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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022142759
(43)【公開日】2022-09-30
(54)【発明の名称】ワンステップＲＴ－ＰＣＲ反応用組成物／キット
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20220922BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220922BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20220922BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022037964
(22)【出願日】2022-03-11
(31)【優先権主張番号】P 2021042896
(32)【優先日】2021-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （その１） 開催日 ２０２１年３月１８日から２０２１年３月２１日 集会名、開催場所 日本農芸化学会２０２１年度大会（オンライン開催） （その２） ウェブサイトの掲載日 ２０２１年１０月１４日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｇｈｔ－ｓｔｕｆｆ．ｂｉｚ／６０ｔｈｋｉｎｋｉ／ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｇｈｔ－ｓｔｕｆｆ．ｂｉｚ／６０ｔｈｋｉｎｋｉ／ｐｒｏｇｒａｍ／ （その３） 開催日 ２０２１年１１月２７日～２０２１年１２月１０日 集会名、開催場所 第４０回日本衛生検査所協会近畿支部学術研究発表会（オンライン開催（オンデマンド形式））
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業「流早産の原因細菌の制限修飾系を利用した新規制御法の開発及び早産関連細菌の簡易核酸増幅技術改良を目指した研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】000173692
【氏名又は名称】一般財団法人阪大微生物病研究会
(71)【出願人】
【識別番号】506286928
【氏名又は名称】地方独立行政法人 大阪府立病院機構
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(71)【出願人】
【識別番号】503092180
【氏名又は名称】学校法人関西学院
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】柳原 格
(72)【発明者】
【氏名】名倉 由起子
(72)【発明者】
【氏名】位田 忍
(72)【発明者】
【氏名】岡本 裕也
(72)【発明者】
【氏名】竹内 宗之
(72)【発明者】
【氏名】大場 雄一郎
(72)【発明者】
【氏名】田村 嘉孝
(72)【発明者】
【氏名】保川 清
(72)【発明者】
【氏名】藤原 伸介
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 孝一朗
(72)【発明者】
【氏名】羽鳥 暢晃
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD02
4B050FF05E
4B050FF11E
4B050KK11
4B050LL03
4B050LL05
4B063QA01
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR07
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】検出感度に優れ且つより多様な組成の反応バッファーを採用可能な二酵素系ワンステップRT-PCR技術を提供すること。
【解決手段】特定のアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び特定のアミノ酸配列に示される配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、組成物／キット。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び特定のアミノ酸配列に示される配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、組成物／キット。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項2】
前記X1及びX3がアルギニンであり、且つX2がリシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記変異アミノ酸配列A1が配列番号2に示されるアミノ酸配列A11又は前記アミノ酸配列A11と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列A12である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記変異アミノ酸配列A12の前記同一性が90％以上である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記アミノ酸配列B1がThermus thermophilus DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記アミノ酸配列B1の前記同一性が90％以上である、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
PCR反応用組成物である、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
ワンステップRT-PCR反応用組成物である、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
核酸検出用である、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
前記核酸がウイルス、バクテリア又は真菌由来である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
2価陽イオン源としてのマンガン塩の含有量が2価陽イオン源100モル％に対して50モル％以下である、且つ／或いは緩衝剤としてBicine緩衝剤を含有する、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
2価陽イオン源としてのマンガン塩の含有量が2価陽イオン源100モル％に対して10モル％以下であり、且つ緩衝剤としてBicine緩衝剤を含有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワンステップRT-PCR反応用組成物／キットに関する。
【背景技術】
【0002】
COVID-19の原因RNAウイルスであるSARS-CoV-2は世界的に広がり、医療と経済に大打撃を与えている。感染を確認するためのウイルスの同定には、核酸検出と抗原検出が主な方法である。逆転写PCR（RT-PCR）は、SARS-CoV-2 RNA等のRNAウイルスを検出するための高感度で広く使われているツールである。RT-PCRによる検出は、通常、逆転写酵素を用いたcDNAの合成と、DNAポリメラーゼを用いたDNA増幅の2つの工程からなる。ワンステップRT-PCR法は、この2つの工程を同一チューブ内で連続的に反応させるものである。ワンステップRT-PCRでは、逆転写反応とPCR反応を同じチューブ内で連続して行うため、操作が簡便でコンタミネーションリスクも低減できる。ワンステップRT-PCRには、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを用いた単一酵素系ワンステップRT-PCRと、逆転写酵素とDNAポリメラーゼの2つを加えて行う二酵素系ワンステップRT-PCRがある。二酵素系ワンステップRT-PCRは、DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素系ワンステップRT-PCRよりも感度が高いが、逆転写酵素とDNAポリメラーゼが干渉し、検出感度を低下させることが報告されている。2つ以上の酵素が同じバッファーで働く必要があるため、反応バッファーの調整が不可欠である。
【0003】
特許文献１には、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用することにより、核酸増幅効率の低下を防ぐ技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第2018/151246号
【特許文献2】特開2016-136970号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、検出感度に優れ且つより多様な組成の反応バッファーを採用可能な二酵素系ワンステップRT-PCR技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素と、配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼとの組合せを採用することにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいて更に研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【0007】
項１． 配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、組成物。
【0008】
項２． 前記X1及びX3がアルギニンであり、且つX2がリシンである、項１に記載の組成物。
【0009】
項３． 前記変異アミノ酸配列A1が配列番号2に示されるアミノ酸配列A11又は前記アミノ酸配列A11と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列A12である、項１又は２に記載の組成物。
【0010】
項４． 前記変異アミノ酸配列A12の前記同一性が90％以上である、項３に記載の組成物。
【0011】
項５． 前記アミノ酸配列B1がThermus thermophilus DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列である、項１～４のいずれかに記載の組成物。
【0012】
項６． 前記アミノ酸配列B1の前記同一性が90％以上である、項１～５のいずれかに記載の組成物。
【0013】
項７． PCR反応用組成物である、項１～６のいずれかに記載の組成物。
【0014】
項８． ワンステップRT-PCR反応用組成物である、項１～７のいずれかに記載の組成物。
【0015】
項９． 核酸検出用である、項１～８のいずれかに記載の組成物。
【0016】
項１０． 前記核酸がウイルス、バクテリア又は真菌由来である、項９に記載の組成物。
【0017】
項１１． 2価陽イオン源としてのマンガン塩の含有量が2価陽イオン源100モル％に対して50モル％以下である、且つ／或いは緩衝剤としてBicine緩衝剤を含有する、項１～９のいずれかに記載の組成物。
【0018】
項１２． 2価陽イオン源としてのマンガン塩の含有量が2価陽イオン源100モル％に対して10モル％以下であり、且つ緩衝剤としてBicine緩衝剤を含有する、請求項１１に記載の組成物。
【0019】
項１３． 配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、キット。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、検出感度に優れ且つより多様な組成の反応バッファーを採用可能な二酵素系ワンステップRT-PCR技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】試験例2-1のワンステップRT-PCR試験において、Buffer 1を使用した場合の結果を示す。縦軸はシグナル強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図2】試験例2-1のワンステップRT-PCR試験において、Buffer 2を使用した場合の結果を示す。縦軸はシグナル強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図3】試験例2-1のワンステップRT-PCR試験において、Buffer 3を使用した場合の結果を示す。縦軸はシグナル強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図4】試験例2-1のワンステップRT-PCR試験において、Buffer 4を使用した場合の結果を示す。縦軸はシグナル強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図5】試験例2-1のワンステップRT-PCR試験において、Buffer 5を使用した場合の結果を示す。縦軸はシグナル強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図6】試験例2-2の逆転写反応時間について検討したワンステップRT-PCR試験の結果を示す。縦軸は蛍光強度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。
【図7】試験例2-3のワンステップRT-PCR試験における、MoCOキット（CDC N1プライマー使用）と市販のキット（タカラバイオ社）との二変量相関を示す。
【図8】試験例2-3のワンステップRT-PCR試験における、MoCOキット（CDC N2プライマー使用）と市販のキット（タカラバイオ社）との二変量相関を示す。
【図9】試験例2-3のワンステップRT-PCR試験における、MoCOキット（CDC N1プライマー使用）とMoCOキット（CDC N2プライマー使用）との二変量相関を示す。
【図10】試験例６のワンステップRT-PCR試験における増殖曲線を示す。
【図11】試験例６のワンステップRT-PCR試験におけるコピー数とCt値の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
1．定義等
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【0023】
本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin S， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、Karlin S，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。本明細書において、アミノ酸の変異は、具体的には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加である。また、一態様において、アミノ酸の変異は、置換であることが好ましく、保存的置換であることがより好ましい。
【0024】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；トレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【0025】
本明細書において、DNA、RNAなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【0026】
本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、アミノ酸一文字表記+N末端アミノ酸から数えた場合のアミノ酸番号で示すことがある。例えば、「E264」は、N末端から264番目のアミノ酸であるグルタミン酸を示す。また、当該数字の後にアミノ酸一文字表記がある場合は、当該数字の前の一文字表記が表すアミノ酸の、当該数字の後の一文字表記が表すアミノ酸への変異を示す。例えば、「E264R」は、N末端から264番目のアミノ酸であるグルタミン酸のアルギニンへの変異を示す。
【0027】
2．組成物
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素（本明細書において、「本発明の逆転写酵素」と示すこともある。）、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼ（本明細書において、「本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼ」と示すこともある。）を含む、組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502Aの変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素（本明細書において、「本発明の逆転写酵素」と示すこともある。）、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼ（本明細書において、「本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼ」と示すこともある。）を含む、組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【0028】
本発明の逆転写酵素は、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む。
【0029】
アミノ酸配列A（配列番号1）は、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）が内在的に発現する（固有に有する）逆転写酵素のアミノ酸配列である。
【0030】
変異アミノ酸配列A1は、アミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含むアミノ酸配列であり、この限りにおいて特に制限されない。これらの変異は、逆転写酵素の熱安定性を向上させる変異である（特許文献２）。
【0031】
X1、X2、又はX3で示される塩基性アミノ酸としては、例えばアルギニン、リシン、ヒスチジン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはアルギニン、リシン等が挙げられる。本発明の一態様において、X1及びX3はアルギニンであることが特に好ましく、X2はリシンであることが特に好ましい。
【0032】
変異アミノ酸配列A1は、逆転写酵素活性及び熱安定性が著しく損なわれない限り、上記以外の他の変異を含むことができる。例えば、変異アミノ酸配列A1は、当該配列からなるタンパク質（タンパク質A1）の逆転写酵素活性及び／又は熱安定性が、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A のみ変異した変異アミノ酸配列（配列番号2）からなるタンパク質（タンパク質2）の逆転写酵素活性及び／又は熱安定性の例えば70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、又は99％以上となる、アミノ酸配列であることができる。
【0033】
逆転写酵素活性は、下記ステップ（1）～（6）を行なうことによって測定する。
（1）反応液〔組成：25mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM塩化カリウム、2mMジチオスレイトール、5mM塩化マグネシウム、12.5μMポリ（rA）・p（dT）15（p（dT）15換算濃度）、および0.2mM［メチル－3H］dTTP〕中で逆転写酵素を37℃でインキュベーションするステップ、
（2）前記ステップ（1）で得られた産物20μLを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
（3）前記ステップ（2）後のガラスフィルターを、冷却された5質量％トリクロロ酢酸水溶液で10分間洗浄した後、冷却された95体積％エタノール水溶液で洗浄する操作を3回繰り返して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（rA）・p（dT）15に取り込まれていない[3H］dTTPを除去するステップ、
（4）前記ステップ（3）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬2．5mL中に入れ、放射活性をカウントするステップ、（5）前記ステップ（4）で得られた放射活性に基づいて、ポリ（rA）・p（dT）15に取り込まれた[3H]dTTPの量（以下、「dTTP取り込み量」という）を算出するステップ、および（6）前記ステップ（5）で算出されたdTTP取り込み量に基づいて、10分間にポリ（rA）・p（dT）15に1nmolのdTTPを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ。
（1）反応液〔組成：25mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM塩化カリウム、2mMジチオスレイトール、5mM塩化マグネシウム、12.5μMポリ（rA）・p（dT）15（p（dT）15換算濃度）、および0.2mM［メチル－3H］dTTP〕中で逆転写酵素を37℃でインキュベーションするステップ、
（2）前記ステップ（1）で得られた産物20μLを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
（3）前記ステップ（2）後のガラスフィルターを、冷却された5質量％トリクロロ酢酸水溶液で10分間洗浄した後、冷却された95体積％エタノール水溶液で洗浄する操作を3回繰り返して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（rA）・p（dT）15に取り込まれていない[3H］dTTPを除去するステップ、
（4）前記ステップ（3）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬2．5mL中に入れ、放射活性をカウントするステップ、（5）前記ステップ（4）で得られた放射活性に基づいて、ポリ（rA）・p（dT）15に取り込まれた[3H]dTTPの量（以下、「dTTP取り込み量」という）を算出するステップ、および（6）前記ステップ（5）で算出されたdTTP取り込み量に基づいて、10分間にポリ（rA）・p（dT）15に1nmolのdTTPを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ。
【0034】
熱安定性は、100nMの濃度のタンパク質を28μMポリ（rA）・p（dT）15の存在下で52℃で5分間インキュベーションした後の逆転写酵素活性として、測定する。
【0035】
変異アミノ酸配列A1における他の変異としては、例えば熱安定性をさらに向上させる変異（特許文献２）や、MMLV逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号1）に対する、そのオルソログ（例えばトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素など）のアミノ酸配列における変異等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他のアミノ酸変異の数は、例えば0～50個、0～20個、0～10個、又は0～5個である。
【0036】
変異アミノ酸配列A1として、好ましくは配列番号2に示されるアミノ酸配列A11又は前記アミノ酸配列A11と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列A12が挙げられる。変異アミノ酸配列A12の上記同一性は、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上、また100％未満である。
【0037】
本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含む。
【0038】
アミノ酸配列B（配列番号3）は、Thermus thermophilusが内在的に発現する（固有に有する）DNAポリメラーゼI（NCBI Accession No.：AB744210）のアミノ酸配列である。
【0039】
アミノ酸配列B1の上記同一性は、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上、また100％未満である。
【0040】
アミノ酸配列B1における、アミノ酸配列Bに対する変異の数は、例えば1～50個、1～20個、1～10個、1～5個である。
【0041】
アミノ酸配列B1は、本発明の一態様において、Thermus thermophilus DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列（例えばアミノ酸配列Bに対して、Thermus thermophilusの株間変異が導入されてなるアミノ酸配列）であることが好ましい。
【0042】
アミノ酸配列B1は、当該配列からなるタンパク質（タンパク質B1）のDNAポリメラーゼ活性が、アミノ酸配列Bからなるタンパク質（タンパク質B）のDNAポリメラーゼ活性の例えば70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、又は99％以上となる、アミノ酸配列であることができる。
【0043】
DNAポリメラーゼ活性は、次のようにしてPCRの反応産物を検出することで評価する。T. kodakarensisゲノムDNAより、PCRにより増幅した16S rDNA断片を基質として用いる。反応液の総量は20μLとし、それぞれDNA依存性DNAポリメラーゼの終濃度4μMとなるよう反応液に入れ、20μL PCR反応液（組成：0.2mM dNTPs, 1mM MgSO4, 0.75μM Fw primer, 0.75μM Rv primer, 0.875ng/μL 16S rDNA（T. kodakarensis）, water）及びサイクル条件（94℃ 2min→（94℃ 15sec→55℃ 30sec→68℃ 1min）×35～45サイクル→68℃ 5min）でPCRを行う。反応液をアガロース電気泳動に供し、PCR反応液においてPCR産物（128 bp）を確認する。
【0044】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、その活性が著しく損なわれない限りにおいて、上記以外の他のアミノ酸配列、例えばタンパク質タグ、蛍光タンパク質、発光タンパク質、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。
【0045】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、その活性が著しく損なわれない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【0046】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
【0047】
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【0048】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
【0049】
さらに、本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているものも包含される。
【0050】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、酸または塩基との塩の形態であってもよい。塩は、特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩； 酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩； アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【0051】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【0052】
本発明の逆転写酵素、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に製造することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して製造することができる。
【0053】
本発明の組成物において、本発明の逆転写酵素の含有量は、逆転写酵素100質量％に対して、例えば50質量％以上、60質量％以上、70質量％以上、80質量％以上、90質量％以上、95質量％以上、99質量％以上、又は100質量％である。
【0054】
本発明の組成物において、本発明の逆転写酵素の含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば0.03～0.8μM、好ましくは0.03～0.4μM、より好ましくは0.05～0.3μM、さらに好ましくは0.05～0.2μMとなるような含有量であることが好ましい。
【0055】
本発明の組成物において、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼの含有量は、DNA依存性DNAポリメラーゼ100質量％に対して、例えば50質量％以上、60質量％以上、70質量％以上、80質量％以上、90質量％以上、95質量％以上、99質量％以上、又は100質量％である。
【0056】
本発明の組成物において、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼの含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば0.5～12μM、好ましくは0.75～6μM、より好ましくは0.75～4.5μM、さらに好ましくは0.75～3μMとなるような含有量であることが好ましい。
【0057】
本発明の組成物において、本発明の逆転写酵素と本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼとの含有比は、本発明の逆転写酵素1モルに対して、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼが例えば5～30モル、好ましくは10～25モル、より好ましくは12～18モルである。
【0058】
本発明の一態様において、本発明の組成物は、PCR反応用組成物であることが好ましく、ワンステップRT-PCR反応用組成物であることがより好ましい。この場合、本発明の組成物は、逆転写反応及び／又はPCR反応において必要な或いは好ましい他の成分を含むことが望ましい。このような成分としては、緩衝剤、2価陽イオン源、1価陽イオン源、tRNA、dNTPs、RNase阻害剤、プライマー／プローブとなるポリヌクレオチド、Uracil-DNA Glycosylase、溶媒（水等）等が挙げられる。
【0059】
本発明の好ましい一態様において、本発明の組成物は、バッファー成分として、緩衝剤、2価陽イオン源、及び1価陽イオン源を含有する。
【0060】
緩衝剤としては、例えばBicine緩衝剤（Bicine-KOH等）、Tris緩衝剤（Tris-HCl等）等が挙げられる。これらの中でも、Bicine緩衝剤及びTris緩衝剤が好ましく、これらを併用することが特に好ましい。本発明の一態様において、本発明の組成物は、検出感度の観点から、好ましくは緩衝剤としてBicine緩衝剤を含有する。
【0061】
上記態様における本発明の組成物において、緩衝剤の含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば5～400mM, 好ましくは10～200mM、より好ましくは10～150mM、さらに好ましくは50～120mMとなるような含有量であることが好ましい。
【0062】
本発明の組成物がBicine緩衝剤を含有する場合、その含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば0～250mM, 好ましくは0～120mM、より好ましくは0～100mM、さらに好ましくは30～80mMとなるような含有量であることが好ましい。
【0063】
本発明の組成物がBicine緩衝剤を含有する場合、その含有量は、緩衝剤100質量％に対して、例えば0～100質量％、好ましくは0～90質量％、より好ましくは25～85質量％、さらに好ましくは50～80質量％である。
【0064】
2価陽イオン源としては、例えばマグネシウム塩（塩化マグネシウム等）、マンガン塩（酢酸マンガン等）が挙げられる。これらの中でも、マグネシウム塩が好ましい。
【0065】
上記態様における本発明の組成物において、2価陽イオン源の含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば0.3～5mM、好ましくは0.6～4mM、より好ましくは1～4mM、さらに好ましくは1.2～3mMとなるような含有量であることが好ましい。
【0066】
本発明の組成物は、検出感度の観点から、マンガン塩の含有量が、他の2価陽イオン源の含有量と比較して、同等又はより少ないこと（特に好ましくはマンガン塩の含有量が他の2価陽イオン源の含有量より少ないこと）が好ましい。この観点から、本発明の組成物においては、2価陽イオン源としてのマンガン塩の含有量が2価陽イオン源100モル％に対して例えば80モル％以下、好ましくは70モル％以下、より好ましくは50モル％以下、さらに好ましくは30モル％以下、よりさらに好ましくは10モル％以下、特に好ましくは0モル％である。1価陽イオン源としては、例えばカリウム塩（塩化カリウム、酢酸カリウム等）が挙げられる。
【0067】
上記態様における本発明の組成物において、1価陽イオン源の含有量は、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液中の濃度が例えば10～200mM、好ましくは20～150mM、より好ましくは40～120mMとなるような含有量であることが好ましい。
【0068】
上記以外の他の成分の含有量は、特に制限されず、PCR又はワンステップRT-PCRにおいて採用されうる含有量を適宜採用することができる。
【0069】
本発明の組成物は、濃縮形態であることができる。例えば、本発明の組成物は、乾燥形態であるか、或いは含有成分の濃度が、PCR、ワンステップRT-PCR反応液中の濃度の例えば1.2～50倍（例えば1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍）となる濃縮形態であることができる。
【0070】
本発明の組成物は、RNA検出、特にRNAウイルス検出やバクテリア・真菌由来のRNA検出に好適に用いることができる。RNAウイルスやバクテリア・真菌としては、特に制限されず、例えば以下のウイルスやバクテリアや真菌が挙げられる。更に本発明の組成物は、逆転写酵素が存在する条件下においても、DNA検出に好適に用いることができる。そのため、RNA検出以外にも、DNAウイルス検出やバクテリア・真菌由来のDNA検出に用いることができる。DNAウイルスやバクテリア・真菌としては、特に制限されず、例えば以下のウイルスやバクテリア・真菌が挙げられる。更に、RNAウイルスとDNAウイルスの同時検出やバクテリア・真菌由来のRNAとDNAウイルスの同時検出にも、好適に用いることができる。更に、SNP検出や目的のウイルスやバクテリア・真菌の変異株の検出などにも好適に用いることができる。例えば、SARSコロナウイルス2の変異ウイルスを検出することも可能である。本明細書において、SARS-CoV-2をSARSコロナウイルス2、2019新型コロナウイルス、2019-Novel Coronavirus、2019-nCoVと示すことがある。
二本鎖RNAウイルス(dsRNA)
レオウイルス科：ロタウイルス、ブルータングウイルス、細胞質多角体病ウイルス(Cypovirus, CPV)
一本鎖マイナス鎖RNAウイルス
オルトミクソウイルス科 : インフルエンザウイルス
パラミクソウイルス科 : ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューキャッスル病ウイルス
ラブドウイルス科 : 狂犬病ウイルス、リッサウイルス、水疱性口内炎ウイルス
ボルナウイルス科ボルナウイルス属:ボルナ病ウイルス、鳥ボルナウイルス、爬虫類ボルナウイルス
フィロウイルス科 : マールブルグウイルス、エボラウイルス
ブニヤウイルス科 : クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、SFTSウイルス、ハンタウイルスアレナウイルス科（2 分節(S-RNAと L-RNA)の 1 本鎖の(-)鎖 RNA をゲノムに有するエンベロープウイルス）：ラッサウイルス、マチュポウイルス、フニンウイルス
一本鎖RNAプラス鎖逆転写
レトロウイルス科 : ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトTリンパ好性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルT細胞白血病ウイルス（STLV）
一本鎖プラス鎖RNAウイルス
ピコルナウイルス科：エンテロウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスなど）、A型肝炎ウイルス
エコーウイルス
コロナウイルス科：SARSコロナウイルス、MERSコロナウイルス、SARSコロナウイルス2（2019新型コロナウイルス）
カリシウイルス科 : ノロウイルス、ノーウォークウイルス、サポウイルス
トガウイルス科 : 風疹ウイルス、チクングニアウイルス
ノダウイルス科: ウイルス性神経壊死症ウイルス
フラビウイルス科 : 黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス。
バクテリア
百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ウレアプラズマ菌
真菌
カビ菌、カンジダ菌
DNAウイルス
ポックスウイルス科：天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス
ヘルペスウイルス科：単純ヘルペスウイルス1型、2型、水痘ー帯状ヘルペスウイルス
アデノウイルス科
パポウイルス科：乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス
パルボウイルス科：パルボウイルス
ヘパドナウイルス科：Ｂ型肝炎ウイルス
二本鎖RNAウイルス(dsRNA)
レオウイルス科：ロタウイルス、ブルータングウイルス、細胞質多角体病ウイルス(Cypovirus, CPV)
一本鎖マイナス鎖RNAウイルス
オルトミクソウイルス科 : インフルエンザウイルス
パラミクソウイルス科 : ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、センダイウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューキャッスル病ウイルス
ラブドウイルス科 : 狂犬病ウイルス、リッサウイルス、水疱性口内炎ウイルス
ボルナウイルス科ボルナウイルス属:ボルナ病ウイルス、鳥ボルナウイルス、爬虫類ボルナウイルス
フィロウイルス科 : マールブルグウイルス、エボラウイルス
ブニヤウイルス科 : クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、SFTSウイルス、ハンタウイルスアレナウイルス科（2 分節(S-RNAと L-RNA)の 1 本鎖の(-)鎖 RNA をゲノムに有するエンベロープウイルス）：ラッサウイルス、マチュポウイルス、フニンウイルス
一本鎖RNAプラス鎖逆転写
レトロウイルス科 : ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトTリンパ好性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルT細胞白血病ウイルス（STLV）
一本鎖プラス鎖RNAウイルス
ピコルナウイルス科：エンテロウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスなど）、A型肝炎ウイルス
エコーウイルス
コロナウイルス科：SARSコロナウイルス、MERSコロナウイルス、SARSコロナウイルス2（2019新型コロナウイルス）
カリシウイルス科 : ノロウイルス、ノーウォークウイルス、サポウイルス
トガウイルス科 : 風疹ウイルス、チクングニアウイルス
ノダウイルス科: ウイルス性神経壊死症ウイルス
フラビウイルス科 : 黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス。
バクテリア
百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ウレアプラズマ菌
真菌
カビ菌、カンジダ菌
DNAウイルス
ポックスウイルス科：天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス
ヘルペスウイルス科：単純ヘルペスウイルス1型、2型、水痘ー帯状ヘルペスウイルス
アデノウイルス科
パポウイルス科：乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス
パルボウイルス科：パルボウイルス
ヘパドナウイルス科：Ｂ型肝炎ウイルス
【0071】
更に本発明の組成物は、病原性ウイルス又は細菌の遺伝子検査を行うこともできる。当事者に公知の任意のプライマー及びプローブを用いてヒト遺伝子のSNP検出を行うことにより、癌や認知症などの疾患に関連する遺伝子検査を好適に用いることができる。
【0072】
本発明の組成物は、そのまま、或いは必要に応じて他の成分を添加して／他の組成物に添加して、PCR反応液又はワンステップRT-PCR反応液として使用することができる。
【0073】
3．キット
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、キット（本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む、キット（本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【0074】
本発明のキットにおいては、本発明の逆転写酵素及び本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼが同一の容器に入っていてもよいし、別々の容器に入っていてもよい。
【0075】
本発明のキットにおいては、その一態様において、本発明の組成物の各成分が、同一の容器、又は複数の容器に分けて含まれている。例えば、本発明のキットは、緩衝剤、2価陽イオン源、及び1価陽イオン源を含有するバッファーを含有することができる。本発明のキットにおける各容器における各成分は、濃縮形態であることができる。各成分、その濃度、濃縮形態等については、本発明の組成物と同様である。
【0076】
本発明のキットは、必要に応じて、PCR又はワンステップRT-PCR反応の実行に使用され得る器具、試薬を含むことができる。
【0077】
4．核酸検出方法
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む反応液中で、核酸（RNA及び／又はDNA）を鋳型として核酸増幅させることを含む、核酸（RNA及び／又はDNA）検出方法（本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264X1、E280X2、L413X3、及びD502A の変異（X1、X2、及びX3はそれぞれ塩基性アミノ酸を示す。）を含む変異アミノ酸配列A1を含む逆転写酵素、及び配列番号3に示されるアミノ酸配列B又は前記アミノ酸配列Bと80％以上の同一性を有するアミノ酸配列B1を含むDNA依存性DNAポリメラーゼを含む反応液中で、核酸（RNA及び／又はDNA）を鋳型として核酸増幅させることを含む、核酸（RNA及び／又はDNA）検出方法（本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【0078】
反応液は、逆転写反応及び／又はPCR反応において必要な他の成分を含む。他の成分については、本発明の組成物における他の成分と同様であり、その濃度についても、本発明の組成物と同様である。
【0079】
RNAを鋳型とした核酸増幅は、ワンステップRT-PCR、すなわち本発明の逆転写酵素によるRNAを鋳型とした逆転写反応、及びそれにより得られたDNAの本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼによる増幅反応によって、行われる。
DNAを鋳型とした核酸増幅は、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼによるDNAの増幅反応によって、行われる。
逆転写反応温度及び時間、PCR反応サイクルの温度及び時間については、特に制限されず、プライマー、プローブ等のTm値、増幅対象の長さ、増幅対象のGC割合等に応じて、適宜設定することができる。
DNAを鋳型とした核酸増幅は、本発明のDNA依存性DNAポリメラーゼによるDNAの増幅反応によって、行われる。
逆転写反応温度及び時間、PCR反応サイクルの温度及び時間については、特に制限されず、プライマー、プローブ等のTm値、増幅対象の長さ、増幅対象のGC割合等に応じて、適宜設定することができる。
【0080】
逆転写反応について、その温度は、好ましくは45～55℃、より好ましくは48～52℃であり、その時間は好ましくは3秒～20分、より好ましくは1分～10分である。
【0081】
PCR反応サイクルについて、好ましくは、変性温度（好ましくは92～98℃、より好ましくは93～97℃）で例えば5～15秒間、及びそれに続いて酵素反応温度（好ましくは55～65℃、より好ましくは58～62℃）で例えば15秒～2分間（好ましくは20～40秒間）からなるサイクルを、例えば25サイクル以上、30サイクル以上、35サイクル以上、40サイクル以上行うことが例示される。
【0082】
核酸増幅後は、増幅核酸に基づくシグナルを検出することにより、核酸の有無を検出することができ、さらに核酸を定量することができる。シグナルの検出は、プライマー／プローブ或いは増幅核酸の、標識／染色に基づいて、行うことができる。標識／染色に使用される物質としては、特に制限されず、例えばCy3、Cy5、FITC、TRITC、Rhodamine、TAMRA、Alexa Fluor、Texas Red、FAM、APC、PE、ATTO、DyLight等の核酸標識物質や、EtBrや各種蛍光色素等の核酸染色物質等が挙げられる。本発明の検出方法は、好適には、リアルタイムPCRにより行うことができる。
【実施例0083】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0084】
試験例1．酵素の調製
試験例1-1．逆転写酵素（MM4）の調製
配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264R、E280K、L413R、及びD502A の変異が導入されてなる変異アミノ酸配列（配列番号2）からなる逆転写酵素（MM4）を調製した。具体的には以下のようにして行った。
試験例1-1．逆転写酵素（MM4）の調製
配列番号1に示されるアミノ酸配列Aに対してE264R、E280K、L413R、及びD502A の変異が導入されてなる変異アミノ酸配列（配列番号2）からなる逆転写酵素（MM4）を調製した。具体的には以下のようにして行った。
【0085】
MM4コード配列（配列番号4）の下流にHisx6 tagコード配列が連結されてなる塩基配列が大腸菌発現ベクター（pET22b(+)）のMCSに組み込まれてなるMM4発現ベクターを使用した。MM4発現ベクターを含む大腸菌（BL21(DE3)）をアンピシリン含有培地400mL中で培養し、培養液のOD値が0.6になった時点でIPTGを添加し、さらに37℃で3時間培養した。培養液を遠心分離（7,000 x g, 30min, 4℃）し、上清を除去し、沈殿物を－80℃で一時保管した。解凍した沈殿物に対して、バッファーA（組成：20 mM Potassium Phosphate buffer (pH 7.2)、2 mM DTT、10% V/V Glycerol、5mM PMSF）30mLを添加し、菌体を超音波破砕（5min x 3 times）した。破砕液を遠心分離（34,000 x g, 60min, 4℃）し、上清をResQ 陰イオン交換クロマトグラフィー（AKTA）に供した。溶出バッファーとして、バッファーB（組成：20 mM Potassium Phosphate buffer (pH 7.2)、2 mM DTT、10% V/V Glycerol、120mM NaCl）及び溶出バッファーC（組成：20 mM Potassium Phosphate buffer (pH 7.2)、2 mM DTT、10% V/V Glycerol、1000mM NaCl）を使用し、リニアグラジエント溶出（120→1000 mM NaCl）を行った。各溶出フラクションをSDS-PAGEにより分析し、MM4のバンドが確認されたフラクションを集め、硫安沈殿（硫安7.29g / 30mL）を行った。遠心分離（4,860 x g, 60min, 4℃）し、上清を除去し、得られた沈殿物をバッファーD（組成：50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3)、200 mM KCl、2mM DTT、10% V/V Glycerol、50mM imidazole）10mLに溶解し、得られた溶液をHis Column purification (AKTA)（Ni-NTA Cartridge (5mL x 5) FUJIFILM 142-09733）に供した。溶出バッファーとして、バッファーD及びバッファーE（組成：50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3)、200 mM KCl、2mM DTT、10% V/V Glycerol、500mM imidazole）を使用し、リニアグラジエント溶出（50→500 mM imidazole）を行った。各溶出フラクションをSDS-PAGEにより分析し、MM4のバンドが確認されたフラクションを集め、PD-10カラムにより脱塩して、MM4を得た（濃度：約150μg/mL）。
【0086】
試験例1-2．DNA依存性DNAポリメラーゼ（M1pol
Tth
）の調製
配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるDNA依存性DNAポリメラーゼ（Thermus thermophilus DNAポリメラーゼI）を調製した。具体的には以下のようにして行った。
配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるDNA依存性DNAポリメラーゼ（Thermus thermophilus DNAポリメラーゼI）を調製した。具体的には以下のようにして行った。
【0087】
M1polTthコード配列（配列番号5）の下流にHisx6 tagコード配列が連結されてなる塩基配列が大腸菌発現ベクター（pET28）のMCSに組み込まれてなるM1polTth発現ベクターを使用した。M1polTth発現ベクターを含む大腸菌（BL21(DE3)）をカナマイシン含有培地400mL中で培養し、培養液のOD値が0.5になった時点でIPTGを添加し、さらに37℃で4時間培養した。培養液を遠心分離（7,000 x g, 40min, 4℃）し、上清を除去し、沈殿物を－80℃で一時保管した。解凍した沈殿物に対して、バッファーF（組成：20 mM Tris-HCl (pH8.0)、500 mM NaCl、0.1% Triton X-100、20 mM imidazole）35mLを添加し、菌体を超音波破砕（5min x 3 times）した。破砕液を遠心分離（34,000 x g, 60min, 4℃）し、上清をHis Column purification (AKTA)（Ni-NTA Cartridge (5mL x5) FUJIFILM 142-09733）に供した。溶出バッファーとして、バッファーF及びバッファーG（組成：20 mM Tris-HCl (pH8.0)、500 mM NaCl、0.1% Triton X-100、500 mM imidazole）を使用し、リニアグラジエント溶出（20→500 mM imidazole）を行った。各溶出フラクションをSDS-PAGEにより分析し、M1polTth のバンドが確認されたフラクションを集め、Thermo: Slide-A-Lyzer（MWCO 3,500）で透析し、M1polTthを得た（濃度：約2800μg/mL）。
【0088】
試験例1-3．DNA依存性DNAポリメラーゼ（K4pol
L329A
）の調製
K4株由来DNAポリメラーゼI（アミノ酸配列：配列番号6）のコード配列（塩基配列：配列番号7）を挿入したpET21aベクター（pET-21a-K4polI-L329A）を用いてそれぞれE. coli BL21 CodonPlus DE3 (RIL) を形質転換し、LB培地(+Amp、+Cm) で37℃一晩培養した。アンピシリンは50 μg/ mL 、クロラムフェニコールは25 μg/ mL添加した。コロニーをつつき、LB (+ Amp、+Cm) 液体培地 (30 mL) で37℃、一晩前培養を行い、新たなLB (+ Amp、+Cm) 液体培地3Lに1%植菌した。そして、OD660が0.5になるまで37℃で振盪培養し、終濃度0.1 mM IPTGを添加して、4時間振盪培養した。そして集菌し、バッファーH（組成：10 mM Tris-HCl(pH8.0)、100 mM NaCl、1 mM DTT、10%グリセロール）を1L菌体あたり15mL加えて5分×3回超音波破砕した。その破砕液を遠心し、上清を回収した後、85℃で30分熱処理した。再び遠心し回収した上清をヘパリンカラム (Hi Prep HeparinFF16/10) に供し、バッファーHとバッファーI（組成：10 mM Tris-HCl(pH8.0)、1000 mM NaCl、1 mM DTT、10%グリセロール）を用いてリニアグラジエントで溶出させた。その溶出画分をバッファーHを用いて透析した。夾雑タンパク質が見られたため熱処理をもう一度1.5mLチューブに1mLずつ分注し、85℃、30分ヒートブロックにて熱処理及び精製を行い、K4polL329Aを得た。
K4株由来DNAポリメラーゼI（アミノ酸配列：配列番号6）のコード配列（塩基配列：配列番号7）を挿入したpET21aベクター（pET-21a-K4polI-L329A）を用いてそれぞれE. coli BL21 CodonPlus DE3 (RIL) を形質転換し、LB培地(+Amp、+Cm) で37℃一晩培養した。アンピシリンは50 μg/ mL 、クロラムフェニコールは25 μg/ mL添加した。コロニーをつつき、LB (+ Amp、+Cm) 液体培地 (30 mL) で37℃、一晩前培養を行い、新たなLB (+ Amp、+Cm) 液体培地3Lに1%植菌した。そして、OD660が0.5になるまで37℃で振盪培養し、終濃度0.1 mM IPTGを添加して、4時間振盪培養した。そして集菌し、バッファーH（組成：10 mM Tris-HCl(pH8.0)、100 mM NaCl、1 mM DTT、10%グリセロール）を1L菌体あたり15mL加えて5分×3回超音波破砕した。その破砕液を遠心し、上清を回収した後、85℃で30分熱処理した。再び遠心し回収した上清をヘパリンカラム (Hi Prep HeparinFF16/10) に供し、バッファーHとバッファーI（組成：10 mM Tris-HCl(pH8.0)、1000 mM NaCl、1 mM DTT、10%グリセロール）を用いてリニアグラジエントで溶出させた。その溶出画分をバッファーHを用いて透析した。夾雑タンパク質が見られたため熱処理をもう一度1.5mLチューブに1mLずつ分注し、85℃、30分ヒートブロックにて熱処理及び精製を行い、K4polL329Aを得た。
【0089】
試験例1-4．DNA依存性DNAポリメラーゼ（RTX）の調製
pET21a-RTX（アミノ酸配列：配列番号8、塩基配列：配列番号9）を用いてそれぞれE. coli BL21 CodonPlus DE3 (RIL) を形質転換し、LB培地（10 mL）で37℃、一晩前培養を行い、新たなLB培地（2 L）に1%植菌した。そして、OD660 = 0.5になるまで37℃で好気培養し、終濃度1 mM IPTGを添加して、4時間、37℃で好気培養した。LB培地にはアンピシリン (50 μg/ mL)を添加している。培養液を集菌し、0.8%NaClで洗菌後、1Lの菌体あたり、15 mLのバッファーJ（組成：10 mMリン酸カリウムバッファー (pH 7.0)、1 mM ジチオスレイトール、10% グリセロール、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸、100 mM NaCl）を加え、1L菌体あたり5分×3回超音波破砕を行った (Out put 4, Duty Cycle 40)。破砕液を14,000 rpm、30分間遠心し、上清を回収した。そして上清を85℃で25分熱処理し、再び14,000 rpm、30分間遠心した。上清を用いてヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。上清をHi-Trap Heparin column (5 mL) へ供し、1 M NaCl を含むバッファーJで目的タンパク質を室温でグラジエント溶出（20カラム体積）させた。SDS-PAGEで目的タンパク質の画分を確認し、得られた画分をバッファーAで透析した。次に、上清を用いて陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。上清をHi-Trap SP column (5 mL) へ供し、1 M NaCl を含むバッファーJで目的タンパク質を室温でグラジエント溶出（20カラム体積）させた。SDS-PAGEで目的タンパク質の画分を確認し、画分をAmicon-Ultra 30 kDa-cutで遠心濃縮（3000×g、4℃）した。濃縮液をバッファーK（組成：50 mM Tris-Cl (pH 8.0)、50% グリセロール、0.1% Tween-20、50 mM KCl、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸、1 mM ジチオスレイトール）で透析し、RTXを得た。
pET21a-RTX（アミノ酸配列：配列番号8、塩基配列：配列番号9）を用いてそれぞれE. coli BL21 CodonPlus DE3 (RIL) を形質転換し、LB培地（10 mL）で37℃、一晩前培養を行い、新たなLB培地（2 L）に1%植菌した。そして、OD660 = 0.5になるまで37℃で好気培養し、終濃度1 mM IPTGを添加して、4時間、37℃で好気培養した。LB培地にはアンピシリン (50 μg/ mL)を添加している。培養液を集菌し、0.8%NaClで洗菌後、1Lの菌体あたり、15 mLのバッファーJ（組成：10 mMリン酸カリウムバッファー (pH 7.0)、1 mM ジチオスレイトール、10% グリセロール、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸、100 mM NaCl）を加え、1L菌体あたり5分×3回超音波破砕を行った (Out put 4, Duty Cycle 40)。破砕液を14,000 rpm、30分間遠心し、上清を回収した。そして上清を85℃で25分熱処理し、再び14,000 rpm、30分間遠心した。上清を用いてヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。上清をHi-Trap Heparin column (5 mL) へ供し、1 M NaCl を含むバッファーJで目的タンパク質を室温でグラジエント溶出（20カラム体積）させた。SDS-PAGEで目的タンパク質の画分を確認し、得られた画分をバッファーAで透析した。次に、上清を用いて陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。上清をHi-Trap SP column (5 mL) へ供し、1 M NaCl を含むバッファーJで目的タンパク質を室温でグラジエント溶出（20カラム体積）させた。SDS-PAGEで目的タンパク質の画分を確認し、画分をAmicon-Ultra 30 kDa-cutで遠心濃縮（3000×g、4℃）した。濃縮液をバッファーK（組成：50 mM Tris-Cl (pH 8.0)、50% グリセロール、0.1% Tween-20、50 mM KCl、0.1 mM エチレンジアミン四酢酸、1 mM ジチオスレイトール）で透析し、RTXを得た。
【0090】
試験例2．ワンステップRT-PCR試験
以下、特に断りの無い限り、RT-PCRは次のようにして行った。臨床サンプルは医療機関から入手した。RNAは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）によって、少なくとも19の喀痰、59の鼻咽頭スワブ、および6つの唾液サンプルを含む合計127の症例から抽出した。UNG（Uracil-DNA Glycosylase）、RNase阻害剤、デオキシリボヌクレオチド：dNTP混合物（A、C、G、T）、およびdNTP混合物（A、C、G、U）は東洋紡から購入した。ワンステップRT-PCRは、QuantStudio 5リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）を使用して実行した。RNAコピー数は、同時にテストされた標準曲線から推定した。2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）のプライマーとプローブは、CDC（アメリカ疾病予防管理センター）からの報告に従って合成した。2019-nCoV_N1フォワードプライマー：GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT（配列番号10）、2019-nCoV_N1リバースプライマー：TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG（配列番号11）、2019-nCoV_N1プローブ：FAM- ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC（配列番号12）TAMRA、2019-nCoV_N2フォワードプライマー：TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA（配列番号13）、2019-nCoV_N2リバースプライマー：GCG CGA CAT TCC GAA GAA（配列番号14）、2019-nCoV_N2プローブ：FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG（配列番号15） -TAMRA、RNase Pフォワードプライマー：AGA TTT GGA CCT GCG AGC G（配列番号16）、RNase Pリバースプライマー：GAG CGG CTG TCT CCA CAAGT（配列番号17）。RNase Pプローブは、CDCからの報告に従ってMGBクエンチャーを付加したプローブを合成した。RNase Pプローブ：VIC-TTC TGA CCT GAA GGC T-MGB（Thermo FisherScientific）。 COVID-19 CDC N1およびN2プライマーセット（US-CDC-N1N2-PC）の合成標準RNAは、日本遺伝子研究所から107コピー/μLの濃度で購入した。次に、標準RNAをRNAグレードTEバッファー（ナカライテスク）で105、104、103、102、10、5コピー/μLに段階希釈した。本発明のワンステップRT-PCRデータと、市販のワンステップRT-PCRキット（SARS-CoV-2ダイレクトPCR検出キット、タカラバイオ社）のデータを比較する場合は、感度、特異度、陽性予測値（NPV）、陰性予測値（NPV）、二変量関係を解析した。感度、特異度、陽性予測値（NPV）、陰性予測値（NPV）、二変量関係をJMP 10ソフトウェア（SAS）を用いて解析した。
以下、特に断りの無い限り、RT-PCRは次のようにして行った。臨床サンプルは医療機関から入手した。RNAは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）によって、少なくとも19の喀痰、59の鼻咽頭スワブ、および6つの唾液サンプルを含む合計127の症例から抽出した。UNG（Uracil-DNA Glycosylase）、RNase阻害剤、デオキシリボヌクレオチド：dNTP混合物（A、C、G、T）、およびdNTP混合物（A、C、G、U）は東洋紡から購入した。ワンステップRT-PCRは、QuantStudio 5リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）を使用して実行した。RNAコピー数は、同時にテストされた標準曲線から推定した。2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）のプライマーとプローブは、CDC（アメリカ疾病予防管理センター）からの報告に従って合成した。2019-nCoV_N1フォワードプライマー：GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT（配列番号10）、2019-nCoV_N1リバースプライマー：TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG（配列番号11）、2019-nCoV_N1プローブ：FAM- ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC（配列番号12）TAMRA、2019-nCoV_N2フォワードプライマー：TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA（配列番号13）、2019-nCoV_N2リバースプライマー：GCG CGA CAT TCC GAA GAA（配列番号14）、2019-nCoV_N2プローブ：FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG（配列番号15） -TAMRA、RNase Pフォワードプライマー：AGA TTT GGA CCT GCG AGC G（配列番号16）、RNase Pリバースプライマー：GAG CGG CTG TCT CCA CAAGT（配列番号17）。RNase Pプローブは、CDCからの報告に従ってMGBクエンチャーを付加したプローブを合成した。RNase Pプローブ：VIC-TTC TGA CCT GAA GGC T-MGB（Thermo FisherScientific）。 COVID-19 CDC N1およびN2プライマーセット（US-CDC-N1N2-PC）の合成標準RNAは、日本遺伝子研究所から107コピー/μLの濃度で購入した。次に、標準RNAをRNAグレードTEバッファー（ナカライテスク）で105、104、103、102、10、5コピー/μLに段階希釈した。本発明のワンステップRT-PCRデータと、市販のワンステップRT-PCRキット（SARS-CoV-2ダイレクトPCR検出キット、タカラバイオ社）のデータを比較する場合は、感度、特異度、陽性予測値（NPV）、陰性予測値（NPV）、二変量関係を解析した。感度、特異度、陽性予測値（NPV）、陰性予測値（NPV）、二変量関係をJMP 10ソフトウェア（SAS）を用いて解析した。
【0091】
試験例2-1．酵素の組合せ及び反応バッファーの検討
精製ヒトtotal RNAを添加したMgCl2、Mn(OCOCH3)2、Bicine-KOH(pH8.2)、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、およびCH3COOKの異なる濃度の5つの異なる緩衝液を調製した（表２及び表３）。MM4と各DNAポリメラーゼ（M1polTth、K4polL329A、又はRTX）を混合してワンステップRT-PCRを行い、SARS-CoV-2 RNAの104コピーを確認した。具体的な条件は以下の表１の通りである。
精製ヒトtotal RNAを添加したMgCl2、Mn(OCOCH3)2、Bicine-KOH(pH8.2)、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、およびCH3COOKの異なる濃度の5つの異なる緩衝液を調製した（表２及び表３）。MM4と各DNAポリメラーゼ（M1polTth、K4polL329A、又はRTX）を混合してワンステップRT-PCRを行い、SARS-CoV-2 RNAの104コピーを確認した。具体的な条件は以下の表１の通りである。
【0092】
【表1】
【0093】
その結果、M1polTthは1から5までの全てのバッファーで特異的なRNAを検出することができたのに対し、K4polL329Aはバッファー1、3、5でのみ増幅することができた（図１～５）。一方、RTXは、RNAの増幅を示さなかった（図１～５）。逆転写酵素としてMM4を用い且つDNAポリメラーゼとしてM1polTthを用いることで、より多様な組成の反応バッファーを採用可能であることがわかった。図１～５では、M1polTthをM1polTth、K4polL329AをK4polL329Aと示す。
【0094】
【表2】
【0095】
【表3】
【0096】
試験例2-2．検出限界、逆転写反応時間の検討
各バッファーにおけるRNA検出限界を調べた。DNAポリメラーゼとしてM1polTthを使用し、SARS-CoV-2 RNAの105、104、103、102、10、5コピーを確認する以外は、試験例2-1と同様にして行った。その結果、Buffer 1、3、5では、100コピーのRNAが検出された（表４）。一方、Buffer 2では10コピー、Buffer 4では5コピーのRNAが最大45回のPCRサイクルで検出された（表４）。
各バッファーにおけるRNA検出限界を調べた。DNAポリメラーゼとしてM1polTthを使用し、SARS-CoV-2 RNAの105、104、103、102、10、5コピーを確認する以外は、試験例2-1と同様にして行った。その結果、Buffer 1、3、5では、100コピーのRNAが検出された（表４）。一方、Buffer 2では10コピー、Buffer 4では5コピーのRNAが最大45回のPCRサイクルで検出された（表４）。
【0097】
【表4】
【0098】
続いて、逆転写反応時間について検討した。逆転写酵素としてMM4を用いた。10,000又は100コピーのサンプルを用いて、50℃で30秒、5分間、10分間、又は15分間で逆転写反応を行った。その結果、いずれの反応時間においても、逆転写反応の進行が確認された（図６）。標準プロトコールとして、逆転写反応時間は臨床で使用する場合は5分とした。
【0099】
増幅されたDNAキャリーオーバーによるPCRのコンタミネーションが問題となっている。そこで、本発明のワンステップRT-PCR法へのUNGの適用性を検討した。RNase P遺伝子は、コロナウイルス検出システムの内部標準として使用されてきた。そこで、CDCプライマーとプローブセットを用いてRNase Pの同時検出が可能かどうかを検討した結果、本発明の方法が問題なく内部標準として使用できることがわかった。ワンステップ RT-PCR の条件と試薬を表５及び表６に示す。本発明のワンステップRT-PCRキットをMother's and Children's, Osaka (MoCO) キットとした（本明細書において、MoCO kitと示すことがある）。
【0100】
【表5】
【0101】
【表6】
【0102】
試験例2-3．市販キットとの整合性の検討
臨床用RNA検体は使用前に-80℃で保存し、解凍後、MoCOキットと市販のキット（タカラバイオ社）を用いてワンステップRT-PCRを行った。両キットを用いて合計127検体のRNAを試験した。MoCOキットはCDCプローブのN1とN2を別々に検出するが、タカラバイオ社のキットでは両プローブが混合されている。MoCOキットの精度を確認するために、1)検出限界を10、5、1コピーに設定し、2)N1プローブまたはN2プローブによる増幅のいずれかがMoCOキットの検出限界を超えた場合、そのサンプルは陽性と判断した。検出限界 10 コピーの場合、感度は 97.7%、特異度は 100%、PPV は 100%、NPV は 95.2%であった。検出限界 5 コピーの場合、感度 97.8％、特異度 100％、PPV 100％、NPV 94.6％であった。検出限界1コピーの場合は、感度100％、特異度100％、PPV100％、NPV100％であった（表７）。線形回帰分析も良好にフィットしていた（図７～９）。以上の結果から、MoCOキットはSARS-CoV-2 RNA定量検出に臨床的に有用な方法であることが分かった。
臨床用RNA検体は使用前に-80℃で保存し、解凍後、MoCOキットと市販のキット（タカラバイオ社）を用いてワンステップRT-PCRを行った。両キットを用いて合計127検体のRNAを試験した。MoCOキットはCDCプローブのN1とN2を別々に検出するが、タカラバイオ社のキットでは両プローブが混合されている。MoCOキットの精度を確認するために、1)検出限界を10、5、1コピーに設定し、2)N1プローブまたはN2プローブによる増幅のいずれかがMoCOキットの検出限界を超えた場合、そのサンプルは陽性と判断した。検出限界 10 コピーの場合、感度は 97.7%、特異度は 100%、PPV は 100%、NPV は 95.2%であった。検出限界 5 コピーの場合、感度 97.8％、特異度 100％、PPV 100％、NPV 94.6％であった。検出限界1コピーの場合は、感度100％、特異度100％、PPV100％、NPV100％であった（表７）。線形回帰分析も良好にフィットしていた（図７～９）。以上の結果から、MoCOキットはSARS-CoV-2 RNA定量検出に臨床的に有用な方法であることが分かった。
【0103】
【表7】
【0104】
試験例３ ワンステップRT-PCR試験を用いたSNP解析－１
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の各種の変異ウイルス（N501Y変異株、アルファ株、デルタ株、オミクロン株）の検出を試みた。
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の各種の変異ウイルス（N501Y変異株、アルファ株、デルタ株、オミクロン株）の検出を試みた。
【0105】
（３－１）N501Y変異株の検出
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（N501Y変異株）の検出可否を検討した。N501Y変異株検出用のプライマーとプローブを用いた。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を以下の表８及び表９に示す。
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（N501Y変異株）の検出可否を検討した。N501Y変異株検出用のプライマーとプローブを用いた。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を以下の表８及び表９に示す。
【0106】
【表8】
【0107】
【表9】
【0108】
その結果、N501Y変異株を検出することができた。蛍光色素FAMはWild typeウイルス、蛍光色素VICは変異ウイルス（N501Y変異株）を検出し、FAM Ct値 ＞ VIC Ct値であればN501Y変異株、FAM Ct値 ＜ VIC Ct値であればWild typeウイルスを示す。検出結果を表１０に示す。当該結果より、全サンプル中の半分以上のサンプルにて、N501Y変異株が検出された。以上の結果から、MoCOキットはSNP解析に有用な方法であることがわかった。
【0109】
【表10】
【0110】
（３－２）アルファ株、デルタ株の検出 MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（アルファ株、デルタ株）の検出可否を検討した。６９－７０の欠失変異の検出は表８の組成及び表１２の条件にて実施した。プライマーとプローブはYale大学からの報告に従って合成した。SARS-CoV-2 69/70del-フォワードプライマー：TCAACTCAGGACTTGTTCTTACCT（配列番号１８）、SARS-CoV-2 69/70del-リバースプライマー：TGGTAGGACAGGGTTATCAAAC（配列番号１９）、SARS-CoV-2 69/70del FAM(WT)プローブ：TTCCATGCTATACATGTCTCTGGGA（配列番号２０）、SARS-CoV-2 69/70 VIC(del)プローブ：TGGTTCCATGCTATCTCTGGGACCA（配列番号２１）。また、L452Rの検出は、Primer/Probe L452R (SARS-CoV-2) ver.2（タカラバイオ社）を用いた。
MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（ 5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。L452Rの検出の具体的な条件を以下の表１１及び表１２に示す。
MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（ 5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。L452Rの検出の具体的な条件を以下の表１１及び表１２に示す。
【0111】
【表11】
【0112】
【表12】
【0113】
その結果、アルファ株又はデルタ株を検出することができた。６９－７０のアミノ酸欠失が検出された株はアルファ株、L452Rの変異が検出された株はデルタ株を示す。MoCO Kitを用いたPCR判定結果及び次世代シーケンサーを用いた判定結果を表１３に示す。当該結果より、いずれの方法も同一の判定結果を示すことがわかった。以上の結果から、MoCOキットはSNP解析に有用な方法であることがわかった。
【0114】
【表13】
【0115】
（３－３）オミクロン株の検出
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（オミクロン株）の検出可否を検討した。E484Aの検出は、Primer/Probe E484A (SARS-CoV-2) （タカラバイオ社）を用いた。
MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を表１１及び表１２（L452R検出条件で50cycle）に示す。
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（オミクロン株）の検出可否を検討した。E484Aの検出は、Primer/Probe E484A (SARS-CoV-2) （タカラバイオ社）を用いた。
MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を表１１及び表１２（L452R検出条件で50cycle）に示す。
【0116】
その結果、オミクロン株を検出することができた。E484Aの変異が検出され、L452Rの変異が検出されない（L452 WT）株はオミクロン株を示す。MoCO Kitを用いたPCR判定結果及び次世代シーケンサーを用いた判定結果を表１４に示す。当該結果より、いずれの方法も同一の判定結果を示すことがわかった。以上の結果から、MoCOキットはSNP解析に有用な方法であることがわかった。
【0117】
【表14】
【0118】
試験例４ ワンステップRT-PCR試験を用いたSNP解析－２
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（N501Y変異株）を検出し、市販キット（タカラバイオ社）との比較を行った。N501Y変異株検出用のプライマーとプローブを用いた。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を以下の表１５及び表９に示す。
MoCOキットを用いて、2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）の変異ウイルス（N501Y変異株）を検出し、市販キット（タカラバイオ社）との比較を行った。N501Y変異株検出用のプライマーとプローブを用いた。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いてワンステップRT-PCRを行った。具体的な条件を以下の表１５及び表９に示す。
【0119】
【表15】
【0120】
結果を表１６に示す。市販キット及びMoCO kitにて、BMSC1～17サンプルはN501Y変異株、BMSC18～36サンプルはWild typeウイルスであることを示した。当該結果より、MoCO kitは市販キットと同等の検出感度を示すことがわかった。
【0121】
【表16】
【0122】
試験例５ ワンステップRT-PCR試験を用いたDNAウイルス遺伝子の検出
MoCOキットを用いて、様々なDNAウイルス遺伝子の検出可否を検討し、市販キットとの比較を行った。検出対象のDNAウイルスとして、HSV1, HSV2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV7の人工遺伝子（DNAスタンダード）を用いた。実験に用いたDNAスタンダード、プライマー及びプローブを表１７に示す。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いて、表８及び表９の条件にて、ワンステップRT-PCRを行った。
MoCOキットを用いて、様々なDNAウイルス遺伝子の検出可否を検討し、市販キットとの比較を行った。検出対象のDNAウイルスとして、HSV1, HSV2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV7の人工遺伝子（DNAスタンダード）を用いた。実験に用いたDNAスタンダード、プライマー及びプローブを表１７に示す。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いて、表８及び表９の条件にて、ワンステップRT-PCRを行った。
【0123】
【表17】
【0124】
結果を表１８～２４に示す。HSV1, HSV2, VZV, CMV, HHV6, HHV7は５コピーのDNAを検出することができ、EBVは５０コピーのDNAを検出することができた。市販のキット（タカラバイオ社）と同等以上の検出感度を示した。
【0125】
【表18】
【0126】
【表19】
【0127】
【表20】
【0128】
【表21】
【0129】
【表22】
【0130】
【表23】
【0131】
【表24】
【0132】
試験例６ ワンステップRT-PCR試験を用いたウレアプラズマDNAの検出
MoCOキットを用いて、ウレアプラズマDNAの検出可否を検討した。以下に示すDNAスタンダード、プライマー及びプローブを用いた。DNAスタンダード：16S-urea/pT7 プラスミドDNA、16S-Urea common フォワードプライマー：AGGCATGCGTCTAGGGTAGGA（配列番号２２）、16S-Urea common リバースプライマー：ACGTTCTCGTAGGGATACCTTGTTA（配列番号２３）、16S-Urea common プローブ：FAM-CGGTGACTGGAGTTAA（配列番号２４）-MGB。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いて、表２５及び表２６の条件にて、ワンステップRT-PCRを行った。
MoCOキットを用いて、ウレアプラズマDNAの検出可否を検討した。以下に示すDNAスタンダード、プライマー及びプローブを用いた。DNAスタンダード：16S-urea/pT7 プラスミドDNA、16S-Urea common フォワードプライマー：AGGCATGCGTCTAGGGTAGGA（配列番号２２）、16S-Urea common リバースプライマー：ACGTTCTCGTAGGGATACCTTGTTA（配列番号２３）、16S-Urea common プローブ：FAM-CGGTGACTGGAGTTAA（配列番号２４）-MGB。MM4（逆転写酵素）とM1polTth（DNAポリメラーゼ）を混合して、表２のバッファー４（5×RT PreMix 4）を用いて、表２５及び表２６の条件にて、ワンステップRT-PCRを行った。
【0133】
【表25】
【0134】
【表26】
【0135】
【0136】
【表27】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】