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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022144004
(43)【公開日】2022-10-03
(54)【発明の名称】サルモネラ菌の分析方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20220926BHJP
A23K 10/00 20160101ALI20220926BHJP
C12Q 1/689 20180101ALN20220926BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
A23K10/00
C12Q1/689 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021044831
(22)【出願日】2021-03-18
(71)【出願人】
【識別番号】000227009
【氏名又は名称】日清オイリオグループ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】篠原 久実
(72)【発明者】
【氏名】中島 明子
【テーマコード（参考）】
2B150
4B063
【Ｆターム（参考）】
2B150AA01
2B150AA05
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QS24
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
より迅速に（すなわち、従来よりも短時間で）サルモネラ菌の存在を検査できる検査方法を提供することを、課題とする。
【解決手段】
被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
【選択図】 なし
より迅速に（すなわち、従来よりも短時間で）サルモネラ菌の存在を検査できる検査方法を提供することを、課題とする。
【解決手段】
被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
【請求項2】
前記被験試料が、油粕である、請求項１に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
【請求項3】
前記インキュベート工程の後に、フィルトレーションをして、被験試料に含まれる残渣を除去した培養液を、前記遠心工程に供する、請求項１又は２に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
【請求項4】
前記インキュベート工程が、４～７時間以内で行われる、請求項１～３の何れか一項に記載の、サルモネラ属菌の検出方法。
【請求項5】
前記被験試料が、菜種粕であって、前記インキュベート工程の時間が６～７時間であるか、又は、前記被験試料が大豆粕であって、前記インキュベート工程の時間が５～６時間である、請求項４に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
【請求項6】
請求項１～５の何れか一項に記載のサルモネラ属菌の検出方法を含む、飼料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サルモネラ菌の分析方法、特に、家畜等に与える飼料に含まれるサルモネラ菌を分析する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
サルモネラ菌は、食中毒の原因となる細菌である。家畜等に与える飼料がサルモネラ菌に汚染されていると、当該飼料を食した家畜由来の食肉もサルモネラ菌に汚染されることとなり、食中毒の原因となり得る。
【0003】
このような状況下で、サルモネラ菌の迅速な検査方法が、種々開発されてきた。例えば特許文献１には、クイックジーン（登録商標）システムとＰＣＲ法との組み合わせにより、試料中のサルモネラ菌を検査する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許第６４５１００２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、検査に際し９～１１時間もの長時間を要していた。これにより、緊急の検査依頼に対応することができなかった。
したがって本発明は、より迅速に（すなわち、従来よりも短時間で）サルモネラ菌の存在を検査できる検査方法を提供することを課題とする。
したがって本発明は、より迅速に（すなわち、従来よりも短時間で）サルモネラ菌の存在を検査できる検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決する本発明は、以下の通りである。
［１］ 被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
［２］ 前記被験試料が、油粕である、［１］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［３］ 前記インキュベート工程の後に、フィルトレーションをして、被験試料に含まれる残渣を除去した培養液を、前記遠心工程に供する、［１］又は［２］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［４］ 前記インキュベート工程が、４～７時間以内で行われる、［１］～［３］の何れかに記載の、サルモネラ属菌の検出方法。
［５］ 前記被験試料が、菜種粕であって、前記インキュベート工程の時間が６～７時間であるか、又は、前記被験試料が大豆粕であって、前記インキュベート工程の時間が５～６時間である、［４］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［６］ ［１］～［５］の何れかに記載のサルモネラ属菌の検出方法を含む、飼料の製造方法。
［１］ 被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む、サルモネラ属菌の検出方法。
［２］ 前記被験試料が、油粕である、［１］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［３］ 前記インキュベート工程の後に、フィルトレーションをして、被験試料に含まれる残渣を除去した培養液を、前記遠心工程に供する、［１］又は［２］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［４］ 前記インキュベート工程が、４～７時間以内で行われる、［１］～［３］の何れかに記載の、サルモネラ属菌の検出方法。
［５］ 前記被験試料が、菜種粕であって、前記インキュベート工程の時間が６～７時間であるか、又は、前記被験試料が大豆粕であって、前記インキュベート工程の時間が５～６時間である、［４］に記載のサルモネラ属菌の検出方法。
［６］ ［１］～［５］の何れかに記載のサルモネラ属菌の検出方法を含む、飼料の製造方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、迅速にサルモネラ菌を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】試験例４において、従来法と本願発明に係る方法の検出感度を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明に係るサルモネラ属菌の検出方法は、被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程と、
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む。
本発明によれば、従来の方法と比較して迅速にサルモネラ属菌を検出することができる。
前記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して、集菌する遠心工程と、
前記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する、ライゼート液調製工程と、
前記ライゼート液から、核酸を抽出する、核酸抽出工程と、
サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程と、を含む。
本発明によれば、従来の方法と比較して迅速にサルモネラ属菌を検出することができる。
【0010】
本発明において「被験試料」は、サルモネラ属菌の存在又は非存在を検査したい試料であれば、特に制限されないが、飼料を被験試料とすることが好ましい。
本発明において「飼料」とは、家禽などが栄養目的で経口的に摂取するもの全てを意味する。具体的には養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、あるいは飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
本発明の好ましい形態では、被験試料が油粕である。ここで、本発明において「油粕」とは、農作物から油を搾り取った残渣であり、例えば菜種粕、綿実粕、茶実粕、大豆粕が含まれるが、これらに限定されない。本発明のより好ましい形態では、被験試料は、菜種粕及び／又は大豆粕である。
本発明において「飼料」とは、家禽などが栄養目的で経口的に摂取するもの全てを意味する。具体的には養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、あるいは飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
本発明の好ましい形態では、被験試料が油粕である。ここで、本発明において「油粕」とは、農作物から油を搾り取った残渣であり、例えば菜種粕、綿実粕、茶実粕、大豆粕が含まれるが、これらに限定されない。本発明のより好ましい形態では、被験試料は、菜種粕及び／又は大豆粕である。
【0011】
本発明において「サルモネラ属菌」とは、グラム陰性通性嫌気性桿菌の腸内細菌科の一属であるサルモネラ属に属する細菌のことであり、主にヒトや動物の消化管に生息する腸内細菌の一種である。サルモネラ属に属する細菌の一部は、ヒトや動物に経口感染して食中毒を引き起こす。サルモネラ属菌による食中毒は人獣共通の感染症である。以下、「サルモネラ属菌」を単に「サルモネラ」又は「サルモネラ菌」と記載する場合もある。
【0012】
本発明においては、第１に、被験試料を培地に分散して、サルモネラ属菌の培養条件下でインキュベートする、インキュベート工程を行う。
インキュベート工程におけるサルモネラ属菌の培養条件は特に制限されず、本分野において公知の条件を、被験試料にあわせて適宜採用、調整することができる。
インキュベート温度は、好ましくは３８℃以上、より好ましくは３９℃以上、さらに好ましくは４０℃以上、さらに好ましくは４１℃以上である。また、インキュベート温度は、好ましくは４４℃以下、より好ましくは４３℃以下である。
インキュベート時間は、好ましくは３時間以上、より好ましくは４時間以上、さらに好ましくは５時間以上である。また、インキュベート時間は、好ましくは１０時間以下、より好ましくは９時間以下、さらに好ましくは８時間以下、さらに好ましくは７時間以下である。
このような条件でインキュベートを行うことで、被験試料中にサルモネラ属菌が存在する場合には、これを培養することができる。
インキュベート工程におけるサルモネラ属菌の培養条件は特に制限されず、本分野において公知の条件を、被験試料にあわせて適宜採用、調整することができる。
インキュベート温度は、好ましくは３８℃以上、より好ましくは３９℃以上、さらに好ましくは４０℃以上、さらに好ましくは４１℃以上である。また、インキュベート温度は、好ましくは４４℃以下、より好ましくは４３℃以下である。
インキュベート時間は、好ましくは３時間以上、より好ましくは４時間以上、さらに好ましくは５時間以上である。また、インキュベート時間は、好ましくは１０時間以下、より好ましくは９時間以下、さらに好ましくは８時間以下、さらに好ましくは７時間以下である。
このような条件でインキュベートを行うことで、被験試料中にサルモネラ属菌が存在する場合には、これを培養することができる。
【0013】
被験試料が菜種粕である場合、インキュベート時間は、好ましくは４時間以上、より好ましくは５時間以上、さらに好ましくは６時間以上である。また、この場合、インキュベート時間は、好ましくは９時間以下、より好ましくは８時間以下、さらに好ましくは７時間以下である。
【0014】
被験試料が大豆粕である場合、インキュベート時間は、好ましくは４時間以上、より好ましくは５時間以上である。また、この場合、インキュベート時間は、好ましくは８時間以下、より好ましくは７時間以下、さらに好ましくは６時間以下である。
【0015】
インキュベート工程において使用する培地は、サルモネラ属菌を培養することができれば特に制限されず、本分野において公知の非選択的及び／又は軽度に選択的な一般的細菌用増殖培地を適宜採用することができる。例えば、ＭＰ培地、ＢＰＷ、ＥＥＭブイヨン、ＢＬＢ培地又はこれと同様なタイプの培地が含まれる。本培地は、潜在的に損傷を受けたサルモネラの迅速な回復と増殖を可能にする非選択培地及び／又は軽度に選択的な培地のいずれでもよく、さらに、十分なサルモネラの増殖を可能にし、その結果、サルモネラが最初のサンプルに存在している場合には、少なくとも１個の生存力のあるサルモネラを含むことが可能となるように調製できる培地が含まれる。
適切な非選択増殖培地の例としては、ＭＰ培地（ＭＰ Ｍｅｄｉａ、ＭＰ）、緩衝ペプトン水（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｗａｔｅｒ、ＢＰＷ）、ＥＥＭブイヨン（ＥＥＭ Ｂｒｏｔｈ、ＥＥＭ）、ＢＴＢ加乳糖ブイヨン（Ｌａｃｔｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ＢＴＢ、ＢＬＢ）及び当業者に既知の他の非選択的培地及び／又は軽度に選択的培地が挙げられる。以上の培地は、デュポン株式会社（ＭＰ培地）、関東化学株式会社（ＢＰＷ）、メルク社（ＥＥＭ培地、ＬＢ培地）から入手可能である。この中で特に本発明で使用される好ましい培地は、ＭＰ培地である。
適切な非選択増殖培地の例としては、ＭＰ培地（ＭＰ Ｍｅｄｉａ、ＭＰ）、緩衝ペプトン水（Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｗａｔｅｒ、ＢＰＷ）、ＥＥＭブイヨン（ＥＥＭ Ｂｒｏｔｈ、ＥＥＭ）、ＢＴＢ加乳糖ブイヨン（Ｌａｃｔｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ ＢＴＢ、ＢＬＢ）及び当業者に既知の他の非選択的培地及び／又は軽度に選択的培地が挙げられる。以上の培地は、デュポン株式会社（ＭＰ培地）、関東化学株式会社（ＢＰＷ）、メルク社（ＥＥＭ培地、ＬＢ培地）から入手可能である。この中で特に本発明で使用される好ましい培地は、ＭＰ培地である。
【0016】
増菌用の培地成分としては、サルモネラの生育に適したものが選択される。例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の栄養成分、乳糖、ブドウ糖等の糖類、及びサルモネラ以外の細菌の生育を抑制するための選択剤や抗生物質を含有する培地成分が用いられる。
糖類としては、被検体試料中に混在している可能性が高い大腸菌群が特に資化する乳糖を用いるのが、サルモネラに対する選択性を向上させる上で好ましい。選択剤としては、マラカイトグリーンや塩化マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、胆汁酸塩類等が好ましく、さらに抗生物質としては、プロテウス属に有効なノボビオシンの添加が有効である。ノボビオシン又はそのナトリウム塩は１～５０μｇ／ｍｌの濃度で添加できる。好ましくはノボビオシンの濃度は２０～４０μｇ／ｍｌで、より好ましい濃度は約２５μｇ／ｍｌである。また、他の抗生物質（例えばバンコマイシン、ペニシリン、アンピシリン及びアミカシン）を適切な濃度で培地に添加することもできる。
糖類としては、被検体試料中に混在している可能性が高い大腸菌群が特に資化する乳糖を用いるのが、サルモネラに対する選択性を向上させる上で好ましい。選択剤としては、マラカイトグリーンや塩化マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、胆汁酸塩類等が好ましく、さらに抗生物質としては、プロテウス属に有効なノボビオシンの添加が有効である。ノボビオシン又はそのナトリウム塩は１～５０μｇ／ｍｌの濃度で添加できる。好ましくはノボビオシンの濃度は２０～４０μｇ／ｍｌで、より好ましい濃度は約２５μｇ／ｍｌである。また、他の抗生物質（例えばバンコマイシン、ペニシリン、アンピシリン及びアミカシン）を適切な濃度で培地に添加することもできる。
【0017】
第２に、上記インキュベート工程で得られた培養液を遠心して集菌する、遠心工程を行う。
遠心工程を含むことによって、培養したサルモネラ属菌を効率よく集菌することができるため、従来と比較してインキュベート時間が短時間でも、後述する核酸検出工程でサルモネラ属菌を検出するために必要な核酸量を確保するために十分な量のサルモネラ属菌を得ることができる。したがって本発明によれば、迅速なサルモネラ属菌の検査ができる。
遠心工程を含むことによって、培養したサルモネラ属菌を効率よく集菌することができるため、従来と比較してインキュベート時間が短時間でも、後述する核酸検出工程でサルモネラ属菌を検出するために必要な核酸量を確保するために十分な量のサルモネラ属菌を得ることができる。したがって本発明によれば、迅速なサルモネラ属菌の検査ができる。
【0018】
本発明の好ましい形態では、インキュベート工程の後に、フィルトレーションをして、被験試料に含まれる残渣を除去した培養液を、遠心工程に供する。
フィルトレーションをすることにより、被験試料に由来する残渣が除かれるため、核酸抽出工程を効率的に行うことができる。
フィルトレーションの方法は、被験試料に由来する残渣を除くことができれば、特に限定されない。フィルトレーションの容易性の観点から、一般的に入手可能なフィルター付きストマッカー袋で被験試料を培養し、フィルター通過側の培養液（すなわち、残渣が除去された培養液）を使用することで、フィルトレーションをした培養液を得ることができる。
フィルトレーションをすることにより、被験試料に由来する残渣が除かれるため、核酸抽出工程を効率的に行うことができる。
フィルトレーションの方法は、被験試料に由来する残渣を除くことができれば、特に限定されない。フィルトレーションの容易性の観点から、一般的に入手可能なフィルター付きストマッカー袋で被験試料を培養し、フィルター通過側の培養液（すなわち、残渣が除去された培養液）を使用することで、フィルトレーションをした培養液を得ることができる。
【0019】
培養液の遠心方法は特に制限されず、本分野において公知の方法で遠心し、集菌することができる。例えば、一般的な遠心機を用いて、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心することで、集菌することができる。
本発明の好ましい形態では、上記遠心工程で集菌した菌体をＰＢＳ等の緩衝液に再懸濁し、これを遠心分離して上清を除去することで、菌体からの残留培養液の除去洗浄を行う。この残留培養液の除去洗浄は、複数回行ってもよい。
本発明の好ましい形態では、上記遠心工程で集菌した菌体をＰＢＳ等の緩衝液に再懸濁し、これを遠心分離して上清を除去することで、菌体からの残留培養液の除去洗浄を行う。この残留培養液の除去洗浄は、複数回行ってもよい。
【0020】
第３に、上記遠心工程で得られた菌体から、ライゼート液を調製する。ライゼート液の調製は、本分野で公知の方法やキットを使用して、調製することができる。例えば、遠心工程の後に、上清を除去し、一般的に入手可能なキットに含まれる溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）と混合することで、ライゼート液を調製することができる。
【0021】
第４に、上記ライゼート液調製工程で調製したライゼート液から核酸を抽出する。菌体から核酸を抽出する方法は特に制限されず、一般的に入手可能な核酸抽出キットを使用して、抽出することができる。
【0022】
本発明において「核酸」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは修飾されたり、又は修飾された塩基を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、２～６０のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。ポリヌクレオチドは、２以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆相補的配列のオリゴヌクレオチドとアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ、単一鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスを含む単一鎖核酸重合体でありうる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、切片化された核酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【0023】
最後に、上記核酸抽出工程で抽出した核酸を、サルモネラ属菌の核酸をターゲットとするプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ法で核酸増幅し、ＡＴＰ検出法により検出する、核酸検出工程を行う。
【0024】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、標的遺伝子の６か所の領域に対して４種類のプライマーを設計し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることを特徴とする、核酸増幅方法である。
核酸増幅方法として、ＬＡＭＰ法を採用することで、ＰＣＲのように特別な機器を使用しなくとも、一定時間等温状態を維持することができれば、上記核酸抽出工程で抽出した核酸を増幅することができる。
なおＬＡＭＰ法は、国際公開２００１－３４７９０号公報に記載の方法で行うことができる。また、一般的に入手可能な、ＬＡＭＰ法を実行するためのキットを使用することでも、実行することができる。
核酸増幅方法として、ＬＡＭＰ法を採用することで、ＰＣＲのように特別な機器を使用しなくとも、一定時間等温状態を維持することができれば、上記核酸抽出工程で抽出した核酸を増幅することができる。
なおＬＡＭＰ法は、国際公開２００１－３４７９０号公報に記載の方法で行うことができる。また、一般的に入手可能な、ＬＡＭＰ法を実行するためのキットを使用することでも、実行することができる。
【0025】
ＡＴＰ検出法は、遺伝子増幅された際に出現するピロリン酸塩及び３′ホスフォアデノシン５′ホスフォ硫酸をＡＴＰスルフリラーゼでの付加反応によりＡＴＰを産生させ，これをルシフェラーゼにより発光検出することにより，特定遺伝子の検出を行う方法である。
ＡＴＰ検出法は発光検出のため、励起光源が不要となる。またＡＴＰ検出法による検出は、蛍光検出よりも高感度で核酸を検出することができる。
ＡＴＰ検出法は、一般的に入手可能な試薬を用いることで、実行することができる。
ＡＴＰ検出法は発光検出のため、励起光源が不要となる。またＡＴＰ検出法による検出は、蛍光検出よりも高感度で核酸を検出することができる。
ＡＴＰ検出法は、一般的に入手可能な試薬を用いることで、実行することができる。
【0026】
本発明においては、ＬＡＭＰ法による核酸増幅と、ＡＴＰ検出法による核酸検出とを、同一の機器を用いて実行することができる。
例えば、スリーエムヘルスケア株式会社より発売されている３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（以下、ＭＤＳともいう）を用いることで、ＬＡＭＰ法による核酸増幅の後、引き続いてＡＴＰ検出法による核酸検出を行うことができる。
例えば、スリーエムヘルスケア株式会社より発売されている３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（以下、ＭＤＳともいう）を用いることで、ＬＡＭＰ法による核酸増幅の後、引き続いてＡＴＰ検出法による核酸検出を行うことができる。
【0027】
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーセットは、サルモネラ属菌の核酸配列に基づいて、適宜設計することができる。サルモネラ属菌の例示的な核酸配列は、例えば下記文献に記載されている。
ＬｉｕＷＱ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｃ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９；４（２）：ｅ４５１０；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＮＲ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＰＴ４ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ２８７／９１ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｈｏｓｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ，“Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８ Ｏｃｔ；１８（１０）：１６２４－３７；ＥｎｃｈｅｖａＶ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｐｕｌｌｏｒｕｍ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓＩ”，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５ Ｊｕｌ １８；５：４２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ Ｔｙｐｈｉ，ｈｕｍａｎ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｔｙｐｈｏｉｄ”，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００４ Ｄｅｃ；３６（１２）：１２６８－７４；Ｃｈｉｕ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，“Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２００４ Ａｐｒ；１７（２）：３１１－２２；Ｄｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ Ｔｙ２ ａｎｄ ＣＴ１８，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３ Ａｐｒ；１８５（７）：２３３０－７；Ｐａｒｋｈｉｌ ｌＪ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ Ｃ Ｔ１８”，Ｎａｔｕｒｅ，２００ １Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８４８－５２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２，“Ｎａｔｕｒｅ，２００１ Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８５２－６．
ＬｉｕＷＱ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｃ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９；４（２）：ｅ４５１０；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＮＲ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＰＴ４ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ２８７／９１ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｈｏｓｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ，“Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８ Ｏｃｔ；１８（１０）：１６２４－３７；ＥｎｃｈｅｖａＶ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｎｄ Ｐｕｌｌｏｒｕｍ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓＩ”，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５ Ｊｕｌ １８；５：４２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ａｎｄ Ｔｙｐｈｉ，ｈｕｍａｎ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｔｙｐｈｏｉｄ”，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００４ Ｄｅｃ；３６（１２）：１２６８－７４；Ｃｈｉｕ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，“Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２００４ Ａｐｒ；１７（２）：３１１－２２；Ｄｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ Ｔｙ２ ａｎｄ ＣＴ１８，”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００３ Ａｐｒ；１８５（７）：２３３０－７；Ｐａｒｋｈｉｌ ｌＪ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ Ｃ Ｔ１８”，Ｎａｔｕｒｅ，２００ １Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８４８－５２；ＭｃＣｌｅｌｌ ａｎｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２，“Ｎａｔｕｒｅ，２００１ Ｏｃｔ ２５；４１３（６８５８）：８５２－６．
【0028】
またプライマーセットは、本分野において公知の方法及び機器によって、合成することができる。
【0029】
以下、実施例を参照して、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されない。
【0030】
＜試験例１＞ＭＤＳで陽性となるサルモネラ属菌の菌数の確認
試験例１では、３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（ＭＤＳ）を利用して核酸抽出工程及び核酸検出工程を行った場合に陽性となるサルモネラ属菌の菌数を確認した。
試験例１では、３ＭＴＭ病原菌自動検出システム（ＭＤＳ）を利用して核酸抽出工程及び核酸検出工程を行った場合に陽性となるサルモネラ属菌の菌数を確認した。
【0031】
試験例１は、以下のように行った。
（１）ハートインフュージョン寒天培地（ＨＩＡ培地）で純粋培養したサルモネラ菌を、ハートインフュージョン液体培地（ＨＩＢ培地）４５０μＬに接種し、３５℃で１４時間程度培養し、菌数がおよそ１０９個の菌原液を得た。
（２）上記（１）で得た菌原液を、１００μＬ当たりの菌数が１０５～１０１個となるように希釈し、菌数の異なる希釈済み菌液を得た。
（３）上記（２）で得た希釈済み菌液各２０μＬを、ＭＤＳを用いて、サルモネラ菌の核酸抽出及び核酸検出を行った。ＭＤＳは、製造元提供のプロトコルに基づいて操作した。
（４）上記（２）で得られた希釈済み菌液のうち、推定菌数が１０３個の菌液と１０２個の菌液をＤＨＬ寒天培地に１００μＬ塗抹し、３５℃で２４時間培養して、定型集落数を確認した。
ＭＤＳ検査の結果と、定型集落数から求めた検査菌数（ｃｆｕ／ｇ）を、下記表１に示す。表１中、「（＋）」はＭＤＳ検査で陽性となったことを表し、「（－）」はＭＤＳ検査で陰性となったことを示す。また表１中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
（１）ハートインフュージョン寒天培地（ＨＩＡ培地）で純粋培養したサルモネラ菌を、ハートインフュージョン液体培地（ＨＩＢ培地）４５０μＬに接種し、３５℃で１４時間程度培養し、菌数がおよそ１０９個の菌原液を得た。
（２）上記（１）で得た菌原液を、１００μＬ当たりの菌数が１０５～１０１個となるように希釈し、菌数の異なる希釈済み菌液を得た。
（３）上記（２）で得た希釈済み菌液各２０μＬを、ＭＤＳを用いて、サルモネラ菌の核酸抽出及び核酸検出を行った。ＭＤＳは、製造元提供のプロトコルに基づいて操作した。
（４）上記（２）で得られた希釈済み菌液のうち、推定菌数が１０３個の菌液と１０２個の菌液をＤＨＬ寒天培地に１００μＬ塗抹し、３５℃で２４時間培養して、定型集落数を確認した。
ＭＤＳ検査の結果と、定型集落数から求めた検査菌数（ｃｆｕ／ｇ）を、下記表１に示す。表１中、「（＋）」はＭＤＳ検査で陽性となったことを表し、「（－）」はＭＤＳ検査で陰性となったことを示す。また表１中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
【0032】
【表1】
【0033】
表１に示す通り、核酸抽出工程及び核酸検出工程を、ＭＤＳを用いて実行する場合、陽性となる菌数は７０個以上であることが明らかになった。
【0034】
＜試験例２＞被験試料の培養時間の検討
試験例２では、培養時間ごとの菌数を測定し、核酸抽出工程及び核酸検出工程を、ＭＤＳを用いて実行する場合に陽性となる培養時間を確認した。
試験例２では、培養時間ごとの菌数を測定し、核酸抽出工程及び核酸検出工程を、ＭＤＳを用いて実行する場合に陽性となる培養時間を確認した。
【0035】
試験例２は、以下のように行った。
（１）低たんぱく大豆粕、高たんぱく大豆粕、及び菜種粕を被験試料とした。各被験試料２５ｇずつを、あらかじめ４２℃に温めておいたＭＰ培地２２５ｇに加え、さらに、１００μＬ当たりの菌数が１０個となるように希釈した菌液を１００μＬ接種し、４２℃で培養５～７時間培養した。培養液は、各被験試料について２本ずつ用意した（下記表２においては各被験試料に１～２のナンバリングをして表示している）。
（２）上記（１）で得られた培養液１００μＬを、攪拌後速やかにＤＨＬ寒天培地に塗抹し、３５℃で２４時間培養して、定型集落数を確認した。
培養時間ごとの定型集落数から求めた菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を、下記表２に示す。表２中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
（１）低たんぱく大豆粕、高たんぱく大豆粕、及び菜種粕を被験試料とした。各被験試料２５ｇずつを、あらかじめ４２℃に温めておいたＭＰ培地２２５ｇに加え、さらに、１００μＬ当たりの菌数が１０個となるように希釈した菌液を１００μＬ接種し、４２℃で培養５～７時間培養した。培養液は、各被験試料について２本ずつ用意した（下記表２においては各被験試料に１～２のナンバリングをして表示している）。
（２）上記（１）で得られた培養液１００μＬを、攪拌後速やかにＤＨＬ寒天培地に塗抹し、３５℃で２４時間培養して、定型集落数を確認した。
培養時間ごとの定型集落数から求めた菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）を、下記表２に示す。表２中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
【0036】
【表2】
【0037】
試験例１と試験例２の結果を合わせると、大豆粕は５時間で、菜種粕は６時間で、ＭＤＳで陽性となる菌数（約７０個以上）となることが明らかになった。
【0038】
＜試験例３＞サルモネラ属菌の検出
本試験例では、サルモネラ菌の検出を行った。
本試験例では、サルモネラ菌の検出を行った。
【0039】
試験例３は、以下のように行った。
（１）試験例２（１）と同様にして、培養液を得た。培養時間は、低たんぱく大豆粕及び高たんぱく大豆粕は５時間及び６時間とし、菜種粕は６時間及び７時間とした。
（２）上記（１）で得られた培養液をよく攪拌し、各被験試料について、培養液１．５ｍＬをマイクロチューブに入れたものを、低タンパク質大豆粕及び高たんぱく大豆粕については３本、菜種粕については５本用意し、各マイクロチューブを遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心した（下記表３においては各被験試料に１～３又は１～５のナンバリングをして表示している）。
（３）上清を捨て、ＰＢＳを１ｍＬ添加、混合し、再び遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心した。
（４）上清を捨て、沈殿物をＭＤＳ試薬キットに含まれる溶解バッファー２００μＬで洗いながら、全量を上記キット中のライシスチューブに移し、１００℃で１５分間加熱した。加熱後、ＭＤＳのプロトコルに従い、核酸検出を行った。
（５）菌数確認のため、（１）で得られた培養液のうち１００μＬをＤＨＬ寒天培地に塗抹し、３５℃で２４時間培養した。
ＭＤＳの検出結果と菌数を、下記表３に示す。表３中、「（＋）」はＭＤＳ検査で陽性となったことを表し、「（－）」はＭＤＳ検査で陰性となったことを示す。また表３中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
（１）試験例２（１）と同様にして、培養液を得た。培養時間は、低たんぱく大豆粕及び高たんぱく大豆粕は５時間及び６時間とし、菜種粕は６時間及び７時間とした。
（２）上記（１）で得られた培養液をよく攪拌し、各被験試料について、培養液１．５ｍＬをマイクロチューブに入れたものを、低タンパク質大豆粕及び高たんぱく大豆粕については３本、菜種粕については５本用意し、各マイクロチューブを遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心した（下記表３においては各被験試料に１～３又は１～５のナンバリングをして表示している）。
（３）上清を捨て、ＰＢＳを１ｍＬ添加、混合し、再び遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心した。
（４）上清を捨て、沈殿物をＭＤＳ試薬キットに含まれる溶解バッファー２００μＬで洗いながら、全量を上記キット中のライシスチューブに移し、１００℃で１５分間加熱した。加熱後、ＭＤＳのプロトコルに従い、核酸検出を行った。
（５）菌数確認のため、（１）で得られた培養液のうち１００μＬをＤＨＬ寒天培地に塗抹し、３５℃で２４時間培養した。
ＭＤＳの検出結果と菌数を、下記表３に示す。表３中、「（＋）」はＭＤＳ検査で陽性となったことを表し、「（－）」はＭＤＳ検査で陰性となったことを示す。また表３中「‐」は、菌数を求めていないことを示す。
【0040】
【表3】
【0041】
表３に示す通り、大豆粕を被験試料とした場合、５時間以上培養することで、ＭＤＳ検査で陽性となり、サルモネラ菌を検出できることが明らかになった。また菜種粕を被験試料とした場合、６時間以上培養することで、ＭＤＳで陽性となり、サルモネラ菌を検出できることが明らかになった。
【0042】
＜試験例４＞従来法との比較
本試験例では、遠心工程を含む本発明に係る検査方法と、従来用いられていたクイックジーン（登録商標）法を含む検査方法とを比較した。被験試料としては、低たんぱく大豆粕を使用した。
本試験例では、遠心工程を含む本発明に係る検査方法と、従来用いられていたクイックジーン（登録商標）法を含む検査方法とを比較した。被験試料としては、低たんぱく大豆粕を使用した。
【0043】
試験例４は、以下の方法で行った。
（１）サルモネラ属菌を、ＨＩＢ培地０．５ｍｌに１白金耳量植菌し、３５℃で一晩培養し、前培養液を得た。
（２）得られた前培養液を、１０８倍までリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した菌懸濁液を調製した。
（３）被験試料２５ｇに対しＭＰ培地（デュポン株式会社製）２２５ｍＬ添加したフィルター付きストマッカー袋に、上記（２）で調製した懸濁液を１００μＬ添加（約１ｃｆｕ（＝１コロニー）分）し、４２℃で５時間培養し、インキュベート工程を行った。
（４）５時間培養後、クイックジーン（登録商標）法及び遠心工程で菌液の処理を行った。
（４－１）クイックジーン（登録商標）法（従来法）
フィルター付きストマッカー袋のフィルター通過側より採取した培養液２００μＬを、１．５～２ｍｌのマイクロチューブに入れ、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ（倉敷紡績株式会社製）キットのマニュアルに従い菌の遺伝子を抽出した。
具体的には、まず、培養液２００μＬに対し、上記キットに含まれる組織溶解液（ＭＤＴ）を１８０μＬ、前処理酵素（ＥＤＴ）を２０μＬ添加し、タッチミキサーでよく攪拌させた。
次いで、上記キットに含まれる溶解液（ＬＤＴ）を１８０μＬ添加しよく攪拌後、７０℃に調温したブロックヒーターで１０分加温した。
加温後、十分に冷却し、エタノールを２４０μＬ添加し、よくピペッティングした。その全量をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ装置にセットしたカラムに添加し、装置が停止するまで加圧した。
そして、カラムの位置を洗浄側から溶出側に移動させ、遺伝子溶出液（ＣＤＴ）をカラムに２００μＬ添加、約３０秒加圧してカラムから溶出した溶液を、クイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体とした。クイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体は、同じものを３本調製した（下記表４においては各試料名を従来法１～３とナンバリングして表示している）。
（４－２）遠心工程（本発明）
フィルター付きストマッカー袋のフィルター通過側より採取した培養液５００μＬを、１．５～２ｍｌのマイクロチューブに入れ、遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分遠心した。上清を除去後、ＰＢＳを１ｍｌ添加しよく攪拌後、再び遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分遠心した。上清を除去後、得られた沈殿物を遠心法処理検体とした。遠心法処理検体は、同じものを３本調製した（下記表４においては各試料名を遠心法１～３とナンバリングして表示している）。
（５）上記（４－１）で得たクイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体のそれぞれの２０μＬに対して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ２－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（ＭＤＡ２ＳＡＬ：スリーエムジャパン株式会社製）付属の溶解バッファーを１８０μＬ添加して、ライゼート液Ａを得た。
上記（４－２）で得た遠心法処理検体は、得られた沈殿物全量を溶解バッファー約５５０μＬで回収し、ライゼート液Ｂを得た（ライゼート液調製工程）。
（６）ライゼート液Ａ、Ｂ（各３本）をそれぞれ、１００℃、１５分加熱後、室温で１０分間冷却し、その処理溶液から上清を２０μＬ取り、リージェントチューブ（ＰＣＲチューブ：スリーエムジャパン株式会社製）に添加した。チューブの内容物を処理溶液上澄みで溶解後、ＭＤＳ装置にセットし分析に供した。測定開始５分後より現れる発光強度から、ピークが得られた検体をサルモネラ属菌遺伝子陽性検体として判断した（核酸抽出工程及び核酸検出工程）。
検出結果を表４及び図１に示す。
（１）サルモネラ属菌を、ＨＩＢ培地０．５ｍｌに１白金耳量植菌し、３５℃で一晩培養し、前培養液を得た。
（２）得られた前培養液を、１０８倍までリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した菌懸濁液を調製した。
（３）被験試料２５ｇに対しＭＰ培地（デュポン株式会社製）２２５ｍＬ添加したフィルター付きストマッカー袋に、上記（２）で調製した懸濁液を１００μＬ添加（約１ｃｆｕ（＝１コロニー）分）し、４２℃で５時間培養し、インキュベート工程を行った。
（４）５時間培養後、クイックジーン（登録商標）法及び遠心工程で菌液の処理を行った。
（４－１）クイックジーン（登録商標）法（従来法）
フィルター付きストマッカー袋のフィルター通過側より採取した培養液２００μＬを、１．５～２ｍｌのマイクロチューブに入れ、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ（倉敷紡績株式会社製）キットのマニュアルに従い菌の遺伝子を抽出した。
具体的には、まず、培養液２００μＬに対し、上記キットに含まれる組織溶解液（ＭＤＴ）を１８０μＬ、前処理酵素（ＥＤＴ）を２０μＬ添加し、タッチミキサーでよく攪拌させた。
次いで、上記キットに含まれる溶解液（ＬＤＴ）を１８０μＬ添加しよく攪拌後、７０℃に調温したブロックヒーターで１０分加温した。
加温後、十分に冷却し、エタノールを２４０μＬ添加し、よくピペッティングした。その全量をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ装置にセットしたカラムに添加し、装置が停止するまで加圧した。
そして、カラムの位置を洗浄側から溶出側に移動させ、遺伝子溶出液（ＣＤＴ）をカラムに２００μＬ添加、約３０秒加圧してカラムから溶出した溶液を、クイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体とした。クイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体は、同じものを３本調製した（下記表４においては各試料名を従来法１～３とナンバリングして表示している）。
（４－２）遠心工程（本発明）
フィルター付きストマッカー袋のフィルター通過側より採取した培養液５００μＬを、１．５～２ｍｌのマイクロチューブに入れ、遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分遠心した。上清を除去後、ＰＢＳを１ｍｌ添加しよく攪拌後、再び遠心機で１４，０００ｒｐｍ、３分遠心した。上清を除去後、得られた沈殿物を遠心法処理検体とした。遠心法処理検体は、同じものを３本調製した（下記表４においては各試料名を遠心法１～３とナンバリングして表示している）。
（５）上記（４－１）で得たクイックジーン（登録商標）処理遺伝子抽出検体のそれぞれの２０μＬに対して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ２－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（ＭＤＡ２ＳＡＬ：スリーエムジャパン株式会社製）付属の溶解バッファーを１８０μＬ添加して、ライゼート液Ａを得た。
上記（４－２）で得た遠心法処理検体は、得られた沈殿物全量を溶解バッファー約５５０μＬで回収し、ライゼート液Ｂを得た（ライゼート液調製工程）。
（６）ライゼート液Ａ、Ｂ（各３本）をそれぞれ、１００℃、１５分加熱後、室温で１０分間冷却し、その処理溶液から上清を２０μＬ取り、リージェントチューブ（ＰＣＲチューブ：スリーエムジャパン株式会社製）に添加した。チューブの内容物を処理溶液上澄みで溶解後、ＭＤＳ装置にセットし分析に供した。測定開始５分後より現れる発光強度から、ピークが得られた検体をサルモネラ属菌遺伝子陽性検体として判断した（核酸抽出工程及び核酸検出工程）。
検出結果を表４及び図１に示す。
【0044】
【表4】
【0045】
表４及び図１に示す通り、従来法（クイックジーン（登録商標）法）でサルモネラ菌を検出した場合、調製した試料３本中１本（試料名「従来法３」）しかサルモネラ菌の発光量（ＲＬＵ）のピークが観察されず、そのピークの高さも低く、ピークが観察されるまでに時間を要した。
これに対し、本発明でサルモネラ菌を検出した場合、調製した３本の試料（試料名「遠心法１」、「遠心法２」、「遠心法３」）すべてでサルモネラ菌の発光量（ＲＬＵ）のピークが観察され、そのピークの高さも従来法と比較して高く、ピークが観察されるまでの時間も短かった。
以上より、本発明は、従来法（クイックジーン（登録商標）法）と比較して、短時間の培養でもサルモネラ菌を感度よく検出することができることが明らかになった。
これに対し、本発明でサルモネラ菌を検出した場合、調製した３本の試料（試料名「遠心法１」、「遠心法２」、「遠心法３」）すべてでサルモネラ菌の発光量（ＲＬＵ）のピークが観察され、そのピークの高さも従来法と比較して高く、ピークが観察されるまでの時間も短かった。
以上より、本発明は、従来法（クイックジーン（登録商標）法）と比較して、短時間の培養でもサルモネラ菌を感度よく検出することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0046】
本発明は、サルモネラ属菌の検出に用いることができる。
【図1】
