▶ 独立行政法人産業技術総合研究所の特許一覧 ▶ ときわバイオ株式会社の特許一覧
特開2022-141733ステルス性を有するＲＮＡを使った遺伝子発現系および当該ＲＮＡを含む遺伝子導入・発現ベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022141733
(43)【公開日】2022-09-29
(54)【発明の名称】ステルス性を有するＲＮＡを使った遺伝子発現系および当該ＲＮＡを含む遺伝子導入・発現ベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220921BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220921BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220921BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220921BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220921BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/11 Z
C12N15/85 Z
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022108103
(22)【出願日】2022-07-05
(62)【分割の表示】P 2020137270の分割
【原出願日】2016-01-18
(31)【優先権主張番号】P 2015007288
(32)【優先日】2015-01-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】515270622
【氏名又は名称】ときわバイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】中西 真人
(72)【発明者】
【氏名】飯島 実
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、ヒト細胞を含む動物細胞において、当該細胞の持つ自然免疫機構が認識できないように構造を最適化したリボ核酸を用いて複数の外来遺伝子を同時にかつ安定に発現することを可能にする技術を提供する。
【解決手段】特定のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（１）から（８）のRNA配列を含むマイナス一本鎖RNA（Ａ）と、一本鎖RNA結合タンパク質（Ｂ）、RNA依存性RNA合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型RNA遺伝子発現系；
（１）任意のタンパク質又は機能性RNAをコードする標的RNA配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているmRNA由来のRNA配列、
（３）前記RNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むRNA配列、
（６）当該酵素をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列、
（８）前記一本鎖RNA結合タンパク質をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列。
（１）任意のタンパク質又は機能性RNAをコードする標的RNA配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているmRNA由来のRNA配列、
（３）前記RNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むRNA配列、
（６）当該酵素をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列、
（８）前記一本鎖RNA結合タンパク質をコードするRNA配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたRNA配列。
【請求項2】
前記（１）の標的RNA配列が、少なくとも6個の遺伝子を含むか、又は全長5000塩基以上の長さのRNA配列である、請求項１に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項3】
前記（２）のRNA配列が、ヒトのmRNA配列に由来する5～49塩基長のRNA配列である、請求項１又は２に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項4】
同一もしくは異なる配列からなる前記（２）のRNA配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる各遺伝子配列の3’末端側及び／又は5’末端側に隣接して配置されることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項5】
前記（６）のRNA配列がコードするRNA依存性RNA合成酵素が、パラミキソウイルス科に属するRNAウイルス由来のLタンパク質及びPタンパク質であり、
前記（７）のRNA配列がコードする当該酵素の活性を調節するタンパク質が、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のCタンパク質であり、
前記（８）のRNA配列がコードする一本鎖RNA結合タンパク質が、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のNPタンパク質であって、かつ
前記（３）～（５）のRNA配列のいずれもが、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のゲノム配列中の転写開始シグナル、転写終結シグナル、及び複製起点を含むRNA配列であることを特徴とする、
請求項１～４のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
前記（７）のRNA配列がコードする当該酵素の活性を調節するタンパク質が、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のCタンパク質であり、
前記（８）のRNA配列がコードする一本鎖RNA結合タンパク質が、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のNPタンパク質であって、かつ
前記（３）～（５）のRNA配列のいずれもが、当該RNAウイルスと同一のウイルス由来のゲノム配列中の転写開始シグナル、転写終結シグナル、及び複製起点を含むRNA配列であることを特徴とする、
請求項１～４のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項6】
前記Lタンパク質、Pタンパク質、Cタンパク質及びNPタンパク質をコードするRNA配列がヒト細胞に最適化されており、かつそのGC含量が50～60％の範囲内に調整されている、請求項５に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項7】
前記パラミキソウイルス科に属するRNAウイルスが、センダイウイルス、ヒト・パラインフルエンザウイルス、及びニューキャッスル病ウイルスのいずれかから選択されたRNAウイルスである、請求項６に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項8】
前記（３）の転写開始シグナル配列が、3’-UCCCACUUUC-5’（配列番号１）、3’-UCCCUAUUUC-5’（配列番号２）、3’-UCCCACUUAC-5’（配列番号３）、3’-UCCUAAUUUC-5’（配列番号７）、及び3’-UGCCCAUCUUC-5’（配列番号９）のいずれかに示されるRNA配列から選択されるRNA配列であり、
前記（４）の転写終結シグナル配列が、3’-AAUUCUUUUU-5’（配列番号４）、3’-CAUUCUUUUU-5’（配列番号５）、3’-UAUUCUUUUU-5’（配列番号６）、及び3’-UUAUUCUUUUU-5’（配列番号８）のいずれかに示されるRNA配列から選択されるRNA配列であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
前記（４）の転写終結シグナル配列が、3’-AAUUCUUUUU-5’（配列番号４）、3’-CAUUCUUUUU-5’（配列番号５）、3’-UAUUCUUUUU-5’（配列番号６）、及び3’-UUAUUCUUUUU-5’（配列番号８）のいずれかに示されるRNA配列から選択されるRNA配列であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項9】
同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる各遺伝子配列の3’末端側に隣接して配置された前記（２）のRNA配列のさらに3’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる各遺伝子配列の5’末端側に隣接して配置されたRNA配列のさらに5’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、請求項４～８のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項10】
前記（５）の複製起点を含むRNA配列が、下記の配列を含むことを特徴とする請求項７～９のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系；
（ａ）3’-UGGUCUGUUCUC-5’（配列番号１１）または3’-UGGUUUGUUCUC-5’（配列番号１２）で示されるRNA配列、
（ｂ）3’-GAGAACAGACCA-5’（配列番号１３）または3’-GAGAACAAACCA-5’（配列番号１４）で示されるRNA配列、
（ｃ）3’-(CNNNNN)3-5’（配列番号１５）で示されるRNA配列、
（ｄ）3’-(NNNNNG)3-5’（配列番号１６）で示されるRNA配列。
（ａ）3’-UGGUCUGUUCUC-5’（配列番号１１）または3’-UGGUUUGUUCUC-5’（配列番号１２）で示されるRNA配列、
（ｂ）3’-GAGAACAGACCA-5’（配列番号１３）または3’-GAGAACAAACCA-5’（配列番号１４）で示されるRNA配列、
（ｃ）3’-(CNNNNN)3-5’（配列番号１５）で示されるRNA配列、
（ｄ）3’-(NNNNNG)3-5’（配列番号１６）で示されるRNA配列。
【請求項11】
前記（ａ）のRNA配列が、マイナス一本鎖RNA（Ａ）の3’末端に位置しており、かつ前記（ｂ）のRNA配列が、5’末端に位置していることを特徴とする、請求項１０に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項12】
前記（ｃ）のRNA配列が、マイナス一本鎖RNA（Ａ）の3’末端から79塩基目から始まり、かつ前記（ｄ）のRNA配列が、5’末端から96塩基目から始まることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項13】
前記（５）の複製起点を含むRNA配列が、さらにマイナス一本鎖RNA（Ａ）の3’末端から97～116塩基目までの位置に、（ｅ）3’-AAAGAAACGACGGUUUCA-5’（配列番号１７）のRNA配列又はその同一塩基長である18塩基長のRNA配列を含むことを特徴とする、請求項１０～１２のいずれかに記載のステルス型RNA遺伝子発現系。
【請求項14】
請求項１～１３に記載のステルス型RNA遺伝子発現系を構成する複合体を含み、動物細胞に当該複合体を導入する活性を持つRNAベクターであって、自然免疫機構を活性化させないステルス型RNAベクター。
【請求項15】
動物細胞への感染能を有するウイルス粒子を形成している、請求項１４に記載のステルス型RNAベクター。
【請求項16】
請求項１４又は１５に記載のステルス型RNAベクターが導入された動物細胞。
【請求項17】
下記（１）から（８）のRNA配列を含むマイナス一本鎖RNA（Ａ）であって、一本鎖RNA結合タンパク質（Ｂ）、及びRNA依存性RNA合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型RNA；
（１）任意のタンパク質又は機能性RNAをコードする標的RNA配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないRNA配列、
（３）RNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むRNA配列、
（６）当該酵素をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列、
（８）一本鎖RNA結合タンパク質をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列。
（１）任意のタンパク質又は機能性RNAをコードする標的RNA配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないRNA配列、
（３）RNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むRNA配列、
（６）当該酵素をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列、
（８）一本鎖RNA結合タンパク質をコードするRNA配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したRNA配列。
【請求項18】
前記マイナス一本鎖RNA（Ａ）の3’末端側及び5’末端側には前記（５）のRNA依存性RNA合成酵素が認識する複製起点を含むRNA配列であって、3’末端側のRNA配列及び5’末端側のRNA配列にはそれぞれ相補するRNA配列が含まれている、請求項１７に記載のステルス型RNA。
【請求項19】
同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の3’末端側に隣接して配置された前記（２）のRNA配列のさらに3’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の5’末端側に隣接して配置されたRNA配列のさらに5’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、請求項１７又は請求項１８に記載のステルス型RNA。
【請求項20】
同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の3’末端側に隣接して配置された前記（２）のRNA配列のさらに3’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的RNA配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の5’末端側に隣接して配置されたRNA配列のさらに5’末端側に隣接して配置されており、さらにその両端に、複数の制限酵素により切断可能な制限酵素サイトを有したカセット構造を構成しており、当該カセット構造が複数結合していることを特徴とする、請求項１７～１９のいずれかに記載のステルス型RNA。
【請求項21】
ステルス型RNA遺伝子発現系を再構成する方法であって、下記の（１）～（５）の工程を含む方法；
（１）T7 RNA polymeraseを発現している大腸菌を用意する工程、
（２）請求項１～１３のいずれかに記載のマイナス一本鎖RNA（Ａ）と共に、少なくともRNA依存性RNA合成酵素及びRNA結合活性タンパク質をコードするRNAが搭載された大腸菌用ベクターと、RNA結合活性タンパク質をコードするDNAを発現する大腸菌用ベクターとを（１）の大腸菌宿主内に導入して形質転換する工程、
（３）（２）の形質転換大腸菌内で、T7 RNA polymeraseにより発現させた外来の遺伝子RNAを含むマイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質との複合体を形成させる工程、
（４）RNA依存性RNA合成酵素を発現している動物細胞を用意する工程、
（５）（３）で得られたマイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質との複合体を、（４）の動物細胞宿主内に導入して、マイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質及びRNA依存性RNA合成酵素との複合体からなる、ステルス型RNA遺伝子発現系を再構成する工程。
（１）T7 RNA polymeraseを発現している大腸菌を用意する工程、
（２）請求項１～１３のいずれかに記載のマイナス一本鎖RNA（Ａ）と共に、少なくともRNA依存性RNA合成酵素及びRNA結合活性タンパク質をコードするRNAが搭載された大腸菌用ベクターと、RNA結合活性タンパク質をコードするDNAを発現する大腸菌用ベクターとを（１）の大腸菌宿主内に導入して形質転換する工程、
（３）（２）の形質転換大腸菌内で、T7 RNA polymeraseにより発現させた外来の遺伝子RNAを含むマイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質との複合体を形成させる工程、
（４）RNA依存性RNA合成酵素を発現している動物細胞を用意する工程、
（５）（３）で得られたマイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質との複合体を、（４）の動物細胞宿主内に導入して、マイナス一本鎖RNAと、RNA結合活性タンパク質及びRNA依存性RNA合成酵素との複合体からなる、ステルス型RNA遺伝子発現系を再構成する工程。
【請求項22】
２箇所のクロ－ニング部位Ａ、Ｂを有するDNAベースのタンデム型カセットであって、
当該タンデム型カセットは5’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれRNAに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないRNAとなる、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAである、
タンデム型カセット。
当該タンデム型カセットは5’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれRNAに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないRNAとなる、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAである、
タンデム型カセット。
【請求項23】
前記（４）クローニング部位Ａは5’末端側から順に制限酵素Ａ認識配列、及び制限酵素Ｃ認識配列を含み、
前記（９）クローニング部位Ｂは、5’末端側から順に制限酵素Ｄ認識配列、及び制限酵素Ｂ認識配列を含んでおり、
ここで制限酵素Ａと制限酵素Ｄは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものであり、制限酵素Ｃと制限酵素Ｂは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものである、
請求項２２に記載のタンデム型カセット。
前記（９）クローニング部位Ｂは、5’末端側から順に制限酵素Ｄ認識配列、及び制限酵素Ｂ認識配列を含んでおり、
ここで制限酵素Ａと制限酵素Ｄは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものであり、制限酵素Ｃと制限酵素Ｂは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものである、
請求項２２に記載のタンデム型カセット。
【請求項24】
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、いずれもNN又はNNNで表される配列任意の一本鎖突出末端を生じる制限酵素の認識配列を含むDNAである、
請求項２２又は２３に記載のタンデム型カセット。
請求項２２又は２３に記載のタンデム型カセット。
【請求項25】
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ、及び（１０）非コード領域Ｂ２が、それぞれそれぞれ動物細胞で発現しているmRNA由来RNA配列の部分配列に対応する同一もしくは異なるcDNAであって、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂに、同一もしくは異なるヒト由来遺伝子が挿入された、請求項２２～２４のいずれかに記載のタンデム型カセット。
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂに、同一もしくは異なるヒト由来遺伝子が挿入された、請求項２２～２４のいずれかに記載のタンデム型カセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、動物細胞に外来遺伝子を導入し、持続的に発現するためのベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト細胞を含む動物細胞に外部から任意の遺伝子を導入し当該細胞において持続的に発現する技術は、バイオテクノロジーを使ったさまざまな産業において必須の技術である。
例えば、医薬品として使われるヒト・モノクローナル抗体を産業用に大量生産するためには、免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を等しいレベルで持続的に発現する技術が必要である。また先天性代謝疾患の遺伝子治療では、治療用遺伝子をヒトの組織細胞に導入し、体内で長期間にわたり安定に発現する技術が必要である。
例えば、医薬品として使われるヒト・モノクローナル抗体を産業用に大量生産するためには、免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を等しいレベルで持続的に発現する技術が必要である。また先天性代謝疾患の遺伝子治療では、治療用遺伝子をヒトの組織細胞に導入し、体内で長期間にわたり安定に発現する技術が必要である。
【0003】
１．細胞リプログラミング技術について
近年、遺伝子を使って正常組織細胞の性質を転換し有用な細胞を作り出す細胞リプログラミング技術が注目を集めているが、動物細胞に遺伝子を導入し持続的に発現する技術は、細胞リプログラミングにおいても欠かせない基盤技術となっている。例えば、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣまたはＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＮＡＮＯＧ， ＬＩＮ２８という４個の遺伝子を組み合わせてヒト正常線維芽細胞に導入し、当該遺伝子を２１日間にわたって持続的に発現させることでヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）を作製することができる（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２）。また、ヒトの線維芽細胞にＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａという３個の遺伝子を導入して１４日間持続的に発現させることで肝細胞を作製することができる（非特許文献３）。さらに、ヒトの線維芽細胞にＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２という５個の遺伝子を導入し、２４日間持続的に発現させることで、ドーパミン作動性ニューロンを作製することができることも報告されている（非特許文献４）。このように、さまざまな細胞リプログラミングにおいて、複数の遺伝子を同時に細胞に導入して発現し、リプログラミングに必要な期間その発現を維持できる技術が必要とされている。
近年、遺伝子を使って正常組織細胞の性質を転換し有用な細胞を作り出す細胞リプログラミング技術が注目を集めているが、動物細胞に遺伝子を導入し持続的に発現する技術は、細胞リプログラミングにおいても欠かせない基盤技術となっている。例えば、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣまたはＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＮＡＮＯＧ， ＬＩＮ２８という４個の遺伝子を組み合わせてヒト正常線維芽細胞に導入し、当該遺伝子を２１日間にわたって持続的に発現させることでヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）を作製することができる（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２）。また、ヒトの線維芽細胞にＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａという３個の遺伝子を導入して１４日間持続的に発現させることで肝細胞を作製することができる（非特許文献３）。さらに、ヒトの線維芽細胞にＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２という５個の遺伝子を導入し、２４日間持続的に発現させることで、ドーパミン作動性ニューロンを作製することができることも報告されている（非特許文献４）。このように、さまざまな細胞リプログラミングにおいて、複数の遺伝子を同時に細胞に導入して発現し、リプログラミングに必要な期間その発現を維持できる技術が必要とされている。
【0004】
細胞のリプログラミングは、生体内でも誘導できることが知られている。例えば、マウスの心筋梗塞モデルで、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５の３個の遺伝子、あるいはＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ２、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５の４個の遺伝子を梗塞部位に投与すると、浸潤している線維芽細胞が心筋細胞に変化することが報告されている（非特許文献５、非特許文献６）このため、細胞リプログラミング技術は、将来、心筋梗塞や脊髄損傷などの再生医療の基盤となることが期待されている。
【0005】
２．細胞のリプログラミング効率の向上
また、体外における細胞リプログラミングを医療に使うことを想定すると、素材となる細胞は、人体から侵襲を加えずに採取でき、かつ生体外の微生物に汚染されない状態で採取できることが望ましい。これらの条件を満たす細胞はほぼ末梢血中の単核細胞に限られており、これらの細胞に適応した遺伝子導入ベクターが望まれる。
また、体外における細胞リプログラミングを医療に使うことを想定すると、素材となる細胞は、人体から侵襲を加えずに採取でき、かつ生体外の微生物に汚染されない状態で採取できることが望ましい。これらの条件を満たす細胞はほぼ末梢血中の単核細胞に限られており、これらの細胞に適応した遺伝子導入ベクターが望まれる。
【0006】
一般に、外部から導入した遺伝子によって動物細胞がリプログラミングされる効率は非常に低いが、当該遺伝子すべてを１つのベクターに搭載し、一度に細胞に導入して発現させることでその効率を高めることができる（特許文献３、特許文献４、非特許文献７、非特許文献８）。
また、細胞リプログラミングに使用する遺伝子の数を増やすことでも、その効率が上昇することも知られている。例えば、マウス線維芽細胞を人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）に転換する技術においては、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣの４個の遺伝子にＢＲＧ１とＢＡＦ１５５の２個の遺伝子を追加して計６個の遺伝子を使用することで転換効率が５倍上昇することが知られている（非特許文献９）。また、ヒトの線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術においては、ＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌという４つの遺伝子に、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２という３つの遺伝子を追加して計７個の遺伝子を使用することで、リプログラミングの効率が１００倍向上することが知られている（非特許文献１０）。
細胞リプログラミングに使用する遺伝子の数を増やすと、搭載しなければならない遺伝子のサイズも増大する。ｉＰＳ細胞の作製の場合を例に取ると、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの遺伝子の合計では４，７７４塩基対であるが、上記のＢＲＧ１（５，０４０塩基対）とＢＡＦ１５５（３，３１８塩基対）の２個の遺伝子を追加すると合計で１３，１３２塩基対になる（非特許文献９）。また、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの遺伝子に、胚性幹細胞で特異的に発現しておりｉＰＳ細胞への初期化を加速することが予想されているクロマチン再構成因子をコードするＣＨＤ１遺伝子（５，１３３塩基対）を追加すると合計で９，９０７塩基対、ＤＮＡ脱メチル化酵素をコードするＴＥＴ１遺伝子（６，４２９塩基対）を追加すると合計で１１，２０３塩基対になる。また、ヒトの線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術においては使われるＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２の７つの遺伝子を合計すると９，８８７塩基対となる（非特許文献１０）。
このように、細胞リプログラミングの効率を上げるためには、少なくとも６個以上の遺伝子を使うことが望ましく、これらの遺伝子をすべて一度に搭載できるベクターが望まれる。また、導入した外来遺伝子のサイズがあわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できるベクターが望まれる。
なお、本明細書においてベクターとは、外来遺伝子を含む核酸を成分とし、当該核酸を動物細胞に導入して当該遺伝子を発現することができる、遺伝子組換えウイルスまたは非ウイルス性の核酸・高分子物質複合体を指すものとする。
また、細胞リプログラミングに使用する遺伝子の数を増やすことでも、その効率が上昇することも知られている。例えば、マウス線維芽細胞を人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）に転換する技術においては、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣの４個の遺伝子にＢＲＧ１とＢＡＦ１５５の２個の遺伝子を追加して計６個の遺伝子を使用することで転換効率が５倍上昇することが知られている（非特許文献９）。また、ヒトの線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術においては、ＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌという４つの遺伝子に、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２という３つの遺伝子を追加して計７個の遺伝子を使用することで、リプログラミングの効率が１００倍向上することが知られている（非特許文献１０）。
細胞リプログラミングに使用する遺伝子の数を増やすと、搭載しなければならない遺伝子のサイズも増大する。ｉＰＳ細胞の作製の場合を例に取ると、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの遺伝子の合計では４，７７４塩基対であるが、上記のＢＲＧ１（５，０４０塩基対）とＢＡＦ１５５（３，３１８塩基対）の２個の遺伝子を追加すると合計で１３，１３２塩基対になる（非特許文献９）。また、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの遺伝子に、胚性幹細胞で特異的に発現しておりｉＰＳ細胞への初期化を加速することが予想されているクロマチン再構成因子をコードするＣＨＤ１遺伝子（５，１３３塩基対）を追加すると合計で９，９０７塩基対、ＤＮＡ脱メチル化酵素をコードするＴＥＴ１遺伝子（６，４２９塩基対）を追加すると合計で１１，２０３塩基対になる。また、ヒトの線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術においては使われるＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌ、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２の７つの遺伝子を合計すると９，８８７塩基対となる（非特許文献１０）。
このように、細胞リプログラミングの効率を上げるためには、少なくとも６個以上の遺伝子を使うことが望ましく、これらの遺伝子をすべて一度に搭載できるベクターが望まれる。また、導入した外来遺伝子のサイズがあわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できるベクターが望まれる。
なお、本明細書においてベクターとは、外来遺伝子を含む核酸を成分とし、当該核酸を動物細胞に導入して当該遺伝子を発現することができる、遺伝子組換えウイルスまたは非ウイルス性の核酸・高分子物質複合体を指すものとする。
【0007】
また、外来遺伝子を発現させて動物細胞のリプログラミングを行う場合に、当該遺伝子の発現レベルが、リプログラミングによって作製された細胞の性質に大きく影響することが知られている。例えば、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣという４つの遺伝子をマウス線維芽細胞で発現させた場合、当該遺伝子の発現が弱い場合はｉＰＳ細胞が生じるのに対し、当該遺伝子の発現が強い場合はｉＰＳ細胞とはまったく性質が違う細胞が生じることが知られている（非特許文献１１）。このため、外部から導入した遺伝子を発現させてヒト細胞を含む動物細胞をリプログラミングする技術には、目的に合わせて当該遺伝子の発現を最適なレベルに設定できるベクターが必要である。
【0008】
３．リプログラミング用遺伝子の除去
さらに、外部から遺伝子を導入して細胞リプログラミングにより作製した細胞がその機能を完全に発揮するためには、当該リプログラミング用遺伝子を当該細胞から完全に除去する必要がある。また、作製したヒト細胞を再生医療の材料として用いる際にも、安全性を確保するために、当該遺伝子を当該細胞から完全に除去する必要がある。例えば、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣの４個の遺伝子を使って作製した人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）では、これら４個の遺伝子が発現したままでは多能性を発揮できないので、少なくともその発現を完全に抑制するか、より望ましくは当該細胞から完全に除去する必要がある（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献７）。また、ｉＰＳ細胞作製時に使用したｃ－ＭＹＣ遺伝子を当該ｉＰＳ細胞の中に残しておくと、当該ｉＰＳ細胞を再分化させて作製した組織細胞が高頻度でガン化することが知られている（非特許文献１２）。そのため、安全性を担保するためには、当該ｃ－ＭＹＣ遺伝子をｉＰＳ細胞から完全に除去する必要がある。
このように、細胞リプログラミングに必要な遺伝子発現技術は、リプログラミングの達成のためには最適なレベルでの持続的な遺伝子発現が望まれる一方で、いったんリプログラミングが終了したら簡単かつ完全に除去できることが要求されるという、矛盾した性質を両立させる必要がある。
さらに、外部から遺伝子を導入して細胞リプログラミングにより作製した細胞がその機能を完全に発揮するためには、当該リプログラミング用遺伝子を当該細胞から完全に除去する必要がある。また、作製したヒト細胞を再生医療の材料として用いる際にも、安全性を確保するために、当該遺伝子を当該細胞から完全に除去する必要がある。例えば、ＯＣＴ４， ＳＯＸ２， ＫＬＦ４， ｃ－ＭＹＣの４個の遺伝子を使って作製した人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）では、これら４個の遺伝子が発現したままでは多能性を発揮できないので、少なくともその発現を完全に抑制するか、より望ましくは当該細胞から完全に除去する必要がある（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献７）。また、ｉＰＳ細胞作製時に使用したｃ－ＭＹＣ遺伝子を当該ｉＰＳ細胞の中に残しておくと、当該ｉＰＳ細胞を再分化させて作製した組織細胞が高頻度でガン化することが知られている（非特許文献１２）。そのため、安全性を担保するためには、当該ｃ－ＭＹＣ遺伝子をｉＰＳ細胞から完全に除去する必要がある。
このように、細胞リプログラミングに必要な遺伝子発現技術は、リプログラミングの達成のためには最適なレベルでの持続的な遺伝子発現が望まれる一方で、いったんリプログラミングが終了したら簡単かつ完全に除去できることが要求されるという、矛盾した性質を両立させる必要がある。
【0009】
４．自然免疫機構の活性化の回避の重要性
現在、動物細胞で使われているほとんどの遺伝子導入・発現ベクターでは、動物に感染するウイルスや、大腸菌等の微生物を使って製造したプラスミドＤＮＡが素材として用いられている。しかし、動物細胞は、外部から侵入してきた病原体を撃退するための自然免疫機構を備えており（非特許文献１３）、細胞外から導入されたウイルスや微生物由来の核酸は異物として認識されて、自然免疫機構が活性化される。自然免疫機構の活性化の程度があるレベルを超えるとアポトーシスによる細胞死が誘導されるため、リプログラミングの効率が低下する。また、自然免疫機構の活性化によりインターフェロンや炎症性サイトカインの発現が誘導されると、生体内では炎症が引き起こされる。このような望ましくない反応を防ぐために、細胞のリプログラミングを行う遺伝子導入・発現技術には、自然免疫機構の活性化を回避することが求められる。この性質は、特に、前記１．で記述した生体内での細胞リプログラミングを含む再生医療への応用において重要である。
現在、動物細胞で使われているほとんどの遺伝子導入・発現ベクターでは、動物に感染するウイルスや、大腸菌等の微生物を使って製造したプラスミドＤＮＡが素材として用いられている。しかし、動物細胞は、外部から侵入してきた病原体を撃退するための自然免疫機構を備えており（非特許文献１３）、細胞外から導入されたウイルスや微生物由来の核酸は異物として認識されて、自然免疫機構が活性化される。自然免疫機構の活性化の程度があるレベルを超えるとアポトーシスによる細胞死が誘導されるため、リプログラミングの効率が低下する。また、自然免疫機構の活性化によりインターフェロンや炎症性サイトカインの発現が誘導されると、生体内では炎症が引き起こされる。このような望ましくない反応を防ぐために、細胞のリプログラミングを行う遺伝子導入・発現技術には、自然免疫機構の活性化を回避することが求められる。この性質は、特に、前記１．で記述した生体内での細胞リプログラミングを含む再生医療への応用において重要である。
【0010】
５．理想的な細胞リプログラミングのための遺伝子導入・発現系
以上の検討から、遺伝子を使ってヒト細胞を含む動物細胞をリプログラミングする技術を、さらに改良して産業に応用するためには、上記１．～４．で検討したように、少なくとも以下の５つの条件を満たす遺伝子導入・発現技術が必要である。
（１）ヒト末梢血細胞を含む動物細胞に外来遺伝子を効率よく導入できる。
（２）必要な任意の期間、当該遺伝子を持続的に発現できる。
（３）当該遺伝子の発現に際し、細胞が持つ自然免疫機構を回避できる。
（４）導入した外来遺伝子長があわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できる。
（５）少なくとも６個、望ましくは８個以上の当該遺伝子を同時に発現できる。
そして、さらに以下の点が達成されていることも強く望まれる。
（６）当該遺伝子の発現レベルを調節することができる。特に、導入遺伝子が複数である場合、各遺伝子の発現レベルを個々に調節可能であることが好ましい。
また、とりわけ遺伝子導入細胞を移植技術に応用する場合には、以下の点もきわめて重要なポイントとなる。
（７）当該遺伝子が不要になった時点で、簡単な手法で除去することができる。
以上の検討から、遺伝子を使ってヒト細胞を含む動物細胞をリプログラミングする技術を、さらに改良して産業に応用するためには、上記１．～４．で検討したように、少なくとも以下の５つの条件を満たす遺伝子導入・発現技術が必要である。
（１）ヒト末梢血細胞を含む動物細胞に外来遺伝子を効率よく導入できる。
（２）必要な任意の期間、当該遺伝子を持続的に発現できる。
（３）当該遺伝子の発現に際し、細胞が持つ自然免疫機構を回避できる。
（４）導入した外来遺伝子長があわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できる。
（５）少なくとも６個、望ましくは８個以上の当該遺伝子を同時に発現できる。
そして、さらに以下の点が達成されていることも強く望まれる。
（６）当該遺伝子の発現レベルを調節することができる。特に、導入遺伝子が複数である場合、各遺伝子の発現レベルを個々に調節可能であることが好ましい。
また、とりわけ遺伝子導入細胞を移植技術に応用する場合には、以下の点もきわめて重要なポイントとなる。
（７）当該遺伝子が不要になった時点で、簡単な手法で除去することができる。
【0011】
６．動物細胞への複数遺伝子導入技術
ヒト細胞を含む動物細胞に外部から複数の遺伝子を導入し当該細胞において持続的に発現する技術であって、細胞のリプログラミングに使用できることが報告されている技術としては、
（１）核内にあるゲノムＤＮＡに当該遺伝子を挿入する方法
（２）核内でゲノムＤＮＡとは独立に安定に存在できるＤＮＡに当該遺伝子を搭載する方法
（３）細胞質に存在するＲＮＡに当該遺伝子を搭載する方法
の３つが知られている。
ヒト細胞を含む動物細胞に外部から複数の遺伝子を導入し当該細胞において持続的に発現する技術であって、細胞のリプログラミングに使用できることが報告されている技術としては、
（１）核内にあるゲノムＤＮＡに当該遺伝子を挿入する方法
（２）核内でゲノムＤＮＡとは独立に安定に存在できるＤＮＡに当該遺伝子を搭載する方法
（３）細胞質に存在するＲＮＡに当該遺伝子を搭載する方法
の３つが知られている。
【0012】
６－１．核内のゲノムＤＮＡに複数遺伝子を挿入する方法
レンチウイルスベクター（非特許文献８、非特許文献１４）・トランスポゾン（非特許文献１５、非特許文献１６）・非相同組換え・相同組換え等を用いて、細胞の核内にあるゲノムＤＮＡに外来遺伝子を挿入する方法では、当該遺伝子はゲノムＤＮＡと同等に安定に存在できる。しかし、いったんゲノムＤＮＡに挿入されると、当該遺伝子だけをゲノムＤＮＡから選択的に除去するためには、配列特異的組換え酵素を細胞に導入する等の煩雑な作業が必要になる上、すべての細胞で確実に除去できるわけではない（非特許文献１５）。また、ゲノムＤＮＡへの外来遺伝子の挿入は宿主細胞のＤＮＡ複製を必要とするため、血液細胞などの増殖能が低い細胞への遺伝子導入は効率が極めて低い。さらに、外来遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることで、宿主の遺伝子の破壊や異常な活性化を起こす「挿入変異」という現象が知られているため、医療応用のためには安全性の懸念が存在する（非特許文献１７）。
レンチウイルスベクター（非特許文献８、非特許文献１４）・トランスポゾン（非特許文献１５、非特許文献１６）・非相同組換え・相同組換え等を用いて、細胞の核内にあるゲノムＤＮＡに外来遺伝子を挿入する方法では、当該遺伝子はゲノムＤＮＡと同等に安定に存在できる。しかし、いったんゲノムＤＮＡに挿入されると、当該遺伝子だけをゲノムＤＮＡから選択的に除去するためには、配列特異的組換え酵素を細胞に導入する等の煩雑な作業が必要になる上、すべての細胞で確実に除去できるわけではない（非特許文献１５）。また、ゲノムＤＮＡへの外来遺伝子の挿入は宿主細胞のＤＮＡ複製を必要とするため、血液細胞などの増殖能が低い細胞への遺伝子導入は効率が極めて低い。さらに、外来遺伝子がゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることで、宿主の遺伝子の破壊や異常な活性化を起こす「挿入変異」という現象が知られているため、医療応用のためには安全性の懸念が存在する（非特許文献１７）。
【0013】
６－２．核内でゲノムＤＮＡとは独立なＤＮＡに複数遺伝子を搭載する方法
細胞の核内で、ゲノムＤＮＡとは独立に安定に存在できるＤＮＡに外来遺伝子を搭載する方法としては、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスのゲノムの複製起点を搭載した環状ＤＮＡを使う方法や（非特許文献１８）、直鎖状の巨大なＤＮＡを含む人工染色体を使う方法が知られている（非特許文献１９）。これらのＤＮＡ分子は、ヒト細胞の核内で複製を続け安定に維持されるが、その機構は宿主細胞のゲノムＤＮＡが複製する機構に依存している。そのため、外来遺伝子が搭載されたＤＮＡの複製だけを特異的に阻害することはできず、当該ＤＮＡを細胞から積極的に除去する技術は報告されていない。また、当該ＤＮＡ分子を細胞核内に導入するためには宿主細胞の分裂が必要であるため、血液細胞などの増殖能が低い細胞への遺伝子導入は効率が極めて低い。また、細胞核内の環状ＤＮＡは、高頻度に当該細胞のゲノムＤＮＡに取り込まれることが知られているため、挿入変異の危険性を排除できない（非特許文献２０）。
細胞の核内で、ゲノムＤＮＡとは独立に安定に存在できるＤＮＡに外来遺伝子を搭載する方法としては、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスのゲノムの複製起点を搭載した環状ＤＮＡを使う方法や（非特許文献１８）、直鎖状の巨大なＤＮＡを含む人工染色体を使う方法が知られている（非特許文献１９）。これらのＤＮＡ分子は、ヒト細胞の核内で複製を続け安定に維持されるが、その機構は宿主細胞のゲノムＤＮＡが複製する機構に依存している。そのため、外来遺伝子が搭載されたＤＮＡの複製だけを特異的に阻害することはできず、当該ＤＮＡを細胞から積極的に除去する技術は報告されていない。また、当該ＤＮＡ分子を細胞核内に導入するためには宿主細胞の分裂が必要であるため、血液細胞などの増殖能が低い細胞への遺伝子導入は効率が極めて低い。また、細胞核内の環状ＤＮＡは、高頻度に当該細胞のゲノムＤＮＡに取り込まれることが知られているため、挿入変異の危険性を排除できない（非特許文献２０）。
【0014】
６－３．同一のベクターＤＮＡから複数遺伝子を発現する技術
また、上記６－１．及び６－２．で記述したようにＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使用する場合、複数の遺伝子を同一のベクターＤＮＡから発現する技術が必要となる。当該技術としては、１）複数の独立した遺伝子を単純に連結して発現する方法、２）Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ （ＩＲＥＳ）と呼ばれるＲＮＡ構造を用いて、１本のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から複数のタンパク質を発現する方法、３）複数のタンパク質を２Ａペプチドで連結した融合タンパク質を発現する方法、の３つが知られている。
また、上記６－１．及び６－２．で記述したようにＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使用する場合、複数の遺伝子を同一のベクターＤＮＡから発現する技術が必要となる。当該技術としては、１）複数の独立した遺伝子を単純に連結して発現する方法、２）Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ （ＩＲＥＳ）と呼ばれるＲＮＡ構造を用いて、１本のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から複数のタンパク質を発現する方法、３）複数のタンパク質を２Ａペプチドで連結した融合タンパク質を発現する方法、の３つが知られている。
【0015】
複数の独立した遺伝子を連結する方法では、遺伝子間の相互干渉によって遺伝子の発現が強く抑制されることが知られている（非特許文献２１）。これを防止するためには、インシュレーターと呼ばれる構造を遺伝子間に挿入する必要があり、ベクターＤＮＡのサイズが大きくなると共に、構造も複雑になる。この方法では、４個の遺伝子を１個のＤＮＡ分子に搭載して発現させた例が報告されているが（非特許文献２２）、５個以上の遺伝子を同時に発現した例は報告されていない。
【0016】
ＩＲＥＳ配列を用いて、１本のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から複数のタンパク質を発現する方法では、ＩＲＥＳ配列の下流に置かれたタンパク質の翻訳効率は、ＩＲＥＳ配列の上流に配置されたタンパク質の翻訳効率よりも低く、１０％以下になる場合もある（非特許文献２３）。
また、ＩＲＥＳ配列は比較的サイズが大きく複雑な構造なので、ＩＲＥＳ配列を使った方法は主に２個のタンパク質を同時に発現させるために使われている。
また、ＩＲＥＳ配列は比較的サイズが大きく複雑な構造なので、ＩＲＥＳ配列を使った方法は主に２個のタンパク質を同時に発現させるために使われている。
【0017】
２Ａペプチドは、プラス一本鎖ＲＮＡウイルスで見いだされた１８から２２アミノ酸残基からなる構造で、複数のタンパク質を２Ａペプチドで接続した融合タンパク質は、合成時に自動的に切断され、元の複数のタンパク質に分解される。この技術では、切断後に生じる各タンパク質のＮ末端には１個のプロリンが、Ｃ末端には１７から２１アミノ酸残基が残り、これらの余分なアミノ酸残基が当該タンパク質の機能に影響を与える可能性がある（非特許文献２４）。また、２Ａペプチド部位での切断効率は融合タンパク質の構造に大きく影響されるため、複数のタンパク質を効率よく作製するためには労力を要する試行錯誤が必要である（非特許文献２５）。２Ａペプチドで複数のタンパク質を接続する方法では、４個のタンパク質を同時に発現した例（非特許文献８）や５個のタンパク質を同時に発現した例（非特許文献１６）が報告されている。また、ＩＲＥＳ配列と２Ａペプチドを組み合わせて４個のタンパク質を発現した例も報告されている（非特許文献１４）。
【0018】
６－４．細胞質に存在するＲＮＡに複数遺伝子を搭載する方法
前記６－１．～６－３．で記述したように、ＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う既存の遺伝子導入・発現技術では、４個から５個の遺伝子を使った細胞のリプログラミングが報告されている。しかし、ＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う限り、６個以上の遺伝子を同時に搭載することや、簡便な方法で遺伝子の除去を達成することは容易では無く、前記５．で示した理想的なリプログラミングに求められる５つの条件ですらすべて満たした技術は報告されていない。
前記６－１．～６－３．で記述したように、ＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う既存の遺伝子導入・発現技術では、４個から５個の遺伝子を使った細胞のリプログラミングが報告されている。しかし、ＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う限り、６個以上の遺伝子を同時に搭載することや、簡便な方法で遺伝子の除去を達成することは容易では無く、前記５．で示した理想的なリプログラミングに求められる５つの条件ですらすべて満たした技術は報告されていない。
【0019】
一方、ＲＮＡをプラットフォームとして、ヒト細胞を含む動物細胞に外部から複数の遺伝子を導入して発現し、細胞をリプログラミングする技術としては、プラス鎖ＲＮＡを使う技術（非特許文献２６、非特許文献２７）と、マイナス鎖ＲＮＡを使う技術（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０）が報告されている。
【0020】
６－４－１．プラス鎖ＲＮＡを用いる方法
細胞質で安定に存在できるプラス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）由来のプラス一本鎖ゲノムＲＮＡを使った技術（非特許文献２６）が報告されている。この技術では、ＶＥＥＶのゲノムＲＮＡ３’側の構造遺伝子を、２Ａペプチドで連結したタンパク質をコードする遺伝子で置き換えることにより、４個のタンパク質の発現を実現している。この系は、非常に強いインターフェロン発現の誘導を引き起こし、必ず抗インターフェロン物質（ワクチニアウイルス由来のＢ１８Ｒタンパク質）と組み合わせる必要がある（非特許文献２６）。また、遺伝子導入の効率は組み合わせる遺伝子導入試薬に依存し、リプログラミングが可能なのは線維芽細胞など接着性の細胞に限定される。外来遺伝子を搭載したＲＮＡは不安定で、Ｂ１８Ｒタンパク質を培地から除去することで消失する。
細胞質で安定に存在できるプラス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）由来のプラス一本鎖ゲノムＲＮＡを使った技術（非特許文献２６）が報告されている。この技術では、ＶＥＥＶのゲノムＲＮＡ３’側の構造遺伝子を、２Ａペプチドで連結したタンパク質をコードする遺伝子で置き換えることにより、４個のタンパク質の発現を実現している。この系は、非常に強いインターフェロン発現の誘導を引き起こし、必ず抗インターフェロン物質（ワクチニアウイルス由来のＢ１８Ｒタンパク質）と組み合わせる必要がある（非特許文献２６）。また、遺伝子導入の効率は組み合わせる遺伝子導入試薬に依存し、リプログラミングが可能なのは線維芽細胞など接着性の細胞に限定される。外来遺伝子を搭載したＲＮＡは不安定で、Ｂ１８Ｒタンパク質を培地から除去することで消失する。
【0021】
プラス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、化学合成したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使った技術（非特許文献２７）も報告されている。この先行技術は、最大５個の外来遺伝子をそれぞれ別々に搭載した複数のｍＲＮＡを混合してから遺伝子導入試薬を使って細胞に導入するもので、遺伝子発現は一過性であるため、当該細胞に毎日新たに導入する必要がある。また、遺伝子導入が可能なのは線維芽細胞など接着性の細胞に限定される。この技術においても自然免疫機構が強力に活性化されるため、必ず抗インターフェロン物質（ワクチニアウイルス由来のＢ１８Ｒタンパク質）と組み合わせる必要がある（非特許文献２７）。
【0022】
６－４－２．マイナス鎖ＲＮＡを用いる方法
マイナス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、パラミキソウイルスの一種であるセンダイウイルス野生株に、外来遺伝子を別々に搭載したベクターを混合して使う方法（特許文献５、非特許文献２８、非特許文献２９）や、３つの遺伝子を同時に搭載する方法（特許文献６、非特許文献３０）が先行技術として報告されている。これらのマイナス鎖ＲＮＡを使った遺伝子発現系では、Ｆ遺伝子を欠失することで野生型ウイルスの自律複製能を減弱し、外来遺伝子はそれぞれ単独の遺伝子発現カセットとして搭載される。自然免疫機構の活性化に関しては記述されていないが、素材であるセンダイウイルスは強いインターフェロン誘導能を持っていることが知られている（非特許文献３１）ため、当該ベクターもこれに準じた自然免疫機構の活性化能を持つと予想される。また、野生型ウイルスのゲノムに温度感受性変異を導入し、培養温度を上昇させてベクターを除去できることが報告されている（特許文献６、非特許文献２９、非特許文献３０）。野生型センダイウイルスを基にしたベクターで発現可能な遺伝子のサイズは、３０７８塩基対（大腸菌ベータ・ガラクトシダーゼ）（非特許文献３２）から３４５０塩基対（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の３つの遺伝子の合計）と報告されている（特許文献６、非特許文献３０）。
マイナス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、パラミキソウイルスの一種であるセンダイウイルス野生株に、外来遺伝子を別々に搭載したベクターを混合して使う方法（特許文献５、非特許文献２８、非特許文献２９）や、３つの遺伝子を同時に搭載する方法（特許文献６、非特許文献３０）が先行技術として報告されている。これらのマイナス鎖ＲＮＡを使った遺伝子発現系では、Ｆ遺伝子を欠失することで野生型ウイルスの自律複製能を減弱し、外来遺伝子はそれぞれ単独の遺伝子発現カセットとして搭載される。自然免疫機構の活性化に関しては記述されていないが、素材であるセンダイウイルスは強いインターフェロン誘導能を持っていることが知られている（非特許文献３１）ため、当該ベクターもこれに準じた自然免疫機構の活性化能を持つと予想される。また、野生型ウイルスのゲノムに温度感受性変異を導入し、培養温度を上昇させてベクターを除去できることが報告されている（特許文献６、非特許文献２９、非特許文献３０）。野生型センダイウイルスを基にしたベクターで発現可能な遺伝子のサイズは、３０７８塩基対（大腸菌ベータ・ガラクトシダーゼ）（非特許文献３２）から３４５０塩基対（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２の３つの遺伝子の合計）と報告されている（特許文献６、非特許文献３０）。
【0023】
また、マイナス鎖ＲＮＡを使って細胞をリプログラミングする技術としては、持続感染変異センダイウイルスを基にした技術が報告されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献７）。この技術においては、ベクターの素材となったウイルスのゲノムにおいて長期持続性に関わる点突然変異が複数同定されており、これらの変異が自然免疫機構の活性化の回避（インターフェロン発現の低下）に関与していることが示されている。また、ウイルスゲノムから３個の遺伝子を欠失したのち新たな遺伝子を搭載することで４個の外来遺伝子を同時に発現させることができる。さらに、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするＬ遺伝子の発現をｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ （ｓｉＲＮＡ）で抑制することで、ベクターを能動的に細胞から除去することが報告されている。持続感染変異センダイウイルスを基にしたベクターでは、発現可能な遺伝子のサイズは４７７４塩基対（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの遺伝子の合計）と報告されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献７）。
【0024】
７．複数遺伝子導入技術の今後の課題
前記６－４．で記述したＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う既存の遺伝子導入・発現技術では、４個から５個の遺伝子を使った細胞のリプログラミングが報告されている。これらの中では、前記６－４－２．で記述した欠損持続発現型センダイウイルスベクターが最も優れた性質を持っているが、搭載可能と報告されている遺伝子の数は４個が最大である。また、ＲＮＡウイルスを素材とした技術では遺伝子発現のレベルを変化させることは難しい。
前記６－４．で記述したＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う既存の遺伝子導入・発現技術では、４個から５個の遺伝子を使った細胞のリプログラミングが報告されている。これらの中では、前記６－４－２．で記述した欠損持続発現型センダイウイルスベクターが最も優れた性質を持っているが、搭載可能と報告されている遺伝子の数は４個が最大である。また、ＲＮＡウイルスを素材とした技術では遺伝子発現のレベルを変化させることは難しい。
【0025】
前記６．に示したように、ヒト細胞を含む動物細胞に外部から複数の遺伝子を導入し当該細胞において持続的に発現する技術は、遺伝子を使って正常組織細胞の性質を転換し有用な細胞を作り出す細胞リプログラミングに最適化することを目指して、さまざまな改良が行われてきた。しかし、前記５．で示した理想的なリプログラミングに求められる５つの条件をすべて満たした技術は、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0026】
【特許文献1】ＷＯ ２００７／０６９６６６
【特許文献2】ＷＯ ２００８／１１８８２０
【特許文献3】ＷＯ ２０１０／１３４５２６
【特許文献4】ＷＯ ２０１２／０６３８１７
【特許文献5】ＷＯ ２０１０／００８０５４
【特許文献6】ＷＯ ２０１２／０２９７７０
【特許文献7】米国特許第８，３２６，５４７号明細書
【特許文献8】米国特許第８，４０１，７９８号明細書
【特許文献9】米国特許第７，５６１，９７３号明細書
【非特許文献】
【0027】
【非特許文献1】Ｔａｋａｈａｓｈｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １３１， ８６１－８７２， ２００７
【非特許文献2】Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８， １９１７－１９２０， ２００７
【非特許文献3】Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １４ ３７０－３８４， ２０１４
【非特許文献4】Ｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ９， ２０５－２１８， ２０１１
【非特許文献5】Ｑｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４８５， ５９３－５９８， ２０１２
【非特許文献6】Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４８５， ５９９－６０４， ２０１２
【非特許文献7】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８６， ４７６０－４７７１， ２０１１
【非特許文献8】Ｃａｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０６， １５７－１６２， ２００９
【非特許文献9】Ｓｉｎｇｈａｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １４１， ９４３－９５５， ２０１０
【非特許文献10】Ｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ９， ２０５－２１８， ２０１１
【非特許文献11】Ｔｏｎｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ５１６， １９２－１９７， ２０１４
【非特許文献12】Ｍｉｕｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２７， ７４３－７４５， ２００９
【非特許文献13】Ｒａｎｄａｌｌ， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ８９， １－４７， ２００８
【非特許文献14】Ｓｏｍｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２８， ６４－７４， ２０１０
【非特許文献15】Ｋａｊｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４５８， ７７１－７７５， ２００９
【非特許文献16】Ｇｒａｂｕｎｄｚｊｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４１， １８２９－１８４７， ２０１３
【非特許文献17】Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０２， ４１５－４１９， ２００３
【非特許文献18】Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １１１， １０６７８－１０６８３， ２０１４
【非特許文献19】Ｈｉｒａｔｓｕｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ， ６， ｅ２５９６１， ２０１１
【非特許文献20】Ｈｕｒｌｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６５， １２４５－１２５４， １９９１
【非特許文献21】Ｙａｈａｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３７４， ５８０－５９０， ２００７
【非特許文献22】Ｎｉｓｈｉｕｍｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ．， ３４， ４７－５９， ２００９
【非特許文献23】Ｂａｌｖａｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １７８９， ５４２－５５７， ２００９
【非特許文献24】Ｆｅｌｉｐｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２４， ６８－７５， ２００６
【非特許文献25】Ｌｅｎｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３４３， １１６－１２４， ２００５
【非特許文献26】Ｙｏｓｈｉｏｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， １３， ２４６－２５４， ２０１３
【非特許文献27】Ｗａｒｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ７， １－１３， ２０１０
【非特許文献28】Ｆｕｓａｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｊｐｎ． Ａｃａｄ． Ｓｅｒ． Ｂ８５， ３４８－３６２， ２００９
【非特許文献29】Ｂａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０８， １４２３４－１４２３９， ２０１１
【非特許文献30】Ｆｕｊｉｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ， ９， ｅ１１３０５２， ２０１４
【非特許文献31】Ｈｕａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．， ６０， １２５－１２８， １９９６
【非特許文献32】Ｓａｋａｉ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４５６， ２２１－２２６， １９９９
【非特許文献33】Ｋｏｎｄｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８， ２１９２４－２１９３０， １９９３
【非特許文献34】Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０８， ３３１－３３６， ２０１１
【非特許文献35】Ｓａｉｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４５４， ５２３－５２７， ２００８
【非特許文献36】Ｖａｂｒｅｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ， ７， ｅ３３５０２， ２０１２
【非特許文献37】Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １４０， ３９７－４０８， ２０１０
【非特許文献38】Ｓｈｉｏｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４， １５４５－１５６３， １９８６
【非特許文献39】Ｖｉｄａｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６４， ２３９－２４６， １９９０
【非特許文献40】Ｉｒｉｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ８６， ７１３６－７１４５， ２０１２
【非特許文献41】Ｋａｔｏ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １６， ５７８－５８７， １９９７
【非特許文献42】Ｔａｐｐａｒｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２， ３１１７－３１２８． １９９８
【非特許文献43】Ｐａｒｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， ５５３７－５５４１， １９９１
【非特許文献44】Ｈａｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６９， ５１２８－５１３１， １９９５
【非特許文献45】Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８， ８４１３－８４１７， １９９４
【非特許文献46】Ｓｈａｒｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５， １２８１－１２９５， １９８７
【非特許文献47】Ｇｕｉｇｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５３， ５１－６０， １９９５
【非特許文献48】Ｖａｂｒｅｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ８８， ４１６１－４１７２， ２０１４
【非特許文献49】Ｒａａｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔ． Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ．， ４， ２１５－２２５， ２０１０
【非特許文献50】Ａｌａｎ， Ｈ．， Ｇｅｎｅ， ５６ １２５－１３５， １９８７
【非特許文献51】Ｋｕｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６２， ４４３９－４４４４， １９８８
【非特許文献52】Ｓｅｎｇｕｐｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １４２４６－１４２５５， １９８９
【非特許文献53】Ｍｅｌｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ７０３５－７０５６， １９８４
【非特許文献54】Ｈａｍｐｅｌ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８， ４９２９－４９３３， １９８９
【非特許文献55】Ｔｕｓｃｈｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １３， ３１９１－３１９７， １９９９
【非特許文献56】Ｃｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １３４， １１４１－１１５６， １９７８
【非特許文献57】Ｇａｒｃｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １４， ６０８７－６０９４， １９９５
【非特許文献58】Ｇｏｔｏｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７１， ４３４－４４３， １９８９
【非特許文献59】Ｌｏｐｅｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３３， １８８－１９９， １９９９
【非特許文献60】Ｋｏｚａｋ， Ｃｅｌｌ， ４４， ２８３－２９２， １９８６
【非特許文献61】Ｋｏｚａｋ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７， ３４３８－３４４５， １９８７
【非特許文献62】Ｖａｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３３， １９７－２０６， １９８５
【非特許文献63】Ｎａｋａｊｉｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６８， ５６５－５７０， ２００４
【非特許文献64】Ａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６， ５９０４－５９１０， ２００７
【非特許文献65】Ｄｒｏｃｏｕｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ４００９， １９９０
【非特許文献66】Ｋｏｇｕｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２４， ５７７－５８１， ２００６
【非特許文献67】Ｇｒｉｔｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２５， １７９－１８８， １９８３
【非特許文献68】Ｓｔｕｄｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １８９， １１３－１３０， １９８６
【非特許文献69】Ｎａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ， ２１， ８９３－８９８， １９９８
【非特許文献70】Ｋａｒａｓａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ３８１， ３０７－３１２， ２００４
【非特許文献71】Ｙｏｎｅｙａｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５， ７３０－７３７， ２００４
【非特許文献72】Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５５， ７６０－７６７， ２０１１
【非特許文献73】Ｊｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８３， ４２４１－４２４８， ２００９
【非特許文献74】Ｓｔｕｄｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １８９， １１３－１３０， １９８６
【非特許文献75】Ａｋａｇｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １００， １３５６７－１３５７２， ２００３
【非特許文献76】Ｈａｔｓｕｚａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ２２０７５－２２０７８， １９９０
【非特許文献77】Ｂｏｓｈａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４１， ５２１－５３０， １９８５
【非特許文献78】Ｔａｉｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．， １４０， １８７－１９４， １９９５
【非特許文献79】Ｔａｋｅｂｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８， ４６６－４７２， １９８８
【非特許文献80】Ｒｅｃｉｌｌａｓ－Ｔａｒｇａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９９， ６８８３－６８８８， ２００２
【非特許文献81】Ｆｕｊｉｔａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４１， ４８９－４９６， １９８５
【非特許文献82】Ｙｉ ａｎｄ Ｌｅｍｏｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７７， ３５５７－３５６８， ２００３
【非特許文献83】Ｙｏｕ ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ８２， １８４－１９５， ２００８
【非特許文献84】Ｃｈｒｏｍｉｋｏｖａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６７， ３４３－３５６， ２０１５
【非特許文献85】Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ ａｎｄ Ｖｏｌｌｍｅｒｓ， Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．， １９， ８９７－９０５， ２００４
【非特許文献86】Ｏｋａｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４９， ４４７－４５９， ２００５
【非特許文献87】Ｌｅｗｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ３２， １９１－１９８， ２０１４
【非特許文献88】Ｗｕｒｍ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２２， １３９３－１３９８， ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0028】
以上述べたように、本発明が解決しようとする課題の１つは、遺伝子を使ってヒト細胞を含む動物細胞をリプログラミングするために望ましい遺伝子導入・発現技術、そのためのベクターを開発することである。さらに、リプログラミング遺伝子に限らず、全長５，０００塩基以上又は少なくとも６個以上の外来遺伝子を搭載でき、かつ動物細胞で自然免疫機構を活性化させずに持続的に発現可能なベクターを提供することである。また、ベクター上に６個以上の外来遺伝子を搭載するための効率的な手法も提供する。
そして、特にリプログラミング技術にとって望ましい以下の（１）～（５）の条件、好ましくはさらに（６）（７）を含めた条件を満たす遺伝子導入・発現技術を提供する。
（１）ヒト末梢血細胞を含む動物細胞に外来の遺伝子を効率よく導入できる。
（２）必要な任意の期間、当該遺伝子を持続的に発現できる。
（３）当該遺伝子の発現に際し、細胞が持つ自然免疫機構を回避できる。
（４）導入した外来遺伝子長があわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できる。
（５）少なくとも６個、望ましくは８個以上の当該遺伝子を同時に発現できる。
（６）当該遺伝子の発現レベルを調節することができる。特に、導入遺伝子が複数である場合、個々に調節可能である。
また、特に移植技術に応用する場合には、以下の点も重要なポイントとなる。
（７）当該遺伝子が不要になった時点で、簡単な手法で遺伝子発現系を除去することができる。
そして、特にリプログラミング技術にとって望ましい以下の（１）～（５）の条件、好ましくはさらに（６）（７）を含めた条件を満たす遺伝子導入・発現技術を提供する。
（１）ヒト末梢血細胞を含む動物細胞に外来の遺伝子を効率よく導入できる。
（２）必要な任意の期間、当該遺伝子を持続的に発現できる。
（３）当該遺伝子の発現に際し、細胞が持つ自然免疫機構を回避できる。
（４）導入した外来遺伝子長があわせて５，０００塩基以上、望ましくは８，０００塩基以上であっても発現できる。
（５）少なくとも６個、望ましくは８個以上の当該遺伝子を同時に発現できる。
（６）当該遺伝子の発現レベルを調節することができる。特に、導入遺伝子が複数である場合、個々に調節可能である。
また、特に移植技術に応用する場合には、以下の点も重要なポイントとなる。
（７）当該遺伝子が不要になった時点で、簡単な手法で遺伝子発現系を除去することができる。
【課題を解決するための手段】
【0029】
背景技術の６－１．～６－３．で記述したように、ＤＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う場合、発明が解決しようとする課題として示した理想的なリプログラミングに求められる５つの条件、さらに好ましい７つの条件をすべて備えることは、原理的に極めて困難である。一方、同６－４．で記述したように、ＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使う場合、同一ベクター上に搭載可能な遺伝子数の上限を６個以上かつ全遺伝子長５，０００塩基以上に引き上げるとともに、ウイルス由来のＲＮＡが細胞内の自然免疫機構の活性化を引き起こす問題をどうやって回避するかが最大の課題となる。
【0030】
そこで、本発明では、自然免疫機構を活性化しない動物細胞由来のｍＲＮＡを素材として使い、これらのＲＮＡを、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル・転写終結シグナル・複製起点と組み合わせたマイナス一本鎖ＲＮＡをまず設計した。次に、このマイナス一本鎖ＲＮＡに、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素など転写と複製に必要な４つのタンパク質をコードする遺伝子を、自然免疫機構に異物として認識されないように構造を最適化した上で搭載した。さらに、５種類の制限酵素を使って１０個の遺伝子を設計通りに結合する新しい方法を開発し、この１０個の遺伝子と相補的なｃＲＮＡを上記のマイナス一本鎖ＲＮＡに搭載した。
上記の方法により完成したマイナス一本鎖ＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使うことで、少なくとも１０個の外来遺伝子（合計のサイズが少なくとも１３．５キロ塩基）を搭載して、自然免疫機構を活性化せずに長期間にわたり持続的に発現することに成功した。さらに、遺伝子発現に必要なＮタンパク質やＣタンパク質の発現効率を変えることで、搭載している遺伝子の発現を最大８０倍の範囲で調節可能にした。このように、ウイルス由来の構造を持つＲＮＡをできる限り排除することで、従来のＲＮＡウイルスのゲノムを使った遺伝子発現系の能力の限界を大幅に超えた新規の遺伝子発現系の作製に成功した。
上記の方法により完成したマイナス一本鎖ＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使うことで、少なくとも１０個の外来遺伝子（合計のサイズが少なくとも１３．５キロ塩基）を搭載して、自然免疫機構を活性化せずに長期間にわたり持続的に発現することに成功した。さらに、遺伝子発現に必要なＮタンパク質やＣタンパク質の発現効率を変えることで、搭載している遺伝子の発現を最大８０倍の範囲で調節可能にした。このように、ウイルス由来の構造を持つＲＮＡをできる限り排除することで、従来のＲＮＡウイルスのゲノムを使った遺伝子発現系の能力の限界を大幅に超えた新規の遺伝子発現系の作製に成功した。
【0031】
さらに、本発明で作製した外来遺伝子を搭載したマイナス一本鎖ＲＮＡを持つ細胞において、特許文献３および非特許文献３３・非特許文献７に記されている方法に従いパラミキソウイルスの外膜タンパク質とマトリックス・タンパク質を発現させることで、当該ＲＮＡ分子を内封し、他の細胞に導入する活性を持つ粒子を作製した。この粒子は、ヒト血液細胞を含むさまざまな動物の細胞において、自然免疫機構の活性化を低く抑えたまま、当該ＲＮＡ分子に搭載された１０個の遺伝子を持続的に発現することができた。さらに当該ＲＮＡ分子に搭載されている、構造最適化されたＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の遺伝子と相補的なｓｉＲＮＡを当該細胞に導入することで、外来遺伝子を搭載したＲＮＡ分子を除去できた。以上の方法により、［発明が解決しようとする課題］で示した（１）～（５）の５個の課題に加え、前述の好ましい場合の課題（６）（７）までも含め、７個の課題をすべて解決できたことを確認し、本発明を完成した。
【0032】
本発明で使用したＲＮＡ分子は、自然免疫機構が「病原微生物に特徴的な分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ， ＰＡＭＰ）」として認識するために必要な特異的な構造を欠失しているため、自然免疫機構に補捉されにくい「ステルス性」を示す。そのため、以後、当該ＲＮＡ分子を「ステルス性を有するＲＮＡ」、当該ＲＮＡを素材として用いた遺伝子発現系を「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」、当該遺伝子発現系を内封し動物細胞に当該遺伝子発現系を導入する活性を持つ構造物を「ステルス型ＲＮＡベクター」と呼ぶ。
【0033】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
ここで、典型的な導入対象細胞はヒト細胞であるため、その好ましい場合は以下の様に記載できる。
〔１’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔２〕 前記（１）の標的ＲＮＡ配列が、少なくとも６個の遺伝子を含むか、又は全長５０００塩基以上の長さのＲＮＡ配列である、前記〔１〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
ここで、標的ＲＮＡ配列は、７～１０個の遺伝子を含むことができ、また、全長５，０００～１５，０００塩基長の長さのＲＮＡ配列である。
〔３〕 前記（２）のＲＮＡ配列が、ヒト遺伝子のｍＲＮＡ配列中の５～４９塩基長のＲＮＡ配列である、前記〔１〕又は〔２〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
ここで、前記ヒト遺伝子のｍＲＮＡ配列として、好ましくはヒトＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子のｍＲＮＡ配列であり、より好ましくはヒトＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子のｍＲＮＡ配列中の非コード領域配列、例えば（表１）に記載のＲＮＡ配列もしくはそのうちの連続した５～４９塩基長の部分配列、又はそれを複数連結して用いることができる。
〔４〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（２）のＲＮＡ配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の３’末端側及び／又は５’末端側に隣接して配置されることを特徴とする、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔５〕 前記（６）のＲＮＡ配列がコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が、パラミキソウイルス科に属するＲＮＡウイルス由来のＬタンパク質及びＰタンパク質であり、
前記（７）のＲＮＡ配列がコードする当該酵素の活性を調節するタンパク質が、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のＣタンパク質であり、
前記（８）のＲＮＡ配列がコードする一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質が、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のＮＰタンパク質であって、かつ
前記（３）～（５）のＲＮＡ配列のいずれもが、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のゲノム配列中の転写開始シグナル、転写終結シグナル、及び複製起点を含むＲＮＡ配列であることを特徴とする、
前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔６〕 前記Ｌタンパク質、Ｐタンパク質、Ｃタンパク質及びＮＰタンパク質をコードするＲＮＡ配列がヒト細胞に最適化されており、かつそのＧＣ含量が５０～６０％の範囲内に調整されている、前記〔５〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔７〕 前記パラミキソウイルス科に属するＲＮＡウイルスが、センダイウイルス、ヒト・パラインフルエンザウイルス、及びニューキャッスル病ウイルスのいずれかから選択されたＲＮＡウイルスである、前記〔６〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔８〕 前記（３）の転写開始シグナル配列が、３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ－５’（配列番号１）、３’－ＵＣＣＣＵＡＵＵＵＣ－５’（配列番号２）、３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＣ－５’（配列番号３）、３’－ＵＣＣＵＡＡＵＵＵＣ－５’（配列番号７）、及び３’－ＵＧＣＣＣＡＵＣＵＵＣ－５’（配列番号９）のいずれかに示されるＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列であり、前記（４）の転写終結シグナル配列が、３’－ＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号４）、３’－ＣＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号５）、３’－ＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号６）、及び３’－ＵＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号８）のいずれかに示されるＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列であることを特徴とする、前記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔９〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、前記〔４〕～〔８〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１０〕 前記（５）の複製起点を含むＲＮＡ配列が、下記の配列を含むことを特徴とする前記〔７〕～〔９〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（ａ）３’－ＵＧＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１１）または３’－ＵＧＧＵＵＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１２）で示されるＲＮＡ配列、
（ｂ）３’－ＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＣＡ－５’（配列番号１３）または３’－ＧＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡ－５’（配列番号１４）で示されるＲＮＡ配列、
（ｃ）３’－（ＣＮＮＮＮＮ）３－５’（配列番号１５）で示されるＲＮＡ配列
（ｄ）３’－（ＮＮＮＮＮＧ）３－５’（配列番号１６）で示されるＲＮＡ配列。
〔１１〕 前記（ａ）のＲＮＡ配列が、マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端に位置しており、かつ前記（ｂ）のＲＮＡ配列が、５’末端に位置していることを特徴とする、前記〔１０〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１２〕 前記（ｃ）のＲＮＡ配列が、マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端から７９塩基目から始まり、かつ前記（ｄ）のＲＮＡ配列が、５’末端から９６塩基目から始まることを特徴とする、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１３〕 前記（５）の複製起点を含むＲＮＡ配列が、さらにマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端から９７～１１６塩基目までの位置に、（ｅ）３’－ＡＡＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＵＵＵＣＡ－５’（配列番号１７）のＲＮＡ配列又はその同一塩基長である１８塩基長のＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１４〕 前記〔１〕～〔１３〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構成する複合体を含み、動物細胞に当該複合体を導入する活性を持つＲＮＡベクターであって、自然免疫機構を活性化させないステルス型ＲＮＡベクター。
〔１５〕 動物細胞への感染能を有するウイルス粒子を形成している、前記〔１４〕に記載のステルス型ＲＮＡベクター。
〔１６〕 前記〔１４〕又は〔１５〕に記載のステルス型ＲＮＡベクターが導入された動物細胞。
〔１７〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないＲＮＡ配列、
（３）ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（８）一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列。
本発明は、以下の態様も含む。
〔１７’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔１７’’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔１８〕 前記マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端側及び５’末端側には前記（５）のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列であって、３’末端側のＲＮＡ配列及び５’末端側のＲＮＡ配列にはそれぞれ相補するＲＮＡ配列が含まれている、前記〔１７〕に記載のステルス型ＲＮＡ。
〔１９〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、前記〔１７〕又は〔１８〕に記載のステルス型ＲＮＡ。
〔２０〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されており、さらにその両端に、複数の制限酵素により切断可能な制限酵素サイトを有したカセット構造を構成しており、当該カセット構造が複数結合していることを特徴とする、前記〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ。
〔２１〕ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する方法であって、下記の（１）～（５）の工程を含む方法；
（１）Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している大腸菌を用意する工程、
（２）前記〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載のマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と共に、少なくともＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素及びＲＮＡ結合活性タンパク質をコードするＲＮＡが搭載された大腸菌用ベクターと、ＲＮＡ結合活性タンパク質をコードするＤＮＡを発現する大腸菌用ベクターとを（１）の大腸菌宿主内に導入して形質転換する工程、
（３）（２）の形質転換大腸菌内で、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより発現させた外来の遺伝子ＲＮＡを含むマイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質との複合体を形成させる工程、
（４）ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素を発現している動物細胞を用意する工程、
（５）（３）で得られたマイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質との複合体を、（４）の動物細胞宿主内に導入して、マイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素との複合体からなる、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する工程。
〔２２〕 ２箇所のクロ－ニング部位Ａ、Ｂを有するＤＮＡベースのタンデム型カセットであって、
当該タンデム型カセットは５’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれＲＮＡに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないＲＮＡとなる、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡである、
タンデム型カセット。
〔２３〕 前記（４）クローニング部位Ａは５’末端側から順に制限酵素Ａ認識配列、及び制限酵素Ｃ認識配列を含み、
前記（９）クローニング部位Ｂは、５’末端側から順に制限酵素Ｄ認識配列、及び制限酵素Ｂ認識配列を含んでおり、
ここで制限酵素Ａと制限酵素Ｄは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものであり、制限酵素Ｃと制限酵素Ｂは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものである、
前記〔２２〕に記載のタンデム型カセット。
〔２４〕 前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、いずれもＮＮ又はＮＮＮで表される配列任意の一本鎖突出末端を生じる制限酵素の認識配列を含むＤＮＡである、
前記〔２２〕又は〔２３〕に記載のタンデム型カセット。
〔２５〕 前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２が、それぞれ動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列の部分配列に対応する同一もしくは異なるｃＤＮＡであって、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂに、同一もしくは異なるヒト由来遺伝子が挿入された、前記〔２２〕～〔２４〕のいずれかに記載のタンデム型カセット。
〔１〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
ここで、典型的な導入対象細胞はヒト細胞であるため、その好ましい場合は以下の様に記載できる。
〔１’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、自然免疫機構を活性化させない複合体である、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔２〕 前記（１）の標的ＲＮＡ配列が、少なくとも６個の遺伝子を含むか、又は全長５０００塩基以上の長さのＲＮＡ配列である、前記〔１〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
ここで、標的ＲＮＡ配列は、７～１０個の遺伝子を含むことができ、また、全長５，０００～１５，０００塩基長の長さのＲＮＡ配列である。
〔３〕 前記（２）のＲＮＡ配列が、ヒト遺伝子のｍＲＮＡ配列中の５～４９塩基長のＲＮＡ配列である、前記〔１〕又は〔２〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
ここで、前記ヒト遺伝子のｍＲＮＡ配列として、好ましくはヒトＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子のｍＲＮＡ配列であり、より好ましくはヒトＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子のｍＲＮＡ配列中の非コード領域配列、例えば（表１）に記載のＲＮＡ配列もしくはそのうちの連続した５～４９塩基長の部分配列、又はそれを複数連結して用いることができる。
〔４〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（２）のＲＮＡ配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の３’末端側及び／又は５’末端側に隣接して配置されることを特徴とする、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔５〕 前記（６）のＲＮＡ配列がコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が、パラミキソウイルス科に属するＲＮＡウイルス由来のＬタンパク質及びＰタンパク質であり、
前記（７）のＲＮＡ配列がコードする当該酵素の活性を調節するタンパク質が、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のＣタンパク質であり、
前記（８）のＲＮＡ配列がコードする一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質が、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のＮＰタンパク質であって、かつ
前記（３）～（５）のＲＮＡ配列のいずれもが、当該ＲＮＡウイルスと同一のウイルス由来のゲノム配列中の転写開始シグナル、転写終結シグナル、及び複製起点を含むＲＮＡ配列であることを特徴とする、
前記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔６〕 前記Ｌタンパク質、Ｐタンパク質、Ｃタンパク質及びＮＰタンパク質をコードするＲＮＡ配列がヒト細胞に最適化されており、かつそのＧＣ含量が５０～６０％の範囲内に調整されている、前記〔５〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔７〕 前記パラミキソウイルス科に属するＲＮＡウイルスが、センダイウイルス、ヒト・パラインフルエンザウイルス、及びニューキャッスル病ウイルスのいずれかから選択されたＲＮＡウイルスである、前記〔６〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔８〕 前記（３）の転写開始シグナル配列が、３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ－５’（配列番号１）、３’－ＵＣＣＣＵＡＵＵＵＣ－５’（配列番号２）、３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＣ－５’（配列番号３）、３’－ＵＣＣＵＡＡＵＵＵＣ－５’（配列番号７）、及び３’－ＵＧＣＣＣＡＵＣＵＵＣ－５’（配列番号９）のいずれかに示されるＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列であり、前記（４）の転写終結シグナル配列が、３’－ＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号４）、３’－ＣＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号５）、３’－ＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号６）、及び３’－ＵＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号８）のいずれかに示されるＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列であることを特徴とする、前記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔９〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる各遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、前記〔４〕～〔８〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１０〕 前記（５）の複製起点を含むＲＮＡ配列が、下記の配列を含むことを特徴とする前記〔７〕～〔９〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系；
（ａ）３’－ＵＧＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１１）または３’－ＵＧＧＵＵＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１２）で示されるＲＮＡ配列、
（ｂ）３’－ＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＣＡ－５’（配列番号１３）または３’－ＧＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡ－５’（配列番号１４）で示されるＲＮＡ配列、
（ｃ）３’－（ＣＮＮＮＮＮ）３－５’（配列番号１５）で示されるＲＮＡ配列
（ｄ）３’－（ＮＮＮＮＮＧ）３－５’（配列番号１６）で示されるＲＮＡ配列。
〔１１〕 前記（ａ）のＲＮＡ配列が、マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端に位置しており、かつ前記（ｂ）のＲＮＡ配列が、５’末端に位置していることを特徴とする、前記〔１０〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１２〕 前記（ｃ）のＲＮＡ配列が、マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端から７９塩基目から始まり、かつ前記（ｄ）のＲＮＡ配列が、５’末端から９６塩基目から始まることを特徴とする、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１３〕 前記（５）の複製起点を含むＲＮＡ配列が、さらにマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端から９７～１１６塩基目までの位置に、（ｅ）３’－ＡＡＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＵＵＵＣＡ－５’（配列番号１７）のＲＮＡ配列又はその同一塩基長である１８塩基長のＲＮＡ配列を含むことを特徴とする、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系。
〔１４〕 前記〔１〕～〔１３〕に記載のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構成する複合体を含み、動物細胞に当該複合体を導入する活性を持つＲＮＡベクターであって、自然免疫機構を活性化させないステルス型ＲＮＡベクター。
〔１５〕 動物細胞への感染能を有するウイルス粒子を形成している、前記〔１４〕に記載のステルス型ＲＮＡベクター。
〔１６〕 前記〔１４〕又は〔１５〕に記載のステルス型ＲＮＡベクターが導入された動物細胞。
〔１７〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないＲＮＡ配列、
（３）ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（８）一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列。
本発明は、以下の態様も含む。
〔１７’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する、動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、導入対象細胞が由来する生物種にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔１７’’〕 下記（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）であって、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）と共に、自然免疫機構を活性化させない複合体を形成することができる、ステルス型ＲＮＡ；
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、ヒト細胞にコドンが最適化されたＲＮＡ配列。
〔１８〕 前記マイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）の３’末端側及び５’末端側には前記（５）のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列であって、３’末端側のＲＮＡ配列及び５’末端側のＲＮＡ配列にはそれぞれ相補するＲＮＡ配列が含まれている、前記〔１７〕に記載のステルス型ＲＮＡ。
〔１９〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されていることを特徴とする、前記〔１７〕又は〔１８〕に記載のステルス型ＲＮＡ。
〔２０〕 同一もしくは異なる配列からなる前記（３）の転写開始シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の３’末端側に隣接して配置された前記（２）のＲＮＡ配列のさらに３’末端側に隣接して配置されており、かつ前記（４）転写終結シグナル配列が、前記（１）の標的ＲＮＡ配列に含まれる複数の遺伝子配列の各々の遺伝子配列の５’末端側に隣接して配置されたＲＮＡ配列のさらに５’末端側に隣接して配置されており、さらにその両端に、複数の制限酵素により切断可能な制限酵素サイトを有したカセット構造を構成しており、当該カセット構造が複数結合していることを特徴とする、前記〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載のステルス型ＲＮＡ。
〔２１〕ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する方法であって、下記の（１）～（５）の工程を含む方法；
（１）Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している大腸菌を用意する工程、
（２）前記〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載のマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と共に、少なくともＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素及びＲＮＡ結合活性タンパク質をコードするＲＮＡが搭載された大腸菌用ベクターと、ＲＮＡ結合活性タンパク質をコードするＤＮＡを発現する大腸菌用ベクターとを（１）の大腸菌宿主内に導入して形質転換する工程、
（３）（２）の形質転換大腸菌内で、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより発現させた外来の遺伝子ＲＮＡを含むマイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質との複合体を形成させる工程、
（４）ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素を発現している動物細胞を用意する工程、
（５）（３）で得られたマイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質との複合体を、（４）の動物細胞宿主内に導入して、マイナス一本鎖ＲＮＡと、ＲＮＡ結合活性タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素との複合体からなる、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する工程。
〔２２〕 ２箇所のクロ－ニング部位Ａ、Ｂを有するＤＮＡベースのタンデム型カセットであって、
当該タンデム型カセットは５’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれＲＮＡに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないＲＮＡとなる、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるＤＮＡである、
タンデム型カセット。
〔２３〕 前記（４）クローニング部位Ａは５’末端側から順に制限酵素Ａ認識配列、及び制限酵素Ｃ認識配列を含み、
前記（９）クローニング部位Ｂは、５’末端側から順に制限酵素Ｄ認識配列、及び制限酵素Ｂ認識配列を含んでおり、
ここで制限酵素Ａと制限酵素Ｄは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものであり、制限酵素Ｃと制限酵素Ｂは同一配列の一本鎖突出末端を生じるものである、
前記〔２２〕に記載のタンデム型カセット。
〔２４〕 前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、いずれもＮＮ又はＮＮＮで表される配列任意の一本鎖突出末端を生じる制限酵素の認識配列を含むＤＮＡである、
前記〔２２〕又は〔２３〕に記載のタンデム型カセット。
〔２５〕 前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２が、それぞれ動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列の部分配列に対応する同一もしくは異なるｃＤＮＡであって、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂに、同一もしくは異なるヒト由来遺伝子が挿入された、前記〔２２〕～〔２４〕のいずれかに記載のタンデム型カセット。
【発明の効果】
【0034】
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、自然免疫機構に補捉されにくいため、細胞障害性が極めて低く、１０個の遺伝子を搭載してさまざまな組織細胞に導入し、必要な期間、いつまでも持続的に発現することができる。なお、本発明で自然免疫機構を回避できる、又は免疫機構に認識されないというとき、導入した遺伝子又はそのためのベクターなどが、宿主の自然免疫を実質的に刺激しないことを指す。具体的には、インターフェロンβ誘導能を指標として、正常細胞におけるＩＦＮ－β ｍＲＮＡの発現量を１．０としたときに３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下であることをいう。
また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は細胞質で機能するため、当該遺伝子発現系を内封したステルス型ＲＮＡベクターを使えば、増殖能を持たず細胞分裂をしていない末梢血の細胞に導入して搭載遺伝子を発現することができる。さらに、最大８０倍の幅で発現の強度が異なる遺伝子発現系を選ぶことができ、不要になったらＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を抑制することで簡単に除去できる。このため、この技術は、これまでは不可能であった、６個以上の遺伝子を使って、ヒト細胞を含む動物細胞の性質を効率よくリプログラミングする目的に最適である。
例えば、ヒトの末梢血細胞を材料として、動物成分不含（Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）・フィーダー細胞不使用（Ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）といった困難な条件下で、再生医療の臨床用に使用する高品質のｉＰＳ細胞を高効率で作製するという応用が考えられる。また６個以上の遺伝子を使って、ヒトの組織細胞（血液・皮膚・胎盤など）から神経細胞・神経幹細胞・幹細胞・膵ベータ細胞などの有用な遺伝子を作り出すダイレクト・リプログラミングと呼ばれる技術への応用も可能である。さらに、細胞死や炎症を引き起こす可能性が低いことから、巨大遺伝子も含む各種遺伝子による遺伝子治療や生体内でのリプログラミングによる再生医療への応用が期待される。
また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は細胞質で機能するため、当該遺伝子発現系を内封したステルス型ＲＮＡベクターを使えば、増殖能を持たず細胞分裂をしていない末梢血の細胞に導入して搭載遺伝子を発現することができる。さらに、最大８０倍の幅で発現の強度が異なる遺伝子発現系を選ぶことができ、不要になったらＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を抑制することで簡単に除去できる。このため、この技術は、これまでは不可能であった、６個以上の遺伝子を使って、ヒト細胞を含む動物細胞の性質を効率よくリプログラミングする目的に最適である。
例えば、ヒトの末梢血細胞を材料として、動物成分不含（Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）・フィーダー細胞不使用（Ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）といった困難な条件下で、再生医療の臨床用に使用する高品質のｉＰＳ細胞を高効率で作製するという応用が考えられる。また６個以上の遺伝子を使って、ヒトの組織細胞（血液・皮膚・胎盤など）から神経細胞・神経幹細胞・幹細胞・膵ベータ細胞などの有用な遺伝子を作り出すダイレクト・リプログラミングと呼ばれる技術への応用も可能である。さらに、細胞死や炎症を引き起こす可能性が低いことから、巨大遺伝子も含む各種遺伝子による遺伝子治療や生体内でのリプログラミングによる再生医療への応用が期待される。
【0035】
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、複数個の遺伝子を同時に搭載して一定の割合で発現できるため、複数のサブユニットからなるバイオ医薬品の製造にも効果を発揮する。例えば、ヒト免疫グロブリンＧを生産する場合は各サブユニットが同じ細胞で同時に発現する必要がある。しかも、ヒト免疫グロブリンＧを生産する場合は、Ｈ鎖とＬ鎖を１：１の割合で、ヒト免疫グロブリンＭを生産する場合は、Ｈ鎖：Ｌ鎖：μ鎖を１：１：０．２の割合で、同じ細胞で同時に発現することが望まれるが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系はこのような要求を容易に満たすことができる。
さらに、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は遺伝子発現のレベルを変えることができるため、バイオ医薬品の製造に必要な強い遺伝子発現を容易に実現できる。これまでの動物細胞を使ったバイオ医薬品の製造工程では、染色体に取り込まれた遺伝子のコピー数が増幅された安定な細胞株を樹立するという多大な時間と労力を必要とする過程が必要であったが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を採用すれば、このような労力は不要となる。
また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、バイオ医薬品の製造にあたって問題となる遺伝子変異を抑制するためにも効果を発揮する。近年、ＲＮＡウイルスのゲノムが変異を起こす主因が、細胞質のアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＡＤＡＲ１）であることが報告されている（非特許文献３９）。ＡＤＡＲ１は自然免疫機構の活性化によって誘導されるため、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系ではＡＤＡＲ１の誘導を最小限に抑えて遺伝子の変異を抑制することが可能である。
さらに、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は遺伝子発現のレベルを変えることができるため、バイオ医薬品の製造に必要な強い遺伝子発現を容易に実現できる。これまでの動物細胞を使ったバイオ医薬品の製造工程では、染色体に取り込まれた遺伝子のコピー数が増幅された安定な細胞株を樹立するという多大な時間と労力を必要とする過程が必要であったが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を採用すれば、このような労力は不要となる。
また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、バイオ医薬品の製造にあたって問題となる遺伝子変異を抑制するためにも効果を発揮する。近年、ＲＮＡウイルスのゲノムが変異を起こす主因が、細胞質のアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＡＤＡＲ１）であることが報告されている（非特許文献３９）。ＡＤＡＲ１は自然免疫機構の活性化によって誘導されるため、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系ではＡＤＡＲ１の誘導を最小限に抑えて遺伝子の変異を抑制することが可能である。
【0036】
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系はまた、複数のサブユニットからなる創薬標的タンパク質の発現にも最適である。例えば、創薬標的酵素のＮＡＤＰＨ酸化酵素 （Ｎｏｘ２）を発現するためには、ｇｐ９１ｐｈｏｘ・ｐ２２ｐｈｏｘ・Ｒａｃ・ｐ４７ｐｈｏｘ・ｐ６７ｐｈｏｘ・ｐ４０ｐｈｏｘの６個のサブユニットを同時に発現する必要があるが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系では容易に実現できる。さらに、ステルス型ＲＮＡベクターを使えば、初代培養血管内皮細胞や神経細胞など、細胞分裂を起こさないため遺伝子導入や発現が困難であった標的細胞にも創薬標的タンパク質を発現させることができ、容易に目的を達成することができる。
【0037】
また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系やステルス型ＲＮＡベクターは、細胞障害や炎症を引き起こす可能性が低いことから、生体内での遺伝子発現により治療効果を得る遺伝子治療のプラットフォームとしての応用が可能である。特に、従来の遺伝子導入・発現ベクターでは不可能であった、血友病Ａの原因遺伝子産物である血液凝固第８因子のｃＤＮＡ（７０５３塩基）やデュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物であるジストロフィンのｃＤＮＡ（１１０５８塩基）などの巨大な遺伝子を搭載して持続的に発現することが可能なので、これらの疾患の遺伝子治療用ベクターとしての応用が期待される。
さらに、本発明においてベクター上に６個以上、好ましくは８個以上の外来遺伝子を搭載するために開発されたタンデム型カセット連結法に用いるタンデム型カセットはＤＮＡベースで構築されるので、当該手法は本発明のステルス型ＲＮＡベクターのみならず、一般的なＤＮＡ発現ベクターなど幅広く応用可能である。
さらに、本発明においてベクター上に６個以上、好ましくは８個以上の外来遺伝子を搭載するために開発されたタンデム型カセット連結法に用いるタンデム型カセットはＤＮＡベースで構築されるので、当該手法は本発明のステルス型ＲＮＡベクターのみならず、一般的なＤＮＡ発現ベクターなど幅広く応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】動物細胞で発現するｍＲＮＡに由来するＲＮＡと、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル・転写終結シグナル・複製起点を組み合わせて作製したマイナス一本鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図
【図2】マイナス一本鎖ＲＮＡ分子の複製に必要な核酸の３’末端と５’末端の構造を示す図
【図3】マイナス一本鎖ＲＮＡ分子の複製に必要な核酸の３’末端の構造を示す図
【図4】マイナス一本鎖ＲＮＡ分子の複製に必要な核酸の５’末端の構造を示す図
【図5】ＲＮＡウイルス由来のｍＲＮＡにおけるＣｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘの解析
【図6】ＲＮＡウイルス由来のｍＲＮＡにおけるＧＣ含量の解析
【図7】ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に搭載する外来遺伝子ｃＤＮＡの設計法を示す図
【図8】２個の外来遺伝子ｃＤＮＡを結合する方法を示した図
【図9】１０個の外来遺伝子ｃＤＮＡを結合する方法を示した図
【図10】１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を作製するための鋳型ｃＤＮＡを構築する方法を示した図
【図11】鋳型ｃＤＮＡからステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成するための第１の方法を示した図
【図12】鋳型ｃＤＮＡからステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成するための第２の方法を示した図
【図13】１０個の外来遺伝子ｃＤＮＡを搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のゲノム構造を示した図
【図14】１０個の外来遺伝子ｃＤＮＡを搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の遺伝子発現活性を示した図
【図16】Ｎ、Ｃ、ＰｏｌＳ（Ｐ）遺伝子の配置を換えて作製した、１０個の外来遺伝子ｃＤＮＡを搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のゲノム構造を示した図
【図17】ステルス型ＲＮＡベクターのインターフェロン誘導活性を示す図
【図18】自然免疫活性誘導能を完全に回避するための追加因子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のゲノム構造を示した図
【図19】追加因子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターによるインターフェロン誘導能を示した図
【図20】異なる遺伝子発現レベルを持ったステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の構造を示す図（プラス鎖ＲＮＡ配列で表記している。）
【図21】Ｃ遺伝子を欠失または翻訳抑制したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のゲノム構造と遺伝子発現を示す図
【図22】ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のパッケージング・シグナルの活性を示す図
【図23】ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を細胞からの除去を示す図
【図24】これまでに作製したステルス型ＲＮＡベクターのゲノム構造を示す図
【図25】６個の初期化遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製効率を示した図
【図26】ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系による免疫グロブリンＭの発現を示した図
【図27】ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系による二重特異性抗体の発現を示した図
【発明を実施するための形態】
【0039】
１． 本発明の「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」の構成要素
本発明で使用したＲＮＡ分子は、自然免疫機構に補捉されにくい「ステルス性」を示す。
そのため、本発明では、当該ＲＮＡ分子を「ステルス性を有するＲＮＡ」、当該ＲＮＡを素材として用いた遺伝子発現系を「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」、当該遺伝子発現系を内封し動物細胞に当該遺伝子発現系を導入する活性を持つ構造物を「ステルス型ＲＮＡベクター」と呼ぶ。
本発明におけるステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系とは、以下の（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、かつ自然免疫機構を活性化させない複合体である。ステルス型ＲＮＡベクターとは、当該複合体を含み動物細胞に当該複合体を導入する活性を持つ粒子である。
なお、本発明においてマイナス一本鎖ＲＮＡのＲＮＡ配列を表記するに際して、タンパク質をコードする配列というとき、アンチセンス鎖側のＲＮＡ配列を指す。
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列。
（以下、遺伝子ＲＮＡ又は、単に遺伝子ということもある。）。
ここで、（２）のＲＮＡは５～４９塩基長を有していることが好ましく、（１）の導入された外来遺伝子ＲＮＡのそれぞれの３’末端側及び５’末端側の非コード領域として配置される。
また、（１）の導入する外来遺伝子ＲＮＡの個数は、６個未満、例えば１～５個であっても、全塩基長が５，０００塩基長未満であっても当然にステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系として機能するが、本発明のＲＮＡ遺伝子発現系が顕著な効果を発揮するのは、特に外来遺伝子ＲＮＡの個数が６個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上の遺伝子を、また全塩基長では５，０００塩基長、好ましくは８，０００塩基長、より好ましくは１０，０００塩基長のＲＮＡを含む場合である。
なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡ、及びこれと相補のプラス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。
本発明で使用したＲＮＡ分子は、自然免疫機構に補捉されにくい「ステルス性」を示す。
そのため、本発明では、当該ＲＮＡ分子を「ステルス性を有するＲＮＡ」、当該ＲＮＡを素材として用いた遺伝子発現系を「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」、当該遺伝子発現系を内封し動物細胞に当該遺伝子発現系を導入する活性を持つ構造物を「ステルス型ＲＮＡベクター」と呼ぶ。
本発明におけるステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系とは、以下の（１）から（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｃ）からなり、かつ自然免疫機構を活性化させない複合体である。ステルス型ＲＮＡベクターとは、当該複合体を含み動物細胞に当該複合体を導入する活性を持つ粒子である。
なお、本発明においてマイナス一本鎖ＲＮＡのＲＮＡ配列を表記するに際して、タンパク質をコードする配列というとき、アンチセンス鎖側のＲＮＡ配列を指す。
（１）任意のタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする標的ＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成する自然免疫機構が認識できないＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）当該酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）当該酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）当該酵素をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（７）当該酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列であって、自然免疫機構が認識できないように構造最適化したＲＮＡ配列。
（以下、遺伝子ＲＮＡ又は、単に遺伝子ということもある。）。
ここで、（２）のＲＮＡは５～４９塩基長を有していることが好ましく、（１）の導入された外来遺伝子ＲＮＡのそれぞれの３’末端側及び５’末端側の非コード領域として配置される。
また、（１）の導入する外来遺伝子ＲＮＡの個数は、６個未満、例えば１～５個であっても、全塩基長が５，０００塩基長未満であっても当然にステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系として機能するが、本発明のＲＮＡ遺伝子発現系が顕著な効果を発揮するのは、特に外来遺伝子ＲＮＡの個数が６個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上の遺伝子を、また全塩基長では５，０００塩基長、好ましくは８，０００塩基長、より好ましくは１０，０００塩基長のＲＮＡを含む場合である。
なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡ、及びこれと相補のプラス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。
【0040】
２． 本発明のステルス型ＲＮＡ発現系の構成要素
２－１． 外来遺伝子ＲＮＡ導入のためのタンデム型カセットの作成
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系における外来遺伝子ＲＮＡは、その３’末端及び５’末端の非コード領域に５～４９塩基の同一もしくは異なる「（１）自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」を有しており、そのさらに外側の３’末端及び５’末端にそれぞれ（３）の「転写開始シグナル」及び（４）の「転写終結シグナル」が設けられ、最も外側の両端にはマルチマー化部位を設けてカセット化することができる。
２－１． 外来遺伝子ＲＮＡ導入のためのタンデム型カセットの作成
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系における外来遺伝子ＲＮＡは、その３’末端及び５’末端の非コード領域に５～４９塩基の同一もしくは異なる「（１）自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」を有しており、そのさらに外側の３’末端及び５’末端にそれぞれ（３）の「転写開始シグナル」及び（４）の「転写終結シグナル」が設けられ、最も外側の両端にはマルチマー化部位を設けてカセット化することができる。
【0041】
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に用いられるマイナス鎖一本鎖ＲＮＡは、下記に示すＤＮＡベースのタンデム型カセットを用いることにより、容易に構築することができる。
本発明のタンデム型カセットは、５’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成される。当該タンデム型カセットを模式的に図示したものとして、図７の下図を挙げることができる。
上記マルチマー化部位Ａ及びＢは互いに同一又は異なってよく、当該カセットのマルチマー化、あるいは他の核酸との結合に使用できる配列である限り、任意の配列を用いることができる。マルチマー化部位の好ましい例として、制限酵素認識配列、及び部位特異的組換え酵素の認識配列が挙げられる。好ましい制限酵素の例として、切断面にＮＮやＮＮＮの様に表される配列任意の一本鎖突出端を生成する性質を持つＳａｐＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＳｆａＮＩを挙げることができる。また他の好ましい例として、認識配列の内部に不定形の配列を持つＡｌｗＮＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳｆｉＩなどが挙げられる。また、相同組換えを利用する場合には組換え酵素の認識配列として、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２などの配列を挙げることができる。さらに、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ） を利用する場合には、連結させる相手となる他のタンデム型カセットの末端部とオーバーラップ配列と同一配列とすることを前提として、マルチマー化部位として任意の１５塩基以上の配列を用いることができる。
転写開始シグナルＡ及びＢは互いに同一又は異なってよく、ＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルとして機能的であればどのような配列でもよい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルの例は以下の段落で具体的に記載する。好ましくは、配列番号１～３の配列が挙げられる。
非コード配列Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２は、互いに同一又は異なってよい。ＲＮＡに転写された場合に上記で定義される「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」であればどのような配列でもよく、好ましい例は５～４９塩基長の配列であって表１に掲げるそれぞれの配列が挙げられる。
クローニング部位Ａ及びＢは、所望の外来遺伝子を挿入できる限りどのような配列であってもよい。好ましくは、一のクローニング部位は１又は２以上の制限酵素認識配列を含むか、１又は２以上の部位特異的組換え酵素の認識配列を含むものである。クローニング部位の好ましい例として、Ａｃｃ６５Ｉ認識部位とＳａｌＩ認識部位とを含む配列、Ａｃｃ６５Ｉ認識部位とＸｈｏＩ認識部位とを含む配列、ＢｓｉＷＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位とを含む配列、及びＢｓｉＷＩ認識部位とＸｈｏＩ認識部位とを含む配列を挙げることができる。
転写終結シグナルＡ及びＢは互いに同一又は異なってよく、ＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルとして機能的であればどのような配列でもよい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルの例は以下の段落で具体的に記載する。好ましくは、配列番号４～６の配列が挙げられる。
当該一のタンデム型カセットには、少なくとも２つの外来遺伝子を挿入させることができる。２つの外来遺伝子が挿入されたカセットを５つ連結させたカセットマルチマーは、１０の外来遺伝子を担持したものとなる。下記の実施例では、このようなタンデム型カセットをマルチマー化することを利用して、外来遺伝子を４、６又は１０担持したＤＮＡフラグメントを作成し、プラスミドにサブクローニングさせた。さらにウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素遺伝子やＲＮＡ結合タンパク質遺伝子と組み合わせることにより、本願発明で所望されるＲＮＡ発現系が構築される。
本発明のタンデム型カセットは、５’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成される。当該タンデム型カセットを模式的に図示したものとして、図７の下図を挙げることができる。
上記マルチマー化部位Ａ及びＢは互いに同一又は異なってよく、当該カセットのマルチマー化、あるいは他の核酸との結合に使用できる配列である限り、任意の配列を用いることができる。マルチマー化部位の好ましい例として、制限酵素認識配列、及び部位特異的組換え酵素の認識配列が挙げられる。好ましい制限酵素の例として、切断面にＮＮやＮＮＮの様に表される配列任意の一本鎖突出端を生成する性質を持つＳａｐＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＳｆａＮＩを挙げることができる。また他の好ましい例として、認識配列の内部に不定形の配列を持つＡｌｗＮＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳｆｉＩなどが挙げられる。また、相同組換えを利用する場合には組換え酵素の認識配列として、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２などの配列を挙げることができる。さらに、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ） を利用する場合には、連結させる相手となる他のタンデム型カセットの末端部とオーバーラップ配列と同一配列とすることを前提として、マルチマー化部位として任意の１５塩基以上の配列を用いることができる。
転写開始シグナルＡ及びＢは互いに同一又は異なってよく、ＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルとして機能的であればどのような配列でもよい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルの例は以下の段落で具体的に記載する。好ましくは、配列番号１～３の配列が挙げられる。
非コード配列Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２は、互いに同一又は異なってよい。ＲＮＡに転写された場合に上記で定義される「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」であればどのような配列でもよく、好ましい例は５～４９塩基長の配列であって表１に掲げるそれぞれの配列が挙げられる。
クローニング部位Ａ及びＢは、所望の外来遺伝子を挿入できる限りどのような配列であってもよい。好ましくは、一のクローニング部位は１又は２以上の制限酵素認識配列を含むか、１又は２以上の部位特異的組換え酵素の認識配列を含むものである。クローニング部位の好ましい例として、Ａｃｃ６５Ｉ認識部位とＳａｌＩ認識部位とを含む配列、Ａｃｃ６５Ｉ認識部位とＸｈｏＩ認識部位とを含む配列、ＢｓｉＷＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位とを含む配列、及びＢｓｉＷＩ認識部位とＸｈｏＩ認識部位とを含む配列を挙げることができる。
転写終結シグナルＡ及びＢは互いに同一又は異なってよく、ＲＮＡに転写された場合にＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルとして機能的であればどのような配列でもよい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルの例は以下の段落で具体的に記載する。好ましくは、配列番号４～６の配列が挙げられる。
当該一のタンデム型カセットには、少なくとも２つの外来遺伝子を挿入させることができる。２つの外来遺伝子が挿入されたカセットを５つ連結させたカセットマルチマーは、１０の外来遺伝子を担持したものとなる。下記の実施例では、このようなタンデム型カセットをマルチマー化することを利用して、外来遺伝子を４、６又は１０担持したＤＮＡフラグメントを作成し、プラスミドにサブクローニングさせた。さらにウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素遺伝子やＲＮＡ結合タンパク質遺伝子と組み合わせることにより、本願発明で所望されるＲＮＡ発現系が構築される。
【0042】
２－２． ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素と当該酵素を認識する転写開始シグナル及び転写終結シグナル
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」並びに当該酵素を認識する転写開始シグナル及び転写終結シグナルは、同一のマイナス鎖ＲＮＡウイルス由来配列から選択されることが好ましく、典型的にはパラミキソウイルス科に属するウイルスゲノム由来配列である。パラミキソウイルス科に属するウイルスのゲノムの「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「当該酵素が認識する転写開始シグナル」及び「当該酵素が認識する転写終結シグナル」の組み合わせは、すべて同じ基本構造を持っているため、どのウイルス由来の配列の組み合わせであっても用いることができる。
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＬ）とＰタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＳ）の組み合わせを選び、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルであるＲＮＡ」として「３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ－５’（配列番号１）」、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルであるＲＮＡ」として「３’－ＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号４）」を選び、転写開始シグナルと転写終結シグナルを各遺伝子の３’側と５’側にそれぞれ配置した（図１）。そして、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」としては、センダイウイルスのＣタンパク質（Ｃ）を、また、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」としては、センダイウイルスのＮＰタンパク質（Ｎ）を用いている。
なお、本明細書で開示される技術において、ＲＮＡは主としてマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡの態様で使用されるため、ＲＮＡ配列は、特に注釈がない限り、マイナス鎖の配列情報として３’末端側から開示される。ただし、本明細書の一部を構成する配列表の配列情報はガイドラインに従い５’末端側から記載されている。
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」並びに当該酵素を認識する転写開始シグナル及び転写終結シグナルは、同一のマイナス鎖ＲＮＡウイルス由来配列から選択されることが好ましく、典型的にはパラミキソウイルス科に属するウイルスゲノム由来配列である。パラミキソウイルス科に属するウイルスのゲノムの「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「当該酵素が認識する転写開始シグナル」及び「当該酵素が認識する転写終結シグナル」の組み合わせは、すべて同じ基本構造を持っているため、どのウイルス由来の配列の組み合わせであっても用いることができる。
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＬ）とＰタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＳ）の組み合わせを選び、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルであるＲＮＡ」として「３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ－５’（配列番号１）」、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルであるＲＮＡ」として「３’－ＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号４）」を選び、転写開始シグナルと転写終結シグナルを各遺伝子の３’側と５’側にそれぞれ配置した（図１）。そして、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」としては、センダイウイルスのＣタンパク質（Ｃ）を、また、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」としては、センダイウイルスのＮＰタンパク質（Ｎ）を用いている。
なお、本明細書で開示される技術において、ＲＮＡは主としてマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡの態様で使用されるため、ＲＮＡ配列は、特に注釈がない限り、マイナス鎖の配列情報として３’末端側から開示される。ただし、本明細書の一部を構成する配列表の配列情報はガイドラインに従い５’末端側から記載されている。
【0043】
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質とＰタンパク質の組み合わせを選んだ場合は、転写開始シグナルとして「３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ－５’（配列番号１）」、「３’－ＵＣＣＣＵＡＵＵＵＣ－５’（配列番号２）」、「３’－ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＣ－５’（配列番号３）」の他、これらの配列と同等の機能を持つＲＮＡを使用することができる。また転写終結シグナルについても同様に、「３’－ＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号４）」「３’－ＣＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号５）」，「３’－ＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号６）」の他、これらの配列と同等の機能を持つＲＮＡを使用することができる。また、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてヒト・パラインフルエンザウイルス３型のＬタンパク質とＰタンパク質の組み合わせを選んだ場合は、転写開始シグナルとして「３’－ＵＣＣＵＡＡＵＵＵＣ－５’（配列番号７）」または同等の機能を持つＲＮＡを、転写終結シグナルとして「３’－ＵＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ－５’（配列番号８）」 または同等の機能を持つＲＮＡを使用することができる。さらに、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてニューキャッスル病ウイルスのＬタンパク質とＰタンパク質の組み合わせを選んだ場合は、転写開始シグナルとして「３’－ＵＧＣＣＣＡＵＣＵＵＣ－５’（配列番号９）」 または同等の機能を持つＲＮＡを、転写終結シグナルとして「３’－ＡＡＵＣＵＵＵＵＵＵ－５’（配列番号１０）」 または同等の機能を持つＲＮＡを使用することができる。
【0044】
２－３． 本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の複製機能のための要素
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の複製機能のための必須の要素としては、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点並びに３’末端側の （ＣＮＮＮＮＮ）３－及び５’末端側の（ＮＮＮＮＮＧ）３－という構造を持つ配列がある。
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質とＰタンパク質の組み合わせを選んだため、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ」としては、センダイウイルスのゲノムの３’末端に存在する１１４塩基のＲＮＡ、およびセンダイウイルスのゲノムの５’末端に存在する９６塩基のＲＮＡを選択した。
この構造のうち、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の複製機能に必須なのは以下のとおりである（図２、図３、図４）。
（１）ゲノム３’末端に存在する「３’－ＵＧＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１１）」または同等の機能を持つ１２塩基のＲＮＡ配列（例えば、「３’－ＵＧＧＵＵＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１２）」）（２）ゲノム５’末端に存在する「３’－ＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＣＡ－５’（配列番号１３）」または同等の機能を持つ１２塩基のＲＮＡ配列（例えば、「３’－ＧＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡ－５’（配列番号１４）」）（３）ゲノム３’末端から７９塩基目から始まる「３’－（ＣＮＮＮＮＮ）３－５’（配列番号１５）」という構造を持つ１８塩基のＲＮＡ配列
（４）ゲノム５’末端から９６塩基目から始まる「３’－（ＮＮＮＮＮＧ）３－５’（配列番号１６）」という構造を持つ１８塩基のＲＮＡ配列
このうち、（１）と（２）は相互に相補的な配列であり、ゲノムＲＮＡの３’末端とアンチゲノムＲＮＡ（ゲノムＲＮＡに相補的なＲＮＡ）の３’末端が同じであることから、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点と考えられている。また、（３）と（４）は機能が不明であるが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素による一本鎖ＲＮＡの複製に必須の配列であることが知られている（非特許文献４２）。
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の複製機能のための必須の要素としては、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点並びに３’末端側の （ＣＮＮＮＮＮ）３－及び５’末端側の（ＮＮＮＮＮＧ）３－という構造を持つ配列がある。
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質とＰタンパク質の組み合わせを選んだため、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ」としては、センダイウイルスのゲノムの３’末端に存在する１１４塩基のＲＮＡ、およびセンダイウイルスのゲノムの５’末端に存在する９６塩基のＲＮＡを選択した。
この構造のうち、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の複製機能に必須なのは以下のとおりである（図２、図３、図４）。
（１）ゲノム３’末端に存在する「３’－ＵＧＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１１）」または同等の機能を持つ１２塩基のＲＮＡ配列（例えば、「３’－ＵＧＧＵＵＵＧＵＵＣＵＣ－５’（配列番号１２）」）（２）ゲノム５’末端に存在する「３’－ＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＣＡ－５’（配列番号１３）」または同等の機能を持つ１２塩基のＲＮＡ配列（例えば、「３’－ＧＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡ－５’（配列番号１４）」）（３）ゲノム３’末端から７９塩基目から始まる「３’－（ＣＮＮＮＮＮ）３－５’（配列番号１５）」という構造を持つ１８塩基のＲＮＡ配列
（４）ゲノム５’末端から９６塩基目から始まる「３’－（ＮＮＮＮＮＧ）３－５’（配列番号１６）」という構造を持つ１８塩基のＲＮＡ配列
このうち、（１）と（２）は相互に相補的な配列であり、ゲノムＲＮＡの３’末端とアンチゲノムＲＮＡ（ゲノムＲＮＡに相補的なＲＮＡ）の３’末端が同じであることから、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点と考えられている。また、（３）と（４）は機能が不明であるが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素による一本鎖ＲＮＡの複製に必須の配列であることが知られている（非特許文献４２）。
【0045】
２－４． マイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化に必須なパッケージング・シグナル領域
また、本発明では、初めてマイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージング・シグナルとなる領域として、ゲノム３’末端から９７塩基目から１１４塩基目までの領域を同定した。
実施例１８（図２２）に示すように、当該領域（「配列Ｄ」として表記）の全てを削除してしまうと、パッケージ細胞内での遺伝子発現には影響はないが、ステルス型ＲＮＡベクターの粒子化効率が極めて低下してしまう結果が得られた。
このことは、この１８塩基の配列もしくはその１８塩基長領域又はその一部がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な配列又は領域であることを示している。
そこで、さらにこの１８塩基の配列を下記（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列から任意に選んで置換してみた（図３の（５）、配列番号７５）ところ、粒子化効率に変化がないことを確認した。
このことから、ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの１８塩基長又はその一部の長さの領域が、マイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージングに必須であると考えられる。すなわち、当該領域は、マイナス一本鎖ＲＮＡを鋳型とした転写と複製には必須ではないが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な「パッケージング・シグナル領域」であるといえる。
（５）ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの「３’－ＡＡＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＵＵＵＣＡ－５’（配列番号１７）」に対応する１８塩基長のＲＮＡ、またはその少なくとも連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の長さの任意のＲＮＡ。
上記（５）の１８塩基長あるいはその一部領域を欠いたステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、たとえ宿主細胞に同種あるいは異種ウイルスが感染したとしても、当該ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を含んだウイルス様粒子の産生につながる可能性が極めて低い。
したがって、当該１８塩基長又はその一部領域は、本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を感染性の粒子とし、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現ベクターとして用いる場合は、必須の領域であるが、ウイルス様粒子の混入を極限まで排除して安全性を確保したいバイオ医薬品製造には、むしろ排除すべき配列となる。
また、本発明では、初めてマイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージング・シグナルとなる領域として、ゲノム３’末端から９７塩基目から１１４塩基目までの領域を同定した。
実施例１８（図２２）に示すように、当該領域（「配列Ｄ」として表記）の全てを削除してしまうと、パッケージ細胞内での遺伝子発現には影響はないが、ステルス型ＲＮＡベクターの粒子化効率が極めて低下してしまう結果が得られた。
このことは、この１８塩基の配列もしくはその１８塩基長領域又はその一部がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な配列又は領域であることを示している。
そこで、さらにこの１８塩基の配列を下記（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列から任意に選んで置換してみた（図３の（５）、配列番号７５）ところ、粒子化効率に変化がないことを確認した。
このことから、ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの１８塩基長又はその一部の長さの領域が、マイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージングに必須であると考えられる。すなわち、当該領域は、マイナス一本鎖ＲＮＡを鋳型とした転写と複製には必須ではないが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な「パッケージング・シグナル領域」であるといえる。
（５）ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの「３’－ＡＡＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＧＵＵＵＣＡ－５’（配列番号１７）」に対応する１８塩基長のＲＮＡ、またはその少なくとも連続した８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上の長さの任意のＲＮＡ。
上記（５）の１８塩基長あるいはその一部領域を欠いたステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、たとえ宿主細胞に同種あるいは異種ウイルスが感染したとしても、当該ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を含んだウイルス様粒子の産生につながる可能性が極めて低い。
したがって、当該１８塩基長又はその一部領域は、本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を感染性の粒子とし、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現ベクターとして用いる場合は、必須の領域であるが、ウイルス様粒子の混入を極限まで排除して安全性を確保したいバイオ医薬品製造には、むしろ排除すべき配列となる。
【0046】
２－５． マイナス一本鎖ＲＮＡの遺伝子発現の鋳型の構築
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルであるＲＮＡ」、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルであるＲＮＡ」およびマイナス一本鎖ＲＮＡの３’末端と５’末端に存在する「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ」を組み合わせ、転写開始シグナルと転写終結シグナルの間に任意の外来遺伝子を搭載したＲＮＡ分子は、トランスに供給されるウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素など必要な因子の存在下で、転写や複製の鋳型となることが知られている（非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５）。例えば、センダイウイルス由来の転写開始シグナル、転写終結シグナルと複製起点を組み合わせ、外来遺伝子として大腸菌のＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）遺伝子を搭載した上記の構造を持つマイナス一本鎖ＲＮＡは、センダイウイルスが感染した細胞の中で転写と複製の鋳型となり、ＣＡＴが作られることが示されている（非特許文献４３、非特許文献４４）。また、同様の構造を持つマイナス一本鎖ＲＮＡは、センダイウイルスのＮＰ（一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質）、Ｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびＬ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）タンパク質を安定に発現する細胞で、持続的に複製を続けることが示されている（非特許文献４５）。
これらの報告は、本発明で作製したマイナス一本鎖ＲＮＡが遺伝子発現の鋳型となることを示しているが、このままでは転写や複製の活性はウイルスの遺伝子を含む細胞からトランスに供給されるＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質に依存するため、任意の細胞で遺伝子発現を行うことができる汎用的な遺伝子発現系とはならない。そこで次に、前記２－３．（図１）で示した構造を持つ、自然免疫機構に認識されない成分から構成されたＲＮＡ分子に、転写と複製に必要な遺伝子を搭載することを試みた。
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナルであるＲＮＡ」、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナルであるＲＮＡ」およびマイナス一本鎖ＲＮＡの３’末端と５’末端に存在する「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ」を組み合わせ、転写開始シグナルと転写終結シグナルの間に任意の外来遺伝子を搭載したＲＮＡ分子は、トランスに供給されるウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素など必要な因子の存在下で、転写や複製の鋳型となることが知られている（非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５）。例えば、センダイウイルス由来の転写開始シグナル、転写終結シグナルと複製起点を組み合わせ、外来遺伝子として大腸菌のＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）遺伝子を搭載した上記の構造を持つマイナス一本鎖ＲＮＡは、センダイウイルスが感染した細胞の中で転写と複製の鋳型となり、ＣＡＴが作られることが示されている（非特許文献４３、非特許文献４４）。また、同様の構造を持つマイナス一本鎖ＲＮＡは、センダイウイルスのＮＰ（一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質）、Ｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびＬ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）タンパク質を安定に発現する細胞で、持続的に複製を続けることが示されている（非特許文献４５）。
これらの報告は、本発明で作製したマイナス一本鎖ＲＮＡが遺伝子発現の鋳型となることを示しているが、このままでは転写や複製の活性はウイルスの遺伝子を含む細胞からトランスに供給されるＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質に依存するため、任意の細胞で遺伝子発現を行うことができる汎用的な遺伝子発現系とはならない。そこで次に、前記２－３．（図１）で示した構造を持つ、自然免疫機構に認識されない成分から構成されたＲＮＡ分子に、転写と複製に必要な遺伝子を搭載することを試みた。
【0047】
３． 動物細胞における自然免疫機構の活性化（ＰＡＭＰ）の回避についての知見
３－１． ウイルス由来ＲＮＡのＰＡＭＰについて
動物細胞が持つ自然免疫機構は、細胞内に侵入したウイルスのゲノムＲＮＡやウイルス遺伝子のｍＲＮＡに存在する「病原微生物に特徴的な分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ， ＰＡＭＰ）」を認識して活性化される。ＰＡＭＰの構造は、これまでにＣ型肝炎ウイルスとヒト免疫不全ウイルスにおいて同定されている。Ｃ型肝炎ウイルスでは、ゲノム３’末端の非コード領域にあるＵｒｉｄｉｎｅに富んだ配列がＰＡＭＰであることが報告されている（非特許文献３５）。一方、ヒト免疫不全ウイルスでは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖの３つの遺伝子から転写されたｍＲＮＡに存在するＡｄｅｎｉｎｅ含量が高い領域がＰＡＭＰとなることが報告されている（非特許文献３６）。この他、センダイウイルスでは、感染細胞中に存在する６００塩基より長い長鎖ＲＮＡ分画に強いＰＡＭＰの活性が検出されており（非特許文献３７）、Ｆ・ＨＮ・Ｌの各遺伝子の非コード領域にもＰＡＭＰとして機能する可能性がある高度な二次構造が存在することが知られている（非特許文献３８）。このように、ほとんどのウイルス由来のＲＮＡはＰＡＭＰを含んでいると予想される。
３－１． ウイルス由来ＲＮＡのＰＡＭＰについて
動物細胞が持つ自然免疫機構は、細胞内に侵入したウイルスのゲノムＲＮＡやウイルス遺伝子のｍＲＮＡに存在する「病原微生物に特徴的な分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ， ＰＡＭＰ）」を認識して活性化される。ＰＡＭＰの構造は、これまでにＣ型肝炎ウイルスとヒト免疫不全ウイルスにおいて同定されている。Ｃ型肝炎ウイルスでは、ゲノム３’末端の非コード領域にあるＵｒｉｄｉｎｅに富んだ配列がＰＡＭＰであることが報告されている（非特許文献３５）。一方、ヒト免疫不全ウイルスでは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖの３つの遺伝子から転写されたｍＲＮＡに存在するＡｄｅｎｉｎｅ含量が高い領域がＰＡＭＰとなることが報告されている（非特許文献３６）。この他、センダイウイルスでは、感染細胞中に存在する６００塩基より長い長鎖ＲＮＡ分画に強いＰＡＭＰの活性が検出されており（非特許文献３７）、Ｆ・ＨＮ・Ｌの各遺伝子の非コード領域にもＰＡＭＰとして機能する可能性がある高度な二次構造が存在することが知られている（非特許文献３８）。このように、ほとんどのウイルス由来のＲＮＡはＰＡＭＰを含んでいると予想される。
【0048】
３－２． ウイルス由来ＲＮＡに対する最適化の検討
ＲＮＡウイルスゲノム中のタンパク質をコードしている領域のコドンをヒト細胞に最適化することでＰＡＭＰ構造を破壊し、自然免疫機構の活性化を回避しようとする試みは従来から複数行われていた。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖの各遺伝子から転写される各ｍＲＮＡにはそれぞれＰＡＭＰが存在しているため、いずれの遺伝子もそのまま動物細胞で発現させるとインターフェロンを誘導するが、ヒト細胞に最適化して発現させたＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖタンパク質はいずれもインターフェロン誘導が抑制されることが報告されている（非特許文献３６）。また、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）においても、ＨＩＶと同様にＧａｇ、Ｐｏｌ、ＥｎｖのｍＲＮＡにＰＡＭＰが存在し、各遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンをヒト細胞に最適化することで、インターフェロン誘導能は低下することが知られている（非特許文献４８）。しかし、ＳＩＶゲノム配列中のＰｏｌ遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンを最適化しただけでは、ＳＩＶのインターフェロン誘導能はほとんど変化しない。そこで、Ｐｏｌ遺伝子の最適化に加えてＧａｇ遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンも最適化してしまうと、ウイルスの複製能が１％以下に低下し、ウイルスの転写・複製の機能が大きく損なわれる結果が示されている（非特許文献４８）。この結果は、ＳＩＶのＰｏｌ遺伝子やＧａｇ遺伝子は、単にＰｏｌタンパク質やＧａｇタンパク質をコードしているだけでなく、タンパク質をコードしている核酸配列自体にウイルスの転写あるいは複製の機能に必要な情報が存在していることを示している。
また、Ｃ型肝炎ウイルスの、ゲノム３’末端の非コード領域中のＰＡＭＰを含む領域についても、当該領域を破壊してしまうと、そのウイルス複製能が損なわれる（非特許文献８２．非特許文献８３）という報告がある。
これらの結果は、ＲＮＡウイルスゲノム中の「ＰＡＭＰを含む領域」が、同時にウイルスの複製等の機能にとって必須の領域である可能性が高いことを示すものである。
このように、ＲＮＡウイルスの機能を損なわずにゲノム核酸からＰＡＭＰの機能を有する構造を除去する普遍的な方法は知られていないことから、ウイルスＲＮＡ中のＰＡＭＰを含む領域のコドンをヒト細胞に最適化する技術をＲＮＡウイルスベクターに適用することは、むしろ否定的な結果となっている。
ＲＮＡウイルスゲノム中のタンパク質をコードしている領域のコドンをヒト細胞に最適化することでＰＡＭＰ構造を破壊し、自然免疫機構の活性化を回避しようとする試みは従来から複数行われていた。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖの各遺伝子から転写される各ｍＲＮＡにはそれぞれＰＡＭＰが存在しているため、いずれの遺伝子もそのまま動物細胞で発現させるとインターフェロンを誘導するが、ヒト細胞に最適化して発現させたＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖタンパク質はいずれもインターフェロン誘導が抑制されることが報告されている（非特許文献３６）。また、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）においても、ＨＩＶと同様にＧａｇ、Ｐｏｌ、ＥｎｖのｍＲＮＡにＰＡＭＰが存在し、各遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンをヒト細胞に最適化することで、インターフェロン誘導能は低下することが知られている（非特許文献４８）。しかし、ＳＩＶゲノム配列中のＰｏｌ遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンを最適化しただけでは、ＳＩＶのインターフェロン誘導能はほとんど変化しない。そこで、Ｐｏｌ遺伝子の最適化に加えてＧａｇ遺伝子のＰＡＭＰを含む領域のコドンも最適化してしまうと、ウイルスの複製能が１％以下に低下し、ウイルスの転写・複製の機能が大きく損なわれる結果が示されている（非特許文献４８）。この結果は、ＳＩＶのＰｏｌ遺伝子やＧａｇ遺伝子は、単にＰｏｌタンパク質やＧａｇタンパク質をコードしているだけでなく、タンパク質をコードしている核酸配列自体にウイルスの転写あるいは複製の機能に必要な情報が存在していることを示している。
また、Ｃ型肝炎ウイルスの、ゲノム３’末端の非コード領域中のＰＡＭＰを含む領域についても、当該領域を破壊してしまうと、そのウイルス複製能が損なわれる（非特許文献８２．非特許文献８３）という報告がある。
これらの結果は、ＲＮＡウイルスゲノム中の「ＰＡＭＰを含む領域」が、同時にウイルスの複製等の機能にとって必須の領域である可能性が高いことを示すものである。
このように、ＲＮＡウイルスの機能を損なわずにゲノム核酸からＰＡＭＰの機能を有する構造を除去する普遍的な方法は知られていないことから、ウイルスＲＮＡ中のＰＡＭＰを含む領域のコドンをヒト細胞に最適化する技術をＲＮＡウイルスベクターに適用することは、むしろ否定的な結果となっている。
【0049】
３－３． ウイルス由来の自然免疫阻害因子の利用
ＲＮＡウイルスのゲノムや合成ＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使った従来の技術では、ＰＡＭＰとして認識される構造を明らかにして当該構造を除去するのではなく、各種のウイルスが備えている自然免疫機構に拮抗する因子の働きでＰＡＭＰによる自然免疫機構の活性化を阻害し、細胞障害性を減弱している。例えば、非特許文献２６や非特許文献２７で必須の構成要素として使われているＢ１８Ｒタンパク質は、ワクチニアウイルスのゲノムＤＮＡにコードされているインターフェロン結合タンパク質で、インターフェロンの活性を阻害することで自然免疫機構の活性化を阻害する機能を持つ。
また、特許文献３・特許文献４・非特許文献７で記述されているセンダイウイルスを基にしたベクターでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｌタンパク質とＰタンパク質）の変異と共に、センダイウイルス由来のＶタンパク質の発現が自然免疫機構の抑制の役割を担っている。Ｖタンパク質は、センダイウイルスのＰ遺伝子領域から転写されたｍＲＮＡから作られるタンパク質の１つであり、Ｐタンパク質と共通のＮ末端（３１７アミノ酸残基）と、Ｖタンパク質に固有の構造を持つ塩基性のＣ末端（６７アミノ酸残基）を持つ（非特許文献３９）。Ｖタンパク質は、転写因子ＩＲＦ－３の阻害を通じて自然免疫機構の活性化を抑制する（非特許文献４０）。また、Ｐ遺伝子の塩基配列に人工的に変異を導入して作製したＶタンパク質欠失センダイウイルスでは、自然免疫機構の活性化を抑制する機能が失われ、感染個体から容易に排除されることが知られている（非特許文献４０、非特許文献４１）。
ＲＮＡウイルスのゲノムや合成ＲＮＡを遺伝子発現のプラットフォームとして使った従来の技術では、ＰＡＭＰとして認識される構造を明らかにして当該構造を除去するのではなく、各種のウイルスが備えている自然免疫機構に拮抗する因子の働きでＰＡＭＰによる自然免疫機構の活性化を阻害し、細胞障害性を減弱している。例えば、非特許文献２６や非特許文献２７で必須の構成要素として使われているＢ１８Ｒタンパク質は、ワクチニアウイルスのゲノムＤＮＡにコードされているインターフェロン結合タンパク質で、インターフェロンの活性を阻害することで自然免疫機構の活性化を阻害する機能を持つ。
また、特許文献３・特許文献４・非特許文献７で記述されているセンダイウイルスを基にしたベクターでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（Ｌタンパク質とＰタンパク質）の変異と共に、センダイウイルス由来のＶタンパク質の発現が自然免疫機構の抑制の役割を担っている。Ｖタンパク質は、センダイウイルスのＰ遺伝子領域から転写されたｍＲＮＡから作られるタンパク質の１つであり、Ｐタンパク質と共通のＮ末端（３１７アミノ酸残基）と、Ｖタンパク質に固有の構造を持つ塩基性のＣ末端（６７アミノ酸残基）を持つ（非特許文献３９）。Ｖタンパク質は、転写因子ＩＲＦ－３の阻害を通じて自然免疫機構の活性化を抑制する（非特許文献４０）。また、Ｐ遺伝子の塩基配列に人工的に変異を導入して作製したＶタンパク質欠失センダイウイルスでは、自然免疫機構の活性化を抑制する機能が失われ、感染個体から容易に排除されることが知られている（非特許文献４０、非特許文献４１）。
【0050】
このように、ウイルス由来の自然免疫阻害因子を併用する場合、外来遺伝子が導入された細胞に別種の病原微生物が感染しても自然免疫機構を活性化できないという安全性の懸念が生じる。例えば、センダイウイルスベクターのゲノムを安定に保持している細胞ではＶタンパク質が恒常的に発現しているので、生体の組織細胞でこのベクターを使用する場合には、当該細胞に別のウイルスが感染しても自然免疫機構を活性化できない可能性がある。そのため、ウイルス由来の因子による自然免疫機構の抑制に頼らない方法で自然免疫機構の活性化を回避する技術が望まれる。
【0051】
４． 本発明のＲＮＡ遺伝子発現系におけるＰＡＭＰ回避のための手法
４－１． 非コード領域配列における「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」
本発明の鍵を握るのは、動物細胞が持つ自然免疫機構の活性化を回避できるＲＮＡの選択である。なお、本発明で自然免疫機構の活性化の回避というとき、インターフェロンβ誘導能を指標として、正常細胞におけるＩＦＮ－β ｍＲＮＡの発現量を１．０としたときに３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である点は、上述の通りである。
そこで、本発明では、「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」の素材として、ヒトなど動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列を用いることとし、そのうちで幅広いヒト細胞で発現しているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡを選択した。当該ｍＲＮＡはほとんどのヒト細胞で比較的大量に発現しており、ヒトの自然免疫機構に認識されるモチーフを含んでいない。さらに、当該ｍＲＮＡのタンパク質をコードしていない非コード領域から、高度な二次構造を取らない５塩基から４９塩基のＲＮＡを選択し（表１）、ベクターに搭載される各遺伝子の５’側非コード領域と３’側非コード領域に配置した（図１）。
下記（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列は、いずれも本発明の非コード領域配列における「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」の「動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列」のうちでも特に好ましい配列として用いることができる。そのような好ましい配列の他の例として、アルブミン遺伝子など生体内で大量に発現している遺伝子のｍＲＮＡに由来するＲＮＡ配列の一部配列も好ましく用いることができる。
このように、本発明の実施例では、再生医療への応用を考えてヒト細胞で発現しているｍＲＮＡ由来の非コード領域配列を選択し、その部分配列を用いたが、「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」としては実施例又は（表１）にあげたヒトｍＲＮＡ由来の非コード領域配列由来の配列に限定されない。例えば、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（特許文献７、 ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）において、基準ＣＡＩ値を求めるために採用されたヒトでの発現量の高いヒトｍＲＮＡ群から適宜選択したヒトｍＲＮＡが有している非コード配列の部分配列を用いることができる。その他、ベクターを使用する宿主細胞の自然免疫機構に認識されなければ、ｍＲＮＡ以外のヒトＲＮＡ、他の動物種の細胞で発現しているＲＮＡ、非天然の合成ＲＮＡでもかまわない。
４－１． 非コード領域配列における「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」
本発明の鍵を握るのは、動物細胞が持つ自然免疫機構の活性化を回避できるＲＮＡの選択である。なお、本発明で自然免疫機構の活性化の回避というとき、インターフェロンβ誘導能を指標として、正常細胞におけるＩＦＮ－β ｍＲＮＡの発現量を１．０としたときに３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である点は、上述の通りである。
そこで、本発明では、「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」の素材として、ヒトなど動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列を用いることとし、そのうちで幅広いヒト細胞で発現しているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡを選択した。当該ｍＲＮＡはほとんどのヒト細胞で比較的大量に発現しており、ヒトの自然免疫機構に認識されるモチーフを含んでいない。さらに、当該ｍＲＮＡのタンパク質をコードしていない非コード領域から、高度な二次構造を取らない５塩基から４９塩基のＲＮＡを選択し（表１）、ベクターに搭載される各遺伝子の５’側非コード領域と３’側非コード領域に配置した（図１）。
下記（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列は、いずれも本発明の非コード領域配列における「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」の「動物細胞で発現しているｍＲＮＡ由来のＲＮＡ配列」のうちでも特に好ましい配列として用いることができる。そのような好ましい配列の他の例として、アルブミン遺伝子など生体内で大量に発現している遺伝子のｍＲＮＡに由来するＲＮＡ配列の一部配列も好ましく用いることができる。
このように、本発明の実施例では、再生医療への応用を考えてヒト細胞で発現しているｍＲＮＡ由来の非コード領域配列を選択し、その部分配列を用いたが、「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」としては実施例又は（表１）にあげたヒトｍＲＮＡ由来の非コード領域配列由来の配列に限定されない。例えば、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（特許文献７、 ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）において、基準ＣＡＩ値を求めるために採用されたヒトでの発現量の高いヒトｍＲＮＡ群から適宜選択したヒトｍＲＮＡが有している非コード配列の部分配列を用いることができる。その他、ベクターを使用する宿主細胞の自然免疫機構に認識されなければ、ｍＲＮＡ以外のヒトＲＮＡ、他の動物種の細胞で発現しているＲＮＡ、非天然の合成ＲＮＡでもかまわない。
【0052】
【表1】
【0053】
４－２． ＲＮＡベクター・ゲノムの３’末端及び５’末端領域における「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」への置換
図２、図３および図４に示すように、本発明のステルス型ＲＮＡベクターを構成するゲノムＲＮＡ配列のうち、３’末端領域及び５’末端領域には、前記２－２．～２－３．等で示した転写、複製などに関わる必須の構成要素以外に任意の機能不明な配列領域が存在しており、これら配列中には、複数の箇所にＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列などの「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」に置き換え可能な領域が存在する。
例えば、図３の実施例で示すように、天然のウイルスのゲノム３’末端に存在する構造のうち、（１）から（６）の領域は、表１のＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列を含む相同性の無い他の塩基配列で置換することが可能であり、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の３’ Ｖａｒｉａｎｔ １から３’ Ｖａｒｉａｎｔ ６はいずれも、安定な遺伝子発現とベクター粒子の産生を行うことができる。また、図４の実施例で示すように、天然のウイルスのゲノム５’末端に存在する構造のうち、（１）から（４）の領域は、相同性の無い他の塩基配列で置換あるいは挿入することが可能であり、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の５’ Ｖａｒｉａｎｔ １から５’ Ｖａｒｉａｎｔ ５はいずれも、安定な遺伝子発現を行うことができる。
そして、これらの位置の配列を（表１）のＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列などの「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」に置き換えることで、さらにインターフェロン誘導能を抑制する可能が高いと考えられる。
図２、図３および図４に示すように、本発明のステルス型ＲＮＡベクターを構成するゲノムＲＮＡ配列のうち、３’末端領域及び５’末端領域には、前記２－２．～２－３．等で示した転写、複製などに関わる必須の構成要素以外に任意の機能不明な配列領域が存在しており、これら配列中には、複数の箇所にＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列などの「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」に置き換え可能な領域が存在する。
例えば、図３の実施例で示すように、天然のウイルスのゲノム３’末端に存在する構造のうち、（１）から（６）の領域は、表１のＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列を含む相同性の無い他の塩基配列で置換することが可能であり、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の３’ Ｖａｒｉａｎｔ １から３’ Ｖａｒｉａｎｔ ６はいずれも、安定な遺伝子発現とベクター粒子の産生を行うことができる。また、図４の実施例で示すように、天然のウイルスのゲノム５’末端に存在する構造のうち、（１）から（４）の領域は、相同性の無い他の塩基配列で置換あるいは挿入することが可能であり、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の５’ Ｖａｒｉａｎｔ １から５’ Ｖａｒｉａｎｔ ５はいずれも、安定な遺伝子発現を行うことができる。
そして、これらの位置の配列を（表１）のＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列などの「自然免疫機構に認識されないＲＮＡ」に置き換えることで、さらにインターフェロン誘導能を抑制する可能が高いと考えられる。
【0054】
５． 転写、複製に必須のタンパク質による自然免疫機構の活性化（ＰＡＭＰ）回避のための手法
５－１． 転写、複製に必須のタンパク質をコードする遺伝子中のＰＡＭＰ構造の指標となる値の検討
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＬ）とＰタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＳ）、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」として、センダイウイルスのＣタンパク質（Ｃ）、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」としてセンダイウイルスのＮＰタンパク質（Ｎ）を選定した。これらのタンパク質はマイナス一本鎖ＲＮＡからの転写や複製に必須であるが、それをコードするセンダイウイルスのゲノムＲＮＡやｍＲＮＡには、非特許文献３７で示されているように「病原微生物に特徴的な分子パターン（ＰＡＭＰ）」が存在する可能性が高い。そのため、自然免疫機構を活性化しないステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構築するためには、これらのタンパク質をコードするＲＮＡから、ＰＡＭＰの可能性のある構造を除去する必要がある。
５－１． 転写、複製に必須のタンパク質をコードする遺伝子中のＰＡＭＰ構造の指標となる値の検討
本発明の実施例においては、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＬ）とＰタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＳ）、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」として、センダイウイルスのＣタンパク質（Ｃ）、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」としてセンダイウイルスのＮＰタンパク質（Ｎ）を選定した。これらのタンパク質はマイナス一本鎖ＲＮＡからの転写や複製に必須であるが、それをコードするセンダイウイルスのゲノムＲＮＡやｍＲＮＡには、非特許文献３７で示されているように「病原微生物に特徴的な分子パターン（ＰＡＭＰ）」が存在する可能性が高い。そのため、自然免疫機構を活性化しないステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構築するためには、これらのタンパク質をコードするＲＮＡから、ＰＡＭＰの可能性のある構造を除去する必要がある。
【0055】
センダイウイルスを構成するゲノムＲＮＡやｍＲＮＡにＰＡＭＰの活性が存在するのは確実であるが、実際にどの領域にＰＡＭＰの活性が存在するのかは明らかではない。しかし、ＰＡＭＰの活性を持っているＲＮＡは、宿主細胞で発現しているＲＮＡとは明確に異なった構造を持っているはずである。そこでまず、ＲＮＡウイルス由来のｍＲＮＡとヒト細胞のｍＲＮＡの構造の違いを検討するために、コード領域のコドン最適化指数（Ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ， ＣＡＩ）を指標にして比較した。ＣＡＩは、ある生物種の細胞においてもっとも強く発現しているタンパク質１００個をコードするｍＲＮＡのコドンの出現頻度からの解離を示す指標であり、ＣＡＩ＝１．０の場合はコドン使用頻度がこれら１００種のｍＲＮＡと同じであることを示している（非特許文献４６）。「ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（特許文献７、 ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）」による解析の結果、任意に選んだ１５１個のヒトｍＲＮＡのコード領域のＣＡＩの平均値が０．７７８であるのに対し、センダイウイルスの７種のｍＲＮＡにおけるＣＡＩの平均値は０．７０４、同じパラミキソウイルス科の麻疹ウイルスの７種のｍＲＮＡにおけるＣＡＩの平均値は０．６９７となり、パラミキソウイルスのｍＲＮＡのＣＡＩはヒト細胞のｍＲＮＡの平均的なＣＡＩより有意に低いという結果を得た（図５）。また、参考として解析した大腸菌で発現している任意の１１種のｍＲＮＡにおけるＣＡＩの平均値は０．６９８であった（図５）。このことから、ヒト細胞で使用する場合、パラミキソウイルスのｍＲＮＡは原核生物の大腸菌のｍＲＮＡに匹敵する構造の偏りがあり、これがＰＡＭＰとして認識されている可能性が考えられた。
【0056】
また、別の視点からＲＮＡウイルス由来のｍＲＮＡとヒト細胞のｍＲＮＡの構造の違いを検討するために、コード領域のＧＣ含量を計算した。その結果、天然のパラミキソウイルス由来のＲＮＡのＧＣ含量の平均値は４７．７％から４８．５％であり、ヒトのｍＲＮＡのコード領域のＧＣ含量平均値である５６．３％（非特許文献４７）より有意に低かった（図６）。ＲＮＡウイルスのゲノムはＧＣ含量が比較的低く、ＡｄｅｎｉｎｅやＵｒｉｄｉｎｅが多い配列がＰＡＭＰとなる可能性が高いこと（非特許文献４３）を考慮すると、ＧＣ含量もＰＡＭＰの存在を示唆する指標となる可能性が考えられた。
【0057】
５－２． センダイウイルス由来の転写・複製に関わる遺伝子の「コドン最適化」適用実験
このようなＣＡＩ値及びＧＣ含量をヒト細胞のｍＲＮＡの平均値に近づけるための「コドンの最適化」が、ウイルス由来コード領域中のＰＡＭＰ構造の破壊及びＰＡＭＰの回避に有効であることは前記３－２．で示したようにＨＩＶ、ＳＩＶや肝炎ウイルスなどで確認されている。
しかしながら、前記３－２．では同時に、これらのウイルスでは転写・複製に必須な遺伝子の配列内のＰＡＭＰ領域に「コドンの最適化」を行うと複製能が大きく損なわれる結果も示されている。このことから、転写・複製に必須な遺伝子の配列内のＰＡＭＰ構造は、転写・複製に必須な二次構造の役割を担っている可能性が高いことは従来の技術常識であったといえる。
一般的にウイルスゲノムは各種機能がコンパクトに積み込まれていることを考え合わせると、このような従来の知見からみて、センダイウイルスの場合もこれらウイルスゲノムと同様に、転写・複製に必須な遺伝子配列内のＰＡＭＰ構造がウイルスの機能に重要である可能性は高いと考えられる。すなわち、本発明のＲＮＡ遺伝子発現系に用いるためのセンダイウイルス由来「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」などの転写・複製に関わるタンパク質のコード領域中のコドンをヒト細胞に最適化した場合、ＰＡＭＰは回避できるとしても、本来の転写・複製能も同時に大きく損なわれることが強く予想された。
そのような状況下、本発明者らは、あえて「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「ＲＮＡ結合タンパク質」など転写・複製に関わるタンパク質をコードするＲＮＡを全てヒト細胞にコドン最適化を行った。
このようなＣＡＩ値及びＧＣ含量をヒト細胞のｍＲＮＡの平均値に近づけるための「コドンの最適化」が、ウイルス由来コード領域中のＰＡＭＰ構造の破壊及びＰＡＭＰの回避に有効であることは前記３－２．で示したようにＨＩＶ、ＳＩＶや肝炎ウイルスなどで確認されている。
しかしながら、前記３－２．では同時に、これらのウイルスでは転写・複製に必須な遺伝子の配列内のＰＡＭＰ領域に「コドンの最適化」を行うと複製能が大きく損なわれる結果も示されている。このことから、転写・複製に必須な遺伝子の配列内のＰＡＭＰ構造は、転写・複製に必須な二次構造の役割を担っている可能性が高いことは従来の技術常識であったといえる。
一般的にウイルスゲノムは各種機能がコンパクトに積み込まれていることを考え合わせると、このような従来の知見からみて、センダイウイルスの場合もこれらウイルスゲノムと同様に、転写・複製に必須な遺伝子配列内のＰＡＭＰ構造がウイルスの機能に重要である可能性は高いと考えられる。すなわち、本発明のＲＮＡ遺伝子発現系に用いるためのセンダイウイルス由来「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」などの転写・複製に関わるタンパク質のコード領域中のコドンをヒト細胞に最適化した場合、ＰＡＭＰは回避できるとしても、本来の転写・複製能も同時に大きく損なわれることが強く予想された。
そのような状況下、本発明者らは、あえて「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「ＲＮＡ結合タンパク質」など転写・複製に関わるタンパク質をコードするＲＮＡを全てヒト細胞にコドン最適化を行った。
【0058】
本発明では、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」としてセンダイウイルスのＬタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＬ）とＰタンパク質（ＲＮＡ合成酵素のｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ、ＰｏｌＳ）、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」として、センダイウイルスのＣタンパク質（Ｃ）、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」としてセンダイウイルスのＮＰタンパク質（Ｎ）を使用するので、これらをコードするＲＮＡからＰＡＭＰを除くことを目的に、コドン最適化法として汎用されているプログラムの１つである「ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（特許文献７、 ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）」によってコドン最適化を行った。その結果、ＣＡＩ値はいずれも０．８６から０．８８となり、ヒト細胞で高発現しているタンパク質をコードしているｍＲＮＡに近い数値を示した。
以下、（表２）として、センダイウイルスのＬ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子に対して「ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＯＧＧＤＳ法ともいう。）」によるコドン最適化を適用した結果を示す。
以下、（表２）として、センダイウイルスのＬ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子に対して「ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＯＧＧＤＳ法ともいう。）」によるコドン最適化を適用した結果を示す。
【0059】
【表2】
【0060】
上記（表２）では、さらに別の視点から最適化したＲＮＡの構造を解析するために、コドン最適化後のＲＮＡについて、ＣＡＩ値と共にＧＣ含量を計算した。その結果、最適化前のＲＮＡのＧＣ含量が４４．０％から５０．１％であったのに対し、最適化後のＲＮＡのＧＣ含量は５２．５％から５５．５％と上昇し、ヒトのｍＲＮＡのコード領域のＧＣ含量平均値である５６．３％（非特許文献４７）に近づいた（表２）（図６）。ＲＮＡウイルスでは、ＡｄｅｎｉｎｅやＵｒｉｄｉｎｅが多い配列がＰＡＭＰとなる可能性が高い（非特許文献３６）ことが知られており、コドン最適化の手法によりウイルス由来のＲＮＡの構造がヒトｍＲＮＡの構造に近づき、同時にＰＡＭＰの活性を持つ領域が除去された可能性が強く示唆された。
【0061】
そして本発明では実際に、この手法でヒト細胞に最適化されたセンダイウイルス由来のＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、Ｃタンパク質、Ｌタンパク質をコードするＲＮＡを、１０個の外来遺伝子と共に搭載したＲＮＡベクター（図１３）を構築し（実施例８）、Ｈｅｌａ細胞内で発現させて検証した結果（実施例９）、１０個の外来遺伝子すべてが観察可能な十分な量発現することを確認した。また、当該ＲＮＡベクターがヒト線維芽細胞内のＩＮＦ－β誘導を回避できることを確認した（実施例１３、図１７）。
このことは、本発明のヒト細胞に最適化されたセンダイウイルス由来の転写・複製に関わる遺伝子ＲＮＡを搭載したＲＮＡベクターが、ＰＡＭＰ回避効果を備えた優れたステルス型ＲＮＡベクターとして機能することを示すものである。
またこの結果は、センダイウイルスの場合には、転写・複製に必須な遺伝子の配列内に存在しているＰＡＭＰ構造は、全て転写・複製に必須な構造ではなかったことを示すものでもあり、あえて実験を行った本発明者らにとっても、予想外の驚くべき結果であった。
このことは、本発明のヒト細胞に最適化されたセンダイウイルス由来の転写・複製に関わる遺伝子ＲＮＡを搭載したＲＮＡベクターが、ＰＡＭＰ回避効果を備えた優れたステルス型ＲＮＡベクターとして機能することを示すものである。
またこの結果は、センダイウイルスの場合には、転写・複製に必須な遺伝子の配列内に存在しているＰＡＭＰ構造は、全て転写・複製に必須な構造ではなかったことを示すものでもあり、あえて実験を行った本発明者らにとっても、予想外の驚くべき結果であった。
【0062】
５－３． コドン最適化方法の検討
前記（表２）の結果によると、ＰＡＭＰの活性を持つ領域を除去して自然免疫反応の誘導を抑えるための「コドン最適化」のためには、「ＣＡＩ値」及び「ＧＣ含量」の２種類の数値範囲の設定が重要な要件であることが示唆される。そこで、両者の要件のうち、どちらがより本質的な要件であるかについて検討するため、別のコドン最適化方法を適用した実験を行うこととした。コドン最適化の方法としては、上記ＯＧＧＤＳ法の他にも、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ（非特許文献４９）やＧｅｎｅＧＰＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（特許文献８、特許文献９）など、種々の方法が提案されているため、この追試実験により、上記ＯＧＧＤＳ法以外の方法を適用しても、同様の効果が奏せられることを確認することもできる。
そこで、ＯＧＧＤＳ法と同様に汎用されている「コドン最適化」手法であるＧｅｎｅＧＰＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（以下、ＧＧＥＯＴ法ともいう。）によるコドン最適化方法を、センダイウイルスのＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、Ｃタンパク質、Ｌタンパク質をコードする鋳型ＤＮＡに適用し、同様に１０個の外来遺伝子を搭載可能なＲＮＡベクター（図１５）を作製した。実施例９の方法で検証したところ、ＯＧＧＤＳ法で最適化されたステルス型ＲＮＡベクターと同様に自然免疫反応の誘導が回避できるステルス型ＲＮＡベクターであることが確認できた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
ＯＧＧＤＳ法による最適化と、ＧＧＥＯＴ法による最適化は、まったく異なったアルゴリズムが用いられており、この２つの方法で最適化された核酸の塩基配列を比較すると、両者の同一性は７７％～８０％となり、コドン最適化のためにかなり異なった塩基が選択されたことが見て取れる（表４）。
以上のことから、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」をコードする遺伝子を、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を作製するために最適化する方法は、特定のコドン最適化法には依存しておらず、どのようなアルゴリズムに基づくコドン最適化方法であっても本発明のコドン最適化法として適用できることが実証された。
以下、（表３）として、センダイウイルスのＬ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子に対してＧＧＥＯＴ法によるコドン最適化後のＧＣ含量と、ＣＡＩ値の値を、上記（表２）に示したＯＧＧＤＳ法による値と対比させた表を示す。なお、ＧＧＥＯＴ法には、「ＣＡＩ値」の計算プログラムがないため、ＯＧＧＤＳ法の「ＣＡＩ値」の計算プログラムに従って計算した。
また、（表４）として、Ｌ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子それぞれについて、もとの配列、ＯＧＧＤＳ適用後配列、及びＧＧＥＯＴ適用後配列間のホモロジー（同一性）の値を示す。
前記（表２）の結果によると、ＰＡＭＰの活性を持つ領域を除去して自然免疫反応の誘導を抑えるための「コドン最適化」のためには、「ＣＡＩ値」及び「ＧＣ含量」の２種類の数値範囲の設定が重要な要件であることが示唆される。そこで、両者の要件のうち、どちらがより本質的な要件であるかについて検討するため、別のコドン最適化方法を適用した実験を行うこととした。コドン最適化の方法としては、上記ＯＧＧＤＳ法の他にも、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ（非特許文献４９）やＧｅｎｅＧＰＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（特許文献８、特許文献９）など、種々の方法が提案されているため、この追試実験により、上記ＯＧＧＤＳ法以外の方法を適用しても、同様の効果が奏せられることを確認することもできる。
そこで、ＯＧＧＤＳ法と同様に汎用されている「コドン最適化」手法であるＧｅｎｅＧＰＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（以下、ＧＧＥＯＴ法ともいう。）によるコドン最適化方法を、センダイウイルスのＮＰタンパク質、Ｐタンパク質、Ｃタンパク質、Ｌタンパク質をコードする鋳型ＤＮＡに適用し、同様に１０個の外来遺伝子を搭載可能なＲＮＡベクター（図１５）を作製した。実施例９の方法で検証したところ、ＯＧＧＤＳ法で最適化されたステルス型ＲＮＡベクターと同様に自然免疫反応の誘導が回避できるステルス型ＲＮＡベクターであることが確認できた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
ＯＧＧＤＳ法による最適化と、ＧＧＥＯＴ法による最適化は、まったく異なったアルゴリズムが用いられており、この２つの方法で最適化された核酸の塩基配列を比較すると、両者の同一性は７７％～８０％となり、コドン最適化のためにかなり異なった塩基が選択されたことが見て取れる（表４）。
以上のことから、「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素」、「ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質」、「一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質」をコードする遺伝子を、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を作製するために最適化する方法は、特定のコドン最適化法には依存しておらず、どのようなアルゴリズムに基づくコドン最適化方法であっても本発明のコドン最適化法として適用できることが実証された。
以下、（表３）として、センダイウイルスのＬ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子に対してＧＧＥＯＴ法によるコドン最適化後のＧＣ含量と、ＣＡＩ値の値を、上記（表２）に示したＯＧＧＤＳ法による値と対比させた表を示す。なお、ＧＧＥＯＴ法には、「ＣＡＩ値」の計算プログラムがないため、ＯＧＧＤＳ法の「ＣＡＩ値」の計算プログラムに従って計算した。
また、（表４）として、Ｌ，Ｐ，Ｃ及びＮタンパク質遺伝子それぞれについて、もとの配列、ＯＧＧＤＳ適用後配列、及びＧＧＥＯＴ適用後配列間のホモロジー（同一性）の値を示す。
【0063】
【表3】
【0064】
【表4】
【0065】
５－４． 「コドンの最適化」のために必須の指標
ＣＡＩは、ヒト細胞内でのｍＲＮＡの翻訳効率を推定する指標の一つとして使われている（非特許文献４６）が、本発明では、コドン最適化はウイルス由来のＲＮＡからＰＡＭＰの活性を持つ構造を消去する手段の１つとして使用しており、必ずしも翻訳効率の上昇が得られなくても良い。
また、ＣＡＩは「ある生物種の細胞においてもっとも強く発現しているタンパク質１００個をコードするｍＲＮＡのコドンの出現頻度からの解離を示す指標」であるが、標準となる１００個のタンパク質を選択する客観的な基準は示されていない。本発明においてヒト由来培養細胞内で同等の自然免疫反応の誘導を抑えた１０個の遺伝子発現を達成できたＯＧＧＤＳ法による最適化と、ＧＧＥＯＴ法による最適化を比較した場合、後者のＣＡＩ 値（ＯＧＧＤＳ法により計算）の場合、最適化後も最適化前とあまり変わらない結果となっている（表３）。
一方、ＧＣ含量については、どちらの最適化法を適用しても５１％以上、最大で約６０％の値を示した。このことから、ＰＡＭＰの活性を持つ構造が除去された可能性を示す指標としては、ＣＡＩ 値よりもＧＣ含量がより有効であることがわかった。すなわち、自然免疫反応の誘導が抑えられた「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」のための「コドン最適化」における指標としては、ＧＣ含量が最も優れた指標であり、ウイルス由来タンパク質のコドン最適化後のＧＣ含量が、少なくとも５０．０％以上、望ましくは５２．０％以上であればＰＡＭＰの活性を持つ構造が除去された可能性が推測される。
以上のことから、本発明でＲＮＡ遺伝子発現系のための「コドン最適化」というとき、ＲＮＡ遺伝子発現系に必要なタンパク質をコードする全ての塩基配列を、ＧＣ含量で５０～６０％、好ましくは５２～５６％に調整することをいう。
なお、コドン最適化による塩基配列の改変の結果、Ｐ遺伝子領域に存在していたＣタンパク質とＶタンパク質をコードする配列は消失し、最適化したＰ遺伝子からはＣタンパク質もＶタンパク質も発現しない。Ｃタンパク質及びＶタンパク質をコードするＲＮＡは完全に除去されても遺伝子発現は行われるため必須ではないが、特にＣタンパク質の場合、本発明のＲＮＡベクターの発現量を適正に調節するためには重要であるため、前記のように最適化したＣタンパク質遺伝子ＲＮＡを配列中に加えることが好ましい。Ｖタンパク質ＲＮＡについても、必要に応じ、適宜同様のコドン最適化して配列中に加えることができる。
ＣＡＩは、ヒト細胞内でのｍＲＮＡの翻訳効率を推定する指標の一つとして使われている（非特許文献４６）が、本発明では、コドン最適化はウイルス由来のＲＮＡからＰＡＭＰの活性を持つ構造を消去する手段の１つとして使用しており、必ずしも翻訳効率の上昇が得られなくても良い。
また、ＣＡＩは「ある生物種の細胞においてもっとも強く発現しているタンパク質１００個をコードするｍＲＮＡのコドンの出現頻度からの解離を示す指標」であるが、標準となる１００個のタンパク質を選択する客観的な基準は示されていない。本発明においてヒト由来培養細胞内で同等の自然免疫反応の誘導を抑えた１０個の遺伝子発現を達成できたＯＧＧＤＳ法による最適化と、ＧＧＥＯＴ法による最適化を比較した場合、後者のＣＡＩ 値（ＯＧＧＤＳ法により計算）の場合、最適化後も最適化前とあまり変わらない結果となっている（表３）。
一方、ＧＣ含量については、どちらの最適化法を適用しても５１％以上、最大で約６０％の値を示した。このことから、ＰＡＭＰの活性を持つ構造が除去された可能性を示す指標としては、ＣＡＩ 値よりもＧＣ含量がより有効であることがわかった。すなわち、自然免疫反応の誘導が抑えられた「ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系」のための「コドン最適化」における指標としては、ＧＣ含量が最も優れた指標であり、ウイルス由来タンパク質のコドン最適化後のＧＣ含量が、少なくとも５０．０％以上、望ましくは５２．０％以上であればＰＡＭＰの活性を持つ構造が除去された可能性が推測される。
以上のことから、本発明でＲＮＡ遺伝子発現系のための「コドン最適化」というとき、ＲＮＡ遺伝子発現系に必要なタンパク質をコードする全ての塩基配列を、ＧＣ含量で５０～６０％、好ましくは５２～５６％に調整することをいう。
なお、コドン最適化による塩基配列の改変の結果、Ｐ遺伝子領域に存在していたＣタンパク質とＶタンパク質をコードする配列は消失し、最適化したＰ遺伝子からはＣタンパク質もＶタンパク質も発現しない。Ｃタンパク質及びＶタンパク質をコードするＲＮＡは完全に除去されても遺伝子発現は行われるため必須ではないが、特にＣタンパク質の場合、本発明のＲＮＡベクターの発現量を適正に調節するためには重要であるため、前記のように最適化したＣタンパク質遺伝子ＲＮＡを配列中に加えることが好ましい。Ｖタンパク質ＲＮＡについても、必要に応じ、適宜同様のコドン最適化して配列中に加えることができる。
【0066】
６． 本発明における多数の外来遺伝子をステルス型ＲＮＡに搭載するための方法（転写カセット連結法）
６－１． ６個以上の遺伝子を同一ベクター上に搭載する方法の検討
次に、６個以上、例えば１０個の外来遺伝子を簡便な方法でステルス型ＲＮＡに搭載する方法を検討した。なお、ＲＮＡ分子そのものは遺伝子組換えによる操作を行えないため、５－４．で最適化したウイルス由来の遺伝子の搭載を含め、すべてｃＤＮＡとして構築し、このｃＤＮＡを鋳型としてＴ７ファージ由来のＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡを作製するものとする。
最も単純に１０個の遺伝子を搭載したＤＮＡ分子を作製するためには、それぞれの遺伝子のｃＤＮＡの上流と下流に各遺伝子に固有な制限酵素切断部位を導入し、この制限酵素で切断したｃＤＮＡを順々に挿入していく方法が考えられる。しかしこの場合は、少なくとも２０個の異なる制限酵素が必要となるうえ、遺伝子の組み合わせやステルス型ＲＮＡ上の位置を変更するためにはｃＤＮＡをすべて作り直す必要があり、非現実的である。
６－１． ６個以上の遺伝子を同一ベクター上に搭載する方法の検討
次に、６個以上、例えば１０個の外来遺伝子を簡便な方法でステルス型ＲＮＡに搭載する方法を検討した。なお、ＲＮＡ分子そのものは遺伝子組換えによる操作を行えないため、５－４．で最適化したウイルス由来の遺伝子の搭載を含め、すべてｃＤＮＡとして構築し、このｃＤＮＡを鋳型としてＴ７ファージ由来のＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素によりＲＮＡを作製するものとする。
最も単純に１０個の遺伝子を搭載したＤＮＡ分子を作製するためには、それぞれの遺伝子のｃＤＮＡの上流と下流に各遺伝子に固有な制限酵素切断部位を導入し、この制限酵素で切断したｃＤＮＡを順々に挿入していく方法が考えられる。しかしこの場合は、少なくとも２０個の異なる制限酵素が必要となるうえ、遺伝子の組み合わせやステルス型ＲＮＡ上の位置を変更するためにはｃＤＮＡをすべて作り直す必要があり、非現実的である。
【0067】
６－２． ２個ずつの遺伝子を搭載した「タンデム型転写カセット」の作製
本発明では、前記２－１．（図１）で述べたように、２個ずつの遺伝子を搭載した「タンデム型転写カセット」を作製し、それらを複数個連結していく手法を採用するが、その際、搭載する遺伝子がすべて同じ構造を持つように設計し、ステルス型ＲＮＡのどの位置にも搭載できるような工夫を行った（図７）。この設計法では、搭載する遺伝子の５’上流側に制限酵素Ａ、３’下流側に制限酵素Ｂと別々の制限酵素切断部位を設定し、ここで切断したｃＤＮＡを鋳型となるＤＮＡ分子に挿入することとした。挿入される鋳型ＤＮＡには制限酵素Ａと制限酵素Ｂによる認識配列に加えて、制限酵素Ｃと制限酵素Ｄによる認識配列も設定されている。これらの制限酵素の組み合わせは、制限酵素Ａで切断したＤＮＡ断片が制限酵素Ｄで切断されたＤＮＡ断片とも共有結合できるように、また制限酵素Ｂで切断したＤＮＡ断片が制限酵素Ｃで切断されたＤＮＡ断片とも共有結合できるように選ぶ。このような組み合わせは数多く存在し、実施例であげたＡｃｃ６５ＩとＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩとＳａｌＩの組み合わせ以外にも、ＸｂａＩとＳｐｅＩやＮｈｅＩとの組み合わせ、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの組み合わせなどが考えられる。この場合、搭載する遺伝子のｃＤＮＡについては、制限酵素Ａ・制限酵素Ｂ・制限酵素Ｃ・制限酵素Ｄの認識配列をその内部に含まないことが構造上の制約となる。このような制限酵素の組み合わせを使うことにより、２個ずつのｃＤＮＡを搭載したＤＮＡ断片をまず作製する（図８）。
本発明では、前記２－１．（図１）で述べたように、２個ずつの遺伝子を搭載した「タンデム型転写カセット」を作製し、それらを複数個連結していく手法を採用するが、その際、搭載する遺伝子がすべて同じ構造を持つように設計し、ステルス型ＲＮＡのどの位置にも搭載できるような工夫を行った（図７）。この設計法では、搭載する遺伝子の５’上流側に制限酵素Ａ、３’下流側に制限酵素Ｂと別々の制限酵素切断部位を設定し、ここで切断したｃＤＮＡを鋳型となるＤＮＡ分子に挿入することとした。挿入される鋳型ＤＮＡには制限酵素Ａと制限酵素Ｂによる認識配列に加えて、制限酵素Ｃと制限酵素Ｄによる認識配列も設定されている。これらの制限酵素の組み合わせは、制限酵素Ａで切断したＤＮＡ断片が制限酵素Ｄで切断されたＤＮＡ断片とも共有結合できるように、また制限酵素Ｂで切断したＤＮＡ断片が制限酵素Ｃで切断されたＤＮＡ断片とも共有結合できるように選ぶ。このような組み合わせは数多く存在し、実施例であげたＡｃｃ６５ＩとＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩとＳａｌＩの組み合わせ以外にも、ＸｂａＩとＳｐｅＩやＮｈｅＩとの組み合わせ、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩの組み合わせなどが考えられる。この場合、搭載する遺伝子のｃＤＮＡについては、制限酵素Ａ・制限酵素Ｂ・制限酵素Ｃ・制限酵素Ｄの認識配列をその内部に含まないことが構造上の制約となる。このような制限酵素の組み合わせを使うことにより、２個ずつのｃＤＮＡを搭載したＤＮＡ断片をまず作製する（図８）。
【0068】
６－３． 「転写カセット」連結法
次に、このように作製した２つのｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を５つ接続して、計１０個のｃＤＮＡを搭載したＤＮＡを作製する（図７，図８、図９）。実施例では、上記６－２．で作製した２つのｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を、ＳａｐＩという制限酵素で切断して単離した。ＳａｐＩで切断されたＤＮＡの切断面は５’側が３塩基突出した構造を持っているが、この３塩基の配列を任意に設定することで４×４×４＝６４通りの切断面を選ぶことができる（図７）（図９）。このため、５つのＤＮＡ断片を設計通りに正確に結合して１つのＤＮＡ分子として回収できる（図９）。この時、搭載する遺伝子のｃＤＮＡについては、制限酵素Ａ・制限酵素Ｂ・制限酵素Ｃ・制限酵素Ｄの認識配列に加え、ＳａｐＩの認識配列も含まないように設計する（図７）。
このような、切断面にＮＮやＮＮＮの様に表される配列中の任意の一本鎖突出端を生成する性質を持つ制限酵素はＳａｐＩに限らず、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＳｆａＮＩなど多くの制限酵素で同様の結果が得られる。また認識配列の内部に不定形の配列を持つＡｌｗＮＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳｆｉＩなども同様の効果を得られる。また、この段階は必ずしも制限酵素を使ったクローニングでなくとも良く、相同組換えを利用した方法（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ＴＡＫＡＲＡ－Ｂｉｏ， Ｉｎｃ） やＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ） ）を利用することもできる。また、１０個のｃＤＮＡを結合した後で環状のプラスミドＤＮＡに組み込む段階は、実施例に示した相同組換えによりｐＤＯＮＲ－２２１等に組み込む方法（Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．））を使わなくても、通常のＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを使った共有結合による方法でも可能である。
また、図９に示した方法により、１個から１０個の任意の遺伝子を搭載したＤＮＡ分子を作製することが可能である。
次に、このように作製した２つのｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を５つ接続して、計１０個のｃＤＮＡを搭載したＤＮＡを作製する（図７，図８、図９）。実施例では、上記６－２．で作製した２つのｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を、ＳａｐＩという制限酵素で切断して単離した。ＳａｐＩで切断されたＤＮＡの切断面は５’側が３塩基突出した構造を持っているが、この３塩基の配列を任意に設定することで４×４×４＝６４通りの切断面を選ぶことができる（図７）（図９）。このため、５つのＤＮＡ断片を設計通りに正確に結合して１つのＤＮＡ分子として回収できる（図９）。この時、搭載する遺伝子のｃＤＮＡについては、制限酵素Ａ・制限酵素Ｂ・制限酵素Ｃ・制限酵素Ｄの認識配列に加え、ＳａｐＩの認識配列も含まないように設計する（図７）。
このような、切断面にＮＮやＮＮＮの様に表される配列中の任意の一本鎖突出端を生成する性質を持つ制限酵素はＳａｐＩに限らず、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＳｆａＮＩなど多くの制限酵素で同様の結果が得られる。また認識配列の内部に不定形の配列を持つＡｌｗＮＩ、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳｆｉＩなども同様の効果を得られる。また、この段階は必ずしも制限酵素を使ったクローニングでなくとも良く、相同組換えを利用した方法（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ＴＡＫＡＲＡ－Ｂｉｏ， Ｉｎｃ） やＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ） ）を利用することもできる。また、１０個のｃＤＮＡを結合した後で環状のプラスミドＤＮＡに組み込む段階は、実施例に示した相同組換えによりｐＤＯＮＲ－２２１等に組み込む方法（Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．））を使わなくても、通常のＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを使った共有結合による方法でも可能である。
また、図９に示した方法により、１個から１０個の任意の遺伝子を搭載したＤＮＡ分子を作製することが可能である。
【0069】
６－４． 外来遺伝子発現量の調節
一般に、１組のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＰｏｌＳ，ＰｏｌＬ）、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）、ＲＮＡ合成酵素活性の調節タンパク質（Ｃ）をそれぞれコードする遺伝子を含むマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ遺伝子発現系において、複数の外来遺伝子を挿入する場合、上流の３’末端側に近いほど発現量が多いことが知られている。本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系でも同様の傾向がある。本発明では、多数の外来遺伝子を任意の順序でカセット状に組み込んでいくことができるため、それぞれの遺伝子を取得したい発現量順に整列させることが簡便にできる。また、個々の遺伝子から作られるタンパク質の発現量は、翻訳効率を変化させることでも調節が可能である（図２０）。
一般に、１組のＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（ＰｏｌＳ，ＰｏｌＬ）、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）、ＲＮＡ合成酵素活性の調節タンパク質（Ｃ）をそれぞれコードする遺伝子を含むマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ遺伝子発現系において、複数の外来遺伝子を挿入する場合、上流の３’末端側に近いほど発現量が多いことが知られている。本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系でも同様の傾向がある。本発明では、多数の外来遺伝子を任意の順序でカセット状に組み込んでいくことができるため、それぞれの遺伝子を取得したい発現量順に整列させることが簡便にできる。また、個々の遺伝子から作られるタンパク質の発現量は、翻訳効率を変化させることでも調節が可能である（図２０）。
【0070】
７． ステルス型ＲＮＡの合成
次に、上記６．で作製した１０個のｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片と、前記５．で記述した方法でヒト細胞にコドンを最適化した（以下、「ヒト化」とも称し、各タンパク質の略号にｈを付して表記する。）一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子（ｈＰｏｌＬ、ｈＰｏｌＳ）を連結し、ステルス型ＲＮＡを合成するための環状の鋳型ｃＤＮＡを作製した（図１０）。ステルス型ＲＮＡの構造は、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが認識するプロモーターの位置によってマイナス鎖とプラス鎖から選ぶことができる。ここでは、ステルス型ＲＮＡに搭載されている遺伝子から発現するｍＲＮＡと同じ方向のＲＮＡをプラス鎖、ｍＲＮＡと相補的な方向のＲＮＡをマイナス鎖と定義し、図１０ではＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使ってマイナス鎖ＲＮＡを合成するための鋳型の作製を例示してある。Ｔ７プロモーター（非特許文献５０）から見て下流側にはＲＮＡを切断して正確な末端を作るためのヒトＤ型肝炎ウイルスのアンチゲノム由来のリボザイム（非特許文献５１）とＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの転写終結シグナル（非特許文献５０）を配置し、ステルス型ＲＮＡの全長に相当するＲＮＡが合成できるようになっている。ＲＮＡの合成に使用する酵素はＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに限定されるものではなく、大腸菌や動物細胞で使用できるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであればどのようなものでも使用することができる。例えば、大腸菌Ｔ３ファージ由来のＴ３ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（非特許文献５２）やサルモネラ菌ＳＰ６ファージ由来のＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（非特許文献５３）も、これらの酵素が認識するプロモーターと転写終結点と組み合わせて使用することができる。またリボザイムはＲＮＡの３’末端を正確に切断するために使用し、実施例のヒトＤ型肝炎ウイルスのアンチゲノム由来のリボザイムに限らず、ヒトＤ型肝炎ウイルスのゲノム由来のリボザイム（非特許文献５１）やタバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム（非特許文献５４）さらには細胞内でＲＮＡを切断することができるｓｈｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（特許文献５５）を使うこともできる。
次に、上記６．で作製した１０個のｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片と、前記５．で記述した方法でヒト細胞にコドンを最適化した（以下、「ヒト化」とも称し、各タンパク質の略号にｈを付して表記する。）一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子（ｈＰｏｌＬ、ｈＰｏｌＳ）を連結し、ステルス型ＲＮＡを合成するための環状の鋳型ｃＤＮＡを作製した（図１０）。ステルス型ＲＮＡの構造は、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが認識するプロモーターの位置によってマイナス鎖とプラス鎖から選ぶことができる。ここでは、ステルス型ＲＮＡに搭載されている遺伝子から発現するｍＲＮＡと同じ方向のＲＮＡをプラス鎖、ｍＲＮＡと相補的な方向のＲＮＡをマイナス鎖と定義し、図１０ではＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使ってマイナス鎖ＲＮＡを合成するための鋳型の作製を例示してある。Ｔ７プロモーター（非特許文献５０）から見て下流側にはＲＮＡを切断して正確な末端を作るためのヒトＤ型肝炎ウイルスのアンチゲノム由来のリボザイム（非特許文献５１）とＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの転写終結シグナル（非特許文献５０）を配置し、ステルス型ＲＮＡの全長に相当するＲＮＡが合成できるようになっている。ＲＮＡの合成に使用する酵素はＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに限定されるものではなく、大腸菌や動物細胞で使用できるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであればどのようなものでも使用することができる。例えば、大腸菌Ｔ３ファージ由来のＴ３ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（非特許文献５２）やサルモネラ菌ＳＰ６ファージ由来のＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（非特許文献５３）も、これらの酵素が認識するプロモーターと転写終結点と組み合わせて使用することができる。またリボザイムはＲＮＡの３’末端を正確に切断するために使用し、実施例のヒトＤ型肝炎ウイルスのアンチゲノム由来のリボザイムに限らず、ヒトＤ型肝炎ウイルスのゲノム由来のリボザイム（非特許文献５１）やタバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム（非特許文献５４）さらには細胞内でＲＮＡを切断することができるｓｈｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（特許文献５５）を使うこともできる。
【0071】
また、ステルス型ＲＮＡの全長に相補的なｃＤＮＡは、ｐ１５Ａ由来の複製起点を持つプラスミド（非特許文献５６）にクローニングする。ｐ１５Ａ由来の複製起点を持つプラスミドは、大腸菌の中で低コピーの状態で維持されるので大きなＤＮＡ断片を大腸菌の中で安定に保持させるために有利であるだけでなく、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成するための方法２において、ＣｏｌＥ１由来の複製起点を持つＮタンパク質発現プラスミドと大腸菌の中で共存させることが可能である（非特許文献５６）。実施例では、ｐ１５Ａ由来の複製起点を持つプラスミドにアンピシリン耐性、ＣｏｌＥ１由来の複製起点を持つプラスミドにカナマイシン耐性を搭載して、アンピシリンとカナマイシンの二重選択によって２つのプラスミドを同一の大腸菌内で維持しているが、抗生物質の組み合わせはこの例には限定されない。またプラスミドの組み合わせも、ｐ１５Ａ由来複製起点の代わりにＦ因子由来複製起点を持つプラスミド、ＣｏｌＥ１由来複製起点の代わりにｐＵＣ由来複製起点を持つプラスミドを使うことができる。
【0072】
８． ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構築
８－１． 従来型の再構築法
マイナス一本鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡに結合するタンパク質からなるステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構築は、２つの方法により可能である。１番目の方法は、既にマイナス一本鎖ＲＮＡのゲノムを持つウイルスや当該ウイルスを利用したベクターの再構成法として知られている技術で、マイナス一本鎖ＲＮＡに相補的なプラス一本鎖ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて動物細胞内で発現させ、同時に、ＮＰ（Ｎ）、Ｐ（ＰｏｌＳ）、Ｌ（ＰｏｌＬ）の３つのタンパク質を当該細胞で発現させることでプラス鎖ＲＮＡのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する（図１１）（非特許文献５７、特許文献３）。この方法では、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを安定に発現している動物細胞を用いることにより、材料となるプラスミドＤＮＡを細胞に導入するだけで再構成ができるという簡便さが長所である。一方で、プラス一本鎖ＲＮＡを合成するための鋳型ｃＤＮＡを含むプラスミドと、ＮＰ、Ｐ、Ｌの３つのタンパク質を発現する遺伝子を搭載した３個のプラスミドを同時に細胞に導入するため、これらのＤＮＡ分子間でしばしば遺伝子組換えが起こり、作製しようとするマイナス一本鎖ＲＮＡの構造に変異が挿入されることが知られている（非特許文献５７）。また特許文献３の実施例では、再構成の効率を上昇させるために、さらにＭ、Ｆ、ＨＮタンパク質を発現するプラスミドを追加している。
８－１． 従来型の再構築法
マイナス一本鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡに結合するタンパク質からなるステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構築は、２つの方法により可能である。１番目の方法は、既にマイナス一本鎖ＲＮＡのゲノムを持つウイルスや当該ウイルスを利用したベクターの再構成法として知られている技術で、マイナス一本鎖ＲＮＡに相補的なプラス一本鎖ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて動物細胞内で発現させ、同時に、ＮＰ（Ｎ）、Ｐ（ＰｏｌＳ）、Ｌ（ＰｏｌＬ）の３つのタンパク質を当該細胞で発現させることでプラス鎖ＲＮＡのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する（図１１）（非特許文献５７、特許文献３）。この方法では、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを安定に発現している動物細胞を用いることにより、材料となるプラスミドＤＮＡを細胞に導入するだけで再構成ができるという簡便さが長所である。一方で、プラス一本鎖ＲＮＡを合成するための鋳型ｃＤＮＡを含むプラスミドと、ＮＰ、Ｐ、Ｌの３つのタンパク質を発現する遺伝子を搭載した３個のプラスミドを同時に細胞に導入するため、これらのＤＮＡ分子間でしばしば遺伝子組換えが起こり、作製しようとするマイナス一本鎖ＲＮＡの構造に変異が挿入されることが知られている（非特許文献５７）。また特許文献３の実施例では、再構成の効率を上昇させるために、さらにＭ、Ｆ、ＨＮタンパク質を発現するプラスミドを追加している。
【0073】
８－２． 本発明で開発した再構築法
２番目の方法では、マイナス一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡ結合能を持つＮＰタンパク質（Ｎ）の複合体をまず大腸菌の中で作製し、この複合体をＰ（ＰｏｌＳ）タンパク質とＬ（ＰｏｌＬ）タンパク質を発現している動物細胞に導入してステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する（図１２）。この方法においては、まず、大腸菌の中で共存可能な２つのプラスミドから、Ｎタンパク質をコードするｍＲＮＡとステルス型ＲＮＡをそれぞれＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって合成し、大腸菌内で一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）とステルス型ＲＮＡを同時に発現することによって複合体を作る。天然に存在するＲＮＡウイルスから単離したＲＮＡ－タンパク質複合体を材料にＲＮＡウイルスを再構成する方法は非特許文献５８に開示されているが、今回開発した方法では、遺伝子組換え技術によって合成したステルス型ＲＮＡを材料に再構成することが可能になった。この方法は、１番目の方法に比べて手順が多く複雑なのが短所であるが、相同組換えに関わる遺伝子（ＲｅｃＡ）やＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子（ＲＮａｓｅＥ）を破壊した大腸菌（非特許文献５９）を使用することで、ゲノムＲＮＡに変異を入れることなくステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成をすることが可能である。
すなわち、本発明で開発されたステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成法は、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している宿主細胞内で、あらかじめマイナス一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡ結合能を持つタンパク質（例えば、ＮＰタンパク質（Ｎ））との複合体を作製し、当該複合体を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（例えば、Ｐ（ＰｏｌＳ）タンパク質とＬ（ＰｏｌＬ）タンパク質）を発現している動物細胞に導入してステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する方法である。好ましくは、宿主細胞として、ＲｅｃＡ遺伝子及びＲＮａｓｅＥ遺伝子が破壊され、かつＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している大腸菌を用いる。
２番目の方法では、マイナス一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡ結合能を持つＮＰタンパク質（Ｎ）の複合体をまず大腸菌の中で作製し、この複合体をＰ（ＰｏｌＳ）タンパク質とＬ（ＰｏｌＬ）タンパク質を発現している動物細胞に導入してステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する（図１２）。この方法においては、まず、大腸菌の中で共存可能な２つのプラスミドから、Ｎタンパク質をコードするｍＲＮＡとステルス型ＲＮＡをそれぞれＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって合成し、大腸菌内で一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）とステルス型ＲＮＡを同時に発現することによって複合体を作る。天然に存在するＲＮＡウイルスから単離したＲＮＡ－タンパク質複合体を材料にＲＮＡウイルスを再構成する方法は非特許文献５８に開示されているが、今回開発した方法では、遺伝子組換え技術によって合成したステルス型ＲＮＡを材料に再構成することが可能になった。この方法は、１番目の方法に比べて手順が多く複雑なのが短所であるが、相同組換えに関わる遺伝子（ＲｅｃＡ）やＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子（ＲＮａｓｅＥ）を破壊した大腸菌（非特許文献５９）を使用することで、ゲノムＲＮＡに変異を入れることなくステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成をすることが可能である。
すなわち、本発明で開発されたステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成法は、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している宿主細胞内で、あらかじめマイナス一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡ結合能を持つタンパク質（例えば、ＮＰタンパク質（Ｎ））との複合体を作製し、当該複合体を、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素（例えば、Ｐ（ＰｏｌＳ）タンパク質とＬ（ＰｏｌＬ）タンパク質）を発現している動物細胞に導入してステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構成する方法である。好ましくは、宿主細胞として、ＲｅｃＡ遺伝子及びＲＮａｓｅＥ遺伝子が破壊され、かつＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現している大腸菌を用いる。
【0074】
次いで、上記７．に記した方法で合成した１０個の遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡを使い、前記８．に記載のいずれかの方法でステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構築する（図１３）。このようにして作製したマイナス一本鎖ＲＮＡを持つ遺伝子発現系が、搭載した１０個の遺伝子をすべて持続的に発現できることは、３種類の薬剤耐性形質（ピューロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性）、４種類の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＥＢＦＰ２、Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ）、３種類のルシフェラーゼ（ホタル・ルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ）を安定に発現していることで確認できる（図１４）。
【0075】
８－３． ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系におけるＲＮＡ結合タンパク質（ｈＮ，ｈＣ，ｈＰｏｌ）遺伝子の連結順序
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系において、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子（ｈＰｏｌＳ）のステルス型ＲＮＡ上の位置は、３’末端側からｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳという図１３で示した順番に限定されない。例えば、ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣや、ｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣのように順番を入れ替えても、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構築することができる（図１６）。
本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系において、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子（ｈＰｏｌＳ）のステルス型ＲＮＡ上の位置は、３’末端側からｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳという図１３で示した順番に限定されない。例えば、ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣや、ｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣのように順番を入れ替えても、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を構築することができる（図１６）。
【0076】
８－４． ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系におけるウイルス由来タンパク質遺伝子中の変異の必要性
また、このステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系において、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするヒト化遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするヒト化遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするヒト化遺伝子（ｈＰｏｌＳ、ｈＰｏｌＬ）から発現するタンパク質には、特別な変異が存在する必要は無い。
前記３－３．で述べたように、従来技術においては、自然免疫機構の回避方法として、ウイルス由来ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素遺伝子などへのＰＡＭＰ活性を抑制する変異の導入が最も有効な手段として用いられていた。
しかし、本発明では、ウイルス由来タンパク質遺伝子は前記５．に示した方法により全てコドン最適化によってＰＡＭＰ活性が除かれるため、あらかじめウイルス由来タンパク質にタンパク質レベルでの変異の導入は不要である。例えば、強いインターフェロン誘導能を持つことが知られる野生型パラミキソウイルスであるセンダイウイルスＺ株由来のＮＰ、Ｐ、ＣおよびＬタンパク質を発現する遺伝子を用いた場合でも、前記５．に示した方法での最適化により、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の素材として用いることができる。例えば、（図１６）で「ｈＰｏｌ」として示したＬタンパク質を発現する遺伝子としては、Ｚ株由来の遺伝子配列をヒト細胞に最適化して用いている。
また、このステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系において、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするヒト化遺伝子（ｈＮ）、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするヒト化遺伝子（ｈＣ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするヒト化遺伝子（ｈＰｏｌＳ、ｈＰｏｌＬ）から発現するタンパク質には、特別な変異が存在する必要は無い。
前記３－３．で述べたように、従来技術においては、自然免疫機構の回避方法として、ウイルス由来ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素遺伝子などへのＰＡＭＰ活性を抑制する変異の導入が最も有効な手段として用いられていた。
しかし、本発明では、ウイルス由来タンパク質遺伝子は前記５．に示した方法により全てコドン最適化によってＰＡＭＰ活性が除かれるため、あらかじめウイルス由来タンパク質にタンパク質レベルでの変異の導入は不要である。例えば、強いインターフェロン誘導能を持つことが知られる野生型パラミキソウイルスであるセンダイウイルスＺ株由来のＮＰ、Ｐ、ＣおよびＬタンパク質を発現する遺伝子を用いた場合でも、前記５．に示した方法での最適化により、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の素材として用いることができる。例えば、（図１６）で「ｈＰｏｌ」として示したＬタンパク質を発現する遺伝子としては、Ｚ株由来の遺伝子配列をヒト細胞に最適化して用いている。
【0077】
９． 自然免疫機構の誘導活性についての検証
９－１． 従来技術での自然免疫機構活性化の回避効果との比較
次に、遺伝子導入をする際に自然免疫機構を誘導する活性について、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を搭載したステルス型ＲＮＡベクターを従来技術と比較するために、非特許文献７の図１Ｂで記述されている従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターと、まったく同じ４個の遺伝子（Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ＥＧＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ）を搭載したステルス型ＲＮＡベクターを作製した。この２種類のベクターを使ってヒト初代培養線維芽細胞に遺伝子導入し、２４時間後のインターフェロン・ベータｍＲＮＡの量を、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を使って定量した（図１７）。その結果、ステルス型ＲＮＡベクターでは、自然免疫機構を抑制するＶ遺伝子を搭載していないにも関わらず、正常細胞におけるインターフェロンβｍＲＮＡの量の５倍以内の誘導に収まった。一方、従来技術ではＶ遺伝子を保持しているにも関わらず正常細胞の４７倍の誘導が観察された（図１７）。この結果から、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系では、自然免疫機構を阻害する因子が存在しない条件下でも、自然免疫機構の活性化を回避することができた。
９－１． 従来技術での自然免疫機構活性化の回避効果との比較
次に、遺伝子導入をする際に自然免疫機構を誘導する活性について、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を搭載したステルス型ＲＮＡベクターを従来技術と比較するために、非特許文献７の図１Ｂで記述されている従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターと、まったく同じ４個の遺伝子（Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ＥＧＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ）を搭載したステルス型ＲＮＡベクターを作製した。この２種類のベクターを使ってヒト初代培養線維芽細胞に遺伝子導入し、２４時間後のインターフェロン・ベータｍＲＮＡの量を、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を使って定量した（図１７）。その結果、ステルス型ＲＮＡベクターでは、自然免疫機構を抑制するＶ遺伝子を搭載していないにも関わらず、正常細胞におけるインターフェロンβｍＲＮＡの量の５倍以内の誘導に収まった。一方、従来技術ではＶ遺伝子を保持しているにも関わらず正常細胞の４７倍の誘導が観察された（図１７）。この結果から、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系では、自然免疫機構を阻害する因子が存在しない条件下でも、自然免疫機構の活性化を回避することができた。
【0078】
９－２． さらなる自然免疫機構の活性化の回避
自然免疫機構を誘導する活性は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を保持する細胞の種類や、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系からの遺伝子発現の強さによっても影響される。例えば、ヒト由来ＨｅＬａ細胞ではほとんどインターフェロン・ベータが誘導されないのに対し、同じくヒト由来の２９３細胞では強く誘導される。また、バイオ医薬品を製造するために遺伝子発現を強めるほどインターフェロン・ベータの誘導も強くなる。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を使ったバイオ医薬品製造の場合には、インターフェロンによって誘導される細胞質のアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＡＤＡＲ１）の活性によるＲＮＡゲノムの変異（非特許文献３９）が問題となるため、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に残存する自然免疫機構誘導活性をさらに抑制することが望ましい。
この目標は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に、自然免疫機構を抑制する因子を追加搭載することで達成することができる（図１８、図１９）。このような因子としては、細胞質に存在する「病原微生物に特徴的な分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ， ＰＡＭＰ）」受容体ＲＩＧ－Ｉの欠失変異体（ＲＩＧ－ＩＣ）（非特許文献７１）、センダイウイルス・Ｖタンパク質のＣ末端領域（非特許文献７２）、プロテオソームの構成成分であるＰＳＭＡ７（非特許文献７３）などが挙げられる。
自然免疫機構を誘導する活性は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を保持する細胞の種類や、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系からの遺伝子発現の強さによっても影響される。例えば、ヒト由来ＨｅＬａ細胞ではほとんどインターフェロン・ベータが誘導されないのに対し、同じくヒト由来の２９３細胞では強く誘導される。また、バイオ医薬品を製造するために遺伝子発現を強めるほどインターフェロン・ベータの誘導も強くなる。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を使ったバイオ医薬品製造の場合には、インターフェロンによって誘導される細胞質のアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＡＤＡＲ１）の活性によるＲＮＡゲノムの変異（非特許文献３９）が問題となるため、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に残存する自然免疫機構誘導活性をさらに抑制することが望ましい。
この目標は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に、自然免疫機構を抑制する因子を追加搭載することで達成することができる（図１８、図１９）。このような因子としては、細胞質に存在する「病原微生物に特徴的な分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ， ＰＡＭＰ）」受容体ＲＩＧ－Ｉの欠失変異体（ＲＩＧ－ＩＣ）（非特許文献７１）、センダイウイルス・Ｖタンパク質のＣ末端領域（非特許文献７２）、プロテオソームの構成成分であるＰＳＭＡ７（非特許文献７３）などが挙げられる。
【0079】
１０． 遺伝子発現レベルの調節
次に、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系における遺伝子発現のレベルが、当該ベクターに搭載されている転写・複製に関わる因子の発現を調節することでどのように変化するのかを検討した（図２０，図２１）。なお、図２０ではプラス鎖ＲＮＡ配列で表記している。個々の因子の発現は、ｍＲＮＡからタンパク質が翻訳される効率を変えることで調節できる。また、翻訳効率を変化させる最も簡単な手段は、翻訳開始コドン（ＡＵＧ）のすぐ上流の５’非コード配列を変更することである。動物細胞で最も翻訳効率が高いと考えられているのは、ＡＵＧの直前が５’－ＣＣＡＣＣ－３’（配列番号１８）という構造を取る場合である（非特許文献６０）。一方、５’上流側に短いコード領域を挿入することで翻訳効率を低下させることができる（非特許文献６１）。実施例では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｈＰｏｌＳとｈＰｏｌＬ）の発現を一定にして、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ｈＮ）とＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質（ｈＣ）の発現をそれぞれ４０％および２３％に抑制したベクターを作製して、搭載されているホタル・ルシフェラーゼの発現を比較した（図２０）。その結果、ｈＮとｈＣのいずれもその発現を抑制することで搭載しているルシフェラーゼ遺伝子の発現は上昇し、ｈＮとｈＣの発現抑制を組み合わせることで最大７９倍もの遺伝子発現の上昇を観察した。
次に、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系における遺伝子発現のレベルが、当該ベクターに搭載されている転写・複製に関わる因子の発現を調節することでどのように変化するのかを検討した（図２０，図２１）。なお、図２０ではプラス鎖ＲＮＡ配列で表記している。個々の因子の発現は、ｍＲＮＡからタンパク質が翻訳される効率を変えることで調節できる。また、翻訳効率を変化させる最も簡単な手段は、翻訳開始コドン（ＡＵＧ）のすぐ上流の５’非コード配列を変更することである。動物細胞で最も翻訳効率が高いと考えられているのは、ＡＵＧの直前が５’－ＣＣＡＣＣ－３’（配列番号１８）という構造を取る場合である（非特許文献６０）。一方、５’上流側に短いコード領域を挿入することで翻訳効率を低下させることができる（非特許文献６１）。実施例では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｈＰｏｌＳとｈＰｏｌＬ）の発現を一定にして、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（ｈＮ）とＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質（ｈＣ）の発現をそれぞれ４０％および２３％に抑制したベクターを作製して、搭載されているホタル・ルシフェラーゼの発現を比較した（図２０）。その結果、ｈＮとｈＣのいずれもその発現を抑制することで搭載しているルシフェラーゼ遺伝子の発現は上昇し、ｈＮとｈＣの発現抑制を組み合わせることで最大７９倍もの遺伝子発現の上昇を観察した。
【0080】
このような遺伝子発現レベルの調節は、ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質（ｈＣ）の発現レベルの調節だけで行うことができる（図２１）。この場合、ｈＣ遺伝子を欠失してもステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を再構築することができ、遺伝子発現のレベルは最大となることから、ｈＣ遺伝子はステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の必須の要素では無い。しかし、搭載遺伝子の発現が強すぎると細胞の増殖が強く阻害されるため、ｈＣタンパク質を適度なレベルで発現させて目的に合わせた遺伝子発現を実現するのが実用的である。
【0081】
遺伝子発現系において重要な性質として、目的に応じて最適な発現レベルを選択できることが挙げられる。例えば、細胞リプログラミングにおいては、転写因子の発現を強くしすぎると細胞死が誘導される。また、バイオ医薬品の製造では発現が弱いと生産効率が落ちる。ＲＮＡウイルスを使った遺伝子発現系では一般に、ベクターの発現レベルを変えることは困難であるが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系では個々の構成成分の発現バランスを微調節することで、使用する目的に応じて発現の強度を自由に変えることができる。
【0082】
次に、このようにして完成したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を内部に封入して、さまざまな動物細胞にステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を導入できるベクター粒子を作製することを試みた。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を細胞質に持つＢＨＫ細胞で、強いＳＲαプロモーターを使ってパラミキソウイルスのＭ、Ｆ、ＨＮの３種類のタンパク質を発現させると、細胞の培養上清に遺伝子導入活性を持つベクター粒子が検出された。その感染価は、約１０７ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ／ｍＬと従来型の持続発現型センダイウイルスベクターと同等に高い活性が得られた。このベクター粒子は、ＦとＨＮタンパク質の活性で細胞表面に吸着し、膜同士の融合によって細胞質に内容物、すなわちステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を導入することができる。
この過程は細胞分裂を必要としないため、分裂していない細胞にも遺伝子導入できる。
また、導入できる細胞の細胞特異性・種特異性は使用するＦとＨＮタンパク質の由来で決定されるが、センダイウイルスのＦとＨＮタンパク質を使用する場合は、末梢血の血液細胞を含む非常に広範囲のヒト細胞や動物細胞に遺伝子導入することができた。
この過程は細胞分裂を必要としないため、分裂していない細胞にも遺伝子導入できる。
また、導入できる細胞の細胞特異性・種特異性は使用するＦとＨＮタンパク質の由来で決定されるが、センダイウイルスのＦとＨＮタンパク質を使用する場合は、末梢血の血液細胞を含む非常に広範囲のヒト細胞や動物細胞に遺伝子導入することができた。
【0083】
１１． ベクターの除去
また、従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性をｓｉＲＮＡによって抑制することで迅速なベクターの除去に成功している（特許文献３、非特許文献７）。そこで、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系でも同様な方法で除去ができるのか検討した（図２３）。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系が持つヒト化ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｈＰｏｌＬ）の塩基配列は従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターとは異なるため、新たに３種類のｓｉＲＮＡを合成し、その活性を検討した。その結果、３種のうち１種のｓｉＲＮＡ（標的配列は配列番号４６）を用いて、従来技術と同じように除去ができることを確認した（図２３）。このように、本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、従来の持続発現型センダイウイルスベクターで用いられていたＲＮＡｉによるベクター除去方法が適用できることがわかった。同様に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いる除去方法も適用可能であり、例えば、特許文献３に記載されるように、外来遺伝子の３’非コード領域又は５’非コード領域にｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を挿入することで、内在性のｍｉＲＮＡに反応して除去することも可能である。
また、従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性をｓｉＲＮＡによって抑制することで迅速なベクターの除去に成功している（特許文献３、非特許文献７）。そこで、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系でも同様な方法で除去ができるのか検討した（図２３）。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系が持つヒト化ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｈＰｏｌＬ）の塩基配列は従来技術である持続発現型センダイウイルスベクターとは異なるため、新たに３種類のｓｉＲＮＡを合成し、その活性を検討した。その結果、３種のうち１種のｓｉＲＮＡ（標的配列は配列番号４６）を用いて、従来技術と同じように除去ができることを確認した（図２３）。このように、本発明のステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系は、従来の持続発現型センダイウイルスベクターで用いられていたＲＮＡｉによるベクター除去方法が適用できることがわかった。同様に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いる除去方法も適用可能であり、例えば、特許文献３に記載されるように、外来遺伝子の３’非コード領域又は５’非コード領域にｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を挿入することで、内在性のｍｉＲＮＡに反応して除去することも可能である。
【0084】
１２． 本発明のステルス型ＲＮＡ発現系の用途
本発明のステルス型ＲＮＡ発現系に用いるマイナス一本鎖ステルス性ＲＮＡベクターには、ヒト由来遺伝子など任意の遺伝子を６個以上、さらには１０個まで搭載可能であり、長さ５，０００塩基長、さらには１５，０００塩基長まで搭載可能である。
そして、ヒト細胞など動物細胞における自然免疫機構の活性化を回避できるステルス性を有しており、ベクターの除去も簡便に行えることから、複数遺伝子の同時導入が必要な細胞のリプログラミング技術、巨大遺伝子を含む遺伝子治療、再生医療、バイオ医薬品の製造など幅広い用途が考えられる。
具体的には、以下の実施態様が考えられる。
（１）再生医療の臨床用に使用する高品質のｉＰＳ細胞を高効率で作製する技術への応用。
ヒト細胞など動物細胞をリプログラミングするための６個以上の遺伝子、例えばｉＰＳ細胞に転換するための山中４因子（ＫＬＦ４，ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ｃ－Ｍｙｃ）＋ＢＲＧ１＋ＢＡＦ１５５の６遺伝子を搭載する場合は１３，１３２塩基長となる。また、ＯＣＴ４， ＫＬＦ４， ＳＯＸ２， ｃ－ＭＹＣ， ＮＡＮＯＧ， ＬＩＮ２８の６遺伝子を搭載する場合は７，０００塩基長となる。
実際に、これら６遺伝子を本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載し（図２５）、ヒト胎児線維芽細胞で発現させたところ、４０％を超える初期化効率が実現するという結果を得た（実施例２１）。なお、その際山中４因子（ＫＬＦ４，ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ｃ－Ｍｙｃ）の搭載順序は適宜変更可能であることを確認している（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
また、ヒトの末梢血細胞を材料として、動物成分不含（Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）・フィーダー細胞不使用（Ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）の条件下でも同様の実験を行った結果、同様に従来法よりも高い初期化を行えるという結果が得られている（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
また、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４遺伝子に、クロマチン再構成因子をコードするＣＨＤ１遺伝子を搭載（合計９，９０７塩基長）、さらにＤＮＡ脱メチル化酵素をコードするＴＥＴ１遺伝子（計１１，２０３塩基長）を追加して、初期化効率を高めることもできる。
他の可能性のある組み合わせとしては、さらに卵母細胞特異的ヒストン２種類を組み合わせた８個の遺伝子をヒト体細胞で発現させ、効率よくヒトｉＰＳ細胞を作製することが可能である。
本発明のステルス型ＲＮＡ発現系に用いるマイナス一本鎖ステルス性ＲＮＡベクターには、ヒト由来遺伝子など任意の遺伝子を６個以上、さらには１０個まで搭載可能であり、長さ５，０００塩基長、さらには１５，０００塩基長まで搭載可能である。
そして、ヒト細胞など動物細胞における自然免疫機構の活性化を回避できるステルス性を有しており、ベクターの除去も簡便に行えることから、複数遺伝子の同時導入が必要な細胞のリプログラミング技術、巨大遺伝子を含む遺伝子治療、再生医療、バイオ医薬品の製造など幅広い用途が考えられる。
具体的には、以下の実施態様が考えられる。
（１）再生医療の臨床用に使用する高品質のｉＰＳ細胞を高効率で作製する技術への応用。
ヒト細胞など動物細胞をリプログラミングするための６個以上の遺伝子、例えばｉＰＳ細胞に転換するための山中４因子（ＫＬＦ４，ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ｃ－Ｍｙｃ）＋ＢＲＧ１＋ＢＡＦ１５５の６遺伝子を搭載する場合は１３，１３２塩基長となる。また、ＯＣＴ４， ＫＬＦ４， ＳＯＸ２， ｃ－ＭＹＣ， ＮＡＮＯＧ， ＬＩＮ２８の６遺伝子を搭載する場合は７，０００塩基長となる。
実際に、これら６遺伝子を本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載し（図２５）、ヒト胎児線維芽細胞で発現させたところ、４０％を超える初期化効率が実現するという結果を得た（実施例２１）。なお、その際山中４因子（ＫＬＦ４，ＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ｃ－Ｍｙｃ）の搭載順序は適宜変更可能であることを確認している（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
また、ヒトの末梢血細胞を材料として、動物成分不含（Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）・フィーダー細胞不使用（Ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）の条件下でも同様の実験を行った結果、同様に従来法よりも高い初期化を行えるという結果が得られている（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
また、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４遺伝子に、クロマチン再構成因子をコードするＣＨＤ１遺伝子を搭載（合計９，９０７塩基長）、さらにＤＮＡ脱メチル化酵素をコードするＴＥＴ１遺伝子（計１１，２０３塩基長）を追加して、初期化効率を高めることもできる。
他の可能性のある組み合わせとしては、さらに卵母細胞特異的ヒストン２種類を組み合わせた８個の遺伝子をヒト体細胞で発現させ、効率よくヒトｉＰＳ細胞を作製することが可能である。
【0085】
（２）ヒトの組織細胞（血液・皮膚・胎盤など）から神経細胞・神経幹細胞・幹細胞・膵ベータ細胞などの有用な遺伝子を作り出すダイレクト・リプログラミング技術を利用した、再生医療への応用。
例えば、ヒト線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術において、ＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌという４つの遺伝子に、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２という３つの遺伝子を追加して計７個の遺伝子（９，８８７塩基長）を搭載することができる。
例えば、ヒト線維芽細胞を運動神経にリプログラミングする技術において、ＬＨＸ３、ＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、ＭＹＴ１Ｌという４つの遺伝子に、ＨＢ９、ＩＳＬ１、ＮＧＮ２という３つの遺伝子を追加して計７個の遺伝子（９，８８７塩基長）を搭載することができる。
【0086】
（３）複数のサブユニットからなるバイオ医薬品の製造
巨大遺伝子であり、しかもサブユニットが同じ細胞で同時に発現する必要があって、各サブユニットの発現量の調整も必要な免疫グロブリンＧ、Ｍを生産するために有用である。
実際に、本発明のステルス性ＲＮＡベクターにヒト免疫グロブリンのＨ（μ）鎖遺伝子、Ｌ（κ、λ）鎖遺伝子及びＪ遺伝子を搭載（図２４）し、ＢＨＫ細胞を用いてヒト免疫グロブリンＭを製造した（実施例２２）。その際、遺伝子を搭載する順番を工夫することでほぼＨ鎖：Ｌ鎖：μ鎖を１：１：０．２の割合で発現させることにも成功した。
また本発明のステルス性ＲＮＡベクターに、ヒト免疫グロブリンの４個のｃＤＮＡ（２個のＨ鎖と２個のＬ鎖）を搭載し、ひと二重特異性抗体の発現にも成功した（実施例２３）。
巨大遺伝子であり、しかもサブユニットが同じ細胞で同時に発現する必要があって、各サブユニットの発現量の調整も必要な免疫グロブリンＧ、Ｍを生産するために有用である。
実際に、本発明のステルス性ＲＮＡベクターにヒト免疫グロブリンのＨ（μ）鎖遺伝子、Ｌ（κ、λ）鎖遺伝子及びＪ遺伝子を搭載（図２４）し、ＢＨＫ細胞を用いてヒト免疫グロブリンＭを製造した（実施例２２）。その際、遺伝子を搭載する順番を工夫することでほぼＨ鎖：Ｌ鎖：μ鎖を１：１：０．２の割合で発現させることにも成功した。
また本発明のステルス性ＲＮＡベクターに、ヒト免疫グロブリンの４個のｃＤＮＡ（２個のＨ鎖と２個のＬ鎖）を搭載し、ひと二重特異性抗体の発現にも成功した（実施例２３）。
【0087】
（４）複数のサブユニットからなる創薬標的タンパク質の発現への応用。
例えば、ｇｐ９１ｐｈｏｘ・ｐ２２ｐｈｏｘ・Ｒａｃ・ｐ４７ｐｈｏｘ・ｐ６７ｐｈｏｘ・ｐ４０ｐｈｏｘの６個のサブユニットを本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載し、同時に発現させることで、創薬標的酵素のＮＡＤＰＨ酸化酵素 （Ｎｏｘ２）を発現させることができる。
例えば、ｇｐ９１ｐｈｏｘ・ｐ２２ｐｈｏｘ・Ｒａｃ・ｐ４７ｐｈｏｘ・ｐ６７ｐｈｏｘ・ｐ４０ｐｈｏｘの６個のサブユニットを本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載し、同時に発現させることで、創薬標的酵素のＮＡＤＰＨ酸化酵素 （Ｎｏｘ２）を発現させることができる。
【0088】
（５）疾患の原因遺伝子が巨大な遺伝子である場合、本発明のステルス性ＲＮＡベクターにこれら巨大遺伝子を搭載して持続的に発現させる、これらの疾患の遺伝子治療用ベクターとしての応用。
具体的には、血友病Ａの原因遺伝子産物である血液凝固第８因子のｃＤＮＡ（７０５３塩基長）やデュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物であるジストロフィンのｃＤＮＡ（１１０５８塩基長）を本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載（図２４）して、用いることができる。
具体的には、血友病Ａの原因遺伝子産物である血液凝固第８因子のｃＤＮＡ（７０５３塩基長）やデュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物であるジストロフィンのｃＤＮＡ（１１０５８塩基長）を本発明のステルス性ＲＮＡベクターに搭載（図２４）して、用いることができる。
【実施例0089】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【0090】
（実施例１）１０個の外来遺伝子を搭載したＤＮＡ断片の作製（１）
以下の遺伝子をＰＣＲによってＡｃｃ６５Ｉ－ｃＤＮＡ－ＸｈｏＩの構造になるように増幅してサブクローニングした（図７）。
１）ホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２４）
２）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２８）
３）Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＥＧＦＰ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｕ５５７６１）
４）ピューロマイシン耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６２、配列番号４７
５）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ：非特許文献６３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ１７７５３１）
６）Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ：ｐＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）に由来する。配列番号４８
７）Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＥＢＦＰ２）：非特許文献６４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＥＦ５１７３１８）
８）ゼオシン耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６５、配列番号４９
９）ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ：非特許文献６６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ２０９９６８）
１０）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６７、配列番号５０
以下の遺伝子をＰＣＲによってＡｃｃ６５Ｉ－ｃＤＮＡ－ＸｈｏＩの構造になるように増幅してサブクローニングした（図７）。
１）ホタル・ルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２４）
２）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２８）
３）Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＥＧＦＰ）：（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｕ５５７６１）
４）ピューロマイシン耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６２、配列番号４７
５）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ：非特許文献６３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ１７７５３１）
６）Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ：ｐＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）に由来する。配列番号４８
７）Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＥＢＦＰ２）：非特許文献６４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＥＦ５１７３１８）
８）ゼオシン耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６５、配列番号４９
９）ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ：非特許文献６６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ２０９９６８）
１０）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（ヒト細胞にコドン最適化して合成）：非特許文献６７、配列番号５０
【0091】
（実施例２）１０個の外来遺伝子を搭載したＤＮＡ断片の作製（２）
次に、以下のプラスミドを作製した。
なお、本実施例において用いた核酸はすべてＤＮＡ断片であり、配列番号１又は配列番号４など、配列表においてマイナス鎖ＲＮＡ配列として特定された配列については、対応するＤＮＡ配列を意味するものとする。ＤＮＡ断片を用いる他の実施例においても同様である。
１）プラスミド ＃１：
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ， Ｉｎｃ）のＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－ａｔｔＢ１（配列番号５１）－配列番号１－配列番号２４－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位－配列番号２５－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号２６－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号２７－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
２）プラスミド ＃２
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号２８－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号２９－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３０－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３１－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
３）プラスミド ＃３
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３２－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３３－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３４－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３５－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
４）プラスミド ＃４
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
５）プラスミド ＃５
ＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ａｔｔＢ２（配列番号５２）－ＳａｐＩ切断部位
次に、以下のプラスミドを作製した。
なお、本実施例において用いた核酸はすべてＤＮＡ断片であり、配列番号１又は配列番号４など、配列表においてマイナス鎖ＲＮＡ配列として特定された配列については、対応するＤＮＡ配列を意味するものとする。ＤＮＡ断片を用いる他の実施例においても同様である。
１）プラスミド ＃１：
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ， Ｉｎｃ）のＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－ａｔｔＢ１（配列番号５１）－配列番号１－配列番号２４－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位－配列番号２５－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号２６－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号２７－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
２）プラスミド ＃２
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号２８－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号２９－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３０－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３１－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
３）プラスミド ＃３
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３２－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３３－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３４－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３５－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
４）プラスミド ＃４
プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位
５）プラスミド ＃５
ＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ａｔｔＢ２（配列番号５２）－ＳａｐＩ切断部位
【0092】
（実施例３）１０個の外来遺伝子を搭載したＤＮＡ断片の作製（３）（図８参照）
次に、以下のプラスミドを作製した。
１）プラスミド＃１Ｃ
プラスミド＃１のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃１ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｃを作製した。
２）プラスミド＃２Ｃ
プラスミド＃２のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃２ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｃを作製した。
３）プラスミド＃３Ｃ
プラスミド＃３のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃３Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃３ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃３Ｃを作製した。
４）プラスミド＃４Ｃ
プラスミド＃４のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＢＦＰ２遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃４Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃４ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ゼオシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃４Ｃを作製した。
５）プラスミド＃５Ｃ
プラスミド＃５のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃５ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｃを作製した。
次に、以下のプラスミドを作製した。
１）プラスミド＃１Ｃ
プラスミド＃１のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃１ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｃを作製した。
２）プラスミド＃２Ｃ
プラスミド＃２のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃２ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｃを作製した。
３）プラスミド＃３Ｃ
プラスミド＃３のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃３Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃３ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃３Ｃを作製した。
４）プラスミド＃４Ｃ
プラスミド＃４のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＢＦＰ２遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃４Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃４ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ゼオシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃４Ｃを作製した。
５）プラスミド＃５Ｃ
プラスミド＃５のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｂを作製した。さらに、プラスミド＃５ＢのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｃを作製した。
【0093】
（実施例４）１０個の外来遺伝子を搭載したＤＮＡ断片の作製（４）（図９参照）
プラスミド＃１ＣからＳａｐＩで切り出したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃２ＣからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃３ ＣからＳａｐＩで切り出したＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ遺伝子とＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃４ ＣからＳａｐＩで切り出したＥＢＦＰ２遺伝子とゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ ＣからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計５００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（ｐＤＯＮＲ－２２１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃７を作製した。
プラスミド＃１ＣからＳａｐＩで切り出したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃２ＣからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃３ ＣからＳａｐＩで切り出したＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ遺伝子とＥ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃４ ＣからＳａｐＩで切り出したＥＢＦＰ２遺伝子とゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ ＣからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計５００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（ｐＤＯＮＲ－２２１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃７を作製した。
【0094】
（実施例５）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡを作る鋳型ＤＮＡの作製（図１０参照）
プラスミド＃８は、ｐ１５Ａの複製起点を持つプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（非特許文献５６）のカナマイシン耐性遺伝子を、ｐＤＯＮＲ－２２１のａｔｔＢ１－クロラムフェニコール耐性遺伝子－ａｔｔＢ２を含むＤＮＡ断片で置き換えて作製する。ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳを含むＤＮＡ（配列番号５３）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ， ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅをこの順番で接続したＤＮＡ断片はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。同様に、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＰｏｌＬを含むＤＮＡ（配列番号５４）の３’側にＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとａｔｔＢ２を接続したＤＮＡを合成した。ＢａｍＨＩとＸｍａＩで切り出したａｔｔＢ１－Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ－ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－ ｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳをこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＸｍａＩとＮｏｔＩでプラスミド＃７から切り出した１０個の遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＮｏｔＩとＳａｌＩで切り出したｈＰｏｌＬ－Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ａｔｔＢ２をこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃８（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で１６時間反応させてから大腸菌ＨＳＴ－０８（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏ．）に導入してアンピシリン耐性コロニーを単離し、マイナス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型となるプラスミド＃９Ｂを作製した。
プラス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型ＤＮＡは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを入れ替えて作製する。具体的には、ａｔｔＢ１－Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ － ｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳをこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＸｍａＩとＮｏｔＩでプラスミド＃７から切り出した１０個の遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＮｏｔＩとＳａｌＩで切り出したｈＰｏｌＬ－ ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ－ａｔｔＢ２をこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃８（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で１６時間反応させてから大腸菌ＨＳＴ－０８に導入してアンピシリン耐性コロニーを単離し、プラス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型となるプラスミド＃９Ａを作製した。
プラスミド＃８は、ｐ１５Ａの複製起点を持つプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（非特許文献５６）のカナマイシン耐性遺伝子を、ｐＤＯＮＲ－２２１のａｔｔＢ１－クロラムフェニコール耐性遺伝子－ａｔｔＢ２を含むＤＮＡ断片で置き換えて作製する。ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳを含むＤＮＡ（配列番号５３）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ， ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅをこの順番で接続したＤＮＡ断片はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。同様に、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＰｏｌＬを含むＤＮＡ（配列番号５４）の３’側にＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとａｔｔＢ２を接続したＤＮＡを合成した。ＢａｍＨＩとＸｍａＩで切り出したａｔｔＢ１－Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ－ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－ ｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳをこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＸｍａＩとＮｏｔＩでプラスミド＃７から切り出した１０個の遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＮｏｔＩとＳａｌＩで切り出したｈＰｏｌＬ－Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ａｔｔＢ２をこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃８（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で１６時間反応させてから大腸菌ＨＳＴ－０８（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏ．）に導入してアンピシリン耐性コロニーを単離し、マイナス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型となるプラスミド＃９Ｂを作製した。
プラス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型ＤＮＡは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを入れ替えて作製する。具体的には、ａｔｔＢ１－Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ － ｈＮ－ｈＣ－ｈＰｏｌＳをこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＸｍａＩとＮｏｔＩでプラスミド＃７から切り出した１０個の遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、ＮｏｔＩとＳａｌＩで切り出したｈＰｏｌＬ－ ＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ－ａｔｔＢ２をこの順番で含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃８（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で１６時間反応させてから大腸菌ＨＳＴ－０８に導入してアンピシリン耐性コロニーを単離し、プラス鎖のステルス型ＲＮＡを合成する鋳型となるプラスミド＃９Ａを作製した。
【0095】
（実施例６）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成（方法１）（図１１参照）
方法１は、特許文献３と非特許文献７に記述された方法に準じて行った。
具体的には、ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞として、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとＭタンパク質を安定に発現するハムスター由来ＢＨＫ－２１細胞を、以下の方法で作製した。ＢＨＫ－２１細胞は理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子（非特許文献７４）を動物細胞にコドン最適化して合成したｃＤＮＡ（配列情報７７）をレトロウイルスベクターｐＣＸ４ｎｅｏ（非特許文献７５，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０８６３８５）に搭載し、ＢＨＫ－２１細胞に導入後、Ｇ－４１８ ８００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択して、ＢＨＫ／Ｔ７細胞を得た。
次に、センダイウイルス温度感受性変異株Ｃｌｏｎｅ １５１株のＭ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１１０４６）をレトロウイルスベクターｐＣＸ４ｐｕｒ（非特許文献７５，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０８６３８６）に搭載し、ＢＨＫ－２１／Ｔ７細胞に導入後、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ２００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択して、ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を得た。
再構成に使用した発現ベクターは、以下の方法で作製した。ＮＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－ＮＰ、Ｐタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ、マウスＦｕｒｉｎ発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎは、センダイウイルスＺ株のＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３０２０２．１）およびマウスＦｕｒｉｎ ｃＤＮＡ（非特許文献７６、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１１０４６）を、ＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓのＩｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ遺伝子のエンハンサー・プロモーター（非特許文献７７）の下流に接続して作製した。ＦおよびＨＮタンパク質発現プラスミドｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ（非特許文献７８）は、センダイウイルスＺ株のＦおよびＨＮ遺伝子を、ＳＲαプロモーター（非特許文献７９）の下流に接続したプラスミドである。ｐＭＫＩＴ－１５１Ｍは、ＳＲαプロモーターの下流にセンダイウイルス温度感受性変異株Ｃｌｏｎｅ １５１株のＭ遺伝子を接続して作製した。
Ｍタンパク質を安定に発現するＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を５ × １０５ ｃｅｌｌｓ ／ ｗｅｌｌで６－ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養した後に洗浄した。プラスミド＃９Ａ、ＮＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－ＮＰ、Ｐタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ、ＦおよびＨＮタンパク質発現プラスミドｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ、マウスＦｕｒｉｎ発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎをそれぞれ２ μｇ、１ μｇ、１ μｇ、１ μｇ、２ μｇ、２０ ｎｇの量比でＯｐｔｉＭＥＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）３００ μＬに懸濁し、１０ μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を含む３００ μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を加えてさらに３２℃で３日間培養した。その後、ハイグロマイシンＢ ３００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に細胞を移して培養を続け、ＢＨＫ／＃９Ａ細胞を分離した。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成が起こったことは、ＥＧＦＰとＫｅｉｍａ－Ｒｅｄの発現により確認した。
方法１は、特許文献３と非特許文献７に記述された方法に準じて行った。
具体的には、ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞として、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとＭタンパク質を安定に発現するハムスター由来ＢＨＫ－２１細胞を、以下の方法で作製した。ＢＨＫ－２１細胞は理化学研究所バイオリソースセンターから入手した。Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子（非特許文献７４）を動物細胞にコドン最適化して合成したｃＤＮＡ（配列情報７７）をレトロウイルスベクターｐＣＸ４ｎｅｏ（非特許文献７５，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０８６３８５）に搭載し、ＢＨＫ－２１細胞に導入後、Ｇ－４１８ ８００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択して、ＢＨＫ／Ｔ７細胞を得た。
次に、センダイウイルス温度感受性変異株Ｃｌｏｎｅ １５１株のＭ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１１０４６）をレトロウイルスベクターｐＣＸ４ｐｕｒ（非特許文献７５，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０８６３８６）に搭載し、ＢＨＫ－２１／Ｔ７細胞に導入後、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ２００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択して、ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を得た。
再構成に使用した発現ベクターは、以下の方法で作製した。ＮＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－ＮＰ、Ｐタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ、マウスＦｕｒｉｎ発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎは、センダイウイルスＺ株のＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３０２０２．１）およびマウスＦｕｒｉｎ ｃＤＮＡ（非特許文献７６、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１１０４６）を、ＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓのＩｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ遺伝子のエンハンサー・プロモーター（非特許文献７７）の下流に接続して作製した。ＦおよびＨＮタンパク質発現プラスミドｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ（非特許文献７８）は、センダイウイルスＺ株のＦおよびＨＮ遺伝子を、ＳＲαプロモーター（非特許文献７９）の下流に接続したプラスミドである。ｐＭＫＩＴ－１５１Ｍは、ＳＲαプロモーターの下流にセンダイウイルス温度感受性変異株Ｃｌｏｎｅ １５１株のＭ遺伝子を接続して作製した。
Ｍタンパク質を安定に発現するＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を５ × １０５ ｃｅｌｌｓ ／ ｗｅｌｌで６－ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養した後に洗浄した。プラスミド＃９Ａ、ＮＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－ＮＰ、Ｐタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ、ＦおよびＨＮタンパク質発現プラスミドｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ、マウスＦｕｒｉｎ発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎをそれぞれ２ μｇ、１ μｇ、１ μｇ、１ μｇ、２ μｇ、２０ ｎｇの量比でＯｐｔｉＭＥＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）３００ μＬに懸濁し、１０ μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を含む３００ μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合して２０分間室温放置した培地を、細胞に添加して４時間培養した。細胞を再度洗浄後、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を加えてさらに３２℃で３日間培養した。その後、ハイグロマイシンＢ ３００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に細胞を移して培養を続け、ＢＨＫ／＃９Ａ細胞を分離した。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成が起こったことは、ＥＧＦＰとＫｅｉｍａ－Ｒｅｄの発現により確認した。
【0096】
（実施例７）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成（方法２）（図１２参照）
ＲｅｃＡとＲＮａｓｅＥの二重欠損変異株である大腸菌Ｅ－ＡＩＳＴ７株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（非特許文献６８）のＲＮａｓｅ Ｅ遺伝子とＲｅｃ Ａ遺伝子をこの順番で破壊して作製した。ＲＮａｓｅ Ｅ遺伝子にはＲＮａｓｅ ＥのＣ末端の欠損変異（ｒｎｅ１３１）（非特許文献５９）を、Ｒｅｃ Ａ遺伝子には完全欠損変異を導入した。遺伝子破壊はＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＱｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し、同キットのプロトコールに従って行った。大腸菌で一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）を発現するプラスミド＃１０は、プラスミドｐＥＴ－２４ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）に大腸菌に合わせてコドン最適化したＮ遺伝子（ｅＮ）（配列番号５５）を搭載して作製した。
大腸菌Ｅ－ＡＩＳＴ７株にプラスミド＃９Ｂとプラスミド＃１０を導入し、アンピシリンとカナマイシンで選択してＥ－ＡＩＳＴ７／Ｎ／９Ｂ株を作製した。Ｅ－ＡＩＳＴ７／Ｎ／９Ｂ株を３０℃で培養し、ＯＤ６００＝０．３になったところで０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えてＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの発現を誘導し、３時間培養して大腸菌を回収した。回収した菌を１０ｍＬの１０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２に懸濁し、１５０ ｋｕｎｉｔｓのｒＬｙｓｏｚｏｍｅ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）と２５ ｕｎｉｔｓのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を加えた後、３０℃で３０分処理してプロトプラストを回収した。プロトプラストを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５０ｍＭ ＣＨＡＰＳで壊し、４，５００ ｒｐｍ １０分の遠心上清をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで２５，０００ ｒｐｍ ６０分遠心して、ＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を沈渣として回収した。ＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体はさらに、２８％塩化セシウム溶液に懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで３７，０００ ｒｐｍ ４５時間遠心してＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を精製した。
ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を５ × １０５ ｃｅｌｌｓ ／ ｗｅｌｌで６－ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養した後にＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ各１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸで導入した。さらに２４時間後、５μｇのＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を１０μＬのＰｒｏ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ ｒｅａｇｅｎｔ （ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合して細胞に導入した。２４時間後からハイグロマイシンＢ ３００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に細胞を移して培養を続け、ＢＨＫ／＃９Ａ２細胞を分離した。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成が起こったことは、ＥＧＦＰとＫｅｉｍａ－Ｒｅｄの発現により確認した。
ＲｅｃＡとＲＮａｓｅＥの二重欠損変異株である大腸菌Ｅ－ＡＩＳＴ７株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（非特許文献６８）のＲＮａｓｅ Ｅ遺伝子とＲｅｃ Ａ遺伝子をこの順番で破壊して作製した。ＲＮａｓｅ Ｅ遺伝子にはＲＮａｓｅ ＥのＣ末端の欠損変異（ｒｎｅ１３１）（非特許文献５９）を、Ｒｅｃ Ａ遺伝子には完全欠損変異を導入した。遺伝子破壊はＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社のＱｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し、同キットのプロトコールに従って行った。大腸菌で一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｎ）を発現するプラスミド＃１０は、プラスミドｐＥＴ－２４ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）に大腸菌に合わせてコドン最適化したＮ遺伝子（ｅＮ）（配列番号５５）を搭載して作製した。
大腸菌Ｅ－ＡＩＳＴ７株にプラスミド＃９Ｂとプラスミド＃１０を導入し、アンピシリンとカナマイシンで選択してＥ－ＡＩＳＴ７／Ｎ／９Ｂ株を作製した。Ｅ－ＡＩＳＴ７／Ｎ／９Ｂ株を３０℃で培養し、ＯＤ６００＝０．３になったところで０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えてＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの発現を誘導し、３時間培養して大腸菌を回収した。回収した菌を１０ｍＬの１０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２に懸濁し、１５０ ｋｕｎｉｔｓのｒＬｙｓｏｚｏｍｅ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）と２５ ｕｎｉｔｓのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を加えた後、３０℃で３０分処理してプロトプラストを回収した。プロトプラストを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５０ｍＭ ＣＨＡＰＳで壊し、４，５００ ｒｐｍ １０分の遠心上清をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで２５，０００ ｒｐｍ ６０分遠心して、ＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を沈渣として回収した。ＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体はさらに、２８％塩化セシウム溶液に懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで３７，０００ ｒｐｍ ４５時間遠心してＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を精製した。
ＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞を５ × １０５ ｃｅｌｌｓ ／ ｗｅｌｌで６－ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間培養した後にＰタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｐ、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＣＭＶ－Ｌ各１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸで導入した。さらに２４時間後、５μｇのＲＮＡ－Ｎタンパク質複合体を１０μＬのＰｒｏ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ ｒｅａｇｅｎｔ （ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合して細胞に導入した。２４時間後からハイグロマイシンＢ ３００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に細胞を移して培養を続け、ＢＨＫ／＃９Ａ２細胞を分離した。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成が起こったことは、ＥＧＦＰとＫｅｉｍａ－Ｒｅｄの発現により確認した。
【0097】
（実施例８）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃１の作製
５．０ ｘ １０５ 個のＢＨＫ／＃９Ａ細胞（あるいはＢＨＫ／＃９Ａ２細胞）に対し、欠損遺伝子発現プラスミドであるｐＭＫＩＴ－１５１Ｍ、ｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ、ｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎを、２ μｇ、２ μｇ、３０ ｎｇの割合でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを用いて導入し、４時間後に細胞を洗浄した後、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を加えてさらに３２℃で４日間培養した。その後、ステルス型ＲＮＡベクター＃１（図１３）を含む培養上清を回収し、０．４５ μｍのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、－８０℃にて保存した。ベクターの活性は、サル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞を用いて、抗ＮＰタンパク質抗体による間接蛍光抗体法で検定した（非特許文献７）。この方法で得られたステルス型ＲＮＡベクターの感染価は、約１０７ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、従来型の持続発現型センダイウイルスベクターと同等あるいはそれ以上の活性が得られた。
５．０ ｘ １０５ 個のＢＨＫ／＃９Ａ細胞（あるいはＢＨＫ／＃９Ａ２細胞）に対し、欠損遺伝子発現プラスミドであるｐＭＫＩＴ－１５１Ｍ、ｐＳＲＤ－ＨＮ－Ｆｍｕｔ、ｐＣＭＶ－Ｆｕｒｉｎを、２ μｇ、２ μｇ、３０ ｎｇの割合でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを用いて導入し、４時間後に細胞を洗浄した後、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を加えてさらに３２℃で４日間培養した。その後、ステルス型ＲＮＡベクター＃１（図１３）を含む培養上清を回収し、０．４５ μｍのフィルターで濾過後、必要ならば超遠心法によりベクターを濃縮した。ベクター懸濁液は液体窒素にて急速冷凍し、－８０℃にて保存した。ベクターの活性は、サル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞を用いて、抗ＮＰタンパク質抗体による間接蛍光抗体法で検定した（非特許文献７）。この方法で得られたステルス型ＲＮＡベクターの感染価は、約１０７ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、従来型の持続発現型センダイウイルスベクターと同等あるいはそれ以上の活性が得られた。
【0098】
（実施例９）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターによる遺伝子発現（図１４参照）
（実施例８）で作製したステルス型ＲＮＡベクター＃１をＨｅＬａ細胞にＭＯＩ＝３で感染し、ハイグロマイシンＢ １００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択してＨｅＬａ／＃９細胞を樹立した。
この細胞の薬剤耐性能は、ピューロマイシン（１．５ μｇ／ｍＬ）、ゼオシン（１００ μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（１００ μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（８００ μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジンＳ（１０ μｇ／ｍＬ）で選択して生存率をコロニーアッセイで測定した。陰性対照のＨｅＬａ細胞はこれらの抗生物質に対してすべて感受性であるのに対し、ＨｅＬａ／＃９細胞はピューロマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシンＢに選択的に耐性を示し、これら３種類の薬剤に対する耐性形質を発現していることが確認された（図１４、上段）。
ＨｅＬａ／＃９細胞における蛍光タンパク質の発現は、フローサイトメーター（Ｇａｌｌｉｏｓ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により計測した。各蛍光タンパク質の観察条件は以下のとおりである。ＥＢＦＰ２：励起４０５ｎｍ、検出４５０ｎｍ；Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ：励起４０５ｎｍ、検出６２０ｎｍ；ＥＧＦＰ：励起４８８ｎｍ、検出５３０ｎｍ；Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ：励起６３８ｎｍ、検出６６０ｎｍ。ＨｅＬａ／＃９細胞は、ベクターを保持していないＨｅＬａ細胞に比べて有意に４個の蛍光タンパク質を発現していることが確認された（図１４、中段）。
ＨｅＬａ／＃９細胞におけるルシフェラーゼの発現は、以下の試薬を使用して、発光をルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｏｒｐ．）で検出した。ホタル・ルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ：Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｏｒｐ．）；Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ：ＢｉｏＬｕｘ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）。いずれのルシフェラーゼの活性も、ベクターを保持していないＨｅＬａ細胞では検出されなかったが、ＨｅＬａ／＃９細胞では高い活性が検出された（図１４、下段）。
（実施例８）で作製したステルス型ＲＮＡベクター＃１をＨｅＬａ細胞にＭＯＩ＝３で感染し、ハイグロマイシンＢ １００ μｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で選択してＨｅＬａ／＃９細胞を樹立した。
この細胞の薬剤耐性能は、ピューロマイシン（１．５ μｇ／ｍＬ）、ゼオシン（１００ μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（１００ μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（８００ μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジンＳ（１０ μｇ／ｍＬ）で選択して生存率をコロニーアッセイで測定した。陰性対照のＨｅＬａ細胞はこれらの抗生物質に対してすべて感受性であるのに対し、ＨｅＬａ／＃９細胞はピューロマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシンＢに選択的に耐性を示し、これら３種類の薬剤に対する耐性形質を発現していることが確認された（図１４、上段）。
ＨｅＬａ／＃９細胞における蛍光タンパク質の発現は、フローサイトメーター（Ｇａｌｌｉｏｓ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により計測した。各蛍光タンパク質の観察条件は以下のとおりである。ＥＢＦＰ２：励起４０５ｎｍ、検出４５０ｎｍ；Ｋｅｉｍａ－Ｒｅｄ：励起４０５ｎｍ、検出６２０ｎｍ；ＥＧＦＰ：励起４８８ｎｍ、検出５３０ｎｍ；Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ：励起６３８ｎｍ、検出６６０ｎｍ。ＨｅＬａ／＃９細胞は、ベクターを保持していないＨｅＬａ細胞に比べて有意に４個の蛍光タンパク質を発現していることが確認された（図１４、中段）。
ＨｅＬａ／＃９細胞におけるルシフェラーゼの発現は、以下の試薬を使用して、発光をルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｏｒｐ．）で検出した。ホタル・ルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ：Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｏｒｐ．）；Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａルシフェラーゼ：ＢｉｏＬｕｘ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）。いずれのルシフェラーゼの活性も、ベクターを保持していないＨｅＬａ細胞では検出されなかったが、ＨｅＬａ／＃９細胞では高い活性が検出された（図１４、下段）。
【0099】
（実施例１０）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃２（図１５）の作製 鋳型ｃＤＮＡの作製に使うｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳ、ｈＰｏｌＬ遺伝子をＧｅｎｅＧＰＳ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって最適化したこと、ｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番で搭載したこと以外は、（実施例８）に記載したのと同じ方法でベクターを作製し、（実施例９）に記載した方法で検証した。ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣを含むＤＮＡ（配列番号７８）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒをこの順番で接続したＤＮＡ断片はＤＮＡ ２．０社で合成した。同様に、ｈＰｏｌＬを含むＤＮＡ（配列番号７９）の３’側にＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ， Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとａｔｔＢ２を接続したＤＮＡ断片をＤＮＡ ２．０社で合成した。
【0100】
（実施例１１）１０個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃３、＃４（図１６）の作製
ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番（＃３）またはｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣの順番（＃４）で搭載したこと以外は、（実施例８）に記載したのと同じ方法でベクターを作製し、（実施例９）に記載した方法で検証した。ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣを含むＤＮＡ（配列番号８０）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒをこの順番で接続したＤＮＡ断片、及びｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣを含むＤＮＡ（配列番号８１）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒをこの順番で接続したＤＮＡ断片、およびｈＰｏｌＬを含むＤＮＡ（配列番号８２）の３’側にＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ， Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとａｔｔＢ２を接続したＤＮＡ断片は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。
ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｙｓｔｅｍで最適化したｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番（＃３）またはｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣの順番（＃４）で搭載したこと以外は、（実施例８）に記載したのと同じ方法でベクターを作製し、（実施例９）に記載した方法で検証した。ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣを含むＤＮＡ（配列番号８０）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒをこの順番で接続したＤＮＡ断片、及びｈＰｏｌＳ－ｈＮ－ｈＣを含むＤＮＡ（配列番号８１）の５’側にａｔｔＢ１とＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒをこの順番で接続したＤＮＡ断片、およびｈＰｏｌＬを含むＤＮＡ（配列番号８２）の３’側にＨＤＶ ｒｉｂｏｚｙｍｅ， Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとａｔｔＢ２を接続したＤＮＡ断片は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で合成した。
【0101】
（実施例１２）４個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃５の作製
ブラストサイジンＳ耐性遺伝子（非特許文献６９）（配列番号５６）およびＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子（非特許文献７０）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ１２８８１９）は、ＰＣＲによってＡｃｃ６５Ｉ－ｃＤＮＡ－ＸｈｏＩの構造になるように増幅してサブクローニングした（図７）。プラスミド ＃５ＤはＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする。ただし、プラスミド＃５とはＳａｐＩ切断断面が異なる：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ａｔｔＢ２－ＳａｐＩ切断部位。
プラスミド＃１のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｄを作製した。さらに、プラスミド＃１ＤのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｅを作製した。また、プラスミド＃５ＤのＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｅを作製した。さらに、プラスミド＃５ＥのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｆを作製した。
プラスミド＃１ＥからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ＦからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計２００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃１１を作製した。プラスミド＃１１からＸｍａＩとＮｏｔＩで切り出した４遺伝子を含むＤＮＡ断片を使ったステルス型ＲＮＡベクター＃５の作製は、（実施例５）～（実施例８）に記述した方法に従って行った。
ブラストサイジンＳ耐性遺伝子（非特許文献６９）（配列番号５６）およびＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子（非特許文献７０）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ１２８８１９）は、ＰＣＲによってＡｃｃ６５Ｉ－ｃＤＮＡ－ＸｈｏＩの構造になるように増幅してサブクローニングした（図７）。プラスミド ＃５ＤはＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングする。ただし、プラスミド＃５とはＳａｐＩ切断断面が異なる：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号３６－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号３７－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３８－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３９－配列番号４－ａｔｔＢ２－ＳａｐＩ切断部位。
プラスミド＃１のＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｄを作製した。さらに、プラスミド＃１ＤのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃１Ｅを作製した。また、プラスミド＃５ＤのＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｅを作製した。さらに、プラスミド＃５ＥのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃５Ｆを作製した。
プラスミド＃１ＥからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ＦからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計２００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃１１を作製した。プラスミド＃１１からＸｍａＩとＮｏｔＩで切り出した４遺伝子を含むＤＮＡ断片を使ったステルス型ＲＮＡベクター＃５の作製は、（実施例５）～（実施例８）に記述した方法に従って行った。
【0102】
（実施例１３）ステルス型ＲＮＡベクターによるＩＦＮ－β遺伝子の誘導（図１７）
欠損持続発現型センダイウイルスベクターＳｅＶｄｐ（ＫＲ／Ｂｓｒ／ＥＧＦＰ／ＫＯ）は非特許文献７に記述されている。（実施例１２）で作製したステルス型ＲＮＡベクター＃５と、ＳｅＶｄｐ（ＫＲ／Ｂｓｒ／ＥＧＦＰ／ＫＯ）ベクターを、共にＭＯＩ＝３で初代培養ヒト皮膚由来線維芽細胞に感染させた。この条件で、どちらのベクターも約８０％の細胞に遺伝子導入できた。ベクター感染後２４時間目に、ＩＳＯＧＥＮ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を使って細胞の全ＲＮＡを抽出し、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ （ＲＴ Ｇｒａｄｅ） （ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を使ってゲノムＤＮＡを分解した。次に、このＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．） とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を使い、逆転写反応によりＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成を行った。さらに、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型に、リファレンス遺伝子またはインターフェロン・ベータ遺伝子のＧｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ （ＧＳＰ）とＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使ってリアルタイムＰＣＲ法によりＩＦＮ－β ｍＲＮＡの発現量の解析を行った。
欠損持続発現型センダイウイルスベクターＳｅＶｄｐ（ＫＲ／Ｂｓｒ／ＥＧＦＰ／ＫＯ）は非特許文献７に記述されている。（実施例１２）で作製したステルス型ＲＮＡベクター＃５と、ＳｅＶｄｐ（ＫＲ／Ｂｓｒ／ＥＧＦＰ／ＫＯ）ベクターを、共にＭＯＩ＝３で初代培養ヒト皮膚由来線維芽細胞に感染させた。この条件で、どちらのベクターも約８０％の細胞に遺伝子導入できた。ベクター感染後２４時間目に、ＩＳＯＧＥＮ Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を使って細胞の全ＲＮＡを抽出し、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ （ＲＴ Ｇｒａｄｅ） （ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を使ってゲノムＤＮＡを分解した。次に、このＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．） とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を使い、逆転写反応によりＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成を行った。さらに、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型に、リファレンス遺伝子またはインターフェロン・ベータ遺伝子のＧｅｎｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ （ＧＳＰ）とＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使ってリアルタイムＰＣＲ法によりＩＦＮ－β ｍＲＮＡの発現量の解析を行った。
【0103】
（実施例１４）６個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８、＃９、＃１０の作製（図２０，図２２）
プラスミド ＃２Ｄは、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングした。ただし、プラスミド＃２とはＳａｐＩによる切断断面の配列が異なる：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号２８－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号２９－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３０－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３１－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位。
プラスミド＃２ＤのＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｅを作製した。さらに、プラスミド＃２ＥのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｆを作製した。
プラスミド＃１ＣからＳａｐＩで切り出したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃２ＦからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ ＣからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃１２を作製した。プラスミド＃１２からＸｍａＩとＮｏｔＩで切り出した６遺伝子を含むＤＮＡ断片を使ったステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８（図２０）（実施例１６）及び＃９、＃１０（図２２）（実施例１８）の作製は、（実施例５）（実施例６）及び（実施例８）に記述した方法に従って行った。
プラスミド ＃２Ｄは、プラスミドＬＩＴＭＵＳ３８ｉのＡｐａＩ切断部位とＳｔｕＩ切断部位の間に、以下の構造を持つＤＮＡをクローニングした。ただし、プラスミド＃２とはＳａｐＩによる切断断面の配列が異なる：ＳａｐＩ切断部位－配列番号１－配列番号２８－Ａｃｃ６５Ｉ切断部位－ＳａｌＩ切断部位配列番号２９－配列番号４－ｃｔｔ－配列番号１－配列番号３０－ＢｓｉＷＩ切断部位－ＸｈｏＩ切断部位－配列番号３１－配列番号４－ＳａｐＩ切断部位。
プラスミド＃２ＤのＡｃｃ６５Ｉ－ＳａｌＩ間に、ＥＧＦＰ遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｅを作製した。さらに、プラスミド＃２ＥのＢｓｉＷＩ－ＸｈｏＩ間に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｃｃ６５Ｉ－ＸｈｏＩフラグメントをクローニングしてプラスミド＃２Ｆを作製した。
プラスミド＃１ＣからＳａｐＩで切り出したホタル・ルシフェラーゼ遺伝子とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃２ＦからＳａｐＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇ、プラスミド＃５ ＣからＳａｐＩで切り出したｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ遺伝子とハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１００ｎｇの計３００ｎｇを、５μＬのＨ２Ｏに溶かし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ ５μＬを混合して１６℃で６０分反応させた。精製後、７μＬのＨ２Ｏに溶かし、１μＬのプラスミド＃６（１５０ｎｇ）と２μＬのＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ２を加えて２５℃で２時間反応させてから大腸菌ＤＨ－５αに導入してカナマイシン耐性コロニーを単離し、プラスミド＃１２を作製した。プラスミド＃１２からＸｍａＩとＮｏｔＩで切り出した６遺伝子を含むＤＮＡ断片を使ったステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８（図２０）（実施例１６）及び＃９、＃１０（図２２）（実施例１８）の作製は、（実施例５）（実施例６）及び（実施例８）に記述した方法に従って行った。
【0104】
（実施例１５）５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１１、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５の作製（図１８）
５個の遺伝子を搭載したプラスミド＃１３は、（実施例１４）のプラスミド＃１２の搭載遺伝子のうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を削除し、ピューロマイシン耐性遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９．１）で置き換えた以外は、（実施例１４）に記載された方法で作製した。
この５個の外来遺伝子を、ｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番で搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃３（図１６）に搭載して、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１１を作製した。さらに、このステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のＸｍａＩ部位に、コドン最適化したＲＩＧ－ＩＣを含む遺伝子カセット（配列番号８３）、コドン最適化したセンダイウイルス・Ｖタンパク質のＣ末端領域を含む遺伝子カセット（配列番号８４）、コドン最適化したプロテオソームの構成成分であるＰＳＭＡ７を含む遺伝子カセット（配列番号８５）を挿入して、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１２、＃１３、＃１４を作製した。また、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１５は、ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣ遺伝子のうちｈＰｏｌＳ遺伝子の一部を最適化していないセンダイウイルスＺ株のＰ遺伝子と置き換えて（配列番号８６）、Ｖタンパク質が発現するようにしたものである。
これらのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を含む細胞から実施例８に従ってステルス型ＲＮＡベクターを作製し、ヒト由来２９３細胞に導入して、インターフェロン誘導能を測定した。図１９では、代表例としてステルス型ＲＮＡベクター＃１１と＃１２の比較を行ったが、ＲＩＧ－ＩＣ遺伝子を追加することにより、ステルス型ＲＮＡベクターで残存しているインターフェロン・ベータの誘導がほぼ完全に抑制されることが示された。
５個の遺伝子を搭載したプラスミド＃１３は、（実施例１４）のプラスミド＃１２の搭載遺伝子のうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を削除し、ピューロマイシン耐性遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９．１）で置き換えた以外は、（実施例１４）に記載された方法で作製した。
この５個の外来遺伝子を、ｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番で搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃３（図１６）に搭載して、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１１を作製した。さらに、このステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のＸｍａＩ部位に、コドン最適化したＲＩＧ－ＩＣを含む遺伝子カセット（配列番号８３）、コドン最適化したセンダイウイルス・Ｖタンパク質のＣ末端領域を含む遺伝子カセット（配列番号８４）、コドン最適化したプロテオソームの構成成分であるＰＳＭＡ７を含む遺伝子カセット（配列番号８５）を挿入して、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１２、＃１３、＃１４を作製した。また、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１５は、ｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣ遺伝子のうちｈＰｏｌＳ遺伝子の一部を最適化していないセンダイウイルスＺ株のＰ遺伝子と置き換えて（配列番号８６）、Ｖタンパク質が発現するようにしたものである。
これらのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を含む細胞から実施例８に従ってステルス型ＲＮＡベクターを作製し、ヒト由来２９３細胞に導入して、インターフェロン誘導能を測定した。図１９では、代表例としてステルス型ＲＮＡベクター＃１１と＃１２の比較を行ったが、ＲＩＧ－ＩＣ遺伝子を追加することにより、ステルス型ＲＮＡベクターで残存しているインターフェロン・ベータの誘導がほぼ完全に抑制されることが示された。
【0105】
（実施例１６）Ｎタンパク質とＣタンパク質の発現効率の変化がステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系に搭載された外来遺伝子の発現に与える影響の解析（図２０参照）
ｐＧＬ４．１２（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２４）がコードしているホタル・ルシフェラーゼｃＤＮＡの翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の上流に、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８に対応するＲＮＡ配列を挿入し、ＣＭＶプロモーターを使ってＨｅＬａ細胞で発現させて、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使ってルシフェラーゼの活性を調べた（図２０）。その結果、本来の翻訳開始コドンの上流に別の開始コドンをアウトフレームに置くと本来のタンパク質と翻訳配列がずれ、翻訳効率が低下することがわかった。
次に、ｈＮ ｍＲＮＡとｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側の塩基配列を改変したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８の遺伝子発現の能力を調べた。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６では、ｈＮ ｍＲＮＡとｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の５’上流側が、翻訳効率が最も高いとされるいわゆる「Ｋｏｚａｋ配列（配列番号５７）」である。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃７では、ｈＮ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は「Ｋｏｚａｋ配列（配列番号５７）」（非特許文献６０）、ｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が２３％に下がる配列番号５９の塩基配列に置き換えられている。またステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃８では、ｈＮ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が４０％に下がる配列番号５８の塩基配列、ｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が２３％に下がる配列番号５９の塩基配列に置き換えられている。この実験では、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８を安定に保持しているＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞において、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使ってルシフェラーゼの活性を調べた（図２０）。
ｐＧＬ４．１２（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ７３８２２４）がコードしているホタル・ルシフェラーゼｃＤＮＡの翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の上流に、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８に対応するＲＮＡ配列を挿入し、ＣＭＶプロモーターを使ってＨｅＬａ細胞で発現させて、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使ってルシフェラーゼの活性を調べた（図２０）。その結果、本来の翻訳開始コドンの上流に別の開始コドンをアウトフレームに置くと本来のタンパク質と翻訳配列がずれ、翻訳効率が低下することがわかった。
次に、ｈＮ ｍＲＮＡとｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側の塩基配列を改変したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８の遺伝子発現の能力を調べた。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６では、ｈＮ ｍＲＮＡとｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の５’上流側が、翻訳効率が最も高いとされるいわゆる「Ｋｏｚａｋ配列（配列番号５７）」である。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃７では、ｈＮ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は「Ｋｏｚａｋ配列（配列番号５７）」（非特許文献６０）、ｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が２３％に下がる配列番号５９の塩基配列に置き換えられている。またステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃８では、ｈＮ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が４０％に下がる配列番号５８の塩基配列、ｈＣ ｍＲＮＡの翻訳開始コドンの５’上流側は翻訳効率が２３％に下がる配列番号５９の塩基配列に置き換えられている。この実験では、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６、＃７、＃８を安定に保持しているＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞において、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使ってルシフェラーゼの活性を調べた（図２０）。
【0106】
（実施例１７）５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１６、＃１７の作製（図２１）
ｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番で搭載し、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１１は（実施例１５）で記述した。このベクターのｈＣ遺伝子は、５’側非翻訳領域の配列を改変して翻訳効率を２３％に下げてある（図２１）。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１６は、＃１１からｈＣ遺伝子を除いたものである。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１７は、＃１１のｈＣ遺伝子の５’非翻訳配列をＫｏｚａｋ配列にして翻訳効率を１００％としたものである。
図２１で示したＥＧＦＰの発現からわかるように、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の遺伝子発現レベルはｈＣ遺伝子の翻訳効率を変えることで調節することができる。また、ｈＣ遺伝子はステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成に必須の要素ではないが、ｈＣ遺伝子が無いと外来遺伝子の発現が非常に強くなるため、細胞の増殖が抑制される。このため、ｈＣ遺伝子をある程度発現させることで実用的なレベルの遺伝子発現を得ることが現実的である。
ｈＮ、ｈＣ、ｈＰｏｌＳの３つの遺伝子をｈＮ－ｈＰｏｌＳ－ｈＣの順番で搭載し、５個の外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１１は（実施例１５）で記述した。このベクターのｈＣ遺伝子は、５’側非翻訳領域の配列を改変して翻訳効率を２３％に下げてある（図２１）。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１６は、＃１１からｈＣ遺伝子を除いたものである。ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１７は、＃１１のｈＣ遺伝子の５’非翻訳配列をＫｏｚａｋ配列にして翻訳効率を１００％としたものである。
図２１で示したＥＧＦＰの発現からわかるように、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の遺伝子発現レベルはｈＣ遺伝子の翻訳効率を変えることで調節することができる。また、ｈＣ遺伝子はステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系の再構成に必須の要素ではないが、ｈＣ遺伝子が無いと外来遺伝子の発現が非常に強くなるため、細胞の増殖が抑制される。このため、ｈＣ遺伝子をある程度発現させることで実用的なレベルの遺伝子発現を得ることが現実的である。
【0107】
（実施例１８）ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系のゲノム３’側にあるパッケージングシグナルがベクター粒子産生に与える影響の解析（図２２参照）
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃９は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６（図２０）からゲノムＲＮＡ３’側の配列Ｄ（配列番号１７）を欠失したものである。また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１０は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃７（図２０）からゲノムＲＮＡ３’側の配列Ｄ（配列番号１７）を欠失したものである。これらのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を安定に保持しているＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞に、（実施例５）に記した方法でＭ、Ｆ、ＨＮの各タンパク質を発現し、上清に回収されるステルス型ＲＮＡベクターの遺伝子導入能を、ＬＬＣＭＫ２細胞を用いた抗ＮＰタンパク質抗体による間接蛍光抗体法で検定した（非特許文献７）。
さらに、この１８塩基の配列を（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列から任意に選んで置換してみた（図２の（５）（配列番号７５））ところ、粒子化効率に変化がないことを確認した（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
このことから、ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの１８塩基長又はその一部の長さの領域が、マイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージングに必須であると考えることができる。いずれにしても、この位置の１８塩基長又はその一部の長さの領域は、マイナス一本鎖ＲＮＡを鋳型とした転写と複製には必須ではないが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な「パッケージング・シグナル領域」であるといえる。
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃９は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６（図２０）からゲノムＲＮＡ３’側の配列Ｄ（配列番号１７）を欠失したものである。また、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃１０は、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃７（図２０）からゲノムＲＮＡ３’側の配列Ｄ（配列番号１７）を欠失したものである。これらのステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を安定に保持しているＢＨＫ／Ｔ７／１５１Ｍ（ＳＥ）細胞に、（実施例５）に記した方法でＭ、Ｆ、ＨＮの各タンパク質を発現し、上清に回収されるステルス型ＲＮＡベクターの遺伝子導入能を、ＬＬＣＭＫ２細胞を用いた抗ＮＰタンパク質抗体による間接蛍光抗体法で検定した（非特許文献７）。
さらに、この１８塩基の配列を（表１）に挙げられているＨｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子由来ｍＲＮＡの部分配列から任意に選んで置換してみた（図２の（５）（配列番号７５））ところ、粒子化効率に変化がないことを確認した（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
このことから、ゲノム３’末端から９７～１１４塩基目までの１８塩基長又はその一部の長さの領域が、マイナス一本鎖ＲＮＡにおける粒子化のためのパッケージングに必須であると考えることができる。いずれにしても、この位置の１８塩基長又はその一部の長さの領域は、マイナス一本鎖ＲＮＡを鋳型とした転写と複製には必須ではないが、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系がウイルス様粒子に取り込まれるために必須な「パッケージング・シグナル領域」であるといえる。
【0108】
（実施例１９）ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系を保持しているＨｅＬａ細胞をｓｉＲＮＡで処理した時のルシフェラーゼ活性の経時変化（図２３参照）
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６（図２０）からステルス型ＲＮＡベクター＃６を作製し、ＨｅＬａ細胞に遺伝子導入してハイグロマイシンＢで選択することによりＨｅＬａ／＃３細胞株を樹立した。ＨｅＬａ／＃３細胞を１．０ × １０４ ／ｗｅｌｌになるように４８ ｗｅｌｌ プレートに播種し、翌日、最終濃度１００ ｎＭになるようにＰｏｌＬ遺伝子の標的配列（配列番号４６）を標的としたｓｉＲＮＡを導入試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）と混合して導入した。ルシフェラーゼ活性を経時的に測定した結果、４回の独立した実験でいずれも、１０日で約０．１％にまでルシフェラーゼの活性が抑制され、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系が効率よく細胞から除去されていることが明らかになった。
ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系＃６（図２０）からステルス型ＲＮＡベクター＃６を作製し、ＨｅＬａ細胞に遺伝子導入してハイグロマイシンＢで選択することによりＨｅＬａ／＃３細胞株を樹立した。ＨｅＬａ／＃３細胞を１．０ × １０４ ／ｗｅｌｌになるように４８ ｗｅｌｌ プレートに播種し、翌日、最終濃度１００ ｎＭになるようにＰｏｌＬ遺伝子の標的配列（配列番号４６）を標的としたｓｉＲＮＡを導入試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）と混合して導入した。ルシフェラーゼ活性を経時的に測定した結果、４回の独立した実験でいずれも、１０日で約０．１％にまでルシフェラーゼの活性が抑制され、ステルス型ＲＮＡ遺伝子発現系が効率よく細胞から除去されていることが明らかになった。
【0109】
（実施例２０）大きな遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターの作製（図２４参照）
各種外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターの作製は、（実施例１）～（実施例２）と同様に２つずつの遺伝子から「転写カセット」を製造し、（実施例３）～（実施例５）と同様に「転写カセット」を順次連結し、（実施例６）若しくは（実施例７）及び（実施例８）と同様の方法で作製できる。このような大きな外来遺伝子として搭載可能な外来遺伝子の名称とその塩基配列は以下のとおりである。ヒトＫＬＦ４：配列番号６０、ヒトＯＣＴ４：配列番号６１、ヒトＳＯＸ２：配列番号６２、ヒトｃ－Ｍｙｃ：配列番号６３、ヒトＢＲＧ１：配列番号６４、ヒトＢＡＦ１５５：配列番号６５、ヒト免疫グロブリンＧ・Ｈ鎖：配列番号６６、ヒト免疫グロブリンＧ・Ｌ鎖：配列番号６７、ヒト免疫グロブリンＭ ｃｌｏｎｅ ２Ｇ９・Ｈ鎖：配列番号６８、ヒト免疫グロブリンＭ ｃｌｏｎｅ ２Ｇ９・Ｌ鎖：配列番号６９、ヒト免疫グロブリンＭ・Ｊ鎖：配列番号７０、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子：配列番号７１、ヒト・ジストロフィン：配列番号７２。
これらの遺伝子を外来遺伝子として担持したＲＮＡ発現系は、上記各実施例に記載された手順に準じた手法で目的の細胞に導入することができる。そして、外来遺伝子を同一細胞において同時に複数個発現させることにより、細胞リプログラミング等、導入細胞に対して所望の変更を加えることが可能となる。
各種外来遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターの作製は、（実施例１）～（実施例２）と同様に２つずつの遺伝子から「転写カセット」を製造し、（実施例３）～（実施例５）と同様に「転写カセット」を順次連結し、（実施例６）若しくは（実施例７）及び（実施例８）と同様の方法で作製できる。このような大きな外来遺伝子として搭載可能な外来遺伝子の名称とその塩基配列は以下のとおりである。ヒトＫＬＦ４：配列番号６０、ヒトＯＣＴ４：配列番号６１、ヒトＳＯＸ２：配列番号６２、ヒトｃ－Ｍｙｃ：配列番号６３、ヒトＢＲＧ１：配列番号６４、ヒトＢＡＦ１５５：配列番号６５、ヒト免疫グロブリンＧ・Ｈ鎖：配列番号６６、ヒト免疫グロブリンＧ・Ｌ鎖：配列番号６７、ヒト免疫グロブリンＭ ｃｌｏｎｅ ２Ｇ９・Ｈ鎖：配列番号６８、ヒト免疫グロブリンＭ ｃｌｏｎｅ ２Ｇ９・Ｌ鎖：配列番号６９、ヒト免疫グロブリンＭ・Ｊ鎖：配列番号７０、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子：配列番号７１、ヒト・ジストロフィン：配列番号７２。
これらの遺伝子を外来遺伝子として担持したＲＮＡ発現系は、上記各実施例に記載された手順に準じた手法で目的の細胞に導入することができる。そして、外来遺伝子を同一細胞において同時に複数個発現させることにより、細胞リプログラミング等、導入細胞に対して所望の変更を加えることが可能となる。
【0110】
（実施例２１）６個の初期化遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクターによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の誘導（図２５）
６個以上のの遺伝子を搭載して確実に発現することができるというステルス型ＲＮＡベクターの特徴は、ヒトの体細胞を初期化してｉＰＳ細胞に転換するといった細胞リプログラミングで特に有効であると考えられる。そこで、ヒト人工多能性幹細胞を作るための方法として最初に報告されたＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの初期化遺伝子の組み合わせ（特許文献１、非特許文献１）に、補完的な機能を持つ初期化遺伝子ＮＡＮＯＧとＬＩＮ２８（特許文献２、非特許文献２）を追加して、合計６個の初期化遺伝子を同時に発現するステルス型ＲＮＡベクターを作製し、これまでに報告されているｉＰＳ細胞の作製技術の中で最も初期化効率が高い、「４個の初期化遺伝子（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ）を同時に搭載した持続発現型センダイウイルスベクター」（特許文献３、特許文献４、非特許文献７）（図２５Ａ）との間で、細胞の初期化活性を比較した。
６個の初期化遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃２３（図２５Ｂ）は、実施例１４に示した方法を用いてヒトＫＬＦ４（配列番号６０）、ヒトＯＣＴ４（配列番号６１）、ヒトＳＯＸ２（配列番号６２）、ヒトｃ－ＭＹＣ（配列番号６３）、ヒトＮＡＮＯＧ（配列番号８７）、ヒトＬＩＮ２８（配列番号８８）をこの順番で結合し、図１６のステルス型ＲＮＡベクター＃３に組み込んで、実施例６および実施例８に従って作製した。
ｉＰＳ細胞の作製は、特許文献３に準じて行った。具体的には、ヒト胎児由来線維芽細胞であるＴＩＧ３細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．０ ｘ １０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、翌日にＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを搭載した持続発現用センダイウイルスベクター（図２５Ａ）、及びＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８を搭載したステルス型ＲＮＡベクター（図２５Ｂ）をそれぞれＭＯＩ （Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ） ＝ ３の条件で培地中に加え、室温で２時間放置した後に３７℃で一晩培養することによって感染させた。マイトマイシンＣ処理をしたＭＥＦをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュ上に準備し、上記ベクター感染細胞をその上に蒔いて、ヒト多能性幹細胞用培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ， Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）中で培養した。遺伝子導入後１１日目に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＴＲＡ－１－６０抗原抗体（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色し、１ｘ１０４個のＴＩＧ－３細胞から出現したＴＲＡ－１－６０陽性のｉＰＳ細胞のクローン数を数えた（図２５Ｃ）。その結果、４因子搭載ベクターによって出現したｉＰＳ細胞は８５クローン（初期化効率０．８５％）であったのに対し、６因子搭載ベクターでは４２９０クローン（初期化効率４２．９％）のｉＰＳ細胞クローンが出現し、６個の遺伝子を同時に搭載したステルス型ＲＮＡベクターの有効性が示された。なお、この実施例で使用した遺伝子の合計塩基長は７．０ ｋｂとなり、従来のＲＮＡベクターを使った方法では実現できないサイズである。
６個以上のの遺伝子を搭載して確実に発現することができるというステルス型ＲＮＡベクターの特徴は、ヒトの体細胞を初期化してｉＰＳ細胞に転換するといった細胞リプログラミングで特に有効であると考えられる。そこで、ヒト人工多能性幹細胞を作るための方法として最初に報告されたＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣの４つの初期化遺伝子の組み合わせ（特許文献１、非特許文献１）に、補完的な機能を持つ初期化遺伝子ＮＡＮＯＧとＬＩＮ２８（特許文献２、非特許文献２）を追加して、合計６個の初期化遺伝子を同時に発現するステルス型ＲＮＡベクターを作製し、これまでに報告されているｉＰＳ細胞の作製技術の中で最も初期化効率が高い、「４個の初期化遺伝子（ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ）を同時に搭載した持続発現型センダイウイルスベクター」（特許文献３、特許文献４、非特許文献７）（図２５Ａ）との間で、細胞の初期化活性を比較した。
６個の初期化遺伝子を搭載したステルス型ＲＮＡベクター＃２３（図２５Ｂ）は、実施例１４に示した方法を用いてヒトＫＬＦ４（配列番号６０）、ヒトＯＣＴ４（配列番号６１）、ヒトＳＯＸ２（配列番号６２）、ヒトｃ－ＭＹＣ（配列番号６３）、ヒトＮＡＮＯＧ（配列番号８７）、ヒトＬＩＮ２８（配列番号８８）をこの順番で結合し、図１６のステルス型ＲＮＡベクター＃３に組み込んで、実施例６および実施例８に従って作製した。
ｉＰＳ細胞の作製は、特許文献３に準じて行った。具体的には、ヒト胎児由来線維芽細胞であるＴＩＧ３細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．０ ｘ １０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、翌日にＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを搭載した持続発現用センダイウイルスベクター（図２５Ａ）、及びＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８を搭載したステルス型ＲＮＡベクター（図２５Ｂ）をそれぞれＭＯＩ （Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ） ＝ ３の条件で培地中に加え、室温で２時間放置した後に３７℃で一晩培養することによって感染させた。マイトマイシンＣ処理をしたＭＥＦをフィーダー細胞として、ゼラチンコートしたディッシュ上に準備し、上記ベクター感染細胞をその上に蒔いて、ヒト多能性幹細胞用培地ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ， Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）中で培養した。遺伝子導入後１１日目に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＴＲＡ－１－６０抗原抗体（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色し、１ｘ１０４個のＴＩＧ－３細胞から出現したＴＲＡ－１－６０陽性のｉＰＳ細胞のクローン数を数えた（図２５Ｃ）。その結果、４因子搭載ベクターによって出現したｉＰＳ細胞は８５クローン（初期化効率０．８５％）であったのに対し、６因子搭載ベクターでは４２９０クローン（初期化効率４２．９％）のｉＰＳ細胞クローンが出現し、６個の遺伝子を同時に搭載したステルス型ＲＮＡベクターの有効性が示された。なお、この実施例で使用した遺伝子の合計塩基長は７．０ ｋｂとなり、従来のＲＮＡベクターを使った方法では実現できないサイズである。
【0111】
（実施例２２）ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）のＨ鎖・Ｌ鎖・Ｊ鎖の同時発現によるヒト免疫グロブリンＭの産生（図２６）
バイオ医薬品製造の分野で、複数のポリペプチドを同時に発現させる必要がある代表的な製品としては抗体医薬品がある。Ｈ鎖とＬ鎖を発現して製造できる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の商業生産技術は既に確立しているが、Ｈ鎖・Ｌ鎖・Ｊ鎖をコードする３つの遺伝子を同時に発現させる必要があるＩｇＭの製造は現在でも容易では無い（非特許文献８４）。ＩｇＭの中には、ＩｇＧには無い強い抗腫瘍活性を持つ抗体が存在することが知られており（非特許文献８５）、ＩｇＭの製造法の確立は産業的な意義が大きい。そこで、ヒトＩｇＭのＨ鎖・Ｌ鎖・Ｊ鎖をコードする３つの遺伝子をステルス型ＲＮＡベクターに搭載して一度に発現させることにより、分子量９５０ｋ ＤａｌｔｏｎのＩｇＭの製造を試みた。
実施例２２では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞と反応するヒト・モノクローナルＩｇＭ抗体９Ｆ１１と２Ｇ９（非特許文献８６）を材料として選び、９Ｆ１１抗体のＨ鎖遺伝子（配列番号８９）とＬ鎖遺伝子（配列番号９０）、Ｊ鎖遺伝子（配列番号７０）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（配列番号５０）、または２Ｇ９抗体のＨ鎖遺伝子（配列番号６８）とＬ鎖遺伝子（配列番号６９）、Ｊ鎖遺伝子（配列番号７０）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（配列番号５０）を実施例１２に従ってこの順番で連結し、図２０のステルス型ＲＮＡベクター＃８に搭載して、ステルス型ＲＮＡベクター＃２３および＃２０を得た。次に、ＭＯＩ＝３の条件で、タンパク質製造用の無血清培地Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に馴化したハムスター由来ＢＨＫ細胞に遺伝子導入し、ハイグロマイシンＢを１００ μｇ／ｍＬ加えて選択した。新しい培地交換後、２４時間で回収し、その培養上清を回収した。
培養上清中のヒトＩｇＭの量を抗ヒトＩｇＭ・ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で定量したところ、２Ｇ９の遺伝子セットを導入した場合は９．１７ μｇ／ｍＬ、９Ｆ１１の遺伝子セットを導入した場合は１１．１５ μｇ／ｍＬのＩｇＭが検出された。遺伝子を導入していないＢＨＫ細胞の培養上清中のＩｇＭは検出限界以下であった。これを細胞１個あたり・１日あたりの発現効率（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）に換算すると、２Ｇ９は１６．３８ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、９Ｆ１１は１９．９１ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった（図２６）。
次に、３００ ｎｇおよび１００ ｎｇのＩｇＭを含む培養上清を、４ － ２０％ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析し、ＢｉｏＳａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｇ２５０ ｓｔａｉｎ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色した。その結果、非還元状態では、天然のヒトＩｇＭと同じ９７０ｋダルトンの位置に、また還元状態では分子量７５ｋダルトンのＨ鎖と２５ｋダルトンのＬ鎖の位置にバンドが検出され、天然と同じ２１本のポリペプチドが結合したＩｇＭ分子ができていることが明らかになった。
非特許文献８４には、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞とＨＥＫ２９３細胞を用いて、メソトレキセートによる遺伝子増幅した結果得られたＩｇＭ安定発現細胞４クローンでの解析結果が記述されているが、発現効率は２５．００， ３．５９， ４．６０， ０．２１ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。このことから、ステルス型ＲＮＡベクターを使用すれば、数ヶ月を要する遺伝子増幅によって達成したＩｇＭの発現と同等もしくはより高いレベルの生産を容易に実現できることが明らかになった。
バイオ医薬品製造の分野で、複数のポリペプチドを同時に発現させる必要がある代表的な製品としては抗体医薬品がある。Ｈ鎖とＬ鎖を発現して製造できる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の商業生産技術は既に確立しているが、Ｈ鎖・Ｌ鎖・Ｊ鎖をコードする３つの遺伝子を同時に発現させる必要があるＩｇＭの製造は現在でも容易では無い（非特許文献８４）。ＩｇＭの中には、ＩｇＧには無い強い抗腫瘍活性を持つ抗体が存在することが知られており（非特許文献８５）、ＩｇＭの製造法の確立は産業的な意義が大きい。そこで、ヒトＩｇＭのＨ鎖・Ｌ鎖・Ｊ鎖をコードする３つの遺伝子をステルス型ＲＮＡベクターに搭載して一度に発現させることにより、分子量９５０ｋ ＤａｌｔｏｎのＩｇＭの製造を試みた。
実施例２２では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞と反応するヒト・モノクローナルＩｇＭ抗体９Ｆ１１と２Ｇ９（非特許文献８６）を材料として選び、９Ｆ１１抗体のＨ鎖遺伝子（配列番号８９）とＬ鎖遺伝子（配列番号９０）、Ｊ鎖遺伝子（配列番号７０）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（配列番号５０）、または２Ｇ９抗体のＨ鎖遺伝子（配列番号６８）とＬ鎖遺伝子（配列番号６９）、Ｊ鎖遺伝子（配列番号７０）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（配列番号５０）を実施例１２に従ってこの順番で連結し、図２０のステルス型ＲＮＡベクター＃８に搭載して、ステルス型ＲＮＡベクター＃２３および＃２０を得た。次に、ＭＯＩ＝３の条件で、タンパク質製造用の無血清培地Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に馴化したハムスター由来ＢＨＫ細胞に遺伝子導入し、ハイグロマイシンＢを１００ μｇ／ｍＬ加えて選択した。新しい培地交換後、２４時間で回収し、その培養上清を回収した。
培養上清中のヒトＩｇＭの量を抗ヒトＩｇＭ・ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で定量したところ、２Ｇ９の遺伝子セットを導入した場合は９．１７ μｇ／ｍＬ、９Ｆ１１の遺伝子セットを導入した場合は１１．１５ μｇ／ｍＬのＩｇＭが検出された。遺伝子を導入していないＢＨＫ細胞の培養上清中のＩｇＭは検出限界以下であった。これを細胞１個あたり・１日あたりの発現効率（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）に換算すると、２Ｇ９は１６．３８ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ、９Ｆ１１は１９．９１ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった（図２６）。
次に、３００ ｎｇおよび１００ ｎｇのＩｇＭを含む培養上清を、４ － ２０％ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析し、ＢｉｏＳａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｇ２５０ ｓｔａｉｎ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色した。その結果、非還元状態では、天然のヒトＩｇＭと同じ９７０ｋダルトンの位置に、また還元状態では分子量７５ｋダルトンのＨ鎖と２５ｋダルトンのＬ鎖の位置にバンドが検出され、天然と同じ２１本のポリペプチドが結合したＩｇＭ分子ができていることが明らかになった。
非特許文献８４には、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞とＨＥＫ２９３細胞を用いて、メソトレキセートによる遺伝子増幅した結果得られたＩｇＭ安定発現細胞４クローンでの解析結果が記述されているが、発現効率は２５．００， ３．５９， ４．６０， ０．２１ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。このことから、ステルス型ＲＮＡベクターを使用すれば、数ヶ月を要する遺伝子増幅によって達成したＩｇＭの発現と同等もしくはより高いレベルの生産を容易に実現できることが明らかになった。
【0112】
（実施例２３）４個のｃＤＮＡを同時発現することによるヒト二重特異性抗体の産生（図２７）
２つの異なる抗原を認識できる二重特異性抗体は、これまでの抗体医薬品の可能性を大幅に拡張する分子として、バイオ医薬品の分野で最近注目されている。二重特異性抗体は、抗原Ａを認識するＨ鎖（Ａ）とＬ鎖（Ａ）と、抗原Ｂを認識するＨ鎖（Ｂ）とＬ鎖（Ｂ）からなる４量体で、Ｈ鎖（Ａ）とＬ鎖（Ｂ）あるいはＨ鎖（Ｂ）とＬ鎖（Ａ）が結合しにくいように変異を導入し、かつＨ鎖（Ａ）同士あるいはＨ鎖（Ｂ）同士の結合よりもＨ鎖（Ａ）とＨ鎖（Ｂ）の結合が強くなるような変異を導入した上で、Ｈ鎖（Ａ）・Ｌ鎖（Ａ）・Ｈ鎖（Ｂ）・Ｌ鎖（Ｂ）をコードする４個の遺伝子を同時に発現させて作製する（非特許文献８７）。このような４個の遺伝子を同時に細胞に導入した後、遺伝子増幅して４個のポリペプチドが同時に高発現する細胞株を得ることは極めて難しいため、通常は一過性の遺伝子発現で生産されている。
本実施例では、非特許文献８７に記述されている二重特異性抗体のうち、ＨＥＲ２と上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を同時に認識するＨＥＤｅｓｉｇｎＬＫの作製を試みた。
非特許文献８７で開示されている抗ＨＥＲ２抗体のＨ鎖ＨＣ１（ＶＨＶＲＤ１ＣＨ１ＣＲＤ２）遺伝子（配列番号９１）およびＬ鎖ＬＣ１（ＶＬＶＲＤ１ＣλＣＲＤ２）遺伝子（配列番号９２）、および抗ＥＧＦＲ抗体のＨ鎖ＨＣ２（ＶＨＶＲＤ２ＣＨ１ＷＴ）遺伝子（配列番号９３）とＬ鎖ＬＣ２（ＶＬＶＲＤ２ＣκＷＴ）遺伝子（配列番号９４）を、ＥＧＦＰ遺伝子およびハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と共に、実施例１４に従って連結し、ステルス型ＲＮＡベクター＃８（図２０）に搭載してステルス型ＲＮＡベクター＃２４を作製した。また、比較のために、抗ＨＥＲ２抗体のＨ鎖とＬ鎖のみを発現するベクター＃２５（図２７Ｂ）および抗ＥＧＦＲ抗体のＨ鎖とＬ鎖のみを発現するベクター＃２６（図２７Ｃ）を、実施例１２に従って作製した。
これらのベクターを使い、実施例２２の方法でＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に馴化したハムスター由来ＢＨＫ細胞に遺伝子導入し、安定発現細胞の培養上清中のヒトＩｇＧの量を抗ヒトＩｇＧ・ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で定量した。その結果、４量体を作る活性の低いＨＣ１とＬＣ１だけの組み合わせ（１２．９３ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）や、ＨＣ２とＬＣ２の組み合わせ（１４．０２ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）に比べて、ＨＣ１・ＬＣ１・ＨＣ２・ＬＣ２の４個の遺伝子を同時に搭載した場合は有意に高い（３７．４５ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）抗体産生が観察され、二重特異性抗体が効率良く産生されていることが示唆された。また、この発現レベルは、遺伝子増幅を使ってＣＨＯ細胞で樹立する一般的な細胞株での遺伝子発現レベル（最大で約９０ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）（非特許文献８８）に匹敵する。このことから、従来の方法では安定発現細胞株を得ることが困難であった二重特異性抗体を安定に産生するための方法として、ステルス型ＲＮＡベクターが非常に有効であることが示唆された。なお、この実施例で使用した遺伝子の合計塩基長は６．７ ｋ塩基となり、従来のＲＮＡベクターを使った方法では実現できないサイズである。
２つの異なる抗原を認識できる二重特異性抗体は、これまでの抗体医薬品の可能性を大幅に拡張する分子として、バイオ医薬品の分野で最近注目されている。二重特異性抗体は、抗原Ａを認識するＨ鎖（Ａ）とＬ鎖（Ａ）と、抗原Ｂを認識するＨ鎖（Ｂ）とＬ鎖（Ｂ）からなる４量体で、Ｈ鎖（Ａ）とＬ鎖（Ｂ）あるいはＨ鎖（Ｂ）とＬ鎖（Ａ）が結合しにくいように変異を導入し、かつＨ鎖（Ａ）同士あるいはＨ鎖（Ｂ）同士の結合よりもＨ鎖（Ａ）とＨ鎖（Ｂ）の結合が強くなるような変異を導入した上で、Ｈ鎖（Ａ）・Ｌ鎖（Ａ）・Ｈ鎖（Ｂ）・Ｌ鎖（Ｂ）をコードする４個の遺伝子を同時に発現させて作製する（非特許文献８７）。このような４個の遺伝子を同時に細胞に導入した後、遺伝子増幅して４個のポリペプチドが同時に高発現する細胞株を得ることは極めて難しいため、通常は一過性の遺伝子発現で生産されている。
本実施例では、非特許文献８７に記述されている二重特異性抗体のうち、ＨＥＲ２と上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を同時に認識するＨＥＤｅｓｉｇｎＬＫの作製を試みた。
非特許文献８７で開示されている抗ＨＥＲ２抗体のＨ鎖ＨＣ１（ＶＨＶＲＤ１ＣＨ１ＣＲＤ２）遺伝子（配列番号９１）およびＬ鎖ＬＣ１（ＶＬＶＲＤ１ＣλＣＲＤ２）遺伝子（配列番号９２）、および抗ＥＧＦＲ抗体のＨ鎖ＨＣ２（ＶＨＶＲＤ２ＣＨ１ＷＴ）遺伝子（配列番号９３）とＬ鎖ＬＣ２（ＶＬＶＲＤ２ＣκＷＴ）遺伝子（配列番号９４）を、ＥＧＦＰ遺伝子およびハイグロマイシンＢ耐性遺伝子と共に、実施例１４に従って連結し、ステルス型ＲＮＡベクター＃８（図２０）に搭載してステルス型ＲＮＡベクター＃２４を作製した。また、比較のために、抗ＨＥＲ２抗体のＨ鎖とＬ鎖のみを発現するベクター＃２５（図２７Ｂ）および抗ＥＧＦＲ抗体のＨ鎖とＬ鎖のみを発現するベクター＃２６（図２７Ｃ）を、実施例１２に従って作製した。
これらのベクターを使い、実施例２２の方法でＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に馴化したハムスター由来ＢＨＫ細胞に遺伝子導入し、安定発現細胞の培養上清中のヒトＩｇＧの量を抗ヒトＩｇＧ・ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で定量した。その結果、４量体を作る活性の低いＨＣ１とＬＣ１だけの組み合わせ（１２．９３ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）や、ＨＣ２とＬＣ２の組み合わせ（１４．０２ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）に比べて、ＨＣ１・ＬＣ１・ＨＣ２・ＬＣ２の４個の遺伝子を同時に搭載した場合は有意に高い（３７．４５ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）抗体産生が観察され、二重特異性抗体が効率良く産生されていることが示唆された。また、この発現レベルは、遺伝子増幅を使ってＣＨＯ細胞で樹立する一般的な細胞株での遺伝子発現レベル（最大で約９０ ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）（非特許文献８８）に匹敵する。このことから、従来の方法では安定発現細胞株を得ることが困難であった二重特異性抗体を安定に産生するための方法として、ステルス型ＲＮＡベクターが非常に有効であることが示唆された。なお、この実施例で使用した遺伝子の合計塩基長は６．７ ｋ塩基となり、従来のＲＮＡベクターを使った方法では実現できないサイズである。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本発明は、人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）の作製を含むヒト細胞のリプログラミング、タンパク質医薬品の製造、巨大遺伝子を含む各種遺伝子による遺伝子治療、創薬標的分子の発現など、多くの産業分野で有用な技術である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２箇所のクロ－ニング部位Ａ、Ｂを有するDNAベースのタンデム型カセットであって、
当該タンデム型カセットは5’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれRNAに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないRNAとなる、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAである、
タンデム型カセット。
当該タンデム型カセットは5’末端側から順に（１）マルチマー化部位Ａ、（２）転写開始シグナルＡ、（３）非コード配列Ａ１、（４）クローニング部位Ａ、（５）非コード領域Ａ２、（６）転写終結シグナルＡ、（７）転写開始シグナルＢ、（８）非コード配列Ｂ１、（９）クローニング部位Ｂ、（１０）非コード領域Ｂ２、（１１）転写終結シグナルＢ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂにより構成されており、
前記（１）マルチマー化部位Ａ、及び（１２）マルチマー化部位Ｂは、それぞれ制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含み、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（２）転写開始シグナルＡ、及び（７）転写開始シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写開始シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（３）非コード配列Ａ１、（５）非コード領域Ａ２、（８）非コード配列Ｂ１、及び（１０）非コード領域Ｂ２は、それぞれRNAに転写された場合に宿主細胞の自然免疫機構に認識されないRNAとなる、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（４）クローニング部位Ａ、及び（９）クローニング部位Ｂは、それぞれ１以上の制限酵素認識配列及び／又は部位特異的組換え酵素認識配列を含む、互いに同一もしくは異なるDNAであり、
前記（６）転写終結シグナルＡ、及び（１１）転写終結シグナルＢは、それぞれRNAに転写された場合にRNA依存性RNA合成酵素が認識する転写終結シグナルを含む、互いに同一もしくは異なるDNAである、
タンデム型カセット。