(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022147892
(43)【公開日】2022-10-06
(54)【発明の名称】Ｆｃ受容体を固定化した抗体吸着剤
(51)【国際特許分類】
B01J 20/281 20060101AFI20220929BHJP
B01D 15/00 20060101ALI20220929BHJP
B01J 20/24 20060101ALI20220929BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220929BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20220929BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220929BHJP
【ＦＩ】
B01J20/281 R ZNA
B01D15/00 K
B01J20/24 C
C07K1/22
C07K16/28
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021049346
(22)【出願日】2021-03-24
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】谷口 直優
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【テーマコード（参考）】
4D017
4G066
4H045
【Ｆターム（参考）】
4D017AA09
4D017BA07
4D017CA12
4D017CA14
4D017CB01
4D017DA07
4D017DB02
4G066AB05D
4G066AB13D
4G066AB27D
4G066AC03B
4G066AC03D
4G066AC17C
4G066BA20
4G066BA28
4G066BA36
4G066CA54
4G066DA07
4G066GA11
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】 従来よりも抗体吸着量が向上し、抗体の分取目的にも利用可能な、Ｆｃ受容体を固定化した抗体吸着剤を提供すること。
【解決手段】 Ｆｃ受容体を、長さが２ｎｍ以上のペプチドリンカーを介して不溶性担体に固定化した抗体吸着剤により、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決手段】 Ｆｃ受容体を、長さが２ｎｍ以上のペプチドリンカーを介して不溶性担体に固定化した抗体吸着剤により、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃ受容体と、不溶性担体と、前記受容体を前記担体に固定化させるためのペプチドリンカーとを含む、抗体吸着剤であって、
前記ペプチドリンカーの長さが２ｎｍ以上である、前記吸着剤。
前記ペプチドリンカーの長さが２ｎｍ以上である、前記吸着剤。
【請求項2】
ペプチドリンカーが、以下の（１）または（２）のいずれかに示すポリペプチドである、請求項１に記載の吸着剤；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項3】
ペプチドリンカーが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち６番目のプロリンから８７番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドである、請求項２に記載の吸着剤。
【請求項4】
Ｆｃ受容体が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドである、請求項１から３のいずれかに記載の吸着剤；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体への結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体への結合活性を有するポリペプチド。
【請求項5】
請求項１から４のいずれかに記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｆｃ受容体を固定化した抗体吸着剤に関する。より詳しくは、従来よりも抗体吸着量が向上した前記吸着剤に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体医薬品は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬品である。抗体医薬品は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬品は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。
【0003】
抗体医薬品が有する糖鎖構造は薬効や安定性に大きく関与することが知られている。そのため、抗体医薬品を製造する際、糖鎖構造の制御は極めて重要である。抗体結合性タンパク質のうち、Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩａは、抗体（免疫グロブリン）の糖鎖構造を認識することが知られており、ＦｃγＲＩＩＩａをアフィニティリガンドとして不溶性担体に固定化した吸着剤を用いることで、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特許文献１）。したがって、前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析に有用である。また、ＦｃγＲＩＩＩａのうち細胞外領域（具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでの領域）中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換した変異体を作製することで、アフィニティリガンドとして必要な、熱安定性、酸安定性、アルカリ安定性を向上させている（特許文献１から３）。
【0004】
しかしながら、不溶性担体と当該担体に固定化したＦｃγＲＩＩＩａまたは前記変異体とを含む抗体吸着剤を、糖鎖構造に基づく抗体の分取目的に適用しようとしたところ、抗体の吸着量が不十分であり、前記吸着剤を工業的な抗体医薬品の製造における抗体の分取目的に適用するのは困難であった。
【0005】
特許文献４には、抗体結合性タンパク質（黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）を、ポリプロリンを含む長さ０．９から９１ｎｍのペプチドリンカーを介して、不溶性担体に固定化させることで、抗体吸着量が向上した旨、開示している。一方、Ｆｃ受容体を固定化した抗体吸着剤における、ペプチドリンカーを用いた吸着量向上に関する検討は、これまで十分に行なわれていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１５－０８６２１６号公報
【特許文献2】特開２０１６－１６９１９７号公報
【特許文献3】特開２０１７－１１８８７１号公報
【特許文献4】ＷＯ２０１７／０１８４３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、従来よりも抗体吸着量が向上し、抗体の分取目的にも利用可能な、Ｆｃ受容体を固定化した抗体吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｆｃ受容体を不溶性担体に固定化させるためのペプチドリンカーの長さを最適化することで、従来よりも抗体吸着量が向上した抗体吸着剤を得ることができた。
【0009】
すなわち、本発明は以下の［１］から［５］に記載の態様を包含する。
【0010】
［１］Ｆｃ受容体と不溶性担体と前記受容体を前記担体に固定化させるためのペプチドリンカーとを含む抗体吸着剤であって、前記ペプチドリンカーの長さが２ｎｍ以上である、前記吸着剤。
【0011】
［２］ペプチドリンカーが、以下の（１）または（２）のいずれかに示すポリペプチドである、［１］に記載の吸着剤；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【0012】
［３］ペプチドリンカーが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち６番目のプロリンから８７番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドである、［２］に記載の吸着剤。
【0013】
［４］Ｆｃ受容体が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドである、［１］から［３］のいずれかに記載の吸着剤；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体への結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体への結合活性を有するポリペプチド。
【0014】
［５］［１］から［４］のいずれかに記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の精製方法。
【0015】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0016】
本発明において不溶性担体に固定化させるＦｃ受容体は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を有するタンパク質である。Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体である場合の具体例としては、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦｃＲｎがあげられる。特にヒトＦｃγＲＩＩＩａは、抗体が有する糖鎖構造を認識可能なヒトＦｃ受容体であり、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化した抗体分離剤は、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特開２０１５－０８６２１６号公報）ことから、本発明において不溶性担体に固定化させるＦｃ受容体として好ましい態様といえる。
【0017】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの好ましい態様として、
（ｉ）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（ｉｉ）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。また前記（ｉｉ）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
（ｉ）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（ｉｉ）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。また前記（ｉｉ）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
【0018】
本発明においてＦｃ受容体を固定化させる不溶性担体は、後述するペプチドリンカーを固定化可能な活性化官能基を有し、かつ当該抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性の物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。またＳｈｏｄｅｘ（昭和電工社製）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（サイティバ社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（デュポン社製）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（ＪＮＣ社製）、ＰＯＲＯＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、トヨパール（東ソー社製）といった公知のクロマトグラフィー用担体に、前記活性化官能基を結合させた態様であってもよい。
【0019】
本発明の吸着剤は、前述したＦｃ受容体を、前述した不溶性担体に固定化させるため
のペプチドリンカーの長さを２ｎｍ以上とすることを特徴としている。なおペプチドリンカーの長さを２ｎｍ以上１０ｎｍ以下とすると好ましく、３ｎｍ以上８ｎｍ以下とするとより好ましい。ペプチドリンカーを構成するポリペプチドの配列は、前述した長さの条件を満たしている限り、特に限定はない。一例として、Ｐｒｏ（プロリン）－Ａｌａ（アラニン）を８回以上繰返した配列、Ｇｌｙ（グリシン）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（セリン）を５回以上繰返した配列、Ｇｌｕ（グルタミン酸）－Ａｌａ（アラニン）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ（リジン）（配列番号２）を３回以上繰返した配列、があげられる。
のペプチドリンカーの長さを２ｎｍ以上とすることを特徴としている。なおペプチドリンカーの長さを２ｎｍ以上１０ｎｍ以下とすると好ましく、３ｎｍ以上８ｎｍ以下とするとより好ましい。ペプチドリンカーを構成するポリペプチドの配列は、前述した長さの条件を満たしている限り、特に限定はない。一例として、Ｐｒｏ（プロリン）－Ａｌａ（アラニン）を８回以上繰返した配列、Ｇｌｙ（グリシン）－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（セリン）を５回以上繰返した配列、Ｇｌｕ（グルタミン酸）－Ａｌａ（アラニン）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ（リジン）（配列番号２）を３回以上繰返した配列、があげられる。
【0020】
前記ペプチドリンカーとして、Ｆｃ受容体の部分配列を用いてもよい。Ｆｃ受容体の部分配列をペプチドリンカーとしたときの好ましい態様として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＤ１ドメインを含むポリペプチドがあげられる。具体的には、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、
をペプチドリンカーとして用いると好ましい。前記（２）の好ましい態様として、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち６番目のプロリンから８７番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のプロリンから１０５番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２４番目から１０５番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、
をペプチドリンカーとして用いると好ましい。前記（２）の好ましい態様として、配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち６番目のプロリンから８７番目のヒスチジンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。
【0021】
前述したペプチドリンカーのＣ末端側には、不溶性担体に固定化させるためのオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸や、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるシステインタグがあげられる。
【0022】
本発明の吸着剤を製造するには、Ｆｃ受容体のＣ末端側に前述したペプチドリンカーを付加したポリペプチドを作製後、当該ポリペプチドを不溶性担体に固定化させて製造すればよい。ペプチドリンカーをＦｃ受容体に付加させる際は、前記ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ受容体のＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記ペプチドリンカーを本発明のＦｃ受容体のＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらにＦｃ受容体のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。またＤｓｂＣシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＧ７の１番目から２１番目までの領域）、および前記シグナルペプチドのうち、Ｎ末端（１番目のメチオニン）およびＣ末端（２０番目のアラニンおよび２１番目のアスパラギン酸）以外のアミノ酸を１または数残基欠失させたオリゴペプチドを、前記リガンドのＮ末端側に付加させてもよい。
【0023】
ペプチドリンカーを付加したＦｃ受容体を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してペプチドリンカーと不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は、例えば適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製すればよい。
【0024】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やエポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面のヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、担体表面に存在するヒドロキシ基やエポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0025】
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0026】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【0027】
Ｆｃ受容体を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ受容体の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【0028】
前述した方法でＦｃ受容体を不溶性担体に固定化し得られた本発明の抗体吸着剤を用いて抗体を分離するには、当該抗体吸着剤を充填したカラムにポンプ等の送液手段を用いて平衡化液を添加することでカラムを平衡化し、前記送液手段で抗体を含む溶液を添加することで前記抗体吸着剤に抗体を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を前記送液手段で添加することで前記吸着した抗体を溶出させればよい。なお本発明において抗体の分離とは、夾雑物を含む溶液からの抗体分離（夾雑物除去）に限らず、構造・性質・活性等に基づく抗体間での分離も含まれる。
【0029】
前記平衡化液としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液が例示でき、さらに前記緩衝液に、１０ｍＭから１００ｍＭ（好ましくは４０ｍＭから６０ｍＭ）の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。平衡化液のｐＨは、ｐＨ４．０から７．０までの範囲から、緩衝液成分、カラム形状、吸着剤のカラムへの充填圧力などを考慮し、適宜最適値を決定すればよい。
【0030】
抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とＦｃ受容体との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、抗体吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、抗体が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよく、一例としてｐＨ２．５以上６．０以下、ｐＨ３．０以上５．０以下、ｐＨ３．０以上４．０以下、があげられる。
【0031】
塩濃度の変化で抗体を溶出させる場合、高濃度の塩を含む緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に塩濃度を段階的に上昇させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で塩濃度を上昇させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば水溶性の塩として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウム濃度０Ｍから１Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させればよい。また、ｐＨ変化で抗体を溶出させる場合、平衡化緩衝液よりｐＨが低下した酸性緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に緩衝液のｐＨを段階的に低下させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で緩衝液のｐＨを低下させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば抗体が吸着する中性から弱酸性の緩衝液から抗体が溶離する酸性の緩衝液へと、リニアグラジエントで溶出させればよい。
【0032】
前述した方法で溶出された、抗体が含まれる画分を分取することで当該抗体が得られる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、自動フラクションコレクター等により画分の分取をする方法が挙げられる。
【発明の効果】
【0033】
本発明は、Ｆｃ受容体と不溶性担体と前記受容体を前記担体に固定化させるためのペプチドリンカーとを含む抗体吸着剤において、前記ペプチドリンカーの長さが２ｎｍ以上であることを特徴としている。本発明の吸着剤は、前記ペプチドリンカーがない、従来のＦｃ受容体を固定化した吸着剤と比較し、抗体吸着量が増加している。従って、本発明は工業的な抗体医薬品の製造における抗体の分取に有用である。
【0034】
特にＦｃ受容体として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを用いた場合、これらタンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体分離剤は、糖鎖構造に基づく分離（特開２０１５－０８６２１６号公報）や、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づいた分離（特開２０１６－０２３１５２号公報）ができるため、特定の糖鎖構造を有した抗体や、抗体依存性細胞傷害活性の高い（または低い）抗体を、選択的かつ大量に調製できる。
【実施例0035】
以下、比較例および実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0036】
実施例１ 不溶性担体の調製
（１）ヒドロキシ基を有したゲルへのエポキシ基の導入
（１－１）表面にヒドロキシ基を有したポリメタクリレートゲル（東ソー社製、トヨパール）スラリーをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥することでサクションドライゲルを調製した。
（１－２）サクションドライゲル１．０ｇに、５ｍＬの水、０．５ｍＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、および５ｍｍｏｌのエポキシ化試薬（エチレングリコールジグリシジルエーテル）を添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とう反応した。
（１－３）反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでエポキシ基を導入したゲル（以下、エポキシトヨパールと命名する）を作製した。
（１）ヒドロキシ基を有したゲルへのエポキシ基の導入
（１－１）表面にヒドロキシ基を有したポリメタクリレートゲル（東ソー社製、トヨパール）スラリーをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥することでサクションドライゲルを調製した。
（１－２）サクションドライゲル１．０ｇに、５ｍＬの水、０．５ｍＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、および５ｍｍｏｌのエポキシ化試薬（エチレングリコールジグリシジルエーテル）を添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間撹拌振とう反応した。
（１－３）反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでエポキシ基を導入したゲル（以下、エポキシトヨパールと命名する）を作製した。
【0037】
（２）エポキシトヨパールへのハロアセチル基の導入
（２－１）（１）で得られたエポキシトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、３．５ｍｍｏｌのアミノ化試薬（トリス（２－アミノエチル）アミン）、１ｍＬの水を添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間撹拌振とう反応した。
（２－２）（２－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでアミノ基を導入したゲル（以下、アミノトヨパールと命名する）を作製した。
（２－３）アミノトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、７．５ｍＬの１，４－ジオキサン、２．５ｍＬの水、０．５ｍｍｏｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）、０．５ｍｍｏｌのハロアセチル化試薬（ヨード酢酸）を添加し、２５℃に設定した撹拌振とう器内で２時間撹拌振とう反応した。
（２－４）（２－３）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、１，４－ジオキサンで４回、水で４回洗浄することでハロアセチル基を導入したゲル（以下、ハロアセチルトヨパールと命名する）を作製した。
（２－１）（１）で得られたエポキシトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、３．５ｍｍｏｌのアミノ化試薬（トリス（２－アミノエチル）アミン）、１ｍＬの水を添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間撹拌振とう反応した。
（２－２）（２－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでアミノ基を導入したゲル（以下、アミノトヨパールと命名する）を作製した。
（２－３）アミノトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、７．５ｍＬの１，４－ジオキサン、２．５ｍＬの水、０．５ｍｍｏｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）、０．５ｍｍｏｌのハロアセチル化試薬（ヨード酢酸）を添加し、２５℃に設定した撹拌振とう器内で２時間撹拌振とう反応した。
（２－４）（２－３）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、１，４－ジオキサンで４回、水で４回洗浄することでハロアセチル基を導入したゲル（以下、ハロアセチルトヨパールと命名する）を作製した。
【0038】
比較例１ 抗体吸着剤の作製（その１）
以下に示す方法で、Ｆｃ受容体ＦｃＲ３６ｉを含むポリペプチドＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（特開２０２０－０９２６８９号公報）（配列番号４）を不溶性担体に固定化し、抗体吸着剤を作製した。なおＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、ただし６番目のプロリンのセリンへのアミノ酸置換が生じたオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでがＦｃ受容体ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、当該２１番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたポリペプチド）であり、２０１番目のシステインから２０７番目のグリシンまでがシステインタグ配列（配列番号３）である。
以下に示す方法で、Ｆｃ受容体ＦｃＲ３６ｉを含むポリペプチドＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（特開２０２０－０９２６８９号公報）（配列番号４）を不溶性担体に固定化し、抗体吸着剤を作製した。なおＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであり、ただし６番目のプロリンのセリンへのアミノ酸置換が生じたオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでがＦｃ受容体ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、当該２１番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたポリペプチド）であり、２０１番目のシステインから２０７番目のグリシンまでがシステインタグ配列（配列番号３）である。
【0039】
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの調製
（１－１）特開２０２０－０９２６８９号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））１００ｍＬに接種し、前培養した（３７℃、１６時間）。
（１－２）前培養後の培養液１０ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で２時間培養後、０．０１ＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＬ加えて、さらに２５℃で終夜振とう培養した。
（１－３）培養終了後、遠心分離により集菌し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。
（１－４）あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、洗浄緩衝液と表記）により平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに、（１－３）で回収した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗浄後、０．１Ｍグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）を通液し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓに相当する画分を回収した。当該溶出画分に、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１／５０倍量加えて中和することで、精製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを調製した。
（１－５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるタンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓが純度よく精製されていることを確認した。
（１－１）特開２０２０－０９２６８９号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））１００ｍＬに接種し、前培養した（３７℃、１６時間）。
（１－２）前培養後の培養液１０ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で２時間培養後、０．０１ＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＬ加えて、さらに２５℃で終夜振とう培養した。
（１－３）培養終了後、遠心分離により集菌し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。
（１－４）あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、洗浄緩衝液と表記）により平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに、（１－３）で回収した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗浄後、０．１Ｍグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）を通液し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓに相当する画分を回収した。当該溶出画分に、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１／５０倍量加えて中和することで、精製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを調製した。
（１－５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるタンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓが純度よく精製されていることを確認した。
【0040】
（２）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル（抗体吸着剤）の作製
（２－１）（１）で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）３０ｍｇに、終濃度１ｍＭとなるようトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加し、１時間静置後、実施例１で作製したハロアセチルトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）および１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、２５℃で２時間反応させた。
（２－２）反応終了後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、２０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の順で洗浄した。
（２－３）洗浄後のゲル１．０ｇ（サクションドライゲル）に２０ｍＭの水酸化ナトリウム１．８ｍＬ、５７μｍｏｌのα－チオグリセロール、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）０．１８ｍＬを添加し、２５℃で２時間追加反応することでＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
（２－１）（１）で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）３０ｍｇに、終濃度１ｍＭとなるようトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加し、１時間静置後、実施例１で作製したハロアセチルトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）および１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、２５℃で２時間反応させた。
（２－２）反応終了後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、２０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の順で洗浄した。
（２－３）洗浄後のゲル１．０ｇ（サクションドライゲル）に２０ｍＭの水酸化ナトリウム１．８ｍＬ、５７μｍｏｌのα－チオグリセロール、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）０．１８ｍＬを添加し、２５℃で２時間追加反応することでＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0041】
比較例２ 抗体吸着剤の作製（その２）
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号８）。
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号８）。
【0042】
（２）ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号６および配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。表１に示す組成からなる反応液を前記ポリヌクレオチドおよびプライマーを用いて調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【0043】
【表1】
【0044】
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＴｒｃ－ＰｅｌＢ（ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【0045】
（４）（３）で得られた形質転換体（遺伝子組み換え大腸菌）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴプレート培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）で培養（３７℃、１６時間）した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓを抽出した。
【0046】
（５）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号６または配列番号７に記載の配列らなるオリゴヌクレオチドを用いて行なった。ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に、それぞれ示す。
【0047】
（６）比較例１（１）に記載の方法で（３）で得られた発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌からＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓを調製し、比較例１（２）に記載の方法でＦｃＲ３６ｉ＿ＥＡＡＡＫ＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0048】
実施例２ 抗体吸着剤の作製（その３）
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を３回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１１）。
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を３回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１１）。
【0049】
（２）鋳型ＤＮＡとしてＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）を用いた他は、比較例２（２）に記載と同様な方法でＰＣＲを実施した。
【0050】
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製後、比較例２（３）に記載の方法でライゲーションおよび形質転換して遺伝子組換え大腸菌を取得し、比較例２（４）に記載の方法で発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓを抽出した。
【0051】
（４）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を比較例２（５）に記載の方法で行なった。ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に、それぞれ示す。
【0052】
（５）比較例１（１）に記載の方法で（３）で得られた発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌からＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓを調製し、比較例１（２）に記載の方法でＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）３＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0053】
実施例３ 抗体吸着剤の作製（その４）
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を５回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１４）。
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を５回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１４）。
【0054】
（２）鋳型ＤＮＡとしてＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を用いた他は、比較例２（２）に記載と同様な方法でＰＣＲを実施した。
【0055】
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製後、比較例２（３）に記載の方法でライゲーションおよび形質転換して遺伝子組換え大腸菌を取得し、比較例２（４）に記載の方法で発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓを抽出した。
【0056】
（４）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を比較例２（５）に記載の方法で行なった。ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に、それぞれ示す。
【0057】
（５）比較例１（１）に記載の方法で（３）で得られた発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌からＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓを調製し、比較例１（２）に記載の方法でＦｃＲ３６ｉ＿（ＥＡＡＡＫ）５＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0058】
実施例４ 抗体吸着剤の作製（その５）
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＤ１ドメインを含む、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１８）。
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＤ１ドメインを含む、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号１８）。
【0059】
（２）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２０および配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（ベクター作製用）ならびに配列番号２２および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（インサート作製用）のうちいずれか一組を用いた。表１に示す組成からなる反応液を前記鋳型ＤＮＡおよびプライマーを用いて調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【0060】
（３）（２）で得られた２種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、ベクター側ポリヌクレオチドとインサート側ポリヌクレオチドをそれぞれ０．０３ｐｍｏｌおよび０．０６ｐｍｏｌ含む混合溶液を調製した。当該混合溶液に対して、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いたギブソンアッセンブリ反応により、ベクター側のポリヌクレオチドとインサート側のポリヌクレオチドとのライゲーションを行なった後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【0061】
（４）（３）で得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を、比較例２（４）に記載の方法で発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓを抽出した。
【0062】
（５）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、比較例２（５）に記載の方法で行なった。ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１９に、それぞれ示す。
【0063】
（６）比較例１（１）に記載の方法で（３）で得られた発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌からＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓを調製し、比較例１（２）に記載の方法でＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0064】
実施例５ 抗体吸着剤の作製（その６）
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を２回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号２４）。
（１）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号４）のうち、２００番目のグリシンと２０１番目のシステインとの間に、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を２回繰返した配列からなるペプチドリンカーを挿入したポリペプチド（ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓ）を設計した（配列番号２４）。
【0065】
（２）鋳型ＤＮＡとしてＦｃＲ３６ｉ＿Ｄ１＿Ｃｙｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号１９）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２０および配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（ベクター作製用）ならびに配列番号２２および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（インサート作製用）のうちいずれか一組を、それぞれ用いた他は、実施例４（２）に記載と同様な方法でＰＣＲを実施した。
【0066】
（３）（２）で得られた２種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製後、実施例４（３）に記載の方法でライゲーションおよび形質転換して遺伝子組換え大腸菌を取得し、比較例２（４）に記載の方法で発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓを抽出した。
【0067】
（４）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、比較例２（５）に記載の方法で行なった。ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２５に、それぞれ示す。
【0068】
（５）比較例１（１）に記載の方法で（３）で得られた発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓを含む遺伝子組換え大腸菌からＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓを調製し、比較例１（２）に記載の方法でＦｃＲ３６ｉ＿２Ｄ１＿Ｃｙｓを固定化したゲル（抗体吸着剤）を作製した。
【0069】
実施例６ 抗体吸着量の測定（その１）
（１）比較例１および２ならびに実施例２および３で作製した抗体吸着剤を、実施例１（１－１）に記載の方法で吸引乾燥し、サクションドライゲルを調製した。
（１）比較例１および２ならびに実施例２および３で作製した抗体吸着剤を、実施例１（１－１）に記載の方法で吸引乾燥し、サクションドライゲルを調製した。
【0070】
（２）サクションドライゲルにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を１５０μＬ添加し、２０００×ｇで１分間遠心分離した。本操作を３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【0071】
（３）洗浄後のゲルに、ＰＢＳを１５０μＬ、および人免疫グロブリン溶液（グロブリン筋注１５００ｍｇ／１０ｍＬ「ＪＢ」、日本血液製剤機構製）を６０μＬ、順次添加し、２５℃にて２時間撹拌することで、ゲルに免疫グロブリン（抗体）を吸着させた。
【0072】
（４）（３）の吸着操作後、スピンカラムを２０００×ｇで１分間遠心分離することで、未吸着の抗体を含んだ溶液とゲルとを分離した。
【0073】
（５）ゲルにＰＢＳを１５０μＬ添加し、２０００×ｇで１分間遠心分離した。本操作を３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【0074】
（６）ゲルに５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１５０μＬ添加し、２０００×ｇで１分間遠心分離した。本操作を３回繰り返すことでゲルに吸着した抗体を溶出した。溶出液の吸光度を測定して抗体の濃度を算出し、Ｆｃ受容体固定化ゲルへの抗体の吸着量を求めた。
【0075】
結果を表２に示す。なお表２におけるリンカー長は、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４（８），５２９－５３２（２００１））に記載の値を参考に示している。リンカーの長さが２ｎｍ以上（実施例２および３）の抗体吸着剤での、ＦｃＲ固定化量に対する抗体吸着量は、リンカーなし（比較例１）およびリンカーの長さが２ｎｍ未満（比較例２）の抗体吸着剤と比較し、向上していることがわかる。
【0076】
【表2】
【0077】
実施例７ 抗体吸着量の測定（その２）
実施例６（１）の抗体吸着剤を、比較例１ならびに実施例４および５で作製した抗体吸着剤にした他は、実施例６に記載と同様な方法で抗体吸着量を測定した。
実施例６（１）の抗体吸着剤を、比較例１ならびに実施例４および５で作製した抗体吸着剤にした他は、実施例６に記載と同様な方法で抗体吸着量を測定した。
【0078】
結果を表３に示す。なお表３におけるリンカー長とは、Ｆｃ受容体が含まれる結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｎｋ：３ＡＹ４）より概算したＦｃγＲＩＩＩａのＤ１ドメイン長の値を示している。ペプチドリンカーの配列が、実施例２および３のような単純なアミノ酸配列の繰返しではなく、特定タンパク質のドメイン配列であっても、リンカーの長さが２ｎｍ以上であれば、リンカーなし（比較例１）の抗体吸着剤と比較し、ＦｃＲ固定化量に対する抗体吸着量が向上することがわかる。
【0079】
【表3】
【配列表】