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特開2022-158459還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022158459
(43)【公開日】2022-10-17
(54)【発明の名称】還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/048 20060101AFI20221006BHJP
A23L 33/10 20160101ALN20221006BHJP
C12N 9/04 20060101ALN20221006BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20221006BHJP
【ＦＩ】
C07H19/048 CSP
A23L33/10
C12N9/04 F ZNA
C12N9/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021063378
(22)【出願日】2021-04-02
(71)【出願人】
【識別番号】000103840
【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】松川 寛和
(72)【発明者】
【氏名】砂原 美子
(72)【発明者】
【氏名】大場 貴史
(72)【発明者】
【氏名】吉谷 亘平
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4C057
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018MD18
4B018ME14
4B050CC03
4B050DD02
4B050LL01
4B050LL03
4C057BB02
4C057DD03
4C057LL05
4C057LL41
4C057LL44
(57)【要約】
【課題】ＨＰＬＣで測定したときの純度が高く、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であり、且つβ－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として高い触媒活性を示し、これにより高い生理活性を有するβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物、並びにβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法および酵素反応性の判定方法を提供すること。
【解決手段】β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である化合物である。
【選択図】なし
【解決手段】β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である化合物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを特徴とする化合物。
【請求項2】
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９８％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が９０％以上である請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上である請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下である請求項３に記載の化合物。
【請求項5】
乳酸脱水素酵素が、哺乳類の心臓由来の乳酸脱水素酵素である請求項１～４のいずれかに記載の化合物。
【請求項6】
乳酸脱水素酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項５に記載の化合物。
【請求項7】
Ｎｍｎａｔが耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子）である請求項１～６のいずれかに記載の化合物。
【請求項8】
実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まない請求項１～７のいずれかに記載の化合物。
【請求項9】
還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の品質評価方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法。
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法。
【請求項10】
還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の酵素反応性の判定方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法。
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酸化型のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「β－ＮＭＮ」と称することがある。）は、補酵素ＮＡＤ＋の生合成中間代謝産物である。近年、β－ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献１参照）、サーカディアンリズムの制御に関与していること（例えば、特許文献２参照）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、β－ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献３参照）。さらに、β－ＮＭＮの投与は、生体中のＮＡＤ＋量を高め、サーチュイン遺伝子を活性化することより、生体の加齢に伴う身体機能の低下を抑制・遅延させ、抗老化の効果が期待されている（例えば、特許文献４参照）。
【0003】
また、β－ＮＭＮを医薬やサプリメント、化粧料等に適用するにあたり、β－ＮＭＮの純度を高めたり、保存安定性を向上させるために結晶化することが提案されている（例えば、特許文献５および６参照）。
【0004】
一方、還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「β－ＮＭＮＨ」と称することがある。）については、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（以下、「Ｎｍｎａｔ」と称することがある。）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「β－ＮＡＤＨ」と称することがある。）に変換されること（例えば、非特許文献１参照）やＮＭＮＨが細胞内においてＮＡＤＨ前駆体として機能すること（例えば、非特許文献２参照）が報告されているが、β－ＮＭＮＨの生理作用は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第７７３７１５８号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１１／１２３５１０号明細書
【特許文献3】国際公開第２０１４／１４６０４４号
【特許文献4】国際公開第２０１７／２０００５０号
【特許文献5】特表２０１８－５３４２６５号公報
【特許文献6】国際公開第２０１８／０４７７１５号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７ Ａｐｒｉｌ， Ｖｏｌ．４６ Ｎｏ．１６， ｐｐ．４９１２－４９２２
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２０２０ Ａｐｒｉｌ， Ｖｏｌ． ２， ｐｐ．３６４－３７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、化学的に製造したβ－ＮＭＮＨや酵素学的に製造したβ－ＮＭＮＨであっても同様に高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；以下、「ＨＰＬＣ」と称することがある。）で測定したときの純度が高いにもかかわらず、また波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数（分子吸光係数と称することもある。）がβ－ＮＭＮＨを示す所定値であるにもかかわらず、β－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として酵素活性、即ち触媒としての活性（触媒活性）に差があり、また、β－ＮＭＮＨを生体に投与した際に同じ投与量でも同様な生理作用が得られないということを見出した。すなわち、ＨＰＬＣで測定したときの純度が同等であっても、また波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であっても生理活性が異なるβ－ＮＭＮＨがあるため、より生理活性が高いβ－ＮＭＮＨの提供が必要である。
【0008】
本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高く、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であり、且つβ－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として高い触媒活性を示し、これにより高い生理活性を有するβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物、並びにβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法および酵素反応性の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＨＰＬＣで測定したときの純度ならびに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が同等であってもβ－ＮＡＤＨに変換したときの触媒活性とβ－ＮＭＮＨそれ自体でも生理活性が異なるのは、これら化合物中のβ－ＮＭＮＨをβ－ＮＡＤＨに変換したときの触媒活性が異なることによるものであることを見出し、本発明を完成させた。
【0010】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを特徴とする化合物である。
＜２＞ ＨＰＬＣで測定したときの純度が９８％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が９０％以上である前記＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞ 波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上である前記＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
＜４＞ 波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下である前記＜３＞に記載の化合物である。
＜５＞ 乳酸脱水素酵素が、哺乳類の心臓由来の乳酸脱水素酵素である前記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の化合物である。
＜６＞ 乳酸脱水素酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記＜５＞に記載の化合物である。
＜７＞ Ｎｍｎａｔが耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子）である前記＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の化合物である。
＜８＞ 実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まない前記＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の化合物である。
＜９＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法である。
＜１０＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の酵素反応性の判定方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法である。
＜１＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを特徴とする化合物である。
＜２＞ ＨＰＬＣで測定したときの純度が９８％以上であり、且つ乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が９０％以上である前記＜１＞に記載の化合物である。
＜３＞ 波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上である前記＜１＞又は＜２＞に記載の化合物である。
＜４＞ 波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数が６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下である前記＜３＞に記載の化合物である。
＜５＞ 乳酸脱水素酵素が、哺乳類の心臓由来の乳酸脱水素酵素である前記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の化合物である。
＜６＞ 乳酸脱水素酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記＜５＞に記載の化合物である。
＜７＞ Ｎｍｎａｔが耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子）である前記＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の化合物である。
＜８＞ 実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まない前記＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の化合物である。
＜９＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質を評価することを含むことを特徴とする方法である。
＜１０＞ β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の酵素反応性の判定方法であって、
ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Ｎｍｎａｔ）により還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤＨ）に変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定することを含むことを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高く、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であり、且つβ－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として高い触媒活性を示し、これにより高い生理活性を有するβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物、並びにβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法および酵素反応性の判定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（化合物）
本発明の化合物は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物（以下、「β－ＮＭＮＨ化合物」と称することがある。）であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である。本発明の化合物は、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ－ＮＭＮＨを示す所定値であることが好ましい。
本発明の化合物は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物（以下、「β－ＮＭＮＨ化合物」と称することがある。）であって、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である。本発明の化合物は、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ－ＮＭＮＨを示す所定値であることが好ましい。
【0014】
β－ＮＭＮＨ化合物としては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法等により、人工的に合成したβ－ＮＭＮＨを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ－ＮＭＮＨを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ－ＮＭＮＨを使用してもよい。
【0015】
β－ＮＭＮＨを合成する化学合成法としては、例えば、β－ＮＭＮを還元する化学薬剤（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム、ハイポサルファイト、チオウレアジオキサイドなど）と反応させることによりβ－ＮＭＮＨを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ＮＡＤＨから、ＮＡＤＨピロホスファターゼ（ＥＣ ３．６．１．２２）によりβ－ＮＭＮＨを製造できる。
【0016】
ＮＡＤＨピロホスファターゼの詳細は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ－ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ／ｅｎｚｙｍｅ．ｐｈｐ？ｅｃｎｏ＝３．６．１．２２に記載されている。ＮＡＤＨピロホスファターゼの特徴としては、補酵素であるＮＡＤ（酸化型のβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびその還元型であるＮＡＤＨの両者を基質として利用することが知られている。
【0017】
ＮＡＤＨピロホスファターゼの使用量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、通常１００～１０，０００Ｕ／Ｌであり、１，０００～５，０００Ｕ／Ｌが好ましい。本発明において、ＮＡＤＨピロホスファターゼの活性単位（Ｕ）は、１分間あたり１μモルのＮＡＤを加水分解する触媒量と定義する。
前記ＮＡＤＨピロホスファターゼを用いる場合の反応条件としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。
前記ＮＡＤＨピロホスファターゼを用いる場合の反応条件としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。
【0018】
前記β－ＮＭＮＨは、薬理学的に許容される塩であってもよい。前記β－ＮＭＮＨの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。
【0019】
＜ＨＰＬＣ純度＞
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の純度としては、ＨＰＬＣで測定したときの純度（以下、「ＨＰＬＣ純度」と称することがある。）が９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の純度としては、ＨＰＬＣで測定したときの純度（以下、「ＨＰＬＣ純度」と称することがある。）が９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
【0020】
本発明におけるＨＰＬＣ純度とは、β－ＮＭＮＨを含有する試料をＨＰＬＣで測定し、検出される様々なピーク面積の総量に対するＮＭＮＨ由来ピーク面積の割合を意味する。具体的には、下記の（式１）から求めることができる。
－（式１）－
ＨＰＬＣ純度（％）＝｛（β－ＮＭＮＨ由来ピーク面積）／（測定されるピーク面積の総量）｝×１００
－（式１）－
ＨＰＬＣ純度（％）＝｛（β－ＮＭＮＨ由来ピーク面積）／（測定されるピーク面積の総量）｝×１００
【0021】
本発明において、ＨＰＬＣ純度を測定する際のＨＰＬＣ分析方法としては、β－ＮＭＮＨを効率よく分離・測定できる方法・条件であれば、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カラムとしてＮｕｃｌｅｏｓｉｌＲ４０００－７ ＰＥＩ（長さ：１２．５ｃｍ、内径：４．０ｍｍ、粒子径：７μｍ、マッハライ・ナーゲル社製）を使用し、「ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ． ２８０， ＮＯ． ４３， ｐｐ． ３６３３４－３６３４１， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２８， ２００５」に記載される方法で、またはカラムとしてＸＢｒｉｇｄｅ Ａｍｉｄｅカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：１０．０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用し、「ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２０， Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ （ＮＭＮＨ） Ｐｏｔｅｎｔｌｙ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＮＡＤ＋， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ， ＴＣＡ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１１．０３．３６６４２７」に記載される方法で測定することができる。本発明においては以下の方法で測定した。
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用する。
・ β－ＮＭＮＨ試料を１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とする。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライする。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分の分離は、以下の方法で実施する。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定する。
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用する。
・ β－ＮＭＮＨ試料を１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とする。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライする。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分の分離は、以下の方法で実施する。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定する。
【0022】
＜波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数＞
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、β－ＮＭＮＨを示す所定値であることが好ましい。前記β－ＮＭＮＨ化合物の波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、β－ＮＭＮＨを示す所定値であることが好ましい。前記β－ＮＭＮＨ化合物の波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
【0023】
波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、下記の（式２）で算出される。測定は、ＮＭＮＨのモル濃度を明らかとした試料を調製し、検出器に適する濃度まで適宜希釈したサンプルの波長３４０ｎｍでの吸光度を光路長既知のセルで測定する。
－（式２）－
波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］＝波長３４０ｎｍにおける吸光度／［測定試料中のＮＭＮＨのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）×セル光路長（ｃｍ）］
－（式２）－
波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］＝波長３４０ｎｍにおける吸光度／［測定試料中のＮＭＮＨのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）×セル光路長（ｃｍ）］
【0024】
ここで測定試料中のＮＭＮＨのモル濃度を明らかとする方法としては、既存のＮＭＮＨのモル吸光係数を適用する方法を利用しない限り、特に制限はなく、適宜選択でき、例えば、重量基準のＮＭＮＨ含量の既知試料を用いてＮＭＮＨ分子量で換算する方法、定量ＮＭＲ、ＮＭＮＨを分子吸光係数が既知の物質へ定量的に変換して測定する方法などが挙げられる。本発明においては以下の方法でモル濃度を明らかとした。
・ 粉末重量当たりに含まれる水分含量（％）をカールフィッシャー法によって算出する。
・ 粉末重量当たりに含まれるナトリウム含量（％）を原子吸光分析法によって算出する。
・ ＨＰＬＣ純度を算出する。
・ ＮＭＮＨ粉末約０．３ｇを秤量し、粉末秤量値を記録する。２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し５０ｍＬにメスアップする、下記の（式３）より、この試料中のＮＭＮＨモル濃度を算出する。ＮＭＮＨ分子量（ｇ／ｍｏｌ）には無水無塩ＮＭＮＨの分子量３３６．２ｇ／ｍｏｌを使用する。
－（式３）－
試料中のＮＭＮＨモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＝［Ａ×｛（１００－Ｂ－Ｃ）／１００｝×｛Ｄ／１００｝］／０．０５（Ｌ）／Ｅ
上記式中、Ａは粉末秤量値（ｇ）、Ｂは水分含量（％）、Ｃはナトリウム含量（％）、ＤはＨＰＬＣ純度（％）、ＥはＮＭＮＨ分子量（ｇ／ｍｏｌ）を表す。
・ 粉末重量当たりに含まれる水分含量（％）をカールフィッシャー法によって算出する。
・ 粉末重量当たりに含まれるナトリウム含量（％）を原子吸光分析法によって算出する。
・ ＨＰＬＣ純度を算出する。
・ ＮＭＮＨ粉末約０．３ｇを秤量し、粉末秤量値を記録する。２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し５０ｍＬにメスアップする、下記の（式３）より、この試料中のＮＭＮＨモル濃度を算出する。ＮＭＮＨ分子量（ｇ／ｍｏｌ）には無水無塩ＮＭＮＨの分子量３３６．２ｇ／ｍｏｌを使用する。
－（式３）－
試料中のＮＭＮＨモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＝［Ａ×｛（１００－Ｂ－Ｃ）／１００｝×｛Ｄ／１００｝］／０．０５（Ｌ）／Ｅ
上記式中、Ａは粉末秤量値（ｇ）、Ｂは水分含量（％）、Ｃはナトリウム含量（％）、ＤはＨＰＬＣ純度（％）、ＥはＮＭＮＨ分子量（ｇ／ｍｏｌ）を表す。
【0025】
測定試料の波長３４０ｎｍでの吸光度を測定する方法としては、測定試料中のβ―ＮＭＮＨ化合物が安定な条件で操作し、検出に適した条件で測定すればよく、特に制限はなく適宜選択できる。本発明では以下の方法を用いた。
ＮＭＮＨのモル濃度が明らかな試料を、約０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＭＮＨ相当になるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）で希釈し、モル濃度既知の測定試料を調製する。分光光度計ＵＶ－１８００（島津製作所製）を用いて測定試料の波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。測定試料の吸光度ならびにモル濃度を用いて、上記した（式２）より波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出する。
ＮＭＮＨのモル濃度が明らかな試料を、約０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＭＮＨ相当になるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）で希釈し、モル濃度既知の測定試料を調製する。分光光度計ＵＶ－１８００（島津製作所製）を用いて測定試料の波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定する。測定試料の吸光度ならびにモル濃度を用いて、上記した（式２）より波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出する。
【0026】
＜β－ＮＡＤＨに変換したときの補酵素としての触媒活性＞
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
本発明において、「ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性」の値は、β－ＮＡＤＨの標準物質の活性を１００％とした場合の相対活性値（％）のことをいう。
本発明において、「β－ＮＡＤＨの標準物質」とは、日本臨床化学会「ヒト血清中酵素活性測定の勧告法」内の試薬規格を満たすＮＡＤＨのことをいう。
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物の、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
本発明において、「ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性」の値は、β－ＮＡＤＨの標準物質の活性を１００％とした場合の相対活性値（％）のことをいう。
本発明において、「β－ＮＡＤＨの標準物質」とは、日本臨床化学会「ヒト血清中酵素活性測定の勧告法」内の試薬規格を満たすＮＡＤＨのことをいう。
【0027】
本発明において、β－ＮＭＮＨ化合物の、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性は、下記のようにして測定して得られる値のことをいう。
【0028】
－β－ＮＭＮＨ化合物からのβ－ＮＡＤＨ変換合成－
まず、β－ＮＭＮＨ化合物をＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換する。
まず、β－ＮＭＮＨ化合物をＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換する。
【0029】
前記Ｎｍｎａｔ（ＥＣ ２．７．７．１）の酵素的性質は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ－ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ／ｅｎｚｙｍｅ．ｐｈｐ？ｅｃｎｏ＝２．７．７．１＆Ｓｕｃｈｗｏｒｄ＝＆ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＝＆ＵｎｉＰｒｏｔＡｃｃ＝＆ｏｒｇａｎｉｓｍ％５Ｂ％５Ｄ＝に記載されている。例えば、ヒトＮｍｎａｔはＮＭＮＨを基質として利用することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７， ４６， １６， ４９１２－４９２２）。
前記Ｎｍｎａｔとしては、耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子、アミノ酸配列は配列番号３参照）が好ましい。前記耐熱性Ｎｍｎａｔは、大腸菌などで発現させたものであってもよい。
前記Ｎｍｎａｔとしては、耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子、アミノ酸配列は配列番号３参照）が好ましい。前記耐熱性Ｎｍｎａｔは、大腸菌などで発現させたものであってもよい。
【0030】
前記Ｎｍｎａｔを用いた反応は、後述する実施例の項目に記載した方法で行うことができる。後述する実施例の項目に示したように、前記Ｎｍｎａｔを用いることで、β－ＮＭＮＨ化合物からβ－ＮＡＤＨを合成することができる。
【0031】
－触媒活性－
Ｎｍｎａｔにより変換したβ－ＮＡＤＨのピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性は、下記のようにして測定できる。
－－Ｎｍｎａｔ変換混合液－－
・ ３ｍＭ ＮＡＤＨ相当
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
－－Ｒ１試験液－－
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当になるように、Ｎｍｎａｔ変換混合液０．１５ｍＬを、０．０２％のＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）４．８５ｍＬにて希釈する。
なお、対照（標準物質）として、β－ＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を用いたＲ１試験液を同一の手順にて調製する。
－－Ｒ３試験液－－
・ ５ｍＭ になるようにピルビン酸ナトリウムを純水に溶解する。
－－酵素溶液－－
・ 乳酸脱水素酵素（以下、「ＬＤＨ」と称することがある。）が、反応液中の終濃度で、５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調製する。希釈液には、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いる。
本発明において、ＬＤＨの活性単位（Ｕ）は、ＮＡＤを補酵素として使用したときの活性単位であり、ＩＦＣＣ準拠のヒトＬＤＨ測定法で測定したときの活性単位を使用する。
Ｎｍｎａｔにより変換したβ－ＮＡＤＨのピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性は、下記のようにして測定できる。
－－Ｎｍｎａｔ変換混合液－－
・ ３ｍＭ ＮＡＤＨ相当
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
－－Ｒ１試験液－－
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当になるように、Ｎｍｎａｔ変換混合液０．１５ｍＬを、０．０２％のＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）４．８５ｍＬにて希釈する。
なお、対照（標準物質）として、β－ＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を用いたＲ１試験液を同一の手順にて調製する。
－－Ｒ３試験液－－
・ ５ｍＭ になるようにピルビン酸ナトリウムを純水に溶解する。
－－酵素溶液－－
・ 乳酸脱水素酵素（以下、「ＬＤＨ」と称することがある。）が、反応液中の終濃度で、５Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調製する。希釈液には、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いる。
本発明において、ＬＤＨの活性単位（Ｕ）は、ＮＡＤを補酵素として使用したときの活性単位であり、ＩＦＣＣ準拠のヒトＬＤＨ測定法で測定したときの活性単位を使用する。
【0032】
－－活性測定－－
補酵素活性の測定には７１７０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用する。測定パラメーターを以下に示す。
［測定パラメーター］
・ 測定温度 ・・・ ３７℃
・ 測定波長（副／主） ・・・ ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
・ 測定モード ・・・ ２ポイントレート［１０］［１８］［２０］［０］［０］
・ 検体量（酵素溶液量） ・・・ ４μＬ
・ Ｒ１試験液量 ・・・ １６０μＬ（０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当）
・ Ｒ３試験液量 ・・・ ４０μＬ
・ スタートアップキャリブ ・・・ あり（精製水）
補酵素活性の測定には７１７０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用する。測定パラメーターを以下に示す。
［測定パラメーター］
・ 測定温度 ・・・ ３７℃
・ 測定波長（副／主） ・・・ ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
・ 測定モード ・・・ ２ポイントレート［１０］［１８］［２０］［０］［０］
・ 検体量（酵素溶液量） ・・・ ４μＬ
・ Ｒ１試験液量 ・・・ １６０μＬ（０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当）
・ Ｒ３試験液量 ・・・ ４０μＬ
・ スタートアップキャリブ ・・・ あり（精製水）
【0033】
［測定手順］
酵素溶液４μＬとＲ１試験液１６０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ３試験液４０μＬを添加して反応を開始する（測光ポイント１７）。反応開始後５分間測定し、反応開始から０．３－０．９分（測光ポイント１８－２０）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。
酵素溶液４μＬとＲ１試験液１６０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ３試験液４０μＬを添加して反応を開始する（測光ポイント１７）。反応開始後５分間測定し、反応開始から０．３－０．９分（測光ポイント１８－２０）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。
【0034】
本発明におけるＬＤＨはＬ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７）とも称される脱水素酵素である。
前記乳酸脱水素酵素としては、哺乳類の心臓由来の乳酸脱水素酵素が好ましく、配列番号２のアミノ酸配列を有する、ブタ由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１がより好ましいが、哺乳類の他の乳酸脱水素酵素、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する、サブユニットの４量体からなる骨格筋由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５なども使用することができる。ＬＤＨは、ピルビン酸を基質として反応を触媒して乳酸に変換するが、このときＮＡＤＨはＮＡＤに変換される。
前記乳酸脱水素酵素としては、哺乳類の心臓由来の乳酸脱水素酵素が好ましく、配列番号２のアミノ酸配列を有する、ブタ由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１がより好ましいが、哺乳類の他の乳酸脱水素酵素、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する、サブユニットの４量体からなる骨格筋由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）１、ヒト由来乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）５なども使用することができる。ＬＤＨは、ピルビン酸を基質として反応を触媒して乳酸に変換するが、このときＮＡＤＨはＮＡＤに変換される。
【0035】
本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物は、実質的にニコチンアミドジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ」と称することがある。）を含まないことが好ましい。ＮＡＤが含まれていると乳酸脱水素酵素に対する反応性を正確に測定できない可能性があるためである。
本発明において、実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まないとは、前記β－ＮＭＮＨ化合物におけるＮＡＤが前述のＨＰＬＣ分析で検出されないことをいう。なお、本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物を配合する製剤や飲食品にＮＡＤが含まれている実施形態を排除するものではない。
本発明において、実質的にニコチンアミドジヌクレオチドを含まないとは、前記β－ＮＭＮＨ化合物におけるＮＡＤが前述のＨＰＬＣ分析で検出されないことをいう。なお、本発明に係るβ－ＮＭＮＨ化合物を配合する製剤や飲食品にＮＡＤが含まれている実施形態を排除するものではない。
【0036】
本発明のβ－ＮＭＮＨ化合物は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が高いだけでなく、β－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として高い触媒活性を示す。そのため、従来のβ－ＮＭＮＨ製品（原薬）と比較して生体利用性が高く、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩とこれを含有する製品として高品質であると同時に、高い生理作用を有している。したがって、β－ＮＭＮＨを有効成分とする医薬としてだけでなく、飲食品（サプリメントを含むが、これに限定されない）や飼料の原料としてまたはこれを投与または摂取することにより高い効果を与えることができる。
【0037】
（化合物の品質評価方法）
本発明の化合物の品質評価方法は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法であって、評価工程を少なくとも含み、必要に応じて更に測定工程などのその他の工程を含む。
本発明の化合物の品質評価方法は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質評価方法であって、評価工程を少なくとも含み、必要に応じて更に測定工程などのその他の工程を含む。
【0038】
＜評価工程＞
本発明の化合物の品質評価方法における評価工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質を評価する工程である。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
前記指標であるピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性の数値としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
前記評価工程では、さらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを指標とすることが好ましい。前記指標である波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
本発明の化合物の品質評価方法における評価工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の品質を評価する工程である。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
前記指標であるピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性の数値としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
前記評価工程では、さらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを指標とすることが好ましい。前記指標である波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
【0039】
－評価－
本発明の化合物の品質評価方法における評価工程では、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記評価対象の品質が良いと評価する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記評価対象は生体利用性が高いβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると評価する。また、前記指標として波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを用いる場合には、前記所定値である場合に、前記評価対象の品質が良いと評価する。より具体的には、前記所定値である場合に、前記評価対象は生体利用性が高いβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると評価する。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、本発明の化合物の品質評価方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
本発明の化合物の品質評価方法における評価工程では、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記評価対象の品質が良いと評価する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記評価対象は生体利用性が高いβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると評価する。また、前記指標として波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを用いる場合には、前記所定値である場合に、前記評価対象の品質が良いと評価する。より具体的には、前記所定値である場合に、前記評価対象は生体利用性が高いβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物であると評価する。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、本発明の化合物の品質評価方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
【0040】
＜その他の工程＞
本発明の化合物の品質評価方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
本発明の化合物の品質評価方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
【0041】
－測定工程－
本発明の化合物の品質評価方法における測定工程は、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度およびＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性を測定する工程である。前記測定工程では、必要に応じてさらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を測定してもよい。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目、＜β－ＮＡＤＨに変換したときの補酵素としての触媒活性＞の項目、および＜波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
本発明の化合物の品質評価方法における測定工程は、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度およびＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性を測定する工程である。前記測定工程では、必要に応じてさらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を測定してもよい。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目、＜β－ＮＡＤＨに変換したときの補酵素としての触媒活性＞の項目、および＜波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
【0042】
（化合物の酵素反応性の判定方法）
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の酵素反応性の判定方法であって、判定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法は、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の酵素反応性の判定方法であって、判定工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0043】
＜判定工程＞
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定する工程である。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
前記指標であるピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性の数値としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
前記判定工程では、さらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを指標とすることが好ましい。前記指標である波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程は、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上であることを指標として、前記β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の乳酸脱水素酵素に対する反応性を判定する工程である。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度の指標としては、９５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９８％以上が好ましい。
前記指標であるピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性の数値としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、９０％以上が好ましい。
前記判定工程では、さらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを指標とすることが好ましい。前記指標である波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、５，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上が好ましく、６，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以上７，０００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］以下がより好ましい。
【0044】
－判定－
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程では、判定対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記判定対象の酵素反応性が高いと判定する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記判定対象は乳酸脱水素酵素に対する反応性が高い還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物であると判定する。また、前記指標として波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを用いる場合には、前記所定値である場合に、前記判定対象の酵素反応性が高いと評価する。より具体的には、前記所定値である場合に、前記判定対象は乳酸脱水素酵素に対する反応性が高い還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物と評価する。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、本発明の化合物の酵素反応性の判定方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における判定工程では、判定対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物が、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記判定対象の酵素反応性が高いと判定する。より具体的には、ＨＰＬＣで測定したときの純度が９５％以上であり、且つＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性が８５％以上である場合に、前記判定対象は乳酸脱水素酵素に対する反応性が高い還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物であると判定する。また、前記指標として波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数がβ―ＮＭＮＨを示す所定値であることを用いる場合には、前記所定値である場合に、前記判定対象の酵素反応性が高いと評価する。より具体的には、前記所定値である場合に、前記判定対象は乳酸脱水素酵素に対する反応性が高い還元型β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド前駆体化合物と評価する。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、本発明の化合物の酵素反応性の判定方法を行う際に測定したものであってもよいし、別途測定したものであってもよい。
【0045】
＜その他の工程＞
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法におけるその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、測定工程などが挙げられる。
【0046】
－測定工程－
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における測定工程は、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度およびＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性を測定する工程である。前記測定工程では、必要に応じてさらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を測定してもよい。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目、＜β－ＮＡＤＨに変換したときの補酵素としての触媒活性＞の項目、および＜波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
本発明の化合物の酵素反応性の判定方法における測定工程は、評価対象のβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物のＨＰＬＣで測定したときの純度およびＮｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性を測定する工程である。前記測定工程では、必要に応じてさらに波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を測定してもよい。
前記ＨＰＬＣで測定したときの純度、Ｎｍｎａｔによりβ－ＮＡＤＨに変換したときに、ピルビン酸を乳酸に変換する乳酸脱水素酵素に対する触媒活性、および波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は、上記した（化合物）の＜ＨＰＬＣ純度＞の項目、＜β－ＮＡＤＨに変換したときの補酵素としての触媒活性＞の項目、および＜波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数＞の項目に記載したものと同様にして測定することができる。
【0047】
本発明の化合物の評価方法および化合物の酵素反応性の判定方法によれば、β－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物のＨＰＬＣ純度だけでは評価できない生体利用性を評価・判定することができ、これにより高品質なβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物を提供することができる。
【0048】
また、本発明は、前記化合物の評価方法または化合物の酵素反応性の判定方法を包含する、高品質なβ－ＮＭＮＨ又はその薬理学的に許容される塩からなるβ－ＮＡＤＨ前駆体化合物の製造方法をも包含する。
【実施例0049】
以下、実施例、比較例、および試験例を示して本発明を説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【0050】
（実施例１：β－ＮＭＮＨ化合物粉末の調製）
市販のＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を出発材料とし、自家調製した組換えＮＡＤＨピロホスファターゼ（配列番号４）にて、β－ＮＭＮＨを生成させた。具体的な反応組成と条件は下記のとおりである。
・ 反応温度 ： ３７℃
・ ｐＨ ： ｐＨ８．０～９．０（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨバッファー）
・ 基質ＮＡＤＨ濃度 ： １リットルあたり２０ｇ粉末
・ ＮＡＤＨピロホスファターゼ添加量 ： ４，０００Ｕ／Ｌ
市販のＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を出発材料とし、自家調製した組換えＮＡＤＨピロホスファターゼ（配列番号４）にて、β－ＮＭＮＨを生成させた。具体的な反応組成と条件は下記のとおりである。
・ 反応温度 ： ３７℃
・ ｐＨ ： ｐＨ８．０～９．０（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨバッファー）
・ 基質ＮＡＤＨ濃度 ： １リットルあたり２０ｇ粉末
・ ＮＡＤＨピロホスファターゼ添加量 ： ４，０００Ｕ／Ｌ
【0051】
＜β－ＮＭＮＨの生成のモニタリングと反応停止＞
ＯＤＳ８０Ｔｓカラム（東ソー社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにてβ－ＮＭＮＨの生成をモニタリングした。下記のＨＰＬＣ操作条件では、β－ＮＭＮＨは７分目、ならびにＮＡＤＨは６０分目に溶出された。ＮＡＤＨピークが完全に消失したところで分子量１０，０００カットの限界ろ過膜を用い、添加した酵素を除去することで反応を停止した。β－ＮＭＮＨは、限外ろ過工程では、ろか外液に回収された。
－ＨＰＬＣ条件－
・ Ｃ１８逆相カラムサイズ ： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔｓ（内径２ｍｍ、長さ１５ｃｍ、粒子径５μｍ）
・ 流速 ： ０．１５ｍＬ／分
・ 測定波長 ： ３４０ｎｍと２６０ｎｍ
・ 溶出条件 ： Ａ液） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
Ｂ液） １５％メタノールを含む上記Ａ液
・ グラジエントプログラム ：
０－２０分 ； Ａ液 １００％ － Ｂ液 ０％
２０－６０分 ； Ａ液／Ｂ液 グラジエント
６０－８０分 ； Ａ液 ０％ － Ｂ液 １００％
ＯＤＳ８０Ｔｓカラム（東ソー社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにてβ－ＮＭＮＨの生成をモニタリングした。下記のＨＰＬＣ操作条件では、β－ＮＭＮＨは７分目、ならびにＮＡＤＨは６０分目に溶出された。ＮＡＤＨピークが完全に消失したところで分子量１０，０００カットの限界ろ過膜を用い、添加した酵素を除去することで反応を停止した。β－ＮＭＮＨは、限外ろ過工程では、ろか外液に回収された。
－ＨＰＬＣ条件－
・ Ｃ１８逆相カラムサイズ ： ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔｓ（内径２ｍｍ、長さ１５ｃｍ、粒子径５μｍ）
・ 流速 ： ０．１５ｍＬ／分
・ 測定波長 ： ３４０ｎｍと２６０ｎｍ
・ 溶出条件 ： Ａ液） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
Ｂ液） １５％メタノールを含む上記Ａ液
・ グラジエントプログラム ：
０－２０分 ； Ａ液 １００％ － Ｂ液 ０％
２０－６０分 ； Ａ液／Ｂ液 グラジエント
６０－８０分 ； Ａ液 ０％ － Ｂ液 １００％
【0052】
＜β－ＮＭＮＨ混合液からの精製＞
β－ＮＭＮＨをイオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーにて精製した。ＨＰＡ２５（三菱化学社製）樹脂１ｍＬあたり１０～２０ｍＬ反応混合液相当の割合でチャージし、平衡化バッファーにてよく洗浄した後に、０～０．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）にてグラジエント溶出を行なった。β－ＮＭＮＨは、５０～１００ｍＭ ＮａＣｌの溶出位置にて回収された。
－ＨＰＡ２５樹脂クロマトグラフィー条件－
・ 操作温度 ： 冷蔵
・ 平衡化バッファー ： １０ｍＭ ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）
・ 溶出バッファー ： ０．２Ｍ ＮａＣｌを含む上記ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨバッファー
・ 溶出操作 ： グラジエント
β－ＮＭＮＨをイオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーにて精製した。ＨＰＡ２５（三菱化学社製）樹脂１ｍＬあたり１０～２０ｍＬ反応混合液相当の割合でチャージし、平衡化バッファーにてよく洗浄した後に、０～０．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）にてグラジエント溶出を行なった。β－ＮＭＮＨは、５０～１００ｍＭ ＮａＣｌの溶出位置にて回収された。
－ＨＰＡ２５樹脂クロマトグラフィー条件－
・ 操作温度 ： 冷蔵
・ 平衡化バッファー ： １０ｍＭ ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）
・ 溶出バッファー ： ０．２Ｍ ＮａＣｌを含む上記ＮａＨＣＯ３－ＮａＯＨバッファー
・ 溶出操作 ： グラジエント
【0053】
精製主分画を集めた後に、電気透析にて過剰なＮａＣｌを取り除き、凍結乾燥操作にて一次濃縮を行なった。得られた黄色味を呈する粉末を少量の精製水にて再溶解し、最終粉末あたりβ－ＮＭＮＨ（無水無塩）として７５重量％になるように調整し、最終のバイアル凍結乾燥を実施した。２０ｇＮＡＤＨ粉末から約２ｇのβ－ＮＭＮＨ化合物粉末が得られた。
【0054】
（比較例１：化学薬剤処理によるβ－ＮＭＮＨ化合物粉末の調製）
β－ＮＭＮを還元する化学薬剤として、参考文献（ＣｈｅｍＲｘｉｖ，２０１９，ＮＡＤＨ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ： Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔａｔｅ， ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐｒｅｐｒｉｎｔ／ＮＡＤＨ＿ｉｎ＿Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＿Ａ＿Ｓｉｎｇｌｅ＿Ｓｔａｔｅ／８２０８４０７／１）に従い亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を用いてβ－ＮＭＮＨ化合物（以下、「１，４－ジヒドロＮＭＮ」と称することがある。）の調製を行なった。下記の化学反応条件下で３４０ｎｍにおける吸光度上昇を確認した後に、実施例１に記載の方法と同様にして１，４－ジヒドロＮＭＮの分離精製を試みた。
＜化学反応混合液の組成（１リットルあたり）＞
・ β－ＮＭＮ粉末（オリエンタル酵母工業社にて製造） ５ｇ
・ 亜ジチオン酸ナトリウム粉末 ５ｇ
・ ＮａＨＣＯ３ ５ｇ
・ Ｎａ２ＣＯ３ １０ｇ
β－ＮＭＮを還元する化学薬剤として、参考文献（ＣｈｅｍＲｘｉｖ，２０１９，ＮＡＤＨ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ： Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔａｔｅ， ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐｒｅｐｒｉｎｔ／ＮＡＤＨ＿ｉｎ＿Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＿Ａ＿Ｓｉｎｇｌｅ＿Ｓｔａｔｅ／８２０８４０７／１）に従い亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）を用いてβ－ＮＭＮＨ化合物（以下、「１，４－ジヒドロＮＭＮ」と称することがある。）の調製を行なった。下記の化学反応条件下で３４０ｎｍにおける吸光度上昇を確認した後に、実施例１に記載の方法と同様にして１，４－ジヒドロＮＭＮの分離精製を試みた。
＜化学反応混合液の組成（１リットルあたり）＞
・ β－ＮＭＮ粉末（オリエンタル酵母工業社にて製造） ５ｇ
・ 亜ジチオン酸ナトリウム粉末 ５ｇ
・ ＮａＨＣＯ３ ５ｇ
・ Ｎａ２ＣＯ３ １０ｇ
【0055】
詳しくは、上記の亜ジチオン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して、β－ＮＭＮ粉末を溶解し遮光しながら室温で３０分以上静置した。３４０ｎｍにおける吸光度増加が安定した、淡黄色を呈する還元液をＨＰＡ２５イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーに供し、１，４－ジヒドロＮＭＮを単離した。
【0056】
（試験例１：ＨＰＬＣ純度の測定）
下記の方法により、実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物について、ＨＰＬＣ純度を測定した。得られた結果を下記の表１に示す。なお、測定結果は３回行った平均値である。
下記の方法により、実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物について、ＨＰＬＣ純度を測定した。得られた結果を下記の表１に示す。なお、測定結果は３回行った平均値である。
【0057】
〔ＨＰＬＣ純度測定〕
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用した。
・ β－ＮＭＮＨ試料を１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とした。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライした。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分の分離は、以下の方法で実施した。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定した。
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用した。
・ β－ＮＭＮＨ試料を１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とした。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライした。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分の分離は、以下の方法で実施した。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定した。
【0058】
【表1】
【0059】
なお、実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物はいずれもＨＰＬＣではＮＡＤのピークは観察されず、実質的にＮＡＤを含まないものであった。
【0060】
（試験例２：モル吸光係数の算出）
下記の方法により、実施例１の方法で製造した３ロットのβ－ＮＭＮＨ化合物の、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出した。得られた結果を下記の表２に示す。
下記の方法により、実施例１の方法で製造した３ロットのβ－ＮＭＮＨ化合物の、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出した。得られた結果を下記の表２に示す。
【0061】
〔分子吸光係数の算出〕
ＮＭＮＨのモル濃度を明らかとした試料を調製し、検出器に適する濃度まで適宜希釈したサンプルの波長３４０ｎｍでの吸光度を光路長既知のセルで測定し、上記した（式２）により波長３４０ｎｍでのモル吸光係数を算出した。
ＮＭＮＨのモル濃度を明らかとした試料は以下のようにして調製した。
・ 粉末重量当たりに含まれる水分含量（％）をカールフィッシャー法によって算出した。
・ 粉末重量当たりに含まれるナトリウム含量（％）を原子吸光分析法によって算出した。
・ ＨＰＬＣ純度を算出した。
・ ＮＭＮＨ粉末約０．３ｇを秤量し、粉末秤量値を記録した。２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し５０ｍＬにメスアップした、上記した（式３）より、この試料中のＮＭＮＨモル濃度を算出した。
測定試料の波長３４０ｎｍでの吸光度は以下のようにして測定した。
ＮＭＮＨのモル濃度が明らかな試料を、約０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＭＮＨ相当になるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）で希釈し、モル濃度既知の測定試料を調製した。分光光度計ＵＶ－１８００（島津製作所製）を用いて測定試料の波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定試料の吸光度ならびにモル濃度を用いて、上記した（式２）より波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出した。
ＮＭＮＨのモル濃度を明らかとした試料を調製し、検出器に適する濃度まで適宜希釈したサンプルの波長３４０ｎｍでの吸光度を光路長既知のセルで測定し、上記した（式２）により波長３４０ｎｍでのモル吸光係数を算出した。
ＮＭＮＨのモル濃度を明らかとした試料は以下のようにして調製した。
・ 粉末重量当たりに含まれる水分含量（％）をカールフィッシャー法によって算出した。
・ 粉末重量当たりに含まれるナトリウム含量（％）を原子吸光分析法によって算出した。
・ ＨＰＬＣ純度を算出した。
・ ＮＭＮＨ粉末約０．３ｇを秤量し、粉末秤量値を記録した。２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し５０ｍＬにメスアップした、上記した（式３）より、この試料中のＮＭＮＨモル濃度を算出した。
測定試料の波長３４０ｎｍでの吸光度は以下のようにして測定した。
ＮＭＮＨのモル濃度が明らかな試料を、約０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＭＮＨ相当になるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）で希釈し、モル濃度既知の測定試料を調製した。分光光度計ＵＶ－１８００（島津製作所製）を用いて測定試料の波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定試料の吸光度ならびにモル濃度を用いて、上記した（式２）より波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数を算出した。
【0062】
【表2】
【0063】
（試験例３）
＜試験例３－１：β－ＮＭＮＨ化合物からのβ－ＮＡＤＨ変換合成＞
実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物にＮｍｎａｔを作用させ、ＡＴＰ共存下でβ－ＮＡＤＨの変換合成を行った。
前記Ｎｍｎａｔとして、本試験例では、β－ＮＭＮＨおよびその化学還元誘導体である１，４－ジヒドロＮＭＮを共に基質として認識して作用する、大腸菌にて発現させた耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子、アミノ酸配列は配列番号３参照）を用いた。
＜試験例３－１：β－ＮＭＮＨ化合物からのβ－ＮＡＤＨ変換合成＞
実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物にＮｍｎａｔを作用させ、ＡＴＰ共存下でβ－ＮＡＤＨの変換合成を行った。
前記Ｎｍｎａｔとして、本試験例では、β－ＮＭＮＨおよびその化学還元誘導体である１，４－ジヒドロＮＭＮを共に基質として認識して作用する、大腸菌にて発現させた耐熱性Ｎｍｎａｔ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＴＫ００６７遺伝子、アミノ酸配列は配列番号３参照）を用いた。
【0064】
Ｎｍｎａｔ変換反応の反応液の組成は、下記のとおりである。
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５０Ｕ／Ｌ 耐熱性Ｎｍｎａｔ
Ｎｍｎａｔの活性単位（１Ｕ）は、ＡＴＰ存在下でβ－ＮＭＮより１分間あたり１μモルのＮＡＤを生成する触媒量と定めた。
・ ３ｍＭ β－ＮＭＮＨ（実施例１）または１，４－ジヒドロＮＭＮ（比較例１）
β－ＮＭＮＨおよび１，４－ジヒドロＮＭＮのモル濃度は、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数６，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］（比較例１に記載の参考文献で報告されている数値）を用いて求めた。
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５０Ｕ／Ｌ 耐熱性Ｎｍｎａｔ
Ｎｍｎａｔの活性単位（１Ｕ）は、ＡＴＰ存在下でβ－ＮＭＮより１分間あたり１μモルのＮＡＤを生成する触媒量と定めた。
・ ３ｍＭ β－ＮＭＮＨ（実施例１）または１，４－ジヒドロＮＭＮ（比較例１）
β－ＮＭＮＨおよび１，４－ジヒドロＮＭＮのモル濃度は、波長３４０ｎｍにおけるモル吸光係数６，５００［Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）］（比較例１に記載の参考文献で報告されている数値）を用いて求めた。
【0065】
３７℃で一晩静置後のＮｍｎａｔ変換反応の様相をＨＰＬＣ溶出パターンの比較により確認した。ＨＰＬＣ条件は下記のとおりである。
－ＨＰＬＣ条件－
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用した。
・ 試料をＮＭＮＨ相当、ＮＡＤＨ相当で合計約１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とした。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライした。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分、ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＨ誘導体の分離は、以下の方法で実施した。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定した。β－ＮＭＮＨ画分は７分、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＨ誘導体は６０分に溶出された。
－ＨＰＬＣ条件－
・ ＨＰＬＣ機器として、ＨＰＬＣシステムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）を使用した。
・ 試料をＮＭＮＨ相当、ＮＡＤＨ相当で合計約１ｍＭになるように２００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ１０．０）に溶解し、これを試料液とした。
・ 試料液１０μＬをＴＳＫ－ＧＥＬ ＯＤＳ－８０ＴＳカラム（長さ：１５ｃｍ、内径：４．６ｍｍ、粒子径：５μｍ、東ソー社製）にアプライした。
・ カラム吸着したβ－ＮＭＮＨ画分、ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＨ誘導体の分離は、以下の方法で実施した。
溶離液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）／メタノールを用い、０－１５％メタノールの濃度勾配にて、流速０．１５ｍＬ／分になるよう調整して溶出・分離し、吸光度３４０ｎｍで測定した。β－ＮＭＮＨ画分は７分、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＨ誘導体は６０分に溶出された。
【0066】
実施例１のβ－ＮＭＮＨのＮｍｎａｔ変換反応前のＨＰＬＣ溶出パターンを図１Ａに、Ｎｍｎａｔ変換反応後のＨＰＬＣ溶出パターンを図１Ｂに、比較例１の１，４－ジヒドロＮＭＮのＮｍｎａｔ変換反応前のＨＰＬＣ溶出パターンを図２Ａに、Ｎｍｎａｔ変換反応後のＨＰＬＣ溶出パターンを図２Ｂに示す。
図１Ａ～２Ｂに示したように、両者間におけるＮＡＤＨ前駆体並びに変換後のＮＡＤＨおよびその誘導体の溶出保持時間は同一であった。また、両者共にＮＡＤＨ前駆体はＮＡＤＨまたはその誘導体にほぼ１００％変換されており、Ｎｍｎａｔ変換反応において両者に差が無いことが確認された。
図１Ａ～２Ｂに示したように、両者間におけるＮＡＤＨ前駆体並びに変換後のＮＡＤＨおよびその誘導体の溶出保持時間は同一であった。また、両者共にＮＡＤＨ前駆体はＮＡＤＨまたはその誘導体にほぼ１００％変換されており、Ｎｍｎａｔ変換反応において両者に差が無いことが確認された。
【0067】
＜試験例３－２：ＬＤＨに対する補酵素活性応答性から見たＮＡＤＨ前駆体能の比較＞
－β－ＮＭＮＨ化合物からのβ－ＮＡＤＨ変換合成－
試験例３－１と同様にして、実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物をβ－ＮＡＤＨに変換した。反応の停止は、分子量１０，０００カットの限外ろ過にて行った。
－β－ＮＭＮＨ化合物からのβ－ＮＡＤＨ変換合成－
試験例３－１と同様にして、実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物をβ－ＮＡＤＨに変換した。反応の停止は、分子量１０，０００カットの限外ろ過にて行った。
【0068】
－ＬＤＨに対する補酵素活性応答性の評価－
ろ過外液（以下、Ｎｍｎａｔ変換混合液と称することがある。）をそのまま用い、変換後のＮＡＤＨおよびＮＡＤＨ誘導体のＬＤＨ活性に対する応答性を下記のようにして調べた。
ろ過外液（以下、Ｎｍｎａｔ変換混合液と称することがある。）をそのまま用い、変換後のＮＡＤＨおよびＮＡＤＨ誘導体のＬＤＨ活性に対する応答性を下記のようにして調べた。
【0069】
〔評価〕
－Ｎｍｎａｔ変換混合液－
・ ３ｍＭ ＮＡＤＨ相当
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
－Ｒ１試験液－
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当になるように、Ｎｍｎａｔ変換混合液０．１５ｍＬを、０．０２％のＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）４．８５ｍＬにて希釈した。
なお、対照（標準物質）として、β－ＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を用いたＲ１試験液を同一の手順にて調製した。
－Ｒ３試験液－
・ ５ｍＭ になるようにピルビン酸ナトリウムを純水に溶解した。
－酵素溶液－
・ ＬＤＨが、反応液中の終濃度で、０、０．５、１、２、５、または１０Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調製した。希釈液には、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いた。
前記ＬＤＨは、組換えＬＤＨ（ブタ心臓由来、配列番号２）または組換えＬＤＨ（ウサギ骨格筋由来、配列番号１）を用いた。
－Ｎｍｎａｔ変換混合液－
・ ３ｍＭ ＮＡＤＨ相当
・ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．５）
・ ２０ｍＭ ＡＴＰ
・ ５ｍＭ ＭｇＣｌ２
－Ｒ１試験液－
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当になるように、Ｎｍｎａｔ変換混合液０．１５ｍＬを、０．０２％のＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）４．８５ｍＬにて希釈した。
なお、対照（標準物質）として、β－ＮＡＤＨ粉末（オリエンタル酵母工業社製）を用いたＲ１試験液を同一の手順にて調製した。
－Ｒ３試験液－
・ ５ｍＭ になるようにピルビン酸ナトリウムを純水に溶解した。
－酵素溶液－
・ ＬＤＨが、反応液中の終濃度で、０、０．５、１、２、５、または１０Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液を調製した。希釈液には、０．５％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いた。
前記ＬＤＨは、組換えＬＤＨ（ブタ心臓由来、配列番号２）または組換えＬＤＨ（ウサギ骨格筋由来、配列番号１）を用いた。
【0070】
－活性測定－
補酵素活性の測定には７１７０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
－－測定パラメーター－－
・ 測定温度 ・・・ ３７℃
・ 測定波長（副／主） ・・・ ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
・ 測定モード ・・・ ２ポイントレート［１０］［１８］［２０］［０］［０］
・ 検体量（酵素溶液量） ・・・ ４μＬ
・ Ｒ１試験液量 ・・・ １６０μＬ（０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当）
・ Ｒ３試験液量 ・・・ ４０μＬ
・ スタートアップキャリブ ・・・ あり（精製水）
補酵素活性の測定には７１７０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
－－測定パラメーター－－
・ 測定温度 ・・・ ３７℃
・ 測定波長（副／主） ・・・ ４０５ｎｍ／３４０ｎｍ
・ 測定モード ・・・ ２ポイントレート［１０］［１８］［２０］［０］［０］
・ 検体量（酵素溶液量） ・・・ ４μＬ
・ Ｒ１試験液量 ・・・ １６０μＬ（０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ相当）
・ Ｒ３試験液量 ・・・ ４０μＬ
・ スタートアップキャリブ ・・・ あり（精製水）
【0071】
－－測定手順－－
酵素溶液４μＬとＲ１試験液１６０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ３試験液４０μＬを添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。反応開始後５分間測定し、反応開始から０．３－０．９分（測光ポイント１８－２０）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。
酵素溶液４μＬとＲ１試験液１６０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、Ｒ３試験液４０μＬを添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。反応開始後５分間測定し、反応開始から０．３－０．９分（測光ポイント１８－２０）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。
【0072】
反応液中の終濃度が５Ｕ／ｍＬとなるように調製した酵素溶液を用いた場合のβ－ＮＡＤＨ標準物質の活性値を１００％としたときのそれぞれの場合の相対活性値（％）を算出し、その結果を図３Ａ（ブタ心臓由来のＬＤＨを用いた場合）、３Ｂ（ウサギ骨格筋由来のＬＤＨを用いた場合）に示した（○：対照、●：実施例１、△：比較例１）。また、反応液中の終濃度が５Ｕ／ｍＬとなるように調製した酵素溶液を用いた場合における、実施例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物から変換したβ－ＮＡＤＨを用いた場合、比較例１で製造した１，４－ジヒドロＮＭＮから変換したβ－ＮＡＤＨを用いた場合の相対活性値を表３に示した。なお、測定結果は３回行った平均値である。
【0073】
【表3】
【0074】
図３Ａおよび３Ｂ、並びに表３に示したように、本発明の実施例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物は、比較例１で製造した１，４－ジヒドロＮＭＮと比べて、β－ＮＡＤＨに変換した際に補酵素として高い触媒活性を示し、優れたＮＡＤＨ前駆体能を有することが確認された。
【0075】
（試験例４：ロテノン誘発細胞死に基づくパーキンソン病細胞モデルでのβ－ＮＭＮＨ化合物の効果）
実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物の生物活性の評価を下記のようにして行った。
実施例１および比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物の生物活性の評価を下記のようにして行った。
【0076】
ヒト神経幹細胞（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）を出発材料に、レチノイン酸ならびにホルボール１２－ミリステート－１３酢酸により分化誘導したヒト神経細胞アッセイにて、ロテノン誘発細胞死に対する抑制度合いを、細胞内ＡＴＰ量を指標として求めた。下記に手順を示した。
【0077】
＜第０日目＞
生細胞数として１ウェルあたり１０４個となるように、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに播いた。
生細胞数として１ウェルあたり１０４個となるように、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに播いた。
【0078】
＜第１日目＞
１０μＭレチノイン酸を添加した培地にて培地交換を行った。
１０μＭレチノイン酸を添加した培地にて培地交換を行った。
【0079】
＜第４日目＞
終濃度８０μＭになるように、ホルボール１２－ミリステート－１３酢酸を培地に添加し、分化誘導した。
終濃度８０μＭになるように、ホルボール１２－ミリステート－１３酢酸を培地に添加し、分化誘導した。
【0080】
＜第７日目＞
１００μＭロテノンを含む培地にて培地交換を行い、細胞死の誘発をかけた。このとき、β－ＮＭＮ（酸化型ＮＭＮ、対照）、または実施例１若しくは比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物を種々の濃度（０、５、５０、または５００μＭ）で培地中に添加した。
１００μＭロテノンを含む培地にて培地交換を行い、細胞死の誘発をかけた。このとき、β－ＮＭＮ（酸化型ＮＭＮ、対照）、または実施例１若しくは比較例１で製造したβ－ＮＭＮＨ化合物を種々の濃度（０、５、５０、または５００μＭ）で培地中に添加した。
【0081】
＜第９日目＞
培養上清を除去し、接着細胞内ＡＴＰ量を市販の細胞ＡＴＰ測定試薬（東洋ビーネット社製、ＣＡＴ ＮＯ． ＣＡ２－１００）を用いて測定した。なお、細胞内ＡＴＰ量は、前記測定試薬に基づき発光プレートリーダーにて得られた発光量と正比例の関係を示すことをＡＴＰ標準液での検量線より予め確かめた。
培養上清を除去し、接着細胞内ＡＴＰ量を市販の細胞ＡＴＰ測定試薬（東洋ビーネット社製、ＣＡＴ ＮＯ． ＣＡ２－１００）を用いて測定した。なお、細胞内ＡＴＰ量は、前記測定試薬に基づき発光プレートリーダーにて得られた発光量と正比例の関係を示すことをＡＴＰ標準液での検量線より予め確かめた。
【0082】
本試験で用いた培地組成は下記のとおりである。
・ 細胞増殖用
Ｆ１２／Ｅ－ＭＥＭ＋１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）＋１５％ＦＢＳ（牛胎児血清）
・ 分化誘導・ロテノン誘発アッセイ用
Ｆ１２／Ｅ－ＭＥＭ＋１％ＮＥＡＡ＋１％Ｎ２＋１ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ（人血清アルブミン）
・ 細胞増殖用
Ｆ１２／Ｅ－ＭＥＭ＋１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）＋１５％ＦＢＳ（牛胎児血清）
・ 分化誘導・ロテノン誘発アッセイ用
Ｆ１２／Ｅ－ＭＥＭ＋１％ＮＥＡＡ＋１％Ｎ２＋１ｍｇ／ｍＬ ＨＳＡ（人血清アルブミン）
【0083】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【配列表】