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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022162862
(43)【公開日】2022-10-25
(54)【発明の名称】フィラグリン及びヒアルロン酸産生促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/65 20060101AFI20221018BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221018BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20221018BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20221018BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20221018BHJP
A61Q 1/00 20060101ALI20221018BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20221018BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221018BHJP
【ＦＩ】
A61K36/65
A61P43/00 111
A61P17/16
A61K8/9789
A61Q19/00
A61Q1/00
A23L33/105 ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021067905
(22)【出願日】2021-04-13
(71)【出願人】
【識別番号】504132881
【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学
(71)【出願人】
【識別番号】521157948
【氏名又は名称】株式会社ＪＩＡアグリ＆バイオ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】野村 義宏
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 栄
【テーマコード（参考）】
4B018
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018MD48
4B018ME14
4B018MF01
4C083AA111
4C083AA112
4C083CC02
4C083CC03
4C083CC11
4C083DD14
4C083DD15
4C083DD16
4C083DD17
4C083DD23
4C083DD27
4C083EE12
4C083EE13
4C083FF01
4C088AB58
4C088AC03
4C088BA08
4C088BA09
4C088CA03
4C088CA05
4C088CA25
4C088MA16
4C088MA23
4C088MA31
4C088MA32
4C088MA35
4C088MA37
4C088MA41
4C088MA43
4C088MA52
4C088MA55
4C088MA56
4C088MA59
4C088MA60
4C088MA63
4C088MA66
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZC02
(57)【要約】
【課題】フィラグリン産生促進作用を有し、皮膚保湿効果を発揮する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品或いはこれらに配合する素材を提供する。
【解決手段】シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
【選択図】なし
【解決手段】シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項2】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項3】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿剤。
【請求項4】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進用食品。
【請求項5】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用食品。
【請求項6】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿用食品。
【請求項7】
抽出物がシャクヤク花弁の熱水抽出物若しくはエタノール－水抽出物、又はシャクヤクから誘導されたカルスのエタノール－水抽出物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の剤、又は請求項４～６のいずれか１項に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フィラグリン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び皮膚保湿剤に関する。
【背景技術】
【0002】
表皮の角質層は皮膚の最上面に位置し、水分の蒸散を押さえることで保湿機能を果たしている。また，外界からの微生物やウィルスの進入、紫外線、侵襲刺激を抑制するバリア機能を果たしている。
【0003】
フィラグリンは、表皮顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒に由来する塩基性タンパク質の一種であり、角層内でケラチンフィラメントを凝集させ、角層の組織構造の構築において重要な役割を担っている。顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒には、フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンが多量に存在し、プロフィラグリンは脱リン酸化とプロテアーゼの作用とを経てフィラグリンに分解される。
フィラグリンは角質細胞の細胞質内でケラチン線維を凝集させたのち、角質層上層で天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors; ＮＭＦ）へと分解される（非特許文献１）。天然保湿因子は、水との親和性が高いアミノ酸やアミノ酸誘導体から構成され、皮膚角質層の水分保持に重要な役割を果たすと考えられ、乾燥の度合いが高い皮膚においては、角層中のＮＭＦが少ないことが明らかになっている（非特許文献２）。
フィラグリンは角質細胞の細胞質内でケラチン線維を凝集させたのち、角質層上層で天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors; ＮＭＦ）へと分解される（非特許文献１）。天然保湿因子は、水との親和性が高いアミノ酸やアミノ酸誘導体から構成され、皮膚角質層の水分保持に重要な役割を果たすと考えられ、乾燥の度合いが高い皮膚においては、角層中のＮＭＦが少ないことが明らかになっている（非特許文献２）。
【0004】
また、フィラグリン欠損マウスにおいて、ＩＬ－１の産生が高まり慢性的な皮膚炎症が起きること（非特許文献３）、アトピー性皮膚炎患者においてフィラグリンの遺伝子変異の割合が多く、フィラグリンが産生されにくいことが報告されている（非特許文献４）。すなわち、アトピー性皮膚炎のような乾燥肌を伴う疾患においては、フィラグリン発現が減少し、また角質層中のアミノ酸が減少することが知られている。また、プロフィラグリンのＮ末端領域には核移行シグナルが存在しており、表皮細胞の核内に移行して表皮の最終的な分化制御やバリア機能の形成に関与すると考えられている（非特許文献５）。
したがって、フィラグリンの発現を促進させることは、皮膚の保水能や表皮細胞の正常な分化を促す上で重要であると考えられる。
したがって、フィラグリンの発現を促進させることは、皮膚の保水能や表皮細胞の正常な分化を促す上で重要であると考えられる。
【0005】
また、ヒアルロン酸は、コラーゲン、エラスチン等と共に真皮細胞外マトリックスを構成し、表皮細胞や線維芽細胞等の細胞の外にあって、細胞の保護、組織水分の保持、柔軟性の維持、潤滑性の保持等において重要な役割を担っている。皮膚のヒアルロン酸の産生量は、加齢とともに減少することが知られており、その結果、細胞の保湿力を低下させて乾燥、肌荒れ、シミ、皺等の症状を引き起こす原因となる。また、近年、紫外線等の外的要因も、ヒアルロン酸量の減少を誘導する因子とされており、乾燥肌や肌荒れの要因となると考えられる。したがって、ヒアルロン酸産生の促進は、皮膚の保湿機能を維持又は改善する上で重要である。
【0006】
従来、フィラグリンの発現やヒアルロン酸の産生を促進させる植物やその成分について種々検討され、例えばカンゾウの抽出物（特許文献１）、カンナの抽出物（特許文献２）、紫根の抽出物（特許文献３）等にフィラグリンの発現促進作用があること、クロミキイチゴ抽出物やヒマラヤンラズベリー抽出物（特許文献４）、トゲドコロの植物体又はその抽出物（特許文献５）にヒアルロン酸産生促進作用があることが見出されている。
【0007】
ボタン科の多年草であるシャクヤク（芍薬）は、古くから薬用植物として知られ、その根部が、鎮痛・鎮痙、収斂、緩和作用等に効果があるとされ、利用されてきた。一方、シャクヤクの花弁はポプリやハーブ茶等に利用されることもあるが、摘花され廃棄されることが多く、あまり利用されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２００２－３６３０５４号公報
【特許文献2】特開２０１７－８８５３８号公報
【特許文献3】特開２０１８－３５１４４号公報
【特許文献4】特開２０１３－０１８７３４号公報
【特許文献5】特開２０１２－０５６９１９号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Yayoi Kamata, Aya Taniguchi, Mami Yamamoto, Junko Nomura, Kazuhiko Ishihara, Hidenari Takahara, Toshihiko Hibino, and Atsushi Takeda, Neutral Cysteine Protease Bleomycin Hydrolase Is Essential for the Breakdown of Deiminated Filaggrin into Amino Acids. J Biol Chem. 2009; 284(19): 12829-12836.
【非特許文献2】L Feng, P Chandar, N Lu, C Vincent, J Bajor, H McGuiness, Characteristic differences in barrier and hygroscopic properties between normal and cosmetic dry skin. II. Depth profile of natural moisturizing factor and cohesivity. Int. J Cosmetic Science, 2014, 36(3): 231-238.
【非特許文献3】Nathan K. Archer, Jay-Hyun Jo, Steven K. Lee, Dongwon Kim, Barbara Smith, Roger V. Ortines, Yu Wang, Mark C. Marchitto, Advaitaa Ravipati, Shuting S. Cai, Carly A. Dillen, Haiyun Liu, Robert J. Miller, Alyssa G. Ashbaugh, Angad S. Uppal, Michiko Oyoshi, Nidhi Malhotra, Sabine Hoff, Luis A Garza, Heidi H. Kong, Julia A. Segre, Raif S. Geha, and Lloyd S. Miller, Injury, dysbiosis and filaggrin deficiency drive skin inflammation via keratinocyte IL-1α release. J Allergy Clin Immunol. 2019 Apr; 143(4): 1426-1443.e6.
【非特許文献4】W H Irwin McLean, Alan D Irvine, Heritable Filaggrin Disorders: The Paradigm of Atopic Dermatitis. J Invest Dermatol. 2012 Nov;132 Suppl 3:E20-21.
【非特許文献5】M Yamamoto-Tanaka, T Makino, A Motoyama, M Miyai, R Tsuboi, and T Hibino. Multiple pathways are involved in DNA degradation during eratinocyte terminal differentiation. Cell Death Dis. 2014 Apr; 5(4): e1181.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、フィラグリン及びヒアルロン酸産生促進作用を有し、皮膚保湿効果を発揮する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品或いはこれらに配合する素材を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記の課題に鑑みて検討したところ、シャクヤク花弁又はその抽出物、及びシャクヤクから誘導されたカルスの抽出物に優れたフィラグリン及びヒアルロン酸産生促進作用があり、これが皮膚の天然保湿因子（ＮＭＦ）の産生促進や皮膚保湿能の向上に有用であることを見出した。
【0012】
すなわち本発明は、以下の１）～７）に係るものである。
１）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
２）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
３）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿剤。
４）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進用食品。
５）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用食品。
６）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿用食品。
７）抽出物がシャクヤク花弁の熱水抽出物若しくはエタノール－水抽出物、又はシャクヤクから誘導されたカルスのエタノール－水抽出物である、１）～３）のいずれかの剤、又は４）～６）のいずれかの食品。
１）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
２）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
３）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿剤。
４）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするフィラグリン産生促進用食品。
５）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用食品。
６）シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を有効成分とする皮膚保湿用食品。
７）抽出物がシャクヤク花弁の熱水抽出物若しくはエタノール－水抽出物、又はシャクヤクから誘導されたカルスのエタノール－水抽出物である、１）～３）のいずれかの剤、又は４）～６）のいずれかの食品。
【発明の効果】
【0013】
本発明のフィラグリン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤又は皮膚保湿剤によれば、フィラグリン又はヒアルロン酸の産生を促進することにより、皮膚の天然保湿因子量を増加させ、皮膚保湿能を向上させることができる。よって、本発明によれば、乾燥肌を伴う疾患又は状態の改善等に有用な医薬品、医薬部外品、化粧品、食品或いはこれらに配合する素材が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】シャクヤク花弁及びカルスの抽出物の逆相クロマトグラム。ＰＥ：花弁熱水抽出物、Ｐ３０：花弁３０％エタノール抽出物、ＣＥ：カルス熱水抽出物、Ｃ３０：カルス３０％エタノール抽出物。
【図2】シャクヤク花弁及び熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウスの皮膚水分量及び経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）。ＰＷ：花弁、ＰＥ：花弁熱水抽出物。
【図3】シャクヤク花弁及び熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウス背部皮膚のシワスコア。［Ａ］ヘアレスマウスの背部皮膚の写真、［Ｂ］シワスコア、ＰＷ：花弁、ＰＥ：花弁熱水抽出物。
【図4】シャクヤク花弁及び熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウス背部皮膚のＨＥ及び免疫染色像。［Ａ］ＨＥ染色像、［Ｂ］抗ラミニン免疫染色像、［Ｃ］抗フィラグリン免疫染色像。ＰＷ：花弁、ＰＥ：花弁熱水抽出物。
【図5】シャクヤク花弁及び熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウス背部皮膚の表皮厚への影響。ＰＷ：花弁、ＰＥ：花弁熱水抽出物。
【図6】シャクヤク花弁熱水抽出物及び構成成分を添加した上皮細胞ＨａＣａＴのフィラグリン遺伝子発現量。［Ａ］花弁熱水抽出物（ＰＥ）、［Ｂ］ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）、ペオニフロリン（ＰＦ）。
【図7】抗フィラグリン抗体を用いた表皮細胞培養液のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇパターン。ＰＣ：ポジティブコントロール（ジンセノシド）。
【図8】シャクヤク花弁抽出物及びカルス抽出物の表皮細胞のフィラグリン遺伝子発現量への影響。ＰＥ：花弁熱水抽出物、Ｐ３０：花弁３０％エタノール抽出物、ＣＥ：カルス培養熱水抽出物、Ｃ３０：カルス３０％エタノール抽出物。
【図9】シャクヤク花弁抽出物及びカルス抽出物の表皮細胞のヒアルロン酸産生への影響。ＰＥ：花弁熱水抽出物、Ｐ３０：花弁３０％エタノール抽出物、ＣＥ：カルス熱水抽出物。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明において、「シャクヤク」とは、ボタン科のシャクヤク（芍薬）（学名：Paeonia lactifloraを指す。
本発明において、シャクヤクは、全草、葉、茎、芽、花弁、蕾、根、根茎、種子等、又はこれらを組み合わせて使用することができるが、好ましくは花弁、蕾、葉、茎であり、より好ましくは花弁である。シャクヤクは、乾燥状態（自然乾燥、凍結乾燥等）のもの、生のものいずれでも好適に使用できる。また、シャクヤクは、適宜粉砕して使用することができる。
本発明において、シャクヤクは、全草、葉、茎、芽、花弁、蕾、根、根茎、種子等、又はこれらを組み合わせて使用することができるが、好ましくは花弁、蕾、葉、茎であり、より好ましくは花弁である。シャクヤクは、乾燥状態（自然乾燥、凍結乾燥等）のもの、生のものいずれでも好適に使用できる。また、シャクヤクは、適宜粉砕して使用することができる。
【0016】
「シャクヤクから誘導されるカルス」とは、シャクヤクの組織又は細胞を培養することにより細胞分裂を繰返して生じた無定形の組織塊を指す。
培養は、例えば、シャクヤク組織の一部（移植片）を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ培地、Ｗｈｉｔｅ培地などの一般的培地中、カイネチン、ゼアチン、６－ベンジルアデニン（６－ＢＡ）、イソペンテニルアデニン、１－フェニル－３－（１，２，３－チアジアゾール－５－イル）尿素（ＴＤＺ）などのサイトカイニン、及びインドール酢酸（ＩＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ナフタレン酢酸、２，３，６－トリクロロフェノキシ安息香酸、ピクロラムなどのオーキシンの存在下、ｐＨ５．６～５．８、２２～２４℃、暗所で静置培養又は振とう培養することにより行うことができる。
抽出に供するカルスは、生及び乾燥のいずれでもよく、また破砕機で破砕されたものでもよい。
培養は、例えば、シャクヤク組織の一部（移植片）を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ培地、Ｗｈｉｔｅ培地などの一般的培地中、カイネチン、ゼアチン、６－ベンジルアデニン（６－ＢＡ）、イソペンテニルアデニン、１－フェニル－３－（１，２，３－チアジアゾール－５－イル）尿素（ＴＤＺ）などのサイトカイニン、及びインドール酢酸（ＩＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ナフタレン酢酸、２，３，６－トリクロロフェノキシ安息香酸、ピクロラムなどのオーキシンの存在下、ｐＨ５．６～５．８、２２～２４℃、暗所で静置培養又は振とう培養することにより行うことができる。
抽出に供するカルスは、生及び乾燥のいずれでもよく、また破砕機で破砕されたものでもよい。
【0017】
シャクヤク又はシャクヤクから誘導されたカルスを抽出するための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；並びにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、好ましくはエタノール、アルコール（好ましくはエタノール）－水混合液が挙げられる。
【0018】
抽出溶媒の使用量は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されないが、例えば、シャクヤク又はシャクヤクから誘導されたカルスの乾燥物に対して５～６０質量倍が好ましく、更に好ましくは５～３０質量倍である。
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出温度は、０℃以上，使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、抽出温度が高温になればより短時間で抽出が可能である。抽出期間（時間）は、例えば、４０℃以上に加熱して抽出する場合には１０分～１日が好ましく、例えば、４０～５０℃で１２～２４時間、５０～６０℃で２～１２時間、６０～７０で１０分～２時間が挙げられる。
また、抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、加圧加熱抽出、蒸留，超臨界抽出等の通常の手段を用いることができる。
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出温度は、０℃以上，使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、抽出温度が高温になればより短時間で抽出が可能である。抽出期間（時間）は、例えば、４０℃以上に加熱して抽出する場合には１０分～１日が好ましく、例えば、４０～５０℃で１２～２４時間、５０～６０℃で２～１２時間、６０～７０で１０分～２時間が挙げられる。
また、抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、加圧加熱抽出、蒸留，超臨界抽出等の通常の手段を用いることができる。
【0019】
本発明の抽出物としては、シャクヤク花弁の熱水抽出物、シャクヤク花弁のエタノール－水抽出物、シャクヤクから誘導されたカルスのエタノール－水抽出物が好ましい。
熱水抽出に用いられる抽出水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水、脱イオン水、超純水（例えば、超純水装置ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）により精製されたミリＱ水）等を挙げることができる。
この場合、抽出温度は、４０℃～１００℃、より好ましくは６０℃～９８℃、さらに好ましくは８０℃～９５℃の熱水を挙げることができ、加圧下では、１００℃以上、好ましくは１００℃～２００℃を挙げることができる。
また、抽出時間は、抽出温度や抽出スケール等を考慮して、適宜設定することができるが、例えば、３０分～１２時間が挙げられ、好ましくは１時間～５時間、より好ましくは２時間～４時間が挙げられる。また、１回目の抽出を行った残渣を用いて２回目の抽出を行い、１回目の一番液と２回目の二番液とを合わせて本発明に用いる抽出物とすることもできる。
熱水抽出における、乾燥花弁の質量に対する、水（熱水）の容量比は、本発明の効果が得られる有効成分を抽出できる条件であれば、特に制限されない。例えば、シャクヤクの乾燥花弁１ｇに対して熱水２～１００ｍＬ、好ましくは熱水５～５０ｍＬ、より好ましくは熱水５～２０ｍＬの比率を挙げることができる。
熱水抽出に用いられる抽出水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水、脱イオン水、超純水（例えば、超純水装置ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）により精製されたミリＱ水）等を挙げることができる。
この場合、抽出温度は、４０℃～１００℃、より好ましくは６０℃～９８℃、さらに好ましくは８０℃～９５℃の熱水を挙げることができ、加圧下では、１００℃以上、好ましくは１００℃～２００℃を挙げることができる。
また、抽出時間は、抽出温度や抽出スケール等を考慮して、適宜設定することができるが、例えば、３０分～１２時間が挙げられ、好ましくは１時間～５時間、より好ましくは２時間～４時間が挙げられる。また、１回目の抽出を行った残渣を用いて２回目の抽出を行い、１回目の一番液と２回目の二番液とを合わせて本発明に用いる抽出物とすることもできる。
熱水抽出における、乾燥花弁の質量に対する、水（熱水）の容量比は、本発明の効果が得られる有効成分を抽出できる条件であれば、特に制限されない。例えば、シャクヤクの乾燥花弁１ｇに対して熱水２～１００ｍＬ、好ましくは熱水５～５０ｍＬ、より好ましくは熱水５～２０ｍＬの比率を挙げることができる。
【0020】
また、エタノール－水抽出に用いられるエタノール－水混合液は、任意の割合で混合して使用することができるが、好ましくはエタノールの割合が２０～９０％の水溶液（２０℃におけるｖ／ｖ％）であり、より好ましくは３０～８０％の水溶液である。
【0021】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。
【0022】
また、上記抽出物は、さらに液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物を除去して用いることが好ましい。また、抽出物は、必要により公知の方法により脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。また、抽出物は、公知の技術及び方法を用いてさらに精製して用いることができる。
【0023】
後述する実施例に示すとおり、シャクヤク花弁又はその抽出物、シャクヤクから誘導されたカルスの抽出物は、表皮細胞のフィラグリン遺伝子発現を有意に促進し、そのタンパク質量を増加させる作用を有する。また、表皮細胞のヒアルロン酸の産生を促進する。
したがって、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物は、フィラグリン産生促進剤及びヒアルロン酸の産生となり得る。フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンは、プロスタシン等の酵素によって分解されてフィラグリンとなり、そのフィラグリンは、皮膚角質層でさらに分解されて、皮膚の水分保持に重要な役割を果たす天然保湿因子（ＮＭＦ）の成分の一つであるアミノ酸となる（前記非特許文献１）。したがって、シャクヤク花弁の熱水抽出物は、フィラグリン産生を促進する作用を介して、天然保湿因子の産生を促進することができ、それによって皮膚保湿効果を発揮することができる。よって、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物は、皮膚保湿剤となり得る。
斯かるフィラグリン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚保湿剤は、乾燥肌に伴う疾患又は状態、例えば肌荒れ、皮膚の乾燥ジワ、及びアトピー性皮膚炎、魚鱗癬、老人性乾皮症等の疾患の改善のために有用である。
したがって、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物は、フィラグリン産生促進剤及びヒアルロン酸の産生となり得る。フィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンは、プロスタシン等の酵素によって分解されてフィラグリンとなり、そのフィラグリンは、皮膚角質層でさらに分解されて、皮膚の水分保持に重要な役割を果たす天然保湿因子（ＮＭＦ）の成分の一つであるアミノ酸となる（前記非特許文献１）。したがって、シャクヤク花弁の熱水抽出物は、フィラグリン産生を促進する作用を介して、天然保湿因子の産生を促進することができ、それによって皮膚保湿効果を発揮することができる。よって、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物は、皮膚保湿剤となり得る。
斯かるフィラグリン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚保湿剤は、乾燥肌に伴う疾患又は状態、例えば肌荒れ、皮膚の乾燥ジワ、及びアトピー性皮膚炎、魚鱗癬、老人性乾皮症等の疾患の改善のために有用である。
【0024】
上記フィラグリン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及び皮膚保湿剤は、フィラグリン産生促進のため、ヒアルロン酸産生促進のため、天然保湿因子産生促進のため、皮膚保湿のため、更には肌荒れ、皮膚の乾燥ジワ、及びアトピー性皮膚炎、魚鱗癬、老人性乾皮症等の疾患の改善のための医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤とすることができる。
なお、上記の食品（「フィラグリン産生促進用食品」、「ヒアルロン酸産生促進用食品」、「皮膚保湿用食品」とも称す）には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
なお、上記の食品（「フィラグリン産生促進用食品」、「ヒアルロン酸産生促進用食品」、「皮膚保湿用食品」とも称す）には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
【0025】
ここで、「フィラグリン産生促進」とは、フィラグリンの遺伝子発現が促進する等により、生体内のフィラグリン産生が促進され、フィラグリン量が増加することを意味する。
また、「ヒアルロン酸産生促進」とは、皮膚表皮細胞のヒアルロン酸の産生能が促進され、ヒアルロン酸量が増加することを意味する。
また、「ヒアルロン酸産生促進」とは、皮膚表皮細胞のヒアルロン酸の産生能が促進され、ヒアルロン酸量が増加することを意味する。
【0026】
シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を含有する上記医薬品又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシロール、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、局所、外用剤、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であり得る。
【0027】
上記医薬品又は医薬部外品は、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、滑沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬品や医薬部外品は、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物の薬理効果が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。
【0028】
本発明のシャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を含有する化粧品は、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を単独で含有していてもよく、又は化粧品として許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、滑沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該化粧品は、本発明の薬理作用が失われない限り、他の有効成分や化粧成分、例えば、保湿剤、美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等を含有していてもよい。化粧品とする場合の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。好ましくは、上記化粧品は、皮膚保湿用化粧品であり得る。
【0029】
また、本発明のシャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を配合した上記食品の形態は、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、トローチ剤等の固形製剤）の栄養補給用組成物が挙げられる。この内、錠剤、カプセル剤が好ましい。
種々の形態の食品は、本発明のシャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
種々の形態の食品は、本発明のシャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【0030】
上記医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品は、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物、必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や薬理成分を組みあわせて用い、常法により製造することができる。当該医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品におけるシャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物の含有量は、乾燥物として製剤全質量中に好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。
【0031】
また、上記医薬品や食品の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人１人当たりの１日の投与量は、通常、シャクヤク、シャクヤクから誘導されたカルス又はそれらの抽出物（乾燥物）として、好ましくは０．６ｇ以上、より好ましくは１ｇ以上であり、好ましくは１２ｇ以下、より好ましくは６ｇ以下である。上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回～数回に分け、数週間～数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
投与対象としては、皮膚の保湿を必要としている若しくは希望しているヒト、すなわち、乾燥肌に伴う疾患又は状態、例えば肌荒れ、皮膚の乾燥ジワ、及びアトピー性皮膚炎、魚鱗癬、老人性乾皮症等の疾患を有する患者や当該疾患を発症する可能性が高いヒト等が挙げられる。
投与対象としては、皮膚の保湿を必要としている若しくは希望しているヒト、すなわち、乾燥肌に伴う疾患又は状態、例えば肌荒れ、皮膚の乾燥ジワ、及びアトピー性皮膚炎、魚鱗癬、老人性乾皮症等の疾患を有する患者や当該疾患を発症する可能性が高いヒト等が挙げられる。
【実施例0032】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜製造例＞
１．シャクヤク花弁抽出物の調製
（１）シャクヤク花弁の熱水抽出物の調製
シャクヤク花弁を凍結乾燥（ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤＵ－８３０：東京理化器機株式会社製）した後、電動ミルを用いて粉状に粉砕した。この花弁粉砕物４０ｇにミリＱ水２０ｍｌを加え、８０℃で２時間、２度の抽出を行った。再びガーゼでろ過した後、これら２度の抽出によって得られた抽出液を合わせて凍結乾燥を行った。花弁４０．０ｇから抽出後の凍結乾燥物５．６６ｇを得た。凍結乾燥後瑪瑙乳鉢で粉末状にし、これをシャクヤク花弁熱水抽出物（ＰＥ）とした。
＜製造例＞
１．シャクヤク花弁抽出物の調製
（１）シャクヤク花弁の熱水抽出物の調製
シャクヤク花弁を凍結乾燥（ＦＲＥＥＺＥ ＤＲＹＥＲ ＦＤＵ－８３０：東京理化器機株式会社製）した後、電動ミルを用いて粉状に粉砕した。この花弁粉砕物４０ｇにミリＱ水２０ｍｌを加え、８０℃で２時間、２度の抽出を行った。再びガーゼでろ過した後、これら２度の抽出によって得られた抽出液を合わせて凍結乾燥を行った。花弁４０．０ｇから抽出後の凍結乾燥物５．６６ｇを得た。凍結乾燥後瑪瑙乳鉢で粉末状にし、これをシャクヤク花弁熱水抽出物（ＰＥ）とした。
【0033】
（２）シャクヤク花弁のエタノール抽出物の調製
（１）と同様に凍結乾燥し粉砕した凍結乾燥花弁粉砕物１０ｇに３０％エタノールを２０ｍｌ加え、超音波をかけながら室温で２時間抽出を行った。ガーゼで濾過して得られた濾液をエバポレーターでエタノールを除去・濃縮した後、濃縮前と同量になるようにミリＱ水を加え、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、瑪瑙乳鉢ですりつぶして粉末状にしたものを３０％エタノール抽出物（Ｐ３０）とした。
（１）と同様に凍結乾燥し粉砕した凍結乾燥花弁粉砕物１０ｇに３０％エタノールを２０ｍｌ加え、超音波をかけながら室温で２時間抽出を行った。ガーゼで濾過して得られた濾液をエバポレーターでエタノールを除去・濃縮した後、濃縮前と同量になるようにミリＱ水を加え、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、瑪瑙乳鉢ですりつぶして粉末状にしたものを３０％エタノール抽出物（Ｐ３０）とした。
【0034】
２．シャクヤクの固体培養カルス及びその抽出物の調製
（１）濃度０．２５％ＰＶＰ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、３％ショ糖、１ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ及び１ｍｇ／Ｌ ＴＤＺを添加した０．８％寒天培地に、つくばボタン園の薬用芍薬の雑種系統５年生株（無農薬栽培）の蕾の花弁を置床した。培養は、温度２４℃、湿度６０％、暗所にて行うことでカルスを調製した。
（２）得られたカルスを培地から取り出した後、ろ紙で軽く水分を取除き、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥物を瑪瑙乳鉢ですりつぶして粉末状にし、上記１と同様に、熱水及び３０％エタノール抽出を行い、カルス熱水抽出物（ＣＥ）及びカルス３０％エタノール抽出物（Ｃ３０）を調製した。
（１）濃度０．２５％ＰＶＰ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、３％ショ糖、１ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ及び１ｍｇ／Ｌ ＴＤＺを添加した０．８％寒天培地に、つくばボタン園の薬用芍薬の雑種系統５年生株（無農薬栽培）の蕾の花弁を置床した。培養は、温度２４℃、湿度６０％、暗所にて行うことでカルスを調製した。
（２）得られたカルスを培地から取り出した後、ろ紙で軽く水分を取除き、凍結乾燥を行った。この凍結乾燥物を瑪瑙乳鉢ですりつぶして粉末状にし、上記１と同様に、熱水及び３０％エタノール抽出を行い、カルス熱水抽出物（ＣＥ）及びカルス３０％エタノール抽出物（Ｃ３０）を調製した。
【0035】
３．逆相クロマトグラフィーによる成分分析
（１）方法
上記１及び２で調製した各抽出物粉末１０ｍｇを１０ｍｌの５０％メタノールに懸濁し３０分振とうすることで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。残渣に同量の５０％メタノールを加え、同様に抽出・ろ過を行い、全濾液を合わせ、０．４５μｍフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－０３ＣＰ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）に通したものを試料溶液とした。また、ペンタガロイルグルコース標準品（１，２，３，４，６－Ｐｅｎｔａ－Ｏ－ｇａｌｌｏｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ、和光純薬株式会社製）及びペオニフロリン標準品（和光純薬株式会社製）は、０．１ｍｇ／ｍＬで５０％メタノールに溶解し、標準溶液とした。試料溶液及び標準溶液をＨＰＬＣ ＬＣ－８０２０II（東ソー社製）で分析した。分析条件は以下の通りである。
・送液：流速１ｍｌ／ｍｉｎ
・移動相：（Ａ）アセトニトリル，（Ｂ）０．１％リン酸水溶液
・グラジエント条件：０－５ｍｉｎ，１０－１５％ Ａ，５－４０ｍｉｎ，１５－３０％ Ａ，４０－４５ｍｉｎ，３０－７０％ Ａ，４５－４６ｍｉｎ，７０－８０％ Ａ，５０－５５ｍｉｎ，８０－１０％ Ａ，５５－６５ｍｉｎ，１０％ Ａ
・カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡ
・測定温度：４０℃
・検出波長：２８０ｎｍ
・注入量：１０μｌ
（１）方法
上記１及び２で調製した各抽出物粉末１０ｍｇを１０ｍｌの５０％メタノールに懸濁し３０分振とうすることで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。残渣に同量の５０％メタノールを加え、同様に抽出・ろ過を行い、全濾液を合わせ、０．４５μｍフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－０３ＣＰ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）に通したものを試料溶液とした。また、ペンタガロイルグルコース標準品（１，２，３，４，６－Ｐｅｎｔａ－Ｏ－ｇａｌｌｏｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ、和光純薬株式会社製）及びペオニフロリン標準品（和光純薬株式会社製）は、０．１ｍｇ／ｍＬで５０％メタノールに溶解し、標準溶液とした。試料溶液及び標準溶液をＨＰＬＣ ＬＣ－８０２０II（東ソー社製）で分析した。分析条件は以下の通りである。
・送液：流速１ｍｌ／ｍｉｎ
・移動相：（Ａ）アセトニトリル，（Ｂ）０．１％リン酸水溶液
・グラジエント条件：０－５ｍｉｎ，１０－１５％ Ａ，５－４０ｍｉｎ，１５－３０％ Ａ，４０－４５ｍｉｎ，３０－７０％ Ａ，４５－４６ｍｉｎ，７０－８０％ Ａ，５０－５５ｍｉｎ，８０－１０％ Ａ，５５－６５ｍｉｎ，１０％ Ａ
・カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ－８０ＴｓＱＡ
・測定温度：４０℃
・検出波長：２８０ｎｍ
・注入量：１０μｌ
【0036】
（２）結果
シャクヤク花弁には、ポリフェノールであるペンタガロイルグルコースが豊富に含まれていることが報告されている。
図１にシャクヤク花弁及びカルスの熱水及び３０％エタノール抽出物の逆相ＨＰＬＣパターンを示した（ＰＥ：シャクヤク花弁熱水抽出物、ＣＥ：カルス熱水抽出物：Ｐ３０：シャクヤク花弁３０％エタノール抽出物、Ｃ３０：カルス３０％エタノール抽出物）。
ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）及びペオニフロリン（ＰＦ）標準品と同じ保持時間にピークが確認できた。ピークの面積から、サンプル中のＰＧＧ及びＰＦ含量を求めた。シャクヤク花弁中のＰＧＧ含量は、０．８９６ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、ＰＦ含量は０．０９２ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、熱水抽出物中のＰＧＧ含量は０．７９９ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、ＰＦ含量は０．１５２ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量となった。
シャクヤク花弁には、ポリフェノールであるペンタガロイルグルコースが豊富に含まれていることが報告されている。
図１にシャクヤク花弁及びカルスの熱水及び３０％エタノール抽出物の逆相ＨＰＬＣパターンを示した（ＰＥ：シャクヤク花弁熱水抽出物、ＣＥ：カルス熱水抽出物：Ｐ３０：シャクヤク花弁３０％エタノール抽出物、Ｃ３０：カルス３０％エタノール抽出物）。
ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）及びペオニフロリン（ＰＦ）標準品と同じ保持時間にピークが確認できた。ピークの面積から、サンプル中のＰＧＧ及びＰＦ含量を求めた。シャクヤク花弁中のＰＧＧ含量は、０．８９６ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、ＰＦ含量は０．０９２ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、熱水抽出物中のＰＧＧ含量は０．７９９ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量、ＰＦ含量は０．１５２ｍｇ／１００ｍｇ乾燥重量となった。
【0037】
＜試験例＞
シャクヤク花弁抽出物及びカルス抽出物に関する薬理試験の方法及び結果を以下に示す。
尚、すべてのパラメーターについて、正規性の有無、等分散性の有無を確認した。独立２群間の検定において、正規分布に従いかつ等分散である場合は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを行った。正規性の有する多群間の検定では一元分散分析を行った。水準間に差がある群間には、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔにより統計処理を行った。
シャクヤク花弁抽出物及びカルス抽出物に関する薬理試験の方法及び結果を以下に示す。
尚、すべてのパラメーターについて、正規性の有無、等分散性の有無を確認した。独立２群間の検定において、正規分布に従いかつ等分散である場合は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを行った。正規性の有する多群間の検定では一元分散分析を行った。水準間に差がある群間には、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔにより統計処理を行った。
【0038】
試験例１ 光老化モデルに対するシャクヤク花弁及び熱水抽出物の摂取効果
１．方法
（１）光老化皮膚モデル
動物は１２時間明暗周期、温度２２．８±２℃、湿度は除湿機と加湿機を用いて、５２±１０％の動物飼育室で飼育した。飼料には一般飼育用固形飼料を用い、自由摂食・自由飲水にのもと、群毎に１つのケージで群飼いとした。３日間の予備飼育後に、体重、皮膚水分量及び皮膚水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が等しくなるように群分けを行い、群分けの２日後に本試験を開始した。０．５％トラガカントゴム溶液を溶媒とし１ｍｇ／１００μｌとなるように投与サンプルを調整し、１００ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔとなるように投与した。
試験群は、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）シャクヤク花弁熱水抽出物投与（ＰＥ）群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）シャクヤク花弁凍結粉砕物投与（ＰＷ）群（ｎ＝７）とした。
紫外線照射方法は、Ｔａｎａｋａらの方法に準じて行った。試験期間中１日１回毎日、胃ゾンデによる被験物質溶液を経口投与した。並行して週３回紫外線照射を行った。紫外線照射用ＵＶＢランプにはｌｕｍｐ ＧＬ２０ＳＥ（ＳＡＮＫＹＯ ＤＥＮＫＩ社製）を用い、これを並列で３本設置したものを照射器として使用した。このランプは主に２８０～３５０ｎｍの波長の光を放ち、３０６ｎｍで最大となる。照射強度はデジタル紫外線強度計ＵＶ－３４０（アズワン社製）を用いて測定した。照射はマウスを、縦１０ｃｍ、横６ｃｍ、高さ４ｃｍの１０連個別ケージに入れて行い、各個別ケージの位置によって照射強度が異なるため、群ごとに毎回位置のローテーションを行い、照射強度の違いを緩和させた。照射は週３回行い、照射時間は、１週目は１分から徐々に照射時間を増やしていき、紅斑形成を防ぐため最大３分４５秒とした。照射期間は６週間とし、総照射量は１．３９Ｊ／ｃｍ２であった。
解剖は、被験物質の経口投与３０分後に行い、背部皮膚写真を撮影したのち、セボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下、下大静脈採血を行い安楽死させ、背部皮膚を採取した。
皮膚水分量の測定は、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍＢＨ社製）を用いて、群分け時及び試験中に週２回の測定を行った。
経表皮水分蒸散量測定は、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ３００（ＣＯＵＲＡＧＥ＋ＫＨＡＺＡＫＡ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧＭＢＨ社製）を用いて、マウス腰部の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ： Ｔｒａｎｓ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗａｔｅｒ Ｌｏｓｓ）を解剖前日に測定した。
解剖前にセボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下でヘアレスマウスの背部皮膚の写真をＯＬＹＭＰＵＳ ＣＡＭＥＤＩＡ ＤＩＧＩＴＡＬ ＣＡＭＥＲＡ Ｃ－３０４０ ＺＯＯＭで撮影した。シワの目視によるスコアリングは、目視判定基準（Inomata et al., J Invest Dermatol. 2003 Jan;120(1):128-34.）に基づき、群分けを知らされていない試験非参加者８名にこの画像をランダムに見せ、０，２，４，６，８の５段階でシワの評価を行った。
１．方法
（１）光老化皮膚モデル
動物は１２時間明暗周期、温度２２．８±２℃、湿度は除湿機と加湿機を用いて、５２±１０％の動物飼育室で飼育した。飼料には一般飼育用固形飼料を用い、自由摂食・自由飲水にのもと、群毎に１つのケージで群飼いとした。３日間の予備飼育後に、体重、皮膚水分量及び皮膚水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が等しくなるように群分けを行い、群分けの２日後に本試験を開始した。０．５％トラガカントゴム溶液を溶媒とし１ｍｇ／１００μｌとなるように投与サンプルを調整し、１００ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔとなるように投与した。
試験群は、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）シャクヤク花弁熱水抽出物投与（ＰＥ）群（ｎ＝７）、ＵＶ（＋）シャクヤク花弁凍結粉砕物投与（ＰＷ）群（ｎ＝７）とした。
紫外線照射方法は、Ｔａｎａｋａらの方法に準じて行った。試験期間中１日１回毎日、胃ゾンデによる被験物質溶液を経口投与した。並行して週３回紫外線照射を行った。紫外線照射用ＵＶＢランプにはｌｕｍｐ ＧＬ２０ＳＥ（ＳＡＮＫＹＯ ＤＥＮＫＩ社製）を用い、これを並列で３本設置したものを照射器として使用した。このランプは主に２８０～３５０ｎｍの波長の光を放ち、３０６ｎｍで最大となる。照射強度はデジタル紫外線強度計ＵＶ－３４０（アズワン社製）を用いて測定した。照射はマウスを、縦１０ｃｍ、横６ｃｍ、高さ４ｃｍの１０連個別ケージに入れて行い、各個別ケージの位置によって照射強度が異なるため、群ごとに毎回位置のローテーションを行い、照射強度の違いを緩和させた。照射は週３回行い、照射時間は、１週目は１分から徐々に照射時間を増やしていき、紅斑形成を防ぐため最大３分４５秒とした。照射期間は６週間とし、総照射量は１．３９Ｊ／ｃｍ２であった。
解剖は、被験物質の経口投与３０分後に行い、背部皮膚写真を撮影したのち、セボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下、下大静脈採血を行い安楽死させ、背部皮膚を採取した。
皮膚水分量の測定は、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍＢＨ社製）を用いて、群分け時及び試験中に週２回の測定を行った。
経表皮水分蒸散量測定は、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ３００（ＣＯＵＲＡＧＥ＋ＫＨＡＺＡＫＡ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧＭＢＨ社製）を用いて、マウス腰部の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ： Ｔｒａｎｓ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗａｔｅｒ Ｌｏｓｓ）を解剖前日に測定した。
解剖前にセボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下でヘアレスマウスの背部皮膚の写真をＯＬＹＭＰＵＳ ＣＡＭＥＤＩＡ ＤＩＧＩＴＡＬ ＣＡＭＥＲＡ Ｃ－３０４０ ＺＯＯＭで撮影した。シワの目視によるスコアリングは、目視判定基準（Inomata et al., J Invest Dermatol. 2003 Jan;120(1):128-34.）に基づき、群分けを知らされていない試験非参加者８名にこの画像をランダムに見せ、０，２，４，６，８の５段階でシワの評価を行った。
【0039】
（２）皮膚組織解析
セボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下、心臓採血後、皮膚組織の採取を行った。生検トレパン（８ｍｍ径、カイインダストリーズ株式会社製）を用いて背部正中線上部に１か所穴を開け、病理解析用皮膚を採取し、濾紙（桐山ロート用濾紙、Ｎｏ．４、２１φｍ／ｍ、桐山製作所製）に真皮側を付けるように貼り付け、直ちに固定液（ティシュー・テックユフィックス鹿島化学薬品株式会社製）を満たしたビンにつけることで固定を行った。続いて、背部全域の皮膚を採取し、カッター板の上に角層側を下にして置き、メス（ディスポメスＮｏ．１２、アズワン株式会社製）の刃のついていない面を用いて皮下組織を除去した。皮膚組織は直ちに液体窒素によって凍結し解析まで－８０℃にて保管した。
解剖時に採取し固定した皮膚は、常法に従ってパラフィン包埋、切り出し、薄切を行い、ヘマトキシリン＆エオジン（ＨＥ）染色及び免疫組織染色を施し、それぞれの組織標本を作製した。
セボフレン（登録商標）吸入麻酔液（丸石製薬株式会社）による麻酔下、心臓採血後、皮膚組織の採取を行った。生検トレパン（８ｍｍ径、カイインダストリーズ株式会社製）を用いて背部正中線上部に１か所穴を開け、病理解析用皮膚を採取し、濾紙（桐山ロート用濾紙、Ｎｏ．４、２１φｍ／ｍ、桐山製作所製）に真皮側を付けるように貼り付け、直ちに固定液（ティシュー・テックユフィックス鹿島化学薬品株式会社製）を満たしたビンにつけることで固定を行った。続いて、背部全域の皮膚を採取し、カッター板の上に角層側を下にして置き、メス（ディスポメスＮｏ．１２、アズワン株式会社製）の刃のついていない面を用いて皮下組織を除去した。皮膚組織は直ちに液体窒素によって凍結し解析まで－８０℃にて保管した。
解剖時に採取し固定した皮膚は、常法に従ってパラフィン包埋、切り出し、薄切を行い、ヘマトキシリン＆エオジン（ＨＥ）染色及び免疫組織染色を施し、それぞれの組織標本を作製した。
【0040】
＜ＨＥ染色＞
脱パラフィンを行い、水洗後、カラッチのヘマトキシリン液で５分間染色を行った。次いで７０％塩酸アルコール液で軽く分別した。水道水による洗浄後、温水に浸漬を１０分間行い、エオジン染色液に５分間浸漬、１００％アルコールで数槽に分けて脱水、キシレンで透徹し、封入した。
これらの標本の全視野を観察し、代表的な部位の写真撮影をＯＬＹＭＰＵＳ ＣＡＭＥＤＩＡ ＤＩＧＩＴＡＬ ＣＡＭＥＲＡ Ｃ－３０４０ ＺＯＯＭにて行った。ＨＥ染色標本を用いて基底層から顆粒層上層までの距離を表皮とみなし、画像処理ソフトウェア Ｉｍａｇｅ Ｊで測定した。１匹当たり３視野の撮影を行い、写真１枚毎に１０か所ずつ表皮の厚さを測定した。写真３枚の平均値を算出し、その値を当該個体の表皮厚とした。
＜免疫組織染色＞
皮膚の基底膜構成成分であるラミニン及び表皮の構成成分であるフィラグリンを観察するため、酵素抗体法を用いた免疫染色を行った。パラフィンブロックから３μｍ厚の切片を作製し、脱パラフィンを行った後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ社製）消化による抗原賦活化処理を行った。続いて、３％過酸化水素・メタノールによる内因性ペルオキシダーゼ阻害処理、１％ヤギ血清によるブロッキング処理を行った後、１％ヤギ血清で希釈した一次抗体（ウサギ由来抗ラミニンポリクローナル抗体，ａｂ１１５７５，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ ｓａｒｃｏｍａ由来，Ａｂｃａｍ社製，１００倍希釈；ウサギ由来抗フィラグリンポリクローナル抗体， ＧＴＸ３７６９５，ＧｅｎｅＴｅｘ社製、２００倍希釈）を用いて、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、ＨＲＰラベル二次抗体（ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体；Ｓｉｍｐｌｅ ｓｔａｉｎ ＭＡＸ ＰＯ、ニチレイバイオ社製）を４滴滴下し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、発色基質（ＩｍｍＰａｃｔ ＤＡＢ、Ｂｅｃｔｏｒ社製）を反応させ染色を行った。マイヤーのヘマトキシリン（武藤化学社製）で対比染色し、水洗後、１００％アルコールで数槽に分けて脱水、キシレンで透徹し、マリノール封入を行った。
脱パラフィンを行い、水洗後、カラッチのヘマトキシリン液で５分間染色を行った。次いで７０％塩酸アルコール液で軽く分別した。水道水による洗浄後、温水に浸漬を１０分間行い、エオジン染色液に５分間浸漬、１００％アルコールで数槽に分けて脱水、キシレンで透徹し、封入した。
これらの標本の全視野を観察し、代表的な部位の写真撮影をＯＬＹＭＰＵＳ ＣＡＭＥＤＩＡ ＤＩＧＩＴＡＬ ＣＡＭＥＲＡ Ｃ－３０４０ ＺＯＯＭにて行った。ＨＥ染色標本を用いて基底層から顆粒層上層までの距離を表皮とみなし、画像処理ソフトウェア Ｉｍａｇｅ Ｊで測定した。１匹当たり３視野の撮影を行い、写真１枚毎に１０か所ずつ表皮の厚さを測定した。写真３枚の平均値を算出し、その値を当該個体の表皮厚とした。
＜免疫組織染色＞
皮膚の基底膜構成成分であるラミニン及び表皮の構成成分であるフィラグリンを観察するため、酵素抗体法を用いた免疫染色を行った。パラフィンブロックから３μｍ厚の切片を作製し、脱パラフィンを行った後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ社製）消化による抗原賦活化処理を行った。続いて、３％過酸化水素・メタノールによる内因性ペルオキシダーゼ阻害処理、１％ヤギ血清によるブロッキング処理を行った後、１％ヤギ血清で希釈した一次抗体（ウサギ由来抗ラミニンポリクローナル抗体，ａｂ１１５７５，Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ ｓａｒｃｏｍａ由来，Ａｂｃａｍ社製，１００倍希釈；ウサギ由来抗フィラグリンポリクローナル抗体， ＧＴＸ３７６９５，ＧｅｎｅＴｅｘ社製、２００倍希釈）を用いて、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、ＨＲＰラベル二次抗体（ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体；Ｓｉｍｐｌｅ ｓｔａｉｎ ＭＡＸ ＰＯ、ニチレイバイオ社製）を４滴滴下し、室温で３０分間反応させた。洗浄後、発色基質（ＩｍｍＰａｃｔ ＤＡＢ、Ｂｅｃｔｏｒ社製）を反応させ染色を行った。マイヤーのヘマトキシリン（武藤化学社製）で対比染色し、水洗後、１００％アルコールで数槽に分けて脱水、キシレンで透徹し、マリノール封入を行った。
【0041】
２．結果
試験期間中、被験物質摂取による異常な体重の増減は認められなかった。毎週、皮膚水分量を経時的に測定した。紫外線照射２週目においてＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で６３．１９±２．８９ ＣＭ ｕｎｉｔｓであったのに対しＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で５２．６０±１．２６ ＣＭ ｕｎｉｔｓとなり、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群の水分量がＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に低い値となった（ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。３週目から７週目においてもＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群の水分量はＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に低下し（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）、ＵＶ照射によって光老化モデルが形成されていることが確認できた。６週目においてＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で６１．１８±１．３０ ＣＭ ｕｎｉｔｓ 、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で４４．７４±１．５８ ＣＭ ｕｎｉｔｓ、ＵＶ（＋）ＰＷ群５５．９７±１．２８ ＣＭ ｕｎｉｔｓ、ＵＶ（＋）ＰＥ群５４．１１±１．５２ ＣＭ ｕｎｉｔｓであった。図２［Ａ］に示すように解剖時においては、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群の水分量の有意な低下の抑制が認められた（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物の摂取により、紫外線暴露により低下する皮膚水分量が改善された。
図２［Ｂ］に示したように、解剖時の測定においてＵＶ（＋）群のＴＥＷＬがＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に高い値となった（ｐ＜０．０１， ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。これに対し、ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群のＴＥＷＬは、若干低下した。よって、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、紫外線暴露により損傷した皮膚のバリア機能が改善する可能性が示唆された。
図３に紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚の写真及びそのシワをスコア化した結果を示した。スコアは、基準となる背部皮膚から算定しており、ＵＶ（－） ｃｏｎｔｒｏｌ群で０．７１±０．１８であったのに対し、ＵＶ（＋） ｃｏｎｔｒｏｌ群６．１８±０．３６、ＵＶ（＋）ＰＷ群４．６８±０．５６、ＵＶ（＋）ＰＥ群４．５４±０．７０であった。ＵＶ照射群間では統計的な有意差は得られなかったが、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、若干、シワの形成が抑制されていた。
図４にシャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚の組織像を示した。［Ａ］にＨＥ染色像、［Ｂ］に抗ラミニン免疫組織染色像、［Ｃ］に抗フィラグリン免疫組織染色像を示した。
ＨＥ染色像から、表皮厚を測定したところ、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で１５．５２±１．２４μｍ、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群４３．０４±２．６７μｍ、ＵＶ（＋） ＰＷ群３３．２５±２．０４μｍ、ＵＶ（＋）ＰＥ群３２．３４±１．７１μｍであった。（図５）。ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してＵＶ照射群では有意に表皮の肥厚化が認められた（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。また、ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群は、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ表皮厚が有意に低下した（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。紫外線暴露により、基底膜上部の表皮細胞の重層化、核の喪失、角層の重層化と剥離が認められる。これに対し、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により基底膜上の表皮細胞の重層化が軽減しており、角質の剥離も抑制されていた。
ラミニン染色では、主に基底膜を染色している。ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群では、矢印で示してある基底膜が明瞭に観察できるが、紫外線暴露により消失しているのが確認できる。これに対して、ＵＶ（＋）ＰＥ群において基底膜の染色が認められる。
フィラグリン染色では、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で上皮組織全体が染色される。これに対し、紫外線暴露したＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で角質層上部が厚く染色される。ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群は、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群と同じように角層上部が染色されるが、上部のみが染色されていた。
以上の結果から、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、紫外線暴露による表皮肥厚の抑制、損傷した基底膜の修復、保水因子であるフィラグリンの角質層上部への集積が認められる。
試験期間中、被験物質摂取による異常な体重の増減は認められなかった。毎週、皮膚水分量を経時的に測定した。紫外線照射２週目においてＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で６３．１９±２．８９ ＣＭ ｕｎｉｔｓであったのに対しＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で５２．６０±１．２６ ＣＭ ｕｎｉｔｓとなり、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群の水分量がＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に低い値となった（ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。３週目から７週目においてもＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群の水分量はＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に低下し（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）、ＵＶ照射によって光老化モデルが形成されていることが確認できた。６週目においてＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で６１．１８±１．３０ ＣＭ ｕｎｉｔｓ 、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で４４．７４±１．５８ ＣＭ ｕｎｉｔｓ、ＵＶ（＋）ＰＷ群５５．９７±１．２８ ＣＭ ｕｎｉｔｓ、ＵＶ（＋）ＰＥ群５４．１１±１．５２ ＣＭ ｕｎｉｔｓであった。図２［Ａ］に示すように解剖時においては、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群の水分量の有意な低下の抑制が認められた（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物の摂取により、紫外線暴露により低下する皮膚水分量が改善された。
図２［Ｂ］に示したように、解剖時の測定においてＵＶ（＋）群のＴＥＷＬがＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ有意に高い値となった（ｐ＜０．０１， ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。これに対し、ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群のＴＥＷＬは、若干低下した。よって、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、紫外線暴露により損傷した皮膚のバリア機能が改善する可能性が示唆された。
図３に紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚の写真及びそのシワをスコア化した結果を示した。スコアは、基準となる背部皮膚から算定しており、ＵＶ（－） ｃｏｎｔｒｏｌ群で０．７１±０．１８であったのに対し、ＵＶ（＋） ｃｏｎｔｒｏｌ群６．１８±０．３６、ＵＶ（＋）ＰＷ群４．６８±０．５６、ＵＶ（＋）ＰＥ群４．５４±０．７０であった。ＵＶ照射群間では統計的な有意差は得られなかったが、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、若干、シワの形成が抑制されていた。
図４にシャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物投与による紫外線照射ヘアレスマウスの背部皮膚の組織像を示した。［Ａ］にＨＥ染色像、［Ｂ］に抗ラミニン免疫組織染色像、［Ｃ］に抗フィラグリン免疫組織染色像を示した。
ＨＥ染色像から、表皮厚を測定したところ、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で１５．５２±１．２４μｍ、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群４３．０４±２．６７μｍ、ＵＶ（＋） ＰＷ群３３．２５±２．０４μｍ、ＵＶ（＋）ＰＥ群３２．３４±１．７１μｍであった。（図５）。ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してＵＶ照射群では有意に表皮の肥厚化が認められた（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。また、ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群は、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ表皮厚が有意に低下した（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０５ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。紫外線暴露により、基底膜上部の表皮細胞の重層化、核の喪失、角層の重層化と剥離が認められる。これに対し、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により基底膜上の表皮細胞の重層化が軽減しており、角質の剥離も抑制されていた。
ラミニン染色では、主に基底膜を染色している。ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群では、矢印で示してある基底膜が明瞭に観察できるが、紫外線暴露により消失しているのが確認できる。これに対して、ＵＶ（＋）ＰＥ群において基底膜の染色が認められる。
フィラグリン染色では、ＵＶ（－）ｃｏｎｔｒｏｌ群で上皮組織全体が染色される。これに対し、紫外線暴露したＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群で角質層上部が厚く染色される。ＵＶ（＋）ＰＷ群及びＵＶ（＋）ＰＥ群は、ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ群と同じように角層上部が染色されるが、上部のみが染色されていた。
以上の結果から、シャクヤク花弁凍結粉砕物及びその熱水抽出物摂取により、紫外線暴露による表皮肥厚の抑制、損傷した基底膜の修復、保水因子であるフィラグリンの角質層上部への集積が認められる。
【0042】
試験例２ シャクヤク花弁熱水抽出物のフィラグリン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用
１．細胞及び細胞培養法
ヒト表皮角化細胞は、ヒトケラチノサイト細胞株 Ｉｔｅｍ Ｎｕｍｂｅｒ ３００４９３（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｅｒｖｉｃｅ， ＨａＣａＴ）を使用した。増殖用培地には、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ’； ＳＩＧＭＡ社製）／１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ＳＩＧＭＡ社製）／１％ ＰＳＮ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｃｔｕｒｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を使用した。添加用培地には、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ， ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ；ＳＩＧＭＡ社製）／１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ社製）／１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を使用した。細胞は、ＣＯ２インキュベーター（ＭＣＯ－１７ＡＩＣ； ＳＡＮＫＹＯ社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
試料及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）及びぺオニフロリン（ＰＦ）は、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に０．５％で溶解し、０．２０μｍのセルロースアセテートメンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した後、使用するまで－２０℃で冷凍保存した。各試料のＤＭＳＯ溶液は、添加用培地に対して終濃度が０．２％となるように調整した。ＤＭＳＯを０．２％含む添加用培地をｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。ＨａＣａＴは、ウェルに対して８０～９０％の被覆率となるまで増殖させた後、増殖用培地を除去し、ＰＢＳ（－）で１回洗浄後、試料を含む添加用培地を添加し、３，１２ないし２４時間培養を行った。
１．細胞及び細胞培養法
ヒト表皮角化細胞は、ヒトケラチノサイト細胞株 Ｉｔｅｍ Ｎｕｍｂｅｒ ３００４９３（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｅｒｖｉｃｅ， ＨａＣａＴ）を使用した。増殖用培地には、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ’； ＳＩＧＭＡ社製）／１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ＳＩＧＭＡ社製）／１％ ＰＳＮ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｉｃｔｕｒｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を使用した。添加用培地には、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ， ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ；ＳＩＧＭＡ社製）／１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ社製）／１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）を使用した。細胞は、ＣＯ２インキュベーター（ＭＣＯ－１７ＡＩＣ； ＳＡＮＫＹＯ社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
試料及びペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）及びぺオニフロリン（ＰＦ）は、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に０．５％で溶解し、０．２０μｍのセルロースアセテートメンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した後、使用するまで－２０℃で冷凍保存した。各試料のＤＭＳＯ溶液は、添加用培地に対して終濃度が０．２％となるように調整した。ＤＭＳＯを０．２％含む添加用培地をｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。ＨａＣａＴは、ウェルに対して８０～９０％の被覆率となるまで増殖させた後、増殖用培地を除去し、ＰＢＳ（－）で１回洗浄後、試料を含む添加用培地を添加し、３，１２ないし２４時間培養を行った。
【0043】
２．定量的リアルタイムRT-PCRを用いた遺伝子発現解析
ＨａＣａＴを１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４ｈ培養した。ＰＢＳで１回洗浄後、サンプルを含む添加用培地に交換した。添加後１２ｈ－２４ｈの細胞に５００μＬの細胞溶解液（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ）を加え溶解し、回収した。細胞溶解液に１００μＬのクロロホルムを加え、よく攪拌した後に、常温で３分静置し、１３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離した。上層２００μＬを別の１．５ｍＬチューブに回収し、２５０μＬのイソプロピルアルコールを加え、攪拌した後、常温で１０分静置した。その後１３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心分離し、デカンテーションで上清を除去した後、風乾した。７０％エタノールを５００μＬ加えて攪拌し、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心分離した後、上清をデカンテーションで除去し、風乾した。
ＨａＣａＴを１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４ｈ培養した。ＰＢＳで１回洗浄後、サンプルを含む添加用培地に交換した。添加後１２ｈ－２４ｈの細胞に５００μＬの細胞溶解液（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ）を加え溶解し、回収した。細胞溶解液に１００μＬのクロロホルムを加え、よく攪拌した後に、常温で３分静置し、１３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離した。上層２００μＬを別の１．５ｍＬチューブに回収し、２５０μＬのイソプロピルアルコールを加え、攪拌した後、常温で１０分静置した。その後１３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心分離し、デカンテーションで上清を除去した後、風乾した。７０％エタノールを５００μＬ加えて攪拌し、１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心分離した後、上清をデカンテーションで除去し、風乾した。
【0044】
ｃＤＮＡ合成は、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＰＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。１個の試料につきＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ６ｂμＬ、Ｒａｎｄｏｍ ６ｍｅｒｓ ０．５μＬ、５×Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ０．５μＬの試薬の調整を行った。そこへ１μＬのサンプルＲＮＡ溶液を加え、サーマルクライマーにて逆転写反応を行った。反応プログラムは３７℃１５分→８５℃→４℃∞として設定した。反応終了後、Ｅａｓｙ Ｄｉｌｕｔｉｏｎにて２倍希釈を行い、使用するまで－８０℃にて保管した。
リアルタイムＰＣＲはＴＢ ＧｒｅｅｎＩを用いたインターカレーター法を利用して行った。反応チューブ（０．２ｍＬ Ｈｉｔ－８－Ｔｕｂｅ：タカラバイオ株式会社製）にＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｍｅ Ｍｉｘ ＴａｑＴＭ（Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｍｇ2+、ＴＢ ＧｒｅｅｎＩを含む試薬：タカラバイオ株式会社製）１２．５μＬ、滅菌水９．５μＬ、１０ｍｏｌ／μＬ特異的プライマー（タカラバイオ株式会社製）をセンス及びアンチセンスそれぞれ０．５μＬ、ｃＤＮＡ（ただし逆転写反応後のｃＤＮＡ溶液は２倍希釈した）２μＬの混合溶液を調整した。ＰＣＲ反応は、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ株式会社製）を使用して行った。反応条件は９５℃５秒（変圧）→５８℃ ３０秒→アニーリングを４０サイクルで行った。反応終了後、相対的な遺伝子発現量を専用の解析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．０２Ａ）で解析した。相対発現量の決定にはスタンダードカーブ法を用い、それぞれのサンプルの遺伝子発現量はともに増幅させたＧＡＤＰＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）で標準化した。使用したプライマーを以下に示す。
・FLG-Forward：CAAGCAGAGAAACACGTAATGAGG（配列番号１）
・FLG-Reverse：CGCACTTGCTTTACAGATATCAGA（配列番号２）
・GAPDH-Forward：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC（配列番号３）
・GAPDH-Reverse：TGGTGAAGACGCCAGTGGA（配列番号４）
リアルタイムＰＣＲはＴＢ ＧｒｅｅｎＩを用いたインターカレーター法を利用して行った。反応チューブ（０．２ｍＬ Ｈｉｔ－８－Ｔｕｂｅ：タカラバイオ株式会社製）にＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｉｍｅ Ｍｉｘ ＴａｑＴＭ（Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｍｇ2+、ＴＢ ＧｒｅｅｎＩを含む試薬：タカラバイオ株式会社製）１２．５μＬ、滅菌水９．５μＬ、１０ｍｏｌ／μＬ特異的プライマー（タカラバイオ株式会社製）をセンス及びアンチセンスそれぞれ０．５μＬ、ｃＤＮＡ（ただし逆転写反応後のｃＤＮＡ溶液は２倍希釈した）２μＬの混合溶液を調整した。ＰＣＲ反応は、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ株式会社製）を使用して行った。反応条件は９５℃５秒（変圧）→５８℃ ３０秒→アニーリングを４０サイクルで行った。反応終了後、相対的な遺伝子発現量を専用の解析ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．０２Ａ）で解析した。相対発現量の決定にはスタンダードカーブ法を用い、それぞれのサンプルの遺伝子発現量はともに増幅させたＧＡＤＰＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）で標準化した。使用したプライマーを以下に示す。
・FLG-Forward：CAAGCAGAGAAACACGTAATGAGG（配列番号１）
・FLG-Reverse：CGCACTTGCTTTACAGATATCAGA（配列番号２）
・GAPDH-Forward：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC（配列番号３）
・GAPDH-Reverse：TGGTGAAGACGCCAGTGGA（配列番号４）
【0045】
３．培養上清中のヒアルロン酸（ＨＡ）測定法
ＨａＣａＴ細胞を２４ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に４×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ播種し、４８時間培養した。各試料の添加は３連で実験を行い、４８時間後に培養上清を回収した。
ヒアルロン酸（ＨＡ）の定量は、Haserodtらの方法（Sarah Haserodt et al., Glycobiology. 2011 Feb;21(2):175-83.）に準じて以下のように行った。ＥＬＩＳＡ用 ９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、１×ＰＢＳで２０００倍希釈したＨｙａｌｕｒｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＨＡＢＰ、フナコシ株式会社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置した。翌日、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬株式会社製）で２回洗浄後、１×ＰＢＳで１％に希釈したブロックエース（登録商標）（雪印メグミルク株式会社製）溶液を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで１回洗浄後、ＨＡスタンダードコーティング溶液（ＨＡＮａ １０００μｇ／ｍＬ（和光純薬株式会社製）を０．５％ブロックエース(R)溶液で１０００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で希釈した各サンプル及び標準ＨＡ溶液（１０００、２５０、６２．５、１５．６２５、３．９０６２５、０ｎｇ／ｍＬのＨＡを含む０．５％ブロックエース（登録商標）溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その上から０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で０．１２５ｍｇ／ｍｌに希釈したビオチン結合ＨＡＢＰ溶液（フナコシ株式会社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で０．０５０μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して３７℃で３０分反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで５回洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ナカライテクス株式会社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、アルミホイルで遮光して３０分常温で静置、発色させた。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、反応を停止した。直後にマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００，ＴＥＣＡＮ社製）を用いてＡＢＳ４５０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。測定は全て２連で行った。計算方法は、スタンダードの吸光度から対数曲線を作成し、試料の濃度を求めた。
ＨａＣａＴ細胞を２４ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に４×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ播種し、４８時間培養した。各試料の添加は３連で実験を行い、４８時間後に培養上清を回収した。
ヒアルロン酸（ＨＡ）の定量は、Haserodtらの方法（Sarah Haserodt et al., Glycobiology. 2011 Feb;21(2):175-83.）に準じて以下のように行った。ＥＬＩＳＡ用 ９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に、１×ＰＢＳで２０００倍希釈したＨｙａｌｕｒｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＨＡＢＰ、フナコシ株式会社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で一晩静置した。翌日、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬株式会社製）で２回洗浄後、１×ＰＢＳで１％に希釈したブロックエース（登録商標）（雪印メグミルク株式会社製）溶液を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで１回洗浄後、ＨＡスタンダードコーティング溶液（ＨＡＮａ １０００μｇ／ｍＬ（和光純薬株式会社製）を０．５％ブロックエース(R)溶液で１０００ｎｇ／ｍｌに希釈したもの）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で希釈した各サンプル及び標準ＨＡ溶液（１０００、２５０、６２．５、１５．６２５、３．９０６２５、０ｎｇ／ｍＬのＨＡを含む０．５％ブロックエース（登録商標）溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その上から０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で０．１２５ｍｇ／ｍｌに希釈したビオチン結合ＨＡＢＰ溶液（フナコシ株式会社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、０．５％ブロックエース（登録商標）溶液で０．０５０μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して３７℃で３０分反応させた。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで５回洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）試薬（ナカライテクス株式会社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、アルミホイルで遮光して３０分常温で静置、発色させた。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、反応を停止した。直後にマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００，ＴＥＣＡＮ社製）を用いてＡＢＳ４５０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。測定は全て２連で行った。計算方法は、スタンダードの吸光度から対数曲線を作成し、試料の濃度を求めた。
【0046】
４．結果
（１）ＨａＣａＴ細胞にシャクヤク花弁熱水抽出物（ＰＥ）を添加し、添加から１２時間後及び２４時間後に細胞を回収し、フィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現を解析した（図６［Ａ］）。１２及び２４時間後にＰＥ添加によりフィラグリンの発現量がｃｏｎｔｒｏｌに比べ有意に増加した（ｐ＜０．０１ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）。また、ＰＧＧ及びＰＦを添加し、添加から１２時間後のＦＬＧの遺伝子発現を解析した（図６［Ｂ］）。ＰＧＧ １０μＭ添加において、ｃｏｎｔｒｏｌに比べ発現量が有意に増加した（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。ＰＦ添加ではＦＬＧの遺伝子発現量に変化は認められなかった。
（１）ＨａＣａＴ細胞にシャクヤク花弁熱水抽出物（ＰＥ）を添加し、添加から１２時間後及び２４時間後に細胞を回収し、フィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現を解析した（図６［Ａ］）。１２及び２４時間後にＰＥ添加によりフィラグリンの発現量がｃｏｎｔｒｏｌに比べ有意に増加した（ｐ＜０．０１ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）。また、ＰＧＧ及びＰＦを添加し、添加から１２時間後のＦＬＧの遺伝子発現を解析した（図６［Ｂ］）。ＰＧＧ １０μＭ添加において、ｃｏｎｔｒｏｌに比べ発現量が有意に増加した（ｐ＜０．０１ Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ’ｓ ｔｅｓｔ）。ＰＦ添加ではＦＬＧの遺伝子発現量に変化は認められなかった。
【0047】
（２）ＨａＣａＴ細胞のタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法によりフィラグリンのタンパク質を解析した（図７）。５０ｋＤａ付近に濃いバンドと、より高分子側に複数のバンドが確認できた。３５ｋＤａ付近にフィラグリンモノマーと見られる薄いバンドを確認できた。また、ローディングコントロールとしてβ－アクチンの検出を行い、タンパク質が等しく発現していることを確認した。ウエスタンブロッティングの結果、２５ｋＤａ～１２０ｋＤａの範囲に複数のバンドが確認できた。これは、抗フィラグリン抗体を使用した場合に、フィラグリンの単量体（３７ｋＤａ）だけでなく、プロフィラグリンやプロフィラグリンのＮ末端タンパク質が検出されるためだと考えられる。
３７ｋＤａのフィラグリンのバンドについて、ＰＥ添加においてｃｏｎｔｒｏｌよりもバンドが濃くなっていることが確認できた。しかし、ＰＧＧ及びＰＦ添加では、バックグラウンドが汚く、バンドの濃さの判別が困難であった。
シャクヤク花弁又はカルス培養物の熱水抽出物（ＰＥ、ＣＥ）、及びシャクヤク花弁又はカルス培養物３０％エタノール抽出物（Ｐ３０、Ｃ３０）を添加し、添加から１２時間後及び２４時間後に細胞を回収し、フィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現を解析した（図８）。添加１２時間後では、ＰＥ，Ｐ３０及びＣ３０で、ｃｏｎｔｒｏｌに比べＦＬＧの遺伝子発現量の増加が認められた。Ｃ３０添加で最も高いものであった。２４時間後でも同様にＰＥ，Ｐ３０及びＣ３０の添加でＦＬＧの遺伝子発現量の増加が認められた。
３７ｋＤａのフィラグリンのバンドについて、ＰＥ添加においてｃｏｎｔｒｏｌよりもバンドが濃くなっていることが確認できた。しかし、ＰＧＧ及びＰＦ添加では、バックグラウンドが汚く、バンドの濃さの判別が困難であった。
シャクヤク花弁又はカルス培養物の熱水抽出物（ＰＥ、ＣＥ）、及びシャクヤク花弁又はカルス培養物３０％エタノール抽出物（Ｐ３０、Ｃ３０）を添加し、添加から１２時間後及び２４時間後に細胞を回収し、フィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現を解析した（図８）。添加１２時間後では、ＰＥ，Ｐ３０及びＣ３０で、ｃｏｎｔｒｏｌに比べＦＬＧの遺伝子発現量の増加が認められた。Ｃ３０添加で最も高いものであった。２４時間後でも同様にＰＥ，Ｐ３０及びＣ３０の添加でＦＬＧの遺伝子発現量の増加が認められた。
【0048】
（３）シャクヤク花弁抽出物、及びペンタガロイルグルコース添加によりフィラグリンの発現上昇が確認されたが、今回添加したＰＥサンプル（１０μｇ／ｍｌ）中に含まれるペンタガロイルグルコース濃度は０．１μＭ程度である。そのため、シャクヤク花弁添加によるフィラグリンの発現上昇は、サンプル中のペンタガロイルグルコースによる影響だけではないと考えられる。ペンタガロイルグルコース以外の成分、あるいはペンタガロイルグルコースと他成分の相互作用によりフィラグリンの発現を促進したことが考えられる。
【0049】
（４）ヒアルロン酸の産生量は、シャクヤク花弁又はカルス培養物の熱水抽出物（ＰＥ、ＣＥ）、シャクヤク花弁３０％エタノール抽出物（Ｐ３０）を添加することで、その産生量の増加が認められた（図９）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】