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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022151224
(43)【公開日】2022-10-07
(54)【発明の名称】細胞分離用溶媒組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/02 20060101AFI20220929BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220929BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20220929BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20220929BHJP
【ＦＩ】
C12N1/02 ZNA
C12N5/10
C07K14/195
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021054195
(22)【出願日】2021-03-26
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】丸山 高廣
(72)【発明者】
【氏名】林 政浩
(72)【発明者】
【氏名】栗原 桃
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 博之
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01Y
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA80
4H045EA65
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】
再生医療用途の細胞の調製において、アニマルフリー条件下で大量の細胞を短時間で分離精製するための、細胞分離溶媒及びその組成を提供すること。
【解決手段】
従来用いられてきたＢＳＡやＦＢＳなどの動物由来成分を含む細胞分離用の溶媒組成物に代わり、有機酸の塩とキレート剤を含有する溶媒組成物を用いることで、前記課題を解決する。
【選択図】
なし
再生医療用途の細胞の調製において、アニマルフリー条件下で大量の細胞を短時間で分離精製するための、細胞分離溶媒及びその組成を提供すること。
【解決手段】
従来用いられてきたＢＳＡやＦＢＳなどの動物由来成分を含む細胞分離用の溶媒組成物に代わり、有機酸の塩とキレート剤を含有する溶媒組成物を用いることで、前記課題を解決する。
【選択図】
なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１種類以上の細胞を懸濁し、吸着剤と接触させることにより細胞を分離精製するために使用される溶媒組成物であって、水溶性溶媒に有機酸の塩とキレート剤とを含有し、動物由来成分を含まないことを特徴とする溶媒組成物。
【請求項2】
有機酸が、酢酸、クエン酸、グルコン酸から選ばれる１種である、請求項１に記載の溶媒組成物。
【請求項3】
有機酸の塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１または２に記載の溶媒組成物。
【請求項4】
有機酸の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の溶媒組成物。
【請求項5】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸またはエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸のいずれかである、請求項１から４のいずれかに記載の溶媒組成物。
【請求項6】
吸着剤がフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤であって、該吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製するために使用される、請求項１から５のいずれかにに記載の溶媒組成物。
【請求項7】
フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤と、請求項１から６のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて該吸着剤に細胞を吸着させたのち、フコースを含有する請求項１から６のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する方法。
【請求項8】
細胞が、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞である、請求項７に記載の方法
【請求項9】
Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
フコース結合性タンパク質が以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかである、請求項７から９のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【請求項11】
フコース結合性タンパク質が、以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかである、請求項７から９のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列が付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｈ）前記（ｇ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列が付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｈ）前記（ｇ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【請求項12】
水に不溶性の担体に親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
【請求項13】
カラムに充填してなる吸着剤を用いることを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は少なくとも１種類以上の細胞を懸濁し、吸着剤と接触させることにより細胞を分離精製するために使用される溶媒組成物であって、特に動物由来成分を含まない溶媒組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ－ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来するＢＣ２ＬＣＮレクチンは、フコース残基を含む糖鎖への結合親和性を有するタンパク質であり、例えば、非特許文献１、特許文献１および特許文献２に記載の未分化糖鎖マーカーとして知られているＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）およびＨタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）以外に、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）やルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース残基を含む複数種の糖鎖に高い結合親和性を有することが知られている（非特許文献２）。
【0003】
また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖が高発現している未分化状態のヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞には結合するが、ヒト体細胞には結合しないことが知られている（非特許文献３）。さらに、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは前記未分化糖鎖マーカーに結合性を有することから、例えば、未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出や、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞等の未分化細胞の検出に使用されている（特許文献１および特許文献２）。また、Ｈタイプ１型糖鎖はＳＳＥＡ－５として特定のがん細胞に高発現していることが知られている（非特許文献４）。
【0004】
ＢＣ２ＬＣＮレクチンは既知の未分化細胞検出用抗体である抗Ｎａｎｏｇ抗体等と同等の未分化幹細胞検出能をもっているものの（特許文献２）、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと未分化細胞の糖鎖の結合は静電相互作用によるものであり、結合の強さは溶媒や塩濃度等の外環境の影響を受ける。このため、実験条件によっては前記未分化細胞および／または前記未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出において、当該糖鎖とＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合親和性が低くなる可能性が考えられることから、前記未分化糖鎖マーカーへの結合親和性が向上したＢＣ２ＬＣＮレクチンが求められている。
【0005】
タンパク質の機能を向上させる方法として、タンパク質工学的手法によりタンパク質にアミノ酸変異を導入し、目的とする機能を向上させる方法が公知であり、例えば、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質が知られている（特許文献３）。また特許文献４には、同様の手法を用い、特定位置のアミノ酸置換により熱に対する安定性や糖鎖への結合親和性が向上したＢＣ２ＬＣＮレクチンが知られている（特許文献４）。さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等の微生物を利用して製造した場合の生産性が向上したＢＣ２ＬＣＮレクチンが知られている（特許文献５）。
【0006】
また、これら熱に対する安定性や糖鎖への結合親和性などの機能および微生物発現による生産性を向上させたＢＣ２ＬＣＮレクチンを不溶性担体に固定化した吸着剤を利用した細胞分離精製方法としては、ｉＰＳ細胞などの未分化細胞を除去して分化細胞を分離精製方法が知られているほか（特許文献６）、さらに吸着剤に吸着した未分化細胞を脱着して回収する方法が知られている（特許文献７）。
【0007】
しかしながら、細胞の分離精製方法としては前記方法の他、既存の方法として磁気ビーズによる方法（非特許文献５）や、セルソーターによる細胞のソーティング（非特許文献５）、細胞ローリングカラムによる方法（非特許文献６）が知られていたが、これまでこれらの方法で臨床用用途の品質・純度の高いｉＰＳ細胞を調製することは極めて困難であった。例えば、ｉＰＳ細胞の培養においては従来、牛血清（以下、ＦＢＳと略す。）あるいはＦＢＳ代替えのための成分であるマウス由来フィーダー細胞を用いた培養条件が使われてきた。しかしながら、血清やフィーダー細胞には未知の因子が含まれロット差がある他、ウイルスや未知の病原体が含まれる可能性があり、病原体混入のリスクを低減させるため、また再現性の高い研究成果を得るため出来るだけ精製された成分や合成成分を用いた既知の組成からなる培地が求められていた。
【0008】
また、細胞分離工程に用いる細胞分離溶媒としては、細胞の浸透圧調整や細胞死抑制のため、例えばＭＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ（－））と２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す。）へ動物由来成分である０．５％（ｗ／ｖ）ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（以下、ＢＳＡと略す。）を添加したもの）、あるいは、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す。）やヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと略す。）を添加して用いる方法が一般的であったが、細胞培養の過程同様、動物由来成分がｉＰＳ細胞に取り込まれることによる細胞の品質低下が懸念されていた。そのため、臨床で用いられる再生医療用途のｉＰＳ細胞の調製においては、現在、世界的に動物由来成分を含まないアニマルフリー条件で培養が可能な組成の培地の開発が進められており、またｉＰＳ細胞の調製における剥離溶媒として、動物由来成分を含まないＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（組換えトリプシン）を用いる方法、細胞分離精製時に用いられる細胞懸濁溶媒としては遺伝子組換えＨＳＡを添加したものを用いる方法がそれぞれ開発されているが、これらの試薬はいずれも高価であり、大量細胞の調製には使用できないという問題点があった。
【0009】
しかるに、現状では再生医療用途のｉＰＳ細胞調製に向け、アニマルフリー条件下で大量細胞を安価で分離精製することができるような、動物由来成分を含まない細胞を分離精製するための溶媒組成物の開発が強く求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＷＯ２０１３／０６５３０２号
【特許文献2】ＷＯ２０１３／１２８９１４号
【特許文献3】特開２０１１－２０６０４６号公報
【特許文献4】特開２０２０－０２５５３５
【特許文献5】特開２０２０－０５８３４３
【特許文献6】特開２０１８－１３４０７３
【特許文献7】特開２０１９－００００６３
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３，２（４）：２６５－２７３．
【非特許文献2】Ｓｕｌａｋ，Ｏ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０，１８（１）：５９－７２．
【非特許文献3】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２３）：２０３４５－２０３５３．
【非特許文献4】Ｔａｎｇ，Ｃ等，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９（９）：８２９－８３５．
【非特許文献5】Ｆｏｎｇ ＣＹ等，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ Ｒｅｐ．２００９，５（１）：７２－８０．
【非特許文献6】Ｍａｈａｒａ，Ａ等，Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．２０１４，２５（１４－１５）：１５９０－６０１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の課題は、再生医療用途の細胞の調製において、アニマルフリー条件下で大量の細胞を短時間で分離精製するための、動物由来成分を含まない溶媒組成物を提供することである。具体的には、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤に細胞混合物を接触させ、しかる後に吸着剤に吸着した細胞を剥離する工程よりなる未分化細胞の分離方法において、未分化マーカー、例えばＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等を細胞表面に発現する未分化細胞を簡便に効率良く分離するための、動物由来成分を含まない溶媒組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、従来用いられてきたＢＳＡやＦＢＳなどの動物由来成分を含む細胞分離用の溶媒組成物に代わり、有機酸の塩とキレート剤を含有する溶媒組成物を用いることで、アニマルフリー条件下で大量の細胞を短時間で分離精製可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
すなわち、本発明は、以下の［１］から［１３］に記載した発明を包含するものである。
［１］少なくとも１種類以上の細胞を懸濁し、吸着剤と接触させることにより細胞を分離精製するために使用される溶媒組成物であって、水溶性溶媒に有機酸の塩とキレート剤とを含有し、動物由来成分を含まないことを特徴とする、溶媒組成物。
［２］有機酸が、酢酸、クエン酸、グルコン酸から選ばれる１種である、前記［１］に記載の溶媒組成物。
［３］有機酸の塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、前記［１］または［２］に記載の溶媒組成物。
［４］有機酸の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、前記［１］から［３］のいずれかに記載の溶媒組成物。
［５］キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸またはエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸のいずれかである、前記［１］から［４］のいずれかに記載の溶媒組成物。
［６］吸着剤がフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤であって、該吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製するために使用される、前記［１］から［５］のいずれかにに記載の溶媒組成物。
［７］フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤と、前記［１］から［６］のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて該吸着剤に細胞を吸着させたのち、フコースを含有する請求項１から６のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する方法。
［８］細胞が、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞である、前記［７］に記載の細胞を分離精製する方法。
［９］Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記［８］に記載の細胞を分離精製する方法。
［１］少なくとも１種類以上の細胞を懸濁し、吸着剤と接触させることにより細胞を分離精製するために使用される溶媒組成物であって、水溶性溶媒に有機酸の塩とキレート剤とを含有し、動物由来成分を含まないことを特徴とする、溶媒組成物。
［２］有機酸が、酢酸、クエン酸、グルコン酸から選ばれる１種である、前記［１］に記載の溶媒組成物。
［３］有機酸の塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、前記［１］または［２］に記載の溶媒組成物。
［４］有機酸の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である、前記［１］から［３］のいずれかに記載の溶媒組成物。
［５］キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸またはエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸のいずれかである、前記［１］から［４］のいずれかに記載の溶媒組成物。
［６］吸着剤がフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤であって、該吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製するために使用される、前記［１］から［５］のいずれかにに記載の溶媒組成物。
［７］フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤と、前記［１］から［６］のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて該吸着剤に細胞を吸着させたのち、フコースを含有する請求項１から６のいずれかに記載の溶媒組成物を用いて吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する方法。
［８］細胞が、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞である、前記［７］に記載の細胞を分離精製する方法。
［９］Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を含む糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記［８］に記載の細胞を分離精製する方法。
【0015】
［１０］フコース結合性タンパク質が以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかである、前記［７］から［９］のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、以下の（１）から（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｄ）前記（ｃ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【0016】
［１１］フコース結合性タンパク質が、以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかである、前記［７］から［９］のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列が付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｈ）前記（ｇ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列が付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有し、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質。
（ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基からＸ番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列において、以下の（４）から（６）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含み、Ｘが１２０以上の整数である、フコース結合性タンパク質
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（ｈ）前記（ｇ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目および７２番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列に対し、さらにＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドが付加され、かつＣ末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されたアミノ酸配列からなり、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有する、フコース結合性タンパク質。
【0017】
［１２］水に不溶性の担体に親水性高分子が共有結合で固定されていることを特徴とする、前記［７］から［９］のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
［１３］カラムに充填してなる吸着剤を用いることを特徴とする、前記［７］から［９］のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
［１３］カラムに充填してなる吸着剤を用いることを特徴とする、前記［７］から［９］のいずれかに記載の細胞を分離精製する方法。
【0018】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0019】
本発明の溶媒組成物（以降、本発明の組成物と略する場合もある。）は、少なくとも１種類以上の細胞を懸濁し、吸着剤と接触させることにより細胞を分離精製するために使用される溶媒組成物であり、動物由来成分を含まないことを特徴とする。本発明の組成物は、特に、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する際に好適に使用される。
【0020】
本発明の組成物は動物由来成分を含まないことから、ウイルスや未知の病原体の混入リスクを低減させることができるだけでなく、動物由来成分が細胞に取り込まれることによる品質低下を抑制することができる。
【0021】
本発明の組成物は、水溶性溶媒に有機酸の塩とキレート剤とを含有することを特徴とする。本発明の組成物における有機酸は、水溶性であり、且つ、細胞毒性を示さなければ特に制限はなく、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸などのモノカルボン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸、クエン酸などのトリカルボン酸、グルクロン酸、グルコン酸などの糖由来のカルボン酸を挙げることができる。これらの中では、細胞毒性が低く、後述する細胞の分離精製方法において高効率に細胞が分離精製できる点で、酢酸、クエン酸、グルコン酸であることが好ましい。
【0022】
また、前記有機酸の塩としては、水溶性が高く、且つ、細胞に悪影響を及ぼさない点で、ナトリウム塩やカリウム塩であることが好ましい。前記有機酸の濃度は細胞が死滅しなければ特に制限はないが、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、細胞収縮や細胞肥大による細胞へのダメージを抑制することができる。
【0023】
さらに、本発明の組成物は、前述した有機酸の塩以外に、後述する細胞の分離精製方法において吸着剤からの細胞脱着を促進させる作用がある化合物が含まれていてもよく、具体的には、キレート剤を含まれることで、高効率に目的の細胞を吸着剤から脱着させることができる。本発明の組成物に含まれるキレート剤は、水溶性であり、且つ、細胞毒性を示さなければ特に制限はないが、高効率に目的の細胞を吸着剤から脱着させることができる点で、エチレンジアミン四酢酸またはエチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸であることが好ましい。
【0024】
前述したとおり、本発明の組成物は、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する際に好適に使用されることから、本発明の組成物には前述した有機酸の塩やキレート剤以外に、細胞とフコース結合性タンパク質の結合を解離させる化合物であるフコースが含有されていてもよい。また、本発明の組成物には細胞の浸透圧を調節する化合物が含有されていてもよく、具体的には、マンニトールを挙げることができる。さらに、前述した有機酸の塩、キレート剤、細胞とフコース結合性タンパク質の結合を解離させる化合物や細胞の浸透圧を調節する化合物以外に、細胞の種類や分離精製方法に応じて、水溶性であり、細胞毒性を示さず、動物由来成分ではない化合物が、本発明の組成物に含有されていても良い。
【0025】
次に、本発明の細胞を分離精製する方法（以降、本発明の分離精製法と略する場合もある。）について説明する。本発明の分離精製法は、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤と、前述した本発明の組成物を用いることで、前記吸着剤に細胞を吸着させたのち、吸着剤から細胞を脱着させることにより細胞を分離精製する方法である。
【0026】
具体的には、フコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤に、少なくとも１種類以上の細胞を接触させたのち、前記吸着剤に吸着しなかった細胞、および、フコースを含有する本発明の組成物を添加して吸着剤から脱着した細胞を取得する方法を例示することができる。また、フコース結合性タンパク質との結合が弱い細胞ほど低濃度のフコースで吸着剤から脱着し、フコース結合性タンパク質との結合が強い細胞ほど高濃度のフコースで吸着剤から脱着できることから、異なるフコース濃度を含有する本発明の組成物を順次添加することにより、フコース結合性タンパク質との結合力が異なる細胞を吸着剤から脱着させて取得することもできる。前記吸着剤に吸着した細胞を脱着させる際に使用する、フコースを含有する本発明の組成物中のフコース濃度は、細胞が死滅しない濃度であれば特に制限はないが、０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上０．５ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。
【0027】
本発明の分離精製法では、後述するフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化してなる吸着剤を用いることから、フコース結合性タンパク質が結合性を有するフコース含有糖鎖、具体的には、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造）、ルイスｂ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃからなる構造）を有する細胞と、これらの糖鎖を有さない細胞を分離精製して、それぞれを取得することができる。前述した糖鎖を有する細胞としては、具体的には、未分化細胞やがん細胞が挙げられる。未分化細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞が挙げられる。がん細胞としては、２１０２ＥｐやＮＴ２／Ｄ１等のヒト胎児性がん細胞、ＰＣ－９等のヒト肺腺がん細胞、Ｃａｐａｎ－１等のヒト膵臓がん細胞、ＨＴ２９等のヒト結腸がん細胞が挙げられる。これらの細胞は、いずれも、例えば、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であってよい。
【0028】
次に、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質について説明する。本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質とは、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）、ルイスｂ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース含有糖鎖への結合性を有するタンパク質であり、前述したＢＣ２ＬＣＮレクチンも本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質に含まれる。本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、具体的には、（ａ）：配列番号１で示される組換えＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。）のうち１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｘが１２０以上の整数であるタンパク質、または（ｂ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｈタイプ１型糖鎖および／またはＨタイプ３型糖鎖への結合性を有し、Ｘが１２０以上の整数であるタンパク質を、大腸菌の形質転換体で組換えタンパク質として発現させたものである。本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、前記フコース含有糖鎖、特にＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してもよく、例えば１５個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してもよい。
【0029】
また、Ｘは１２０以上１５５以下であってよく、１２５以上１５５以下であってよい。特開２０２０－２５５３５に開示されているように、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端側の複数個のアミノ酸残基を欠失させることにより、当該アミノ酸残基を欠失させない場合に比べて生産性（発現量）を向上させることができる。
【0030】
また、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、熱に対する安定性を向上させる点で、（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換、（ｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基のグリシン残基および／またはアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換、（ｉｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換、のいずれか１つ以上を含んでいてもよい。
【0031】
特開２０２０－２５５３５に開示されているように、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸置換を行うことにより、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質の熱に対する安定性を向上させることができる。前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸置換は、単独であっても複数を組み合わせても熱に対する安定性の向上に効果があるが、熱に対する安定性をさらに向上させることができる点で、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のアミノ酸置換を複数組合せることがより好ましい。
【0032】
さらに、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリンからＸ番目のアミノ酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（３）の置換により置換された位置以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基を欠失、置換若しくは挿入してもよく、例えば１５個以下、好ましくは１０個以下のアミノ酸残基を欠失、置換若しくは挿入してもよい。
【0033】
本発明の細胞分離におけるフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、フコース結合性タンパク質を検出する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。
【0034】
前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとする。）、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、大腸菌を用いて製造した場合の生産性が高く、蛍光標識した抗ポリヒスチジン抗体あるいは抗ＧＳＴ抗体を用いることでフコース結合性タンパク質の検出が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドあるいはＧＳＴであることが好ましく、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることがより好ましい。
【0035】
ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数特に制限はないが、ヒスチジンの繰返し配列が短い場合は抗ポリヒスチジン抗体による検出が困難となり、長い場合は、フコース結合性タンパク質の前記糖鎖への結合性が損なわれる可能性がある。従って、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数の長さはヒスチジンが５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から１０個からなる繰返し配列であることがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、または、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、抗ポリヒスチジン抗体による検出が効率的に行える点で、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
【0036】
さらに、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、フコース結合性タンパク質を水不溶性の担体に固定化する際に有用な、システイン残基またはリジン残基を含むオリゴペプチドからなる付加的なアミノ酸配列（以下、担体固定化用タグと呼ぶ。）を有していても良い。フコース結合性タンパク質を担体に固定化することで、例えば、特許文献４に記載されているヒトｉＰＳ細胞等の未分化細胞を除去するための未分化細胞吸着剤を作製することができる。
【0037】
前記担体固定化用タグの長さは、フコース結合性タンパク質がＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、特に制限はない。担体固定化用タグとしては、水不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に行える点で、システイン残基を１つ以上含む２から１０アミノ酸残基からなるオリゴペプチドが好ましく、具体的には、「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の３アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の５アミノ酸残基からなるオリゴペプチドおよび「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを例示することができる。前記システインを１つ以上含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、フコース結合性タンパク質の担体への固定化が効率的に行える点、さらにはフコース結合性タンパク質の活性中心から離れるため結合活性を阻害しにくいという点において、前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＣ末端側に付加されていることが好ましい。
【0038】
本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質の具体例としては、配列番号１、配列番号２（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち１番目から１２７番目までのアミノ酸配列）、配列番号３（配列番号２の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号４（配列番号２の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号５（配列番号２の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号６（配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号７（配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号８（配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）、配列番号９（配列番号４で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）および配列番号１０（配列番号５で示されるアミノ酸配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、Ｃ末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したアミノ酸配）のいずれかで示されるフコース結合性タンパク質を挙げることができる。
【0039】
本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【0040】
本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡは、公知の方法により調製することができる。前記ＤＮＡの調製法として、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に合成する方法や、本発明の分離精製方法におけるフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを直接人工的に調製する方法、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製する方法を例示することができる。
【0041】
なお、当該調製法において、前記塩基配列を設計する際は、形質転換する大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましく、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０２０年５月７日）を利用することによっても可能である。
【0042】
前記方法により調製したフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換するには、当該ＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に当該ＤＮＡを挿入して発現ベクターとし、それを用いて形質転換することが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに当該ＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。
【0043】
前記発現ベクターとして使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＢＢＲベクター等が例示できる。また、前記プロモータとしては、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。前記発現ベクターを用いて宿主である大腸菌を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行えばよく、例えば、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株などを選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。
【0044】
次に、本発明におけるフコース結合性タンパク質の製造方法について説明する。本発明におけるフコース結合性タンパク質は、前記形質転換体を培養することでフコース結合性タンパク質を生産する工程（以下、第１工程という。）と、得られた培養物からフコース結合性タンパク質を回収する工程（以下、第２工程という。）の２つの工程を含む工程により製造することができる。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。前記第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、必要な栄養源を補ったＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地等を使用することが好ましい。
【0045】
発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが好ましい。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主が大腸菌である場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。また、培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすればよく、例えば宿主が大腸菌である場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。
【0046】
好ましい誘導剤としては、例えば、ｔａｃプロモータやｌａｃプロモータを使用する場合はｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を挙げることができ、その添加濃度は０．００５ｍＭから１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１ｍＭから０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。前記第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によって本発明のフコース結合性タンパク質を回収する。例えば、本発明のフコース結合性タンパク質が培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のフコース結合性タンパク質を回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加する等により細胞を破砕し、細胞破砕液からフコース結合性タンパク質を回収すればよい。また、フコース結合性タンパク質の純度を向上させたい場合には、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。
【0047】
液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて行なうことがより好ましい。また、前記クロマトグラフィーにより精製した本発明のフコース結合性タンパク質の純度および分子量は当該技術分野において公知の方法を用いて調べればよく、一例として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
【0048】
本発明におけるフコース結合性タンパク質の糖鎖への結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトをフコース結合性タンパク質、固相を糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖）として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ、ＧＥヘルスケア製）や、デキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＧＥヘルスケア製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。また、結合性親和評価は当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。
【0049】
次に、本発明の分離精製方法における吸着剤について説明する。本発明の分離精製方法における吸着剤に使用する水不溶性担体の原料に特に制限はなく、シリカゲルや金薄膜を蒸着させたガラスなどの無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサン等の多糖類を原料とした水に不溶性の多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナン等の水溶性多糖類を架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスチレン等の合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体を例示することができる。これらの担体の中では、水酸基を有し、後述する親水性高分子による修飾が容易に行える点で、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン等の電荷をもたない多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体や、ポリ（メタ）アクリレートやポリウレタン等の親水性合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。
【0050】
また、吸着剤に使用する水不溶性担体は、細胞やフコース含有糖鎖および／または複合糖質の非特異吸着を抑制する点で、前記の水不溶性担体表面が親水性高分子で修飾されていることが好ましく、親水性高分子が水不溶性担体に共有結合で固定されていることがより好ましい。水不溶性担体の表面を修飾する親水性高分子としては、アガロース、セルロース、デキストラン、プルラン、デンプン等の中性多糖類や、ポリ（２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）やポリビニルアルコール等の水酸基を有する合成高分子を例示することができる。これら親水性高分子の中では、親水性が高く、不溶性担体表面への共有結合による固定が容易に行える点で、デキストラン、プルランおよびデンプンなどの中性多糖類が好ましく、デキストランおよびプルランがより好ましい。デキストランおよびプルランの分子量に特に制限はないが、不溶性担体表面の親水性修飾が十分に行える点で、数平均分子量が１０，０００から１，０００，０００のものが好ましい。吸着剤に使用する水不溶性担体の形状に特に制限はなく、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状のいずれであってもよいが、吸着剤への細胞吸着を効率的に行える点で粒子状の担体であることが好ましく、真球状の粒子状担体であることがより好ましい。
【0051】
本発明の分離精製方法における吸着剤に使用する水不溶性担体の、水に膨潤させた状態での平均粒径（メジアン径）は、担体から製造される吸着剤をカラムに充填した場合に分離対象の細胞が吸着剤表面と十分接触し、かつ吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を淀みなく通過できる点で、好ましくは１００μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下であり、さらに好ましくは１５０μｍ以上３００μｍ以下である。粒径が１００μｍ未満の場合には、吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を通過しづらくなり、細胞の回収率が低下する。また、粒径が１０００μｍ超の場合には、吸着剤に結合する細胞と吸着剤表面の接触が不十分となり、吸着剤に結合する細胞と結合しない細胞の分離効率が低下する。不溶性担体の粒径は、例えば、ベックマンコールター（株）製の精密粒度分布測定装置（製品名「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３」）などを用いて測定することができる。あるいは、光学顕微鏡を用いて目盛り付きスライドグラスの画像を撮影したのち、同じ倍率で測定対象の複数個の粒子の画像を撮影し、物差しを用いて撮影した複数個の担体の粒径を測定し、その平均値を算出することで求めることができる。吸着剤に使用する水不溶性担体の細孔の有無に特に制限はなく、多孔性または無孔性のいずれであってもよい。
【0052】
また、本発明の吸着剤に使用する水不溶性担体は、本発明の吸着剤に使用するフコース結合性タンパク質を担体に固定化するための活性官能基導入が容易に行える点で、水酸基を有する粒子状担体であることが好ましい。さらに、本発明の吸着剤に使用する水不溶性担体は市販品を使用してもよく、例えば、ポリ（メタ）アクリレートを原料としたトヨパール（東ソー製）、アガロースを原料としたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料としたセルフィア（旭化成製）等を使用することができる。
【0053】
本発明の分離精製方法における吸着剤は、水不溶性担体から反応性水不溶性担体を製造する工程（以下、工程Ｘとする。）と、該反応性水不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を作用させて固定化する工程（以下、工程Ｙとする。）の２つの工程を含む工程により製造することができる。以下に工程Ｘと工程Ｙの詳細を説明する。
【0054】
工程Ｘは、水不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化するための反応性官能基を導入して反応性水不溶性担体を製造する工程である。水不溶性担体に本発明のフコース結合性タンパク質を固定化するため反応性官能基は、一般的なタンパク質固定化用の官能基であれば特に制限されず、エポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、活性エステル基、アミノ基、マレイミド基、ハロアセチル基等を例示することができる。
【0055】
水不溶性担体に前記官能基を導入する方法は、一般的な官能基導入方法であれば特に制限はされず、エポキシ基を導入する方法としては、水不溶性担体の水酸基とエピクロロヒドリンやエピブロモヒドリン等のハロヒドリン類、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル等のジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル等のテトラグリシジルエーテル類等のエポキシ基含有化合物を反応させる方法を例示することができる。また、水不溶性担体の水酸基とエポキシ基含有化合物を反応させる場合、反応効率を高める点で、塩基性条件下で反応を行うことが好ましい。
【0056】
水不溶性担体にホルミル基を導入する方法としては、水不溶性担体の水酸基とグルタルアルデヒド等の２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、担体を過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤と反応させる方法を例示することができる。また、前述の方法によりエポキシ基を導入した水不溶性担体と、Ｄ－グルカミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、α－チオグリセロール等の化合物を反応させることで隣接する水酸基を導入した水不溶性担体を、過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。水不溶性担体にカルボキシル基を導入する方法としては、水不溶性担体の水酸基とモノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸等のハロ酢酸と塩基性条件下で反応させる方法の他に、前述の方法によりエポキシ基を導入した水不溶性担体を、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸類、β－アラニン、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸等のアミノ基含有カルボン酸類、チオグリコール酸やチオリンゴ酸等の含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。
【0057】
さらに、水不溶性担体に導入したカルボキシル基を１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとする。）等の縮合剤存在下でＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、活性エステル基であるＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルへ誘導する方法を例示することができる。水不溶性担体にアミノ基を導入する方法としては、前述の方法によりエポキシ基を導入した水不溶性担体を、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２－アミノエチル）アミン等の少なくとも２つ以上のアミノ基を有する化合物と反応させる方法を例示することができる。水不溶性担体にマレイミド基を導入する方法としては、水酸基および／またはアミノ基を有する水不溶性担体と、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸等のマレイミド基を有するカルボン酸類をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法を例示することができる。さらに、前述のマレイミド基を有するカルボン酸類のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を例示することができる。水不溶性担体にハロアセチル基を導入する方法としては、例えば、水酸基を有する水不溶性担体や、前述の方法によりアミノ基を導入した水不溶性担体と、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド等の酸ハロゲン化物を反応させる方法や、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸等のハロゲン化酢酸をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法を挙げることができる。さらに、前述のハロゲン化酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を挙げることができる。
【0058】
工程Ｙは、工程Ｘで製造した反応性水不溶性担体に、本発明におけるフコース結合性タンパク質を固定化する工程である。工程Ｘで得られた反応性水不溶性担体にフコース結合性タンパク質を固定化する方法は、一般的なタンパク質の固定化方法であれば特に制限はされず、例えば、配位結合やアフィニティー結合などを利用し、共有結合を形成せずにタンパク質を水不溶性担体に固定化する方法、タンパク質に固定化用活性官能基を導入したのち、固定化用活性官能基と担体を反応させて水不溶性担体に固定化する方法、水不溶性担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させ、共有結合を形成させて水不溶性担体に固定化する方法を挙げることができる。共有結合を形成せずにタンパク質を水不溶性担体に固定化する方法としては、アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用し、ビオチンを導入したタンパク質をストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケア製）などのアビジンが固定化された水不溶性担体に固定化する方法を例示することができる。タンパク質へのビオチンの導入方法としては、９－（ビオチンアミド）－４，７－ジオキサノナン酸－Ｎ－スクシンイミジル等の活性エステル基を有するビオチン化試薬とタンパク質のアミノ基を反応させる方法や、Ｎ－ビオチニル－Ｎ’－［２－（Ｎ－マレイミド）エチル］ピペラジン塩酸塩等のマレイミド基を有するビオチン化試薬とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
また、タンパク質に導入した固定化用活性官能基と水不溶性担体を反応させ、共有結合を形成させて固定化する方法としては、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸 ３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩等のマレイミド基と活性エステル基の双方を有する化合物の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させてタンパク質にマレイミド基を導入したのち、メルカプト基が導入された水不溶性担体と反応させる方法を例示することができる。さらに、水不溶性担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させて水不溶性担体に固定化する方法としては、水不溶性担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、水不溶性担体に導入したアミノ基とタンパク質のカルボキシル基を反応させる方法、水不溶性担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基またはハロアルキル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
また、タンパク質に導入した固定化用活性官能基と水不溶性担体を反応させ、共有結合を形成させて固定化する方法としては、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸 ３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩等のマレイミド基と活性エステル基の双方を有する化合物の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させてタンパク質にマレイミド基を導入したのち、メルカプト基が導入された水不溶性担体と反応させる方法を例示することができる。さらに、水不溶性担体に導入した固定化用活性官能基とタンパク質を反応させて水不溶性担体に固定化する方法としては、水不溶性担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、水不溶性担体に導入したアミノ基とタンパク質のカルボキシル基を反応させる方法、水不溶性担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基またはハロアルキル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【0059】
これらの固定化方法の中では、短時間に高収率で水不溶性担体へのタンパク質固定化が行える点で、水不溶性担体に導入したホルミル基または活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、および、水不溶性担体に導入したマレイミド基またはハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が好ましく、固定化反応をｐＨが中性付近で行うことが可能でありタンパク質の変性を抑制できることが可能である点で、水不溶性担体に導入したマレイミド基またはハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法がより好ましく、官能基の安定性が高い点で、水不溶性担体に導入したマレイミド基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が、さらに好ましい。
【0060】
前記固定化用官能基を導入した水不溶性担体と、緩衝液に溶解したフコース結合性タンパク質を反応させることで、本発明における吸着剤を製造することができる。フコース結合性タンパク質を溶解する緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬製）等の市販の緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液に塩化ナトリウム等の無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等の界面活性剤を添加してもよい。フコース結合性タンパク質を水不溶性担体に固定化する際の反応温度およびｐＨは、活性官能基の反応性や本発明のフコース結合性タンパク質の安定性を考慮した上で反応温度については０℃以上５０℃以下、ｐＨについてはｐＨ４以上ｐＨ１０以下の範囲の中から適宜設定すればよく、フコース結合性タンパク質の失活を抑制する点で、反応温度については１５℃以上４０℃以下、ｐＨについてはｐＨ５以上ｐＨ９以下の範囲が好ましい。
【0061】
水不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化量は、本発明の分離精製方法において分離対象となる細胞とフコース結合性タンパク質との結合性を考慮したうえで適宜設定すればよく、１ｍＬの水不溶性担体あたり０．０１ｍｇ以上５０ｍｇ以下が好ましく、０．０５ｍｇ以上３０ｍｇ以下がより好ましい。また、水不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化量は、固定化反応時の前記タンパク質の使用量や水不溶性担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。フコース結合性タンパク質の水不溶性担体への固定化量は、固定化反応液および反応後の洗浄液を回収して未反応のフコース結合性タンパク質量を求めたのち、固定化反応に使用したフコース結合性タンパク質量から未反応の本発明のフコース結合性タンパク質量を差し引くことで算出することができる。
【0062】
また、前述したように、本発明における吸着剤に使用する水不溶性担体は、細胞の非特異吸着を抑制する点で、親水性高分子が共有結合で固定されていることが好ましいことから、吸着剤を製造する場合には、前記工程Ｘで本発明のフコース結合性タンパク質を固定化するための官能基を導入する前に、水不溶性担体に親水性高分子を共有結合で固定することもできる。水不溶性担体に親水性高分子を共有結合で固定する方法は、一般的な共有結合形成反応であれば特に制限はなく、例えば、水不溶性担体表面の水酸基とエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル等のエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることで水不溶性担体にエポキシ基を導入したのち、エポキシ基と親水性高分子の水酸基を塩基性条件下で反応させる方法を挙げることができる。
【発明の効果】
【0063】
本発明により、アニマルフリーの組成の細胞分離溶媒と細胞吸着剤を利用した細胞の分離方法を提供することができる。
【0064】
本発明によれば、具体的には、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖等のフコース含有糖鎖を有する細胞の混合物において、前記糖鎖を有する細胞を、動物由来成分を含まないアニマルフリー組成の細胞分離溶媒、すなわち有機酸の塩とキレート剤とを含む水溶液を用いて分離精製する方法が提供できる。
【0065】
また、本発明の細胞分離溶媒を用いた細胞分離方法は、臨床用用途の品質・純度の高いｉＰＳ細胞の大量精製に利用することができるため、医療分野、特に再生医療分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】実施例１と比較例１における、細胞流出率と細胞脱着率を示したグラフである。
【図2】実施例１と比較例１における、脱着細胞数／流出細胞数の比率を示したグラフである。
【図3】実施例２と比較例２における、細胞流出率を示したグラフである。
【実施例0067】
以下、作製例、実施例および比較例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0068】
作製例１ 吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの作製
特開２０２０－０２５５３５（特許文献４）の実施例１２および実施例３４に記載の方法に従い、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号９で示されるアミノ酸配列）を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを作製した。
特開２０２０－０２５５３５（特許文献４）の実施例１２および実施例３４に記載の方法に従い、フコース結合性タンパク質１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号９で示されるアミノ酸配列）を不溶性担体に固定化した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを作製した。
【0069】
実施例１ 有機酸水溶液を用いた２１０２Ｅｐ細胞の分離
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μＭのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。次に、作製例１で作製した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧをＭＡＣＳ緩衝液で置換したのち、１２時間以上放置後の吸着剤の沈降体積が５０％となるように調整した吸着剤の５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬを添加して、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。カラムとして、カラムＮＯ．１～４の４本を準備した。次に、カラムＮＯ．１は０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
（２）２１０２Ｅｐ細胞の培養と細胞懸濁液の調製
「Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト胎児性がん細胞である２１０２Ｅｐ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｃｌ．４／Ｄ３細胞はコスモバイオより入手した。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μＭのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。次に、作製例１で作製した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧをＭＡＣＳ緩衝液で置換したのち、１２時間以上放置後の吸着剤の沈降体積が５０％となるように調整した吸着剤の５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬを添加して、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。カラムとして、カラムＮＯ．１～４の４本を準備した。次に、カラムＮＯ．１は０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
（２）２１０２Ｅｐ細胞の培養と細胞懸濁液の調製
「Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト胎児性がん細胞である２１０２Ｅｐ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｃｌ．４／Ｄ３細胞はコスモバイオより入手した。
【0070】
２１０２Ｅｐ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）と抗生物質溶液（ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製）を添加したＤ－ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ、富士フイルム和光純薬製）を用い、直径６ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）または直径１０ｃｍの接着培養用シャーレ（コーニング製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを用いた２１０２Ｅｐ細胞の蛍光染色は以下の方法で行った。２１０２Ｅｐ細胞を培養中のシャーレ内の培地を廃棄後、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地を添加して細胞を洗浄したのち、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地を廃棄した。次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを最終濃度が１０μＭとなるように無血清のＲＰＭＩ １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）に溶解した液を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。前記蛍光試薬液を廃棄後、１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に、１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を廃棄したのち、再び新しい１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを用いた２１０２Ｅｐ細胞の蛍光染色は以下の方法で行った。２１０２Ｅｐ細胞を培養中のシャーレ内の培地を廃棄後、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地を添加して細胞を洗浄したのち、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地を廃棄した。次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを最終濃度が１０μＭとなるように無血清のＲＰＭＩ １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）に溶解した液を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。前記蛍光試薬液を廃棄後、１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。次に、１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を廃棄したのち、再び新しい１０％ＦＢＳと抗生物質溶液を添加したＤ－ＭＥＭ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【0071】
次に、細胞の回収と細胞懸濁液の調製を以下の方法で行った。細胞培養中のシャーレ内の培地を廃棄してＤ－ＰＢＳ（－）を添加したのち、細胞を洗浄してＤ－ＰＢＳ（－）液を廃棄した。次に、適当量のＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー製）を添加し、数分間放置することで２１０２Ｅｐ細胞を剥離させ、５０ｍＬチューブ４本へと回収した（以下、チューブに分注した細胞をそれぞれ細胞ＮＯ．１、細胞ＮＯ．２、細胞ＮＯ．３、細胞ＮＯ．４と記載する。）。次に、細胞ＮＯ．１は０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液でそれぞれ懸濁後、細胞を遠心分離して沈降させたのち上清を廃棄し、同様の操作にて細胞を再懸濁した後、遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返したのち、細胞ＮＯ．１は０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液をそれぞれ適当量用いて懸濁し、セルストレーナーでろ過することにより、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をそれぞれ調製した。得られた２１０２Ｅｐ細胞液は一部を分取し、１０倍希釈して血球計算盤にて細胞密度の算出を行った。以下、この細胞密度を元にして、細胞密度×カラムへのアプライ細胞液量から、カラムへの細胞添加量を算出した。
【0072】
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２１０２Ｅｐ細胞の吸着と脱着
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．１には細胞ＮＯ．１を添加量が２．１×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．２には細胞ＮＯ．２を添加量が３．２×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．３には細胞ＮＯ．３を添加量が４．８×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．４には細胞ＮＯ．４を添加量が３．６×１０＾４個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．５ｍＬでカラムに添加した（以下、これらを添加細胞数－１～添加細胞数－４と記載する。）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．１については０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を１．５ｍＬそれぞれ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－１～流出細胞液－４と記載する。）。
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．１には細胞ＮＯ．１を添加量が２．１×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．２には細胞ＮＯ．２を添加量が３．２×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．３には細胞ＮＯ．３を添加量が４．８×１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．４には細胞ＮＯ．４を添加量が３．６×１０＾４個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．５ｍＬでカラムに添加した（以下、これらを添加細胞数－１～添加細胞数－４と記載する。）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．１については０．３５Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を１．５ｍＬそれぞれ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－１～流出細胞液－４と記載する。）。
【0073】
次に、カラム上部より、カラムＮＯ．１については０．３５Ｍグルコン酸カリウムと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．２は０．３５Ｍグルコン酸ナトリウムと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．４は０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液をそれぞれ２．０ｍＬ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ脱着細胞液－１～脱着細胞液－４と記載する。）。
【0074】
（４）２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率・細胞脱着率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－１～流出細胞液－４および脱着細胞液－１～脱着細胞液－４をそれぞれ５００μＬ分取し、１．５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、セルストレーナー・キャップ付き５ｍＬポリスチレンラウンドチューブ（日本ＢＤ製）に分取し、細胞数計測用内部標準ビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（インビトロゲン製）を５０μＬ、および細胞生死判定試薬として７－ＡＡＤを５０μＬ添加した後、セルソーターＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（日本ＢＤ製）にて細胞数の測定を行った。流出細胞液－１～流出細胞液－４および脱着細胞液－１～脱着細胞液－４それぞれに含まれる細胞数はドットプロットで得られた内部標準ビーズの粒子数を元に、比例計算により算出した（この細胞数をそれぞれ流出細胞数－１～流出細胞数－４および脱着細胞数－１~脱着細胞数－４とする。細胞流出率は流出細胞数－１～４をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－１～添加細胞数－４で割ることにより算出した。また同様に、細胞脱着率は脱着細胞数－１～脱着細胞数－４をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－１~４で割ることにより算出した。
上記の操作により得られた、流出細胞液－１～流出細胞液－４および脱着細胞液－１～脱着細胞液－４をそれぞれ５００μＬ分取し、１．５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、セルストレーナー・キャップ付き５ｍＬポリスチレンラウンドチューブ（日本ＢＤ製）に分取し、細胞数計測用内部標準ビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（インビトロゲン製）を５０μＬ、および細胞生死判定試薬として７－ＡＡＤを５０μＬ添加した後、セルソーターＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（日本ＢＤ製）にて細胞数の測定を行った。流出細胞液－１～流出細胞液－４および脱着細胞液－１～脱着細胞液－４それぞれに含まれる細胞数はドットプロットで得られた内部標準ビーズの粒子数を元に、比例計算により算出した（この細胞数をそれぞれ流出細胞数－１～流出細胞数－４および脱着細胞数－１~脱着細胞数－４とする。細胞流出率は流出細胞数－１～４をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－１～添加細胞数－４で割ることにより算出した。また同様に、細胞脱着率は脱着細胞数－１～脱着細胞数－４をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－１~４で割ることにより算出した。
【0075】
測定の結果、細胞流出率はＮＯ．１のカラムで４１．２％、ＮＯ．２のカラムで２５．４％、ＮＯ．３のカラムで２６．５％、ＮＯ．４のカラムで１１．２％と４割未満であり２１０２Ｅｐ細胞の吸着性は良好であった。また細胞脱着率はＮＯ．１のカラムで３５．２％、ＮＯ．２のカラムで１７．１％、ＮＯ．３のカラムで２８．８％、ＮＯ．４のカラムで１２．４％であった。細胞流出率と細胞脱着率を表１と図１に示す。また、これらの結果から算出した脱着細胞数／流出細胞数の比率はＮＯ．１のカラムで０．９、ＮＯ．２のカラムで０．７、ＮＯ．３のカラムで１．１、ＮＯ．４のカラムで１．１であった。脱着細胞数／流出細胞数の比率を表１と図２に示す。この結果から、どのカラムでも剥離細胞数／流出細胞数の比率は概ね０．７以上であり、０．３５Ｍグルコン酸カリウム、０．３５Ｍグルコン酸ナトリウム、０．３５Ｍ酢酸ナトリウム、０．３５Ｍクエン酸３ナトリウムいずれの水溶液を細胞分離溶媒として用いた場合も、２１０２Ｅｐ細胞の吸着剤への吸着能が高く保持されていることが明らかとなり、これらの動物由来成分を含まない溶液を利用した細胞の吸着分離が可能であることが示された。
【0076】
比較例１ 有機酸以外の水溶液または培地を用いた２１０２Ｅｐ細胞の分離
比較例１は、前記実施例１で製造した吸着剤を利用した、細胞吸着および脱着による未分化細胞の分離における、マンニトール水溶液およびリン酸緩衝液をベースとした水溶液およびＤＭＥＭ培地を用いた細胞分離方法に関するものである。
比較例１は、前記実施例１で製造した吸着剤を利用した、細胞吸着および脱着による未分化細胞の分離における、マンニトール水溶液およびリン酸緩衝液をベースとした水溶液およびＤＭＥＭ培地を用いた細胞分離方法に関するものである。
【0077】
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例１と同様の方法で分離剤を充填したカラム（カラムＮＯ．５～７）を用意した。カラムＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
実施例１と同様の方法で分離剤を充填したカラム（カラムＮＯ．５～７）を用意した。カラムＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
【0078】
（２）２１０２Ｅｐ細胞の培養と細胞懸濁液の調製
細胞洗浄操作に細胞ＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
細胞洗浄操作に細胞ＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、細胞ＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【0079】
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２１０２Ｅｐ細胞の吸着と剥離
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．５には細胞ＮＯ．５を添加量が２．０ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．６には細胞ＮＯ．６を添加量が６．３ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．７には細胞ＮＯ．７を添加量が６．１ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．５ｍＬでカラムに添加した（以下、これらを添加細胞数－５～添加細胞数－７と記載する。）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．５については０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を１．５ｍＬそれぞれ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－５～流出細胞液－７と記載する。）。
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２１０２Ｅｐ細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．５には細胞ＮＯ．５を添加量が２．０ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．６には細胞ＮＯ．６を添加量が６．３ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤、カラムＮＯ．７には細胞ＮＯ．７を添加量が６．１ｘ１０＾５個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．５ｍＬでカラムに添加した（以下、これらを添加細胞数－５～添加細胞数－７と記載する。）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．５については０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を１．５ｍＬそれぞれ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－５～流出細胞液－７と記載する。）。
【0080】
次に、カラム上部より、カラムＮＯ．５については０．３５Ｍマンニトールと０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．６はＤ－ＰＢＳ（－）と０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．７は無血清のＤＭＥＭ培地と０．２Ｍフコースおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液をそれぞれ２．０ｍＬ添加することで、計２ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ脱着細胞液－５～脱着細胞液－７と記載する。）。
【0081】
（４）２１０２Ｅｐ細胞の細胞流出率・細胞脱着率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－５～流出細胞液－７および脱着細胞液－５～脱着細胞液－７を用い、実施例１と同じ方法で細胞数の測定を行った。細胞流出率は流出細胞数－５～流出細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－５～添加細胞数－７で割ることにより算出した。また同様に、細胞脱着率は脱着細胞数－５～脱着細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－５～添加細胞数－８で割ることにより算出した。
上記の操作により得られた、流出細胞液－５～流出細胞液－７および脱着細胞液－５～脱着細胞液－７を用い、実施例１と同じ方法で細胞数の測定を行った。細胞流出率は流出細胞数－５～流出細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－５～添加細胞数－７で割ることにより算出した。また同様に、細胞脱着率は脱着細胞数－５～脱着細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数－５～添加細胞数－８で割ることにより算出した。
【0082】
測定の結果、細胞流出率はカラムＮＯ．５で５０．２％、カラムＮＯ．６で５２．２％、カラムＮＯ．７で４３．９％であり、概ね４割以上と高く、２１０２Ｅｐ細胞の吸着性能が低いことが明らかとなった。また細胞脱着率はカラムＮＯ．５で８．５％、カラムＮＯ．６で２０．０％、カラムＮＯ．７で１３．５％であった。細胞流出率と細胞脱着率を表１と図１に示す。また、これらの結果から算出した脱着細胞数／流出細胞数の比率はカラムＮＯ．５で０．２、カラムＮＯ．６で０．４、カラムＮＯ．７で０．３であった。脱着細胞数／流出細胞数の比率を表１と図２に示す。この結果から、どのカラムでも脱着細胞数／流出細胞数の比率は概ね０．４以下であり、０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、Ｄ－ＰＢＳ（－）に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、無血清のＤＭＥＭ培地に２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液いずれの水溶液を細胞分離溶媒として用いた場合でも、２１０２Ｅｐ細胞の流出細胞数が脱着細胞数を大きく上回り、２１０２Ｅｐ細胞の吸着剤への吸着能が低下していることが明らかとなった。従って、これらのアニマルフリー組成の溶液を利用した細胞の吸着分離は困難であることが示された。
【0083】
【表1】
【0084】
実施例２ 有機酸水溶液を用いたｉＰＳ細胞の分離
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）の間に目開き４０μＭのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。次に、実施例１で作製した吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２ＧをＭＡＣＳ緩衝液で置換したのち、１２時間以上放置後の吸着剤の沈降体積が５０％となるように調整した吸着剤の５０％懸濁液を調製し、作製したカラムに１．０ｍＬを添加して、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。カラムはカラムＮＯ．１～カラムＮＯ．３の３本を準備した。次に、カラムＮＯ．１は０．１８Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．２は０．１８Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
（２）２０１Ｂ７細胞の培養と細胞懸濁液の調製
「Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞は特許実施許諾契約およびＭＴＡ契約を締結後、京都大学ＣｉＲＡより入手した。
【0085】
２０１Ｂ７細胞の培養は、接着培養用シャーレ（コーニング製）を用いて、以下の方法で行った。予め調製したｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ製）をＤ－ＰＢＳに３μｇ／ｍＬで希釈した溶液をシャーレに添加して４℃で一晩以上放置することにより、シャーレ培養面へのｉＭａｔｒｉｘ－５１１のコーティングを行った。コーティングを行ったシャーレのｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液を廃棄したのち、ｉＰＳ細胞培養用培地であるＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（味の素製）を添加して洗浄後、凍結バイアルより解凍した２０１Ｂ７細胞を、ロックインヒビター（Ｙ－２７６３２：富士フイルム和光純薬製）を１０μＭ添加した同培地に懸濁して播種した。一晩培養後、Ｙ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を廃棄し、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地へと培地交換を行い、適切な細胞密度になったところで、細胞回収と継代を行った。
【0086】
次に、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを用いた２０１Ｂ７細胞の蛍光染色は以下の方法で行った。まず、シャーレ中の培地を廃棄後、無血清のＲＰＭＩ １６４０培地を添加して細胞をリンス後、培地を吸引廃棄した。次にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅを無血清のＲＰＭＩ １６４０培地に終濃度１０μＭで溶解した溶液を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。蛍光試薬液を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１時間培養した。培地を廃棄後、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【0087】
次に、細胞の回収と細胞懸濁液の調製を以下の方法で行った。シャーレにＤ－ＰＢＳ（－）を添加して細胞をリンスしたのち、Ｄ－ＰＢＳ（－）を廃棄する操作を２回繰り返して細胞を洗浄後、ＣＴＳ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１：１で混合した剥離溶液を添加して５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１０分間放置した。細胞が丸く剥がれつつあるのを確認したのち、剥離溶液中にてピペッティングを繰り返すことで細胞を剥離し、５０ｍＬチューブ中に回収した。回収した細胞を遠心分離して沈降後、細胞をＤ-ＰＢＳ（－）で懸濁し、再度遠心分離して上清を廃棄することで細胞を洗浄した。細胞洗浄操作を２回繰り返したのち、Ｄ-ＰＢＳ（－）で懸濁し、セルストレーナーを用いてろ過することにより、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅで染色した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液を調製した。得られた２０１Ｂ７細胞液は一部を分取し、１０倍希釈して血球計算盤にて細胞密度の算出を行った。以下、この細胞密度を元にして、細胞密度×カラムへのアプライ細胞液量から、カラムへの細胞添加量を算出した
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２０１Ｂ７細胞の吸着
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．１～ＮＯ．３に添加量が２．１×１０＾６個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．１ｍＬでカラムに添加した（添加細胞数：０．５ｍＬ吸着剤あたり１．０５×１０＾６個）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．１は０．１８Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．２は０．１８Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液をそれぞれ１．０ｍＬ添加することで、計１．１ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－１～流出細胞液－３と記載する。）。
（４）２０１Ｂ７細胞の細胞流出率・細胞脱着率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－１～流出細胞液－３にＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、セルストレーナー・キャップ付き５ｍＬポリスチレンラウンドチューブ（日本ＢＤ製）に分取し、細胞数計測用内部標準ビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（インビトロゲン製）を５０μＬ、および細胞生死判定試薬として７－ＡＡＤを５０μＬ添加した後、セルソーターＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（日本ＢＤ製）にて細胞数の測定を行った。流出細胞液－１～流出細胞液－３に含まれる細胞数はドットプロットで得られた内部標準ビーズの粒子数を元に、比例計算により算出した（この細胞数をそれぞれ流出細胞数－１～流出細胞数－３とする。細胞流出率は流出細胞数－１～流出細胞数－３をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数で割ることにより算出した。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２０１Ｂ７細胞の吸着
吸着剤１２７Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを充填したカラムを垂直に立てた状態で、前記の方法で調製した２０１Ｂ７細胞の細胞懸濁液をカラムＮＯ．１～ＮＯ．３に添加量が２．１×１０＾６個／ｍＬ－吸着剤となるように、それぞれ細胞液量０．１ｍＬでカラムに添加した（添加細胞数：０．５ｍＬ吸着剤あたり１．０５×１０＾６個）。次に、カラム上部より、カラムＮＯ．１は０．１８Ｍグルコン酸カリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．２は０．１８Ｍグルコン酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．３は０．３５Ｍ酢酸ナトリウムに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液をそれぞれ１．０ｍＬ添加することで、計１．１ｍＬの細胞液を回収した（以下これらを、それぞれ流出細胞液－１～流出細胞液－３と記載する。）。
（４）２０１Ｂ７細胞の細胞流出率・細胞脱着率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－１～流出細胞液－３にＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、セルストレーナー・キャップ付き５ｍＬポリスチレンラウンドチューブ（日本ＢＤ製）に分取し、細胞数計測用内部標準ビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（インビトロゲン製）を５０μＬ、および細胞生死判定試薬として７－ＡＡＤを５０μＬ添加した後、セルソーターＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（日本ＢＤ製）にて細胞数の測定を行った。流出細胞液－１～流出細胞液－３に含まれる細胞数はドットプロットで得られた内部標準ビーズの粒子数を元に、比例計算により算出した（この細胞数をそれぞれ流出細胞数－１～流出細胞数－３とする。細胞流出率は流出細胞数－１～流出細胞数－３をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数で割ることにより算出した。
【0088】
測定の結果、細胞流出率はカラムＮＯ．１で１．２％、カラムＮＯ．２で１．５％、カラムＮＯ．３ムで１．０％であり２０１Ｂ７細胞の吸着性は１．５％以下と良好であった。細胞流出率を表２と図３に示す。この結果から、０．１８Ｍグルコン酸カリウム、０．１８Ｍグルコン酸ナトリウム、０．３５Ｍ酢酸ナトリウムいずれの水溶液を細胞分離溶媒として用いた場合も、２０１Ｂ７細胞の吸着剤への吸着能が高く保持されていることが明らかとなった。また有機酸の塩または糖由来の酸の塩の水溶液中の濃度は適宜調整して用いることが可能であり、これらのアニマルフリー組成の溶液を利用した細胞の吸着分離が可能であることが示された。
【0089】
比較例２ マンニトール水溶液またはＭＡＣＳ緩衝液を用いたｉＰＳ細胞の分離
比較例２は、前記実施例１で製造した吸着剤を利用した、細胞吸着および脱着による未分化細胞の分離における、マンニトール水溶液またはＭＡＣＳ緩衝液を用いた細胞分離方法に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２と同様の方法で分離剤を充填したカラム（カラムＮＯ．４～７）を用意した。
カラムＮＯ．４は０．１８Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．６は０．７０Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．７はＭＡＣＳ緩衝液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
（２）２０１Ｂ７細胞の培養と細胞懸濁液の調製
実施例２と同様の方法で行った。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２０１Ｂ７細胞の吸着
実施例２と同様の方法で２０１Ｂ７細胞をカラムに添加した。カラム上部より、カラムＮＯ．４は０．１８Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．６は０．７０Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．７はＭＡＣＳ緩衝液をそれぞれ１．０ｍＬ添加した以外は、実施例２と同様の方法で行った。以下カラムＮＯ．４～ＮＯ．７から取得した流出細胞液を、それぞれ流出細胞液－４～流出細胞液－７と記載する。
（４）２０１Ｂ７細胞の細胞流出率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－４～流出細胞液－７にＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、実施例２と同様の方法にて流出細胞液－４～流出細胞液－７に含まれる細胞数の測定を行った。細胞流出率は流出細胞数－４～流出細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数で割ることにより算出した。
比較例２は、前記実施例１で製造した吸着剤を利用した、細胞吸着および脱着による未分化細胞の分離における、マンニトール水溶液またはＭＡＣＳ緩衝液を用いた細胞分離方法に関するものである。
（１）吸着剤を充填したカラムの作製
実施例２と同様の方法で分離剤を充填したカラム（カラムＮＯ．４～７）を用意した。
カラムＮＯ．４は０．１８Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．６は０．７０Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、ＮＯ．７はＭＡＣＳ緩衝液を十分通液することで、それぞれの溶媒で吸着剤懸濁液の置換を行った。
（２）２０１Ｂ７細胞の培養と細胞懸濁液の調製
実施例２と同様の方法で行った。
（３）吸着剤を充填したカラムを用いた２０１Ｂ７細胞の吸着
実施例２と同様の方法で２０１Ｂ７細胞をカラムに添加した。カラム上部より、カラムＮＯ．４は０．１８Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．５は０．３５Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．６は０．７０Ｍマンニトールに２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水溶液、カラムＮＯ．７はＭＡＣＳ緩衝液をそれぞれ１．０ｍＬ添加した以外は、実施例２と同様の方法で行った。以下カラムＮＯ．４～ＮＯ．７から取得した流出細胞液を、それぞれ流出細胞液－４～流出細胞液－７と記載する。
（４）２０１Ｂ７細胞の細胞流出率の測定
上記の操作により得られた、流出細胞液－４～流出細胞液－７にＭＡＣＳ緩衝液を加え２ｍＬとしたのち、実施例２と同様の方法にて流出細胞液－４～流出細胞液－７に含まれる細胞数の測定を行った。細胞流出率は流出細胞数－４～流出細胞数－７をそれぞれ（３）に記載の添加細胞数で割ることにより算出した。
【0090】
測定の結果、細胞流出率はカラムＮＯ．４で２．８％、カラムＮＯ．５で２．９％、カラムＮＯ．６で２．６％、カラムＮＯ．７で１．８％であった。細胞流出率を表２と図３に示す。この結果から、０．１８Ｍマンニトール、０．３５Ｍマンニトール、０．７０Ｍマンニトールいずれの水溶液を細胞分離溶媒として用いた場合も、細胞流出率は２．６％以上と高く、２０１Ｂ７細胞の吸着剤への吸着能が低いことが明らかとなった。また、ＭＡＣＳ緩衝液を用いた場合は、動物由来成分であるＢＳＡを含んでいる状態で、なおかつ実施例２と比較してやや細胞流出率が高い結果となった。
【0091】
従って、濃度を適宜調整したマンニトール水溶液またはＭＡＣＳ緩衝液を利用した細胞の吸着分離は、アニマルフリー条件下での細胞分離を行うにあたり、細胞吸着性能の低さや動物由来成分を含んでいるという点で困難であることが示された。
【0092】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】