル類（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル）、エーテル類（例えば、ジオキサン、ジイソプロピルエーテル）、および酸アミド類（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド）などが挙げられる。

【0027】

固体担体としては、粘土類（例えば、カオリナイト、珪藻土）、タルク類、その他の無機鉱物（例えば、炭酸カルシウム、活性炭、水和シリカ）、化学肥料（例えば、硫安、塩安、燐安、尿素）および有機物（例えば、サトウキビ、タバコ茎末）等の微粉末あるいは粒状物が挙げられる。

【0028】

上記クロロフィル分解酵素阻害剤中に含まれる異なる成分の含有量については、クロロフィル分解酵素阻害活性が妨げられなければ特に限定されない。

【0029】

＜製剤＞
本実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、所望の濃度となるように、上述の有効成分を固体担体または液体担体（希釈剤）、界面活性剤およびその他の製剤補助剤などと混合して粉剤、水和剤、粒剤および乳剤などの種々の形態に製剤することで調製することができる。

【0030】

＜クロロフィル分解酵素阻害剤の効果＞
本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、クロロフィル分解酵素がクロロフィルの分解反応を触媒する機能を阻害するクロロフィル分解酵素阻害活性を有している。そのため、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、クロロフィル分解酵素の存在下においても、クロロフィルの分解反応を抑制することができる。

【0031】

また、植物はクロロフィルにおける光吸収により緑色を示すが、クロロフィル分解酵素によって分解されて生じるフェオフィチンによる光吸収では植物は緑色を示さない。これを利用すれば、本発明の一実施形態に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、クロロフィル分解酵素の存在下においても、クロロフィルの光吸収によってもたらされる緑色を維持することができる。そのため、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、例えば、芝生、観賞用の植物、あるいは緑色野菜の変色の防止剤としての利用が可能である。

【0032】

さらに、近年、イネにおいて、遺伝子操作によりクロロフィル分解酵素の発現時期を遅らせ、緑色を長く維持することにより、コメの収量が増加したことが報告されている（非特許文献：Shin, D. et al. (2020) Natural variations at the Stay-Green gene promoter control lifespan and yield in rice cultivars. Nature Communications 11: 2819）。上述の通り、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤によれば、植物体の緑色を長く維持することができる。よって、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、果実および種子等の収量を増加させる生長調節剤としての利用が可能である。

【0033】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【0034】

＜まとめ＞
上述の通り、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、亜鉛、銅、ニッケル、コバルトおよびマンガンからなる群から選択される金属の金属イオン、当該金属イオンの錯体または当該金属の塩を有効成分として含む。

【0035】

また、前記金属は、亜鉛、銅またはコバルトであることが好ましい。

【0036】

また、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、前記金属の塩を有効成分として含み、前記金属の塩が、前記金属の硫酸塩、酢酸塩またはアンモニウム塩であることが好ましい。

【0037】

また、前記金属の塩は硫酸塩であることが好ましい。

【0038】

また、本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、前記金属イオンの錯体または前記金属の塩を有効成分として含み、前記金属が亜鉛であることが好ましい。

【0039】

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

【実施例0040】

１．準備
ＦＡＴＴタグベクターを用意し、ＦＡＴＴタグの下流側に、プロリンと、トリプトファンと、葉緑体移行シグナルに該当するＮ末端側の４８アミノ酸を削除したシロイヌナズナのクロロフィル分解酵素発現遺伝子ＡｔＳＧＲ１（ＡＴ４Ｇ２２９２０）とを下流に向かってこの順に導入した。これをｐＥＴプラスミド（ｐＥＴ３０ａ（＋）、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込み、さらに大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入した。大腸菌をオートインダクション培地に播種して３７℃で１６時間培養し、クロロフィル分解酵素を誘導させた。１０，０００ｇで５分間遠心してペレットを回収した。

【0041】

回収したペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールの混合液）に懸濁し、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社）で６分間処理した。

【0042】

処理後の溶液に、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（βＤＭ）を０．０５％になるように加え、２０，０００ｇで１０分間遠心した。上清をニッケルカラム（ＨｉｓＴｒａＰ、Ｃｙｔｉｖａ社）に通した後、０．０５％βＤＭを含む緩衝液Ａで洗浄した。

【0043】

洗浄後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールおよび０．０５％βＤＭの混合液）を徐々に加え、濃度を段階的に上げることによりクロロフィル分解酵素を溶出させた。これを、クロロフィル分解酵素溶出液Ｉとした。

【0044】

また、シロイヌナズナのクロロフィル分解酵素発現遺伝子ＡｔＳＧＲ１（ＡＴ４Ｇ２２９２０）に代えて、当該遺伝子に相同なＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＭ２３－６３の遺伝子（ＫＰＫ９４５８０）をｐＥＴプラスミド（ｐＥＴ３０ａ（＋））に組み込んだ。その後、クロロフィル分解酵素溶出液Ｉと同様にして、クロロフィル分解酵素溶出液ＩＩを得た。

【0045】

２．クロロフィル分解酵素阻害活性の確認
〔実施例１〕
クロロフィル分解酵素溶出液Ｉ ４０μＬと、色素液（５０μＭクロロフィルａ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％βＤＭ）１０μＬとを混合した。この混合液に、クロロフィル分解酵素阻害剤として１ｍＭ硫酸マンガン水溶液５μＬを加え、硫酸マンガンを１００μＭの濃度で含む反応液を調製した。この反応液を３７℃で３０分反応させた後、アセトン２００μＬを加えて反応を停止させた。

【0046】

混合液に加える硫酸マンガン水溶液の濃度を１０ｍＭに変更して調製した、硫酸マンガンを１０００μＭの濃度で含む反応液についても、同様に反応を行った。

【0047】

〔実施例２〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸コバルトを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0048】

〔実施例３〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸ニッケルを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0049】

〔実施例４〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸銅（ＩＩ）を用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0050】

〔実施例５〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸亜鉛を用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0051】

〔実施例６〕
クロロフィル分解酵素阻害剤として、硫酸マンガン水溶液５μＬに代えて、１０ｍＭおよび１００ｍＭジンクピリチオンＤＭＳＯ溶液０．５μＬずつを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0052】

〔実施例７〕
クロロフィル分解酵素阻害剤として、硫酸マンガン水溶液５μＬに代えて、１０ｍＭおよび１００ｍＭビス（８－キノリノラトラト）亜鉛（ＩＩ）ＤＭＳＯ溶液０．５μＬずつを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作を行った。

【0053】

〔実施例８〕
クロロフィル分解酵素溶出液ＩＩ ０．５μＬを、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）４０μＬと混ぜた。さらにこの溶液を、クロロフィルａを５０μＭの濃度で含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １０μＬと混合した。この混合液に、クロロフィル分解酵素阻害剤として０．１ｍＭ硫酸マンガン水溶液０．５μＬを加え、硫酸マンガンを１μＭの濃度で含む反応液を調製した。この反応液を２５℃で１０分反応させた後、アセトン２００μＬを加えて反応を停止させた。

【0054】

混合液に加える硫酸マンガン水溶液の濃度を１ｍＭおよび１０ｍＭに変更して調製した、硫酸マンガンを１０μＭおよび１００μＭの濃度で含む反応液についても、それぞれ同様に反応を行った。

【0055】

〔実施例９〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸コバルトを用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0056】

〔実施例１０〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸ニッケルを用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0057】

〔実施例１１〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸銅（ＩＩ）を用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0058】

〔実施例１２〕
硫酸マンガンに代えて、硫酸亜鉛を用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0059】

〔実施例１３〕
クロロフィル分解酵素阻害剤として、硫酸マンガン水溶液０．５μＬに代えて、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭジンクピリチオンＤＭＳＯ溶液０．５μＬずつを用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0060】

〔実施例１４〕
クロロフィル分解酵素阻害剤として、硫酸マンガン水溶液０．５μＬに代えて、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭビス（８－キノリノラトラト）亜鉛（ＩＩ）ＤＭＳＯ溶液０．５μＬずつを用いたこと以外は、実施例８と同様に操作を行った。

【0061】

〔比較例１～１４〕
実施例１～１４においてクロロフィル分解酵素阻害剤を加えずに反応させたこと以外は、それぞれ、実施例１～１４と同様の操作を行った。

【0062】

〔比較例１５および１６〕
クロロフィル分解酵素阻害剤としての硫酸マンガンに代えて、モリブデン酸アンモニウムを用いたこと以外は、実施例１および８と同様に操作を行った。さらに、モリブデン酸アンモニウムを加えない反応液についても同様に反応を行った。

【0063】

３．分析
反応を停止した各溶液を、２０，０００ｇで１０分間遠心し、上清を高速液体クロマトグラフィーで分析した。クロロフィル分解酵素によるクロロフィル分解反応の反応産物としてフェオフィチンを検出するため、蛍光検出器（ＲＦ－２０Ａ、島津製作所）を用いて４１０ｎｍの励起光を照射し、６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。クロマトグラムの面積を用い、比較例１～１４の反応産物量を１．０として、対応する実施例のフェオフィチン量の相対量を求めた。比較例１５および１６では、モリブデン酸アンモニウムを加えなかった場合の反応産物量を１．０として、他の反応液でのフェオフィチン量の相対量を求めた。実施例１～７、比較例１～７および１５の結果を図１に示す。また、実施例８～１４、比較例８～１４および１６の結果を図２に示す。なお、図１および２中のＭｏ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＣｕおよびＺｎは、それぞれ、クロロフィル分解酵素阻害剤に含まれる金属イオンの元素を示している。Ｚｎ－ＰおよびＢｉ－Ｚｎは、それぞれ、ジンクピリチオンおよびビス（８－キノリノラトラト）亜鉛（ＩＩ）を示す。

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明に係るクロロフィル分解酵素阻害剤は、例えば、芝生、観賞用の植物、あるいは緑色野菜の変色の防止剤としての利用が見込める。

【図1】

【図2】