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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022142169
(43)【公開日】2022-09-30
(54)【発明の名称】パラチロイドホルモンの測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220922BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20220922BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 F
G01N33/543 501A
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021042219
(22)【出願日】2021-03-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】小林 龍司
(57)【要約】
【課題】ＰＴＨの検出感度を向上させること。
【解決手段】パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）をサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体としてＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、又はＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出する。
【選択図】 図３
【解決手段】パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）をサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体としてＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、又はＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出する。
【選択図】 図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）をサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
【請求項2】
１次抗体として、ホールＰＴＨ（ｗＰＴＨ）の３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ＰＴＨをサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、ＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、ＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
【請求項5】
１次抗体として、ｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、パラチロイドホルモンの測定方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
副甲状腺から分泌されるホルモンに、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）がある。ＰＴＨは８４残基のアミノ酸からなるペプチドホルモンの一種であり、血中のカルシウム濃度などを調節する働きがある。しかし副甲状腺の腫瘍や腎不全、機能性副甲状腺のう胞などに罹患すると、このホルモンの血中濃度が異常になる（非特許文献１、非特許文献２）。そのためこれらの疾患を診断するためには、このホルモンの血中濃度を調べることが必要となっている。
【0003】
ＰＴＨは副甲状腺から血中へ分泌されるが、血液中には様々な分解酵素がある。そのためこのホルモンは、血液中でいくつかのフラグメントへ分解される。この分解産物のうち、Ｎ末端から数えて６番目までのアミノ酸残基が切断されたものはインタクトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）と呼ばれている（図１）。また酵素による分解を全く受けていないものについては、ホールＰＴＨ（ｗＰＴＨ）と呼ばれている（図１）。疾患の診断では主に、この２種類のＰＴＨの血中濃度が利用されている。
【0004】
ＰＴＨの血中濃度測定では通常、エピトープの異なる２種類の抗ＰＴＨ抗体（１次抗体・２次抗体）を用いたサンドイッチ法が利用されている（図２）。この方法ではまず、１次抗体が固相化されているところへ検体を加えて反応させる。その後これを洗浄し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素で標識された２次抗体（標識２次抗体）をここへ加える。そしてこれを再び洗浄し、固相に結合している標識２次抗体から出るシグナルを測定してその血中濃度を調べている。
【0005】
ＰＴＨの血中濃度は臨床上非常に重要な情報ではあるが、その測定系の構築は容易でない。特に血中のＰＴＨ濃度は非常に低いため、その検出には感度の良い測定系を構築する必要がある。ＰＴＨ測定系の構築では、反応時間や検体量、反応条件など様々な因子がその検出感度に影響を与える。しかしその検出感度に最も強い影響を与えるのは、このいずれでもない。ＰＴＨの検出感度は、使用する抗体の性能に最も強い影響を受ける。基本的には、ＰＴＨとの親和性が高い抗体を用いるほどその検出感度は高くなる。しかし、ＰＴＨとの親和性が高い抗体は容易に得られない。そのため感度良くＰＴＨを検出することは非常に難しく、これまで大きな課題となってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｄ Ｂ Ｅｎｄｒｅｓ， Ｒ Ｖｉｌｌａｕｅｖａ， Ｃ Ｆ Ｓｈａｒｐ Ｊｒ， Ｆ Ｒ Ｓｉｎｇｅｒ．（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｐａｒａｔｈｙｒｉｎ：ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ ａｎｄ ｈｙｐｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ． Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３７，１６２－１６８．
【非特許文献2】Ｒ Ｌｅｐａｇｅ， Ｓ Ｗｈｉｔｔｏｍ， Ｓ Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｇ Ｂａｈｓａｌｉ， Ｐ Ｄ‘Ａｍｏｕｒ．（１９９２）Ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｏｖｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ｆｏｒ ｉｎｔａｃｔ， ｍｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅ， ａｎｄ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐａｒａｔｈｙｒｉｎ ｉｎ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃａｌｃｅｍｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３８，２１２９－２１３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決しようとする課題は、ＰＴＨの検出感度を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下の通りである。
（１）パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）をサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
（２）１次抗体として、ホールＰＴＨ（ｗＰＴＨ）の３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（１）に記載の方法。
（３）１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＰＴＨをサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、ＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
（５）１次抗体として、ｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（４）に記載の方法。
（６）１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（４）又は（５）に記載の方法。
（１）パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）をサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
（２）１次抗体として、ホールＰＴＨ（ｗＰＴＨ）の３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（１）に記載の方法。
（３）１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＰＴＨをサンドイッチ法により測定する方法において、
・１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、ＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したもの、及び
・２次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、１次抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を標識化したもの
を検体中のＰＴＨと反応させ、
生成した免疫反応複合体である１次抗体－ＰＴＨ－２次抗体の標識を検出することを特徴とする方法。
（５）１次抗体として、ｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（４）に記載の方法。
（６）１次抗体として、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸のいずれかを特異的に認識する抗体を用いる、（４）又は（５）に記載の方法。
【0009】
以下、本発明を詳細に説明する。まず、第一の発明について説明する。
【0010】
第一の発明はＰＴＨの検出感度を向上させる方法に関するものであり、エピトープが異なる２種類以上の抗体を固相化して１次抗体として用いることを特徴とする（図３）。用いられる抗体はそれぞれエピトープが違っていれば特にその種類が限定されるものではなく、例えばＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹやこれらの混合物などを用いることができる。
【0011】
またこの抗体の由来についても特に限定されるものではなく、マウスやラット、ウサギ、ラクダ、サメ、アルパカ、ニワトリ、ダチョウ、ヤギ、ヒツジなどに由来するものやこれらの混合物を用いることができる。
【0012】
更にここで使われる抗体はモノクローナル抗体でもよければポリクローナル抗体でもよく、あるいはモノクローナル抗体の混合物であってもよい。またここで利用する抗体はＰＴＨと結合することができれば特にそのフォーマットが限定されるものでもなく、インタクトな抗体やＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂやこれらの類似物、そしてこれらの混合物であってもよい。更にここで利用される抗体はＰＴＨと結合する性質のある分子であれば特にその種類が限定されるものでもなく、アプタマー等のアフィニティ分子を含んでもよい。
【0013】
１次抗体に用いられる固相としては特に限定は無く、例えば、磁性微粒子や金コロイド、ポリスチレン等があげられる。
【0014】
２次抗体に用いられる標識としては特に限定は無く、例えば、アルカリホスファターゼ、ホーセラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素や、蛍光を発するタンパク質や化合物等があげられる。
【0015】
検体としては特に限定は無く、例えば血液、血漿、血清、尿等があげられる。
【0016】
次に第二の発明について説明する。第二の発明は、１次抗体として、ＰＴＨを特異的に認識する抗体であって、ＰＴＨの２か所以上のエピトープと結合しうる抗体を固定化したものを用いることに特徴がある。そのような抗体としては、例えばｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体、Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ（ＢｉＴＥｓ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉ－Ｆａｂ等があげられる（図４）。それ以外の点については、第二の発明は第一の発明と同様である。
【発明の効果】
【0017】
本発明により、ＰＴＨの検出感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＰＴＨのフラグメントに関する図である。
【図2】サンドイッチ法によってＰＴＨを検出する原理に関する図である。
【図3】エピトープが異なる２種類以上の抗体を１次抗体として用いてＰＴＨを検出する原理に関する図である。
【図4】ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体を１次抗体として用いてＰＴＨを検出する原理に関する図である。
【図5】ｗＰＴＨモノクローナル抗体を２次抗体として検量線を作成した図である。
【図6】ｉＰＴＨモノクローナル抗体を２次抗体として検量線を作成した図である。
【図7】ｗＰＴＨモノクローナル抗体を２次抗体とし、エピトープが異なる２種類の抗体を１次抗体として使用した際に、その混合比を変えるとＳ／Ｎ比にどのような影響がでるか調べた図である。
【図8】ｉＰＴＨモノクローナル抗体を２次抗体とし、エピトープが異なる２種類の抗体を１次抗体として使用した際に、その混合比を変えるとＳ／Ｎ比にどのような影響がでるか調べた図である。
【実施例0019】
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。尚、本実施例に使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。
ＰＢＳ（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
炭酸緩衝液（ｐＨ ９．６）
１２ｍＭ 炭酸ナトリウム
３８ｍＭ 炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ ７．４）
１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン
７．５ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
１％ スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
０．１％ スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ ジエタノールアミン
０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１０ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルリン酸
ビーズ洗浄液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン
７．５ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０。
ＰＢＳ（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
炭酸緩衝液（ｐＨ ９．６）
１２ｍＭ 炭酸ナトリウム
３８ｍＭ 炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ ７．４）
１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン
７．５ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
１％ スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
０．１％ スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ ジエタノールアミン
０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１０ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルリン酸
ビーズ洗浄液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン
７．５ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０。
【0020】
［実施例１］
（１）免疫抗原の調製
まず２０ｍｇのオブアルブミン（ＯＶＡ）を用意し、２ｍｌの超純水に溶かした。次に４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸 ３－スルフォ－Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステルナトリウム塩（ｓｕｌｆо－ＳＭＣＣ）を２０ｍｇ量り取り、４ｍｌの超純水に溶かした。その後これらの溶液を混ぜて室温で１時間静置し、反応させた。その後この溶液をＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ社）へ通して脱塩し、未反応のｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを除去した。
（１）免疫抗原の調製
まず２０ｍｇのオブアルブミン（ＯＶＡ）を用意し、２ｍｌの超純水に溶かした。次に４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸 ３－スルフォ－Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステルナトリウム塩（ｓｕｌｆо－ＳＭＣＣ）を２０ｍｇ量り取り、４ｍｌの超純水に溶かした。その後これらの溶液を混ぜて室温で１時間静置し、反応させた。その後この溶液をＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ社）へ通して脱塩し、未反応のｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを除去した。
【0021】
次にｗＰＴＨの３４番目から８４番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチドを用意した（ＰＴＨ３４－８４）。そしてこのペプチドを２０ｍｇ量り取り、５ｍｌのＰＢＳに溶かした。その後この溶液を先ほどＰＤ－１０で脱塩したＯＶＡ溶液に加えて室温で２時間静置し、ＰＴＨ３４－８４をＯＶＡに結合させた（ＯＶＡ＿ＰＴＨ３４－８４）。そしてこの溶液にＰＢＳを加え、液量が２０ｍｌとなるように調整した。その後この反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して４℃で透析し、未反応のペプチドを除去した。透析後は透析チューブの中からＯＶＡ＿ＰＴＨ３４－８４を回収し、免疫用の抗原として利用した。
【0022】
（２）実験動物への免疫
免疫動物としてマウス（雌、ＩＣＲ、４週齢）を用意した。次に先ほど調整したＯＶＡ＿ＰＴＨ３４－８４溶液とフロイントコンプリートアジュバンドを１：１の比で混ぜた。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるマウスの腹腔へ１００μｌ注入して免疫した。
免疫動物としてマウス（雌、ＩＣＲ、４週齢）を用意した。次に先ほど調整したＯＶＡ＿ＰＴＨ３４－８４溶液とフロイントコンプリートアジュバンドを１：１の比で混ぜた。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるマウスの腹腔へ１００μｌ注入して免疫した。
【0023】
初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、透析から回収したＯＶＡ＿ＰＴＨ３４－８４とフロイントインコンプリートアジュバンドを１：１の比で混ぜた。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液をマウスの腹腔へ１００μｌ注入して免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を週に１回のペースで７週間に渡り実施した。
【0024】
（３）細胞融合・スクリーニング
免疫後のマウスを安楽死させ、脾臓細胞を回収した。そしてこの細胞とミエローマ細胞とを２：１の比率で混ぜ、電気融合法で細胞融合を行った。電気融合が終了したら細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ウシ血清＋５％ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、脾臓細胞の細胞密度が６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにした。その後、この細胞懸濁液を３８４プレートへまき、３７℃、５％ＣＯ２の環境で１１日間培養した。培養終了後、プレート内の各ウェルから培養液を少量回収した。そして、ＰＴＨと強く結合する抗体が作られているウェルをＥＬＩＳＡ法によって下記の通り調べた。
免疫後のマウスを安楽死させ、脾臓細胞を回収した。そしてこの細胞とミエローマ細胞とを２：１の比率で混ぜ、電気融合法で細胞融合を行った。電気融合が終了したら細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ウシ血清＋５％ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、脾臓細胞の細胞密度が６．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにした。その後、この細胞懸濁液を３８４プレートへまき、３７℃、５％ＣＯ２の環境で１１日間培養した。培養終了後、プレート内の各ウェルから培養液を少量回収した。そして、ＰＴＨと強く結合する抗体が作られているウェルをＥＬＩＳＡ法によって下記の通り調べた。
【0025】
（Ａ）抗マウス抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）ｗＰＴＨを５ｎｇ／ｍｌとなるようにインキュベーション緩衝液へ溶かした。そしてこの溶液を５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ｗＰＴＨのＮ末端領域を認識する抗体にＡＬＰを標識したものを各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｇ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｈ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、ｗＰＴＨと強く結合する抗体のあるウェルを調べた。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）ｗＰＴＨを５ｎｇ／ｍｌとなるようにインキュベーション緩衝液へ溶かした。そしてこの溶液を５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ｗＰＴＨのＮ末端領域を認識する抗体にＡＬＰを標識したものを各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｇ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｈ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、ｗＰＴＨと強く結合する抗体のあるウェルを調べた。
【0026】
（４）クローニング
ｗＰＴＨと強く結合する抗体のあるウェルをいくつか選び、その中からそれぞれ細胞を回収した。そしてこれらの細胞をそれぞれ細胞培養用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ウシ血清）または細胞融合用培地に懸濁して３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。その後細胞の生育が確認できたら、それぞれの細胞について下記の通り限界希釈を行い、細胞を単クローン化した。
（Ａ）回収した細胞を、６．４ｍｌの細胞培養用培地または細胞融合用培地へ懸濁した。
（Ｂ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｃ）残された３．２ｍｌの細胞懸濁液に新たな培地を等量加え、よく懸濁した。
（Ｄ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
ｗＰＴＨと強く結合する抗体のあるウェルをいくつか選び、その中からそれぞれ細胞を回収した。そしてこれらの細胞をそれぞれ細胞培養用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ウシ血清）または細胞融合用培地に懸濁して３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。その後細胞の生育が確認できたら、それぞれの細胞について下記の通り限界希釈を行い、細胞を単クローン化した。
（Ａ）回収した細胞を、６．４ｍｌの細胞培養用培地または細胞融合用培地へ懸濁した。
（Ｂ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｃ）残された３．２ｍｌの細胞懸濁液に新たな培地を等量加え、よく懸濁した。
（Ｄ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
【0027】
（Ｅ）ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となるまで上記の希釈・分注操作を繰り返した。
（Ｆ）細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２の環境下におき、培養した。
（Ｇ）培養上清中に分泌された抗体とＰＴＨとの反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、ＥＬＩＳＡの条件は、スクリーニングの際に行ったＥＬＩＳＡと全く同じものを用いた。
（Ｈ）ｗＰＴＨと強く反応する抗体が含まれるウェルの中から、ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となっているものだけを選抜した。そして、これらのウェルを顕微鏡で観察し、細胞が単クローン化されていることを確認した。その後、このウェルから細胞を回収した。そしてこの細胞を新たな細胞培養用培地または細胞融合用培地へ懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養した。
（Ｆ）細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２の環境下におき、培養した。
（Ｇ）培養上清中に分泌された抗体とＰＴＨとの反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、ＥＬＩＳＡの条件は、スクリーニングの際に行ったＥＬＩＳＡと全く同じものを用いた。
（Ｈ）ｗＰＴＨと強く反応する抗体が含まれるウェルの中から、ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となっているものだけを選抜した。そして、これらのウェルを顕微鏡で観察し、細胞が単クローン化されていることを確認した。その後、このウェルから細胞を回収した。そしてこの細胞を新たな細胞培養用培地または細胞融合用培地へ懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養した。
【0028】
（５）エピトープの同定
まず２０ｍｇのオブアルブミン（ＯＶＡ）を用意し、２ｍｌの超純水に溶かした。次にｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを２０ｍｇ量り取り、４ｍｌの超純水に溶かした。その後これらの溶液を混ぜて室温で１時間静置し、反応させた。この溶液をＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ社）へ通して脱塩し、未反応のｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを除去した。
まず２０ｍｇのオブアルブミン（ＯＶＡ）を用意し、２ｍｌの超純水に溶かした。次にｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを２０ｍｇ量り取り、４ｍｌの超純水に溶かした。その後これらの溶液を混ぜて室温で１時間静置し、反応させた。この溶液をＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ社）へ通して脱塩し、未反応のｓｕｌｆо－ＳＭＣＣを除去した。
【0029】
次にｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチド（ＰＴＨ３７－５３）と、ｗＰＴＨの４６番目から６０番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチド（ＰＴＨ４６－６０）と、ｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチド（ＰＴＨ５３－６７）と、ｗＰＴＨの６０番目から７４番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチド（ＰＴＨ６０－７４）と、ｗＰＴＨの６７番目から８４番目までのアミノ酸で構成されているペプチドのＮ末端にシステインが導入されているペプチド（ＰＴＨ６７－８４）を用意した。そしてこれらのペプチドを４ｍｇずつ量り取り、それぞれ１ｍｌのＰＢＳに溶かした。次に先ほどＰＤ－１０で脱塩したＯＶＡ溶液を５等分し、ＰＢＳへ溶かした各ペプチド溶液をこのＯＶＡ溶液へそれぞれ加えた。その後この溶液を室温で２時間静置し、ＯＶＡと各ペプチドを結合させた（それぞれＯＶＡ＿ＰＴＨ３７－５３、ＯＶＡ＿ＰＴＨ４６－６０、ＯＶＡ＿ＰＴＨ５３－６７、ＯＶＡ＿ＰＴＨ６０－７４、ＯＶＡ＿ＰＴＨ６７－８４とする）。反応後はこの溶液にそれぞれＰＢＳを加え、液量が４ｍｌとなるように調整した。そしてこの反応液をそれぞれ透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して４℃で透析し、未反応のペプチドを除去した。透析後は透析チューブの中から各サンプルをそれぞれ回収し、単クローン化された抗体のエピトープを同定する下記の実験に利用した。
【0030】
（Ａ）ＯＶＡ＿ＰＴＨ３７－５３、ＯＶＡ－ＰＴＨ４６－６０、ＯＶＡ－ＰＴＨ５３－６７、ＯＶＡ－ＰＴＨ６０－７４またはＯＶＡ－ＰＴＨ６７－８４を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、これらの溶液をそれぞれ別のＥＬＩＳＡ用プレート（９６ウェル）の各ウェルへ１００μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに２００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに７０μｌずつ加えた。その後単クローン化した細胞の培養上清を各プレートの各ウェルにそれぞれ３０μｌずつ加えていった。その後これを室温で１時間静置してから各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに２００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに７０μｌずつ加えた。その後単クローン化した細胞の培養上清を各プレートの各ウェルにそれぞれ３０μｌずつ加えていった。その後これを室温で１時間静置してから各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【0031】
（Ｄ）ＡＬＰ標識された抗マウス抗体をインキュベーション緩衝液で１万倍希釈した。その後この溶液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに１００μｌずつ加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）ＡＬＰ緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに１００μｌずつ加え、３０分静置した。
（Ｆ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、得られた各抗体がＰＴＨのどのフラグメントと反応するか調べた。実験の結果、ｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（ＰＴＨ１１５）とｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（ＰＴＨ１１３）を単離できていると確認できた。
（Ｅ）ＡＬＰ緩衝液を用意したＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに１００μｌずつ加え、３０分静置した。
（Ｆ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、得られた各抗体がＰＴＨのどのフラグメントと反応するか調べた。実験の結果、ｗＰＴＨの３７番目から５３番目までのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（ＰＴＨ１１５）とｗＰＴＨの５３番目から６７番目までのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（ＰＴＨ１１３）を単離できていると確認できた。
【0032】
（６）抗体の精製・フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識
ＰＴＨ１１５を産生する細胞とＰＴＨ１１３を産生する細胞をそれぞれ培養液から回収した。そしてこれらの細胞をそれぞれＰＢＳに懸濁して洗浄した。次にこれらの細胞を１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにそれぞれハイブリドーマ用の無血清培地（サイテバ社）へ懸濁して３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養した。
ＰＴＨ１１５を産生する細胞とＰＴＨ１１３を産生する細胞をそれぞれ培養液から回収した。そしてこれらの細胞をそれぞれＰＢＳに懸濁して洗浄した。次にこれらの細胞を１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにそれぞれハイブリドーマ用の無血清培地（サイテバ社）へ懸濁して３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養した。
【0033】
細胞培養後、抗体が含まれている培養上清を回収してそれぞれフィルターろ過した。そしてこれらの溶液をそれぞれＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（東ソー社）へ通した。次にここへＰＢＳを流してそれぞれカラムを洗浄した。その後このカラムへ１００ｍＭ Ｇｌｙ－Ｃｌ（ｐＨ２．５）を流し、カラムからそれぞれの抗体を溶出させた。次に精製されたこれらの抗体を濃縮し、それぞれ透析チューブの中へ入れてＰＢＳ溶液に対して４℃で透析した。透析後は透析チューブの中からモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３を回収し、ＢＣＡ法によってタンパク質濃度を測定した。
【0034】
精製したモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３の濃度と容量がそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌとなるようにＰＢＳで調整した。そしてこの抗体溶液をそれぞれ透析チューブの中へ入れ、５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ９）に対して４℃で透析した。そして透析終了後は各抗体をそれぞれ透析チューブから回収した。次に６－（フルオレセイン－５－カルボキサミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルを１．９ｍｇ量り取り、１ｍｌのＤＭＳＯに溶かした。その後この溶液をホウ酸溶液で透析した各抗体溶液１ｍｌへ１０μｌずつ加えた。そしてこれらの溶液を４℃で一晩転倒混和し、それぞれの抗体をＦＩＴＣで標識した。反応後この反応液へ１２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう超純水に溶かしたグリシン溶液を１００μｌずつ加えて反応を止めた。そしてこれらの溶液をそれぞれ透析チューブの中へ入れてＰＢＳ溶液に対して４℃で透析し、未反応のＦＩＴＣを除去した。そして透析後は透析チューブの中からＦＩＴＣで標識されたモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３をそれぞれ回収した。
【0035】
（７）抗体の性能評価
ＦＩＴＣで標識されたモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３を使い、以下の通りその性能を評価した。
ＦＩＴＣで標識されたモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３を使い、以下の通りその性能を評価した。
【0036】
まず、ＦＩＴＣで標識されたモノクローナル抗体ＰＴＨ１１５またはＰＴＨ１１３をインキュベーション緩衝液で希釈して０．１ｍｇ／ｍｌとなるように濃度を調整した。次にこの抗体溶液やこれらを混合した溶液を抗ＦＩＴＣ抗体が固定化された粒子へそれぞれ一定量加え、室温で一時間反応させた。その後この粒子をビーズ洗浄液で３回洗浄し、ＡＬＰで標識された２次抗体を一定量加えた。尚ここでは、ｗＰＴＨのＮ末端から数えて１番目から６番目までのアミノ酸残基を認識する抗体（ｗＰＴＨ抗体とする）とＰＴＨのＮ末端から数えて７番目から３４番目までのアミノ酸残基を認識する抗体（ｉＰＴＨ抗体とする）のいずれかを２次抗体として利用している。そしてここへｗＰＴＨ濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１－Ｃａｌ６の６種類）を一定量加え、一定時間反応させた。
【0037】
その後Ｂ／Ｆ分離を行ってからＡＬＰの基質を加え、ビーズに固定されているＡＬＰ標識２次抗体から出るシグナルを測定した。そしてＰＴＨが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｎ）を１とし、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２－６）を加えた時のシグナル（Ｓ）をそれぞれ相対的な値（Ｓ／Ｎ比）として算出した。ＰＴＨ濃度を横軸、Ｓ／Ｎを縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。尚この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ－６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行った。
【0038】
実験の結果、モノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３をそれぞれ単独で用いた時よりも、これらを１：１の比で混合して用いた時（ＰＴＨ１１３＋ＰＴＨ１１５）の方が検量線のＳ／Ｎ比が向上すると分かった（図５、図６）。またこの時モノクローナル抗体ＰＴＨ１１５とＰＴＨ１１３の混合比を変えて実験を行ったところ（ｗＰＴＨ濃度１６．１ｐｇ／ｍｌ又は１．５６ｎｇ／ｍｌで２次抗体がｗＰＴＨ抗体又はｉＰＴＨ抗体）、ＰＴＨ１１３：ＰＴＨ１１５の比が２：８から８：２の範囲であればそれぞれの抗体を単独で用いた時と比較して検量線のＳ／Ｎ比が向上すると分かった（図７、図８）。またこのようなＳ／Ｎ比の向上は、ｗＰＴＨ抗体とｉＰＴＨ抗体のいずれを２次抗体として用いた場合でも確認された（図５、図６、図７、図８）。以上の結果から、エピトープが異なる２種類以上の抗体を１次抗体として使用することによってＰＴＨの検出感度が向上することが明らかになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
