特開 2022-173420 気体の細胞毒性評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022173420

(43)【公開日】2022-11-18

(54)【発明の名称】気体の細胞毒性評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20221111BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20221111BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022154699

(22)【出願日】2022-09-28

(62)【分割の表示】P 2018122876の分割

【原出願日】2018-06-28

(71)【出願人】

【識別番号】000002853

【氏名又は名称】ダイキン工業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】友塚 育美

(72)【発明者】

【氏名】松本 博士

(72)【発明者】

【氏名】澤田 光平

(57)【要約】

【課題】細胞培養液中に存在する細胞に対しても適用可能な、つまり、気管支や肺由来の
細胞以外の細胞に対しても適用可能な、気体の細胞毒性評価方法を提供すること。
【解決手段】気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする、気体によ
る細胞への毒性評価方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする、気体によ
る細胞への毒性評価方法。

【請求項2】

前記気体溶解工程は、
前記細胞培養液をｐＨ７．１～７．７、及び温度３５～３９℃に維持して実施される、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記気体溶解工程は、
前記気体を前記細胞培養液の表面に接触させ、培養液中に溶解させることにより実施さ
れる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞は、哺乳類由来細胞である、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、気体の細胞毒性評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１では、被験物質を細胞培養液中に含んだ状態で細胞培養を行い、細胞の状態
を測定することにより、被験物質の毒性を評価することが提案されている。

【0003】

特許文献１に記載された評価方法は、医薬品の研究開発における候補化合物（固体又は
液体）の選定に活用するものである。

【0004】

非特許文献１では、in vitroレベルでのガスの毒性評価方法が、提案されている。気体
と細胞培養液との気液界面に半透膜を設け、当該半透膜上で細胞を培養する。そして、半
透膜上で培養された細胞に、直接的に被験物質としてのガスを曝露し、当該ガスの細胞毒
性を評価するというものである。かかる方法により、A549細胞又はCalu-3細胞へのガス毒
性を評価できるとされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２００３－５１００９３号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】生産研究, 59巻, 2号, 2007, p89-92

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示の目的とするところは、細胞培養液中に存在する細胞に対しても適用可能な、つ
まり、気管支や肺由来の細胞以外の細胞に対しても適用可能な、気体の細胞毒性評価方法
を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、被験物質としての気体を細
胞培養液に溶解させることにより、前記気体による細胞への毒性を評価することができる
ことを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらに研究を重ね、本開示を完成す
るに至った。

【0009】

即ち、本開示は、以下の毒性評価方法を提供する。
項１．
気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする、気体によ
る細胞への毒性評価方法。
項２．
前記気体溶解工程は、
前記細胞培養液をｐＨ７．１～７．７、及び温度３５～３９℃に維持して実施される、
項１に記載の方法。
項３．
前記気体溶解工程は、
前記気体を前記細胞培養液の表面に接触させ、培養液中に溶解させることにより実施さ
れる、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記細胞は、哺乳類由来細胞である、項１～３の何れかに記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本開示の毒性評価方法によれば、細胞培養液中に存在する細胞に対する気体の毒性評価
を行うことができるため、これまでには評価できなかった気管支や肺由来の細胞以外の細
胞に応用することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本開示の、細胞への毒性評価方法の模式図。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本開示の、気体による細胞への毒性評価方法は、気体を細胞培養液に溶解させる気体溶
解工程、及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする。

【0013】

被験物としての気体は、気体であれば特に限定はない。但し、毒性評価という目的を考
慮すれば、毒性評価に供される気体であることが好ましい。また、被験物としての気体は
、単独種類の気体であってもよいし、複数種の気体の混合物であってもよい。

【0014】

かかる気体として、具体的には、窒素酸化物や硫黄酸化物など大気汚染物質、一酸化炭
素、二酸化炭素や炭化水素など排出ガス類、メタン、プロパン、ブタン、およびアセチレ
ンなど燃料ガス類、ホルムアルデヒド、トルエン、キシレン、パラジクロロベンゼン、エ
チルベンゼン、およびスチレンなど製品中から放出されるガス、ハイドロフルオロカーボ
ン（HFC）類、ハイドロクロロフルオロカーボン（HCFC）類、ハイドロフルオロオレフィ
ン（HFO）類、ヒドロクロロフルオロオレフィン（HCFO）類、並びに、モノマーガスなど
生産の過程で出るガスを例示することができる。

【0015】

中でも、産業上の利用価値が大きいという観点から、メタン、プロパン、ブタン、およ
びアセチレンなど燃料ガス類、ホルムアルデヒド、トルエン、キシレン、パラジクロロベ
ンゼン、エチルベンゼン、およびスチレンなど製品中から放出されるガス、HFC類、HCFC
類、HFO類、及びHCFO類等の冷媒用ガス、並びに、モノマーガスなど生産の過程で出るガ
スを好適に使用可能である。

【0016】

毒性評価に供する細胞としては、任意の培養細胞を使用することが可能である。初代培
養された細胞であってもよいし。継代培養された細胞であってもよい。また、培養細胞は
、細胞培養容器の底面に接着した状態であってもよいし、細胞培養液中に浮遊した状態で
あってもよい。もちろん、半浮遊細胞であってもよい。

【0017】

毒性評価に供する細胞としては、単一種類の細胞を使用してもよいし、複数種の細胞種
を使用してもよい。

【0018】

毒性評価に供する細胞は、上述の通り任意の培養細胞を使用することが可能であるが、
毒性評価という目的に鑑みれば、哺乳類由来細胞であることが好ましい。

【0019】

また、毒性評価の目的に応じて、生体中の、適宜の部位由来の細胞を使用することが可
能である。具体的には、心筋細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、肺細胞、消
化管細胞、膵臓細胞、脾臓細胞、子宮内膜細胞、繊維芽細胞、皮膚細胞、筋細胞、血液細
胞、および骨髄細胞から選択される１種以上を例示することができる。

【0020】

細胞培養液として使用する培地の種類は、使用する細胞に応じて、適宜設定すればよい
。具体的には、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ－１２培地、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地などを使用することができる。

【0021】

播種する細胞の個数及び密度、並びに細胞培養容器のサイズに関しては、毒性評価の目
的や細胞の種類に応じ、適宜設定すればよい。

【0022】

本開示の毒性評価方法は、気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程を有する。

【0023】

気体を細胞培養液に溶解させる際には、気体以外の要因により細胞の状態が影響を受け
ることを排除すべく、細胞培養液のｐＨを二酸化炭素や緩衝液等により７．１～７．７に
維持することが好ましく、７．３～７．５に維持することがより好ましい。同様の理由に
より、細胞培養液の温度を３５～３９℃に維持することが好ましく、３６～３８℃に維持
することがより好ましい。

【0024】

細胞培養液に気体を溶解させる方法としては、適宜の方法を採用することが可能であり
、特に限定はない。具体的には、気体を細胞培養液中でバブリングさせる方法、気体を細
胞培養液の表面にフローさせる（換言すれば、気体を細胞培養液の表面に接触させ、培養
液中に溶解させる。）方法を例示することができる。この際、細胞培養液表面に導入する
気体の濃度は、０vol％より大きく１００vol％未満の任意の濃度に設定することが可能で
ある。細胞培養に資するための二酸化炭素濃度に関しても、特に限定はなく、０vol％よ
り大きく１０vol％以下の任意の濃度を設定することが可能である。

【0025】

上記した中でも、細胞培養液のｐＨ及び温度を上記した数値範囲内に安定して維持する
ことが可能であるという理由から、気体を細胞培養液の表面にフローさせる方法が、好ま
しい。

【0026】

気体を細胞培養液の表面にフローさせる具体的な態様としては、気体の流入口及び流出
口をそれぞれ少なくとも１つ有する容器（インキュベーター）に開放した細胞培養容器を
設置し、気体をフローさせる態様を例示することができる。

【0027】

尚、容器（インキュベーター）内に気体をフローさせる際の、容器（インキュベーター
）内の気圧は、９０～１２０ｋＰａに維持されていることが好ましい。

【0028】

気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも一つ有する容器のサイズとしては、細胞
培養容器のサイズに応じて、適宜設定すればよい。また、気体をフローする際の流量とし
ても、気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも一つ有する容器のサイズ、細胞培養
容器のサイズに応じて適宜設定すればよい。

【0029】

さらに、本開示の細胞毒性評価方法においては、気体の細胞毒性を詳細、明確、且つ正
確に把握するために、気体溶解工程の後に、細胞機能を評価する細胞評価工程を設ける。

【0030】

評価する細胞機能としては、細胞生存率、ミトコンドリア機能、細胞複製能、細胞内エ
ネルギーバランス、細胞膜完全性等を例示することができる。また、細胞の種類に応じて
、当該細胞特有の機能を評価することも好ましい。例えば、心筋細胞を評価する際には、
その拍動の指標を評価することも好適である。

【0031】

本明細書において細胞生存率とは、生細胞および死細胞の総数に対する生細胞数の割合
と定義する。生細胞および死細胞の数は、例えば、生体染色剤を用いた色素排除試験によ
り得ることができる。

【0032】

本明細書においてミトコンドリア機能とは、ミトコンドリアにおける酸素消費速度、カ
ルシウムイオン流動量、および膜電位の変化から示される機能と定義する。
ミトコンドリアにおける酸素消費速度の変化は、例えば、酸素感受性プローブの発光強度
を測定することにより得ることが出来る。カルシウムイオン流動量の変化は、例えばカル
シウムイオン感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることができる。膜電位
の変化は、例えば、膜電位感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることがで
きる。

【0033】

本明細書において細胞内エネルギーバランスとは、ＡＤＰ／ＡＴＰ量比と定義する。Ａ
ＤＰ／ＡＴＰ量比とは、例えば、ルシフェラーゼ反応による化学発光強度を測定すること
により得ることができる。

【0034】

本明細書において細胞膜完全性とは、細胞膜損傷の程度と定義する。かかる細胞損傷の
程度は、例えば、LDHなど逸脱酵素測定することにより得ることができる。

【0035】

以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示はこうした例に何ら限定されるも
のではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲において種々なる形態で実施し得ることは勿
論である。

【実施例0036】

以下、実施例に基づき、本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示がこれら
に限定されるものではない。

【0037】

細胞毒性評価試験
ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（iCell cardiomyocytes², CDI社製）を９６well half ar
ea プレートに、40,000cells/wellの密度で播種し、７～１０日間、インキュベーター内
で培養した。その後、上記心筋細胞にCa指示薬（EarlyTox Cardiotoxicity Kit, Molecul
ar Devices社製）を３０μL/wellずつ添加した。その後、密閉容器内に、クロロジフルオ
ロメタン（実施例）、ジフルオロメタン（参考例）を、細胞培養液表面にそれぞれ流速５
０ｍＬ/ｍｉｎという条件でフローした。その際、細胞培養液は、ｐＨ７．４、温度３７
℃、インキュベーター内の気圧１０１．３ｋＰａに維持されていた。フロー開始時点、及
びフロー開始から１０分後の時点における心筋細胞の拍動数を、共焦点定量イメージサイ
トメーター（ＣＱ１、横河電機社製）により蛍光測定を行い、計測した。

【0038】

尚、クロロジフルオロメタンは動物実験により、心臓に影響のある気体であることが報
告されている。これに対してジフルオロメタンは心臓に有意な影響を与えないことが知ら
れていることから、陰性対照として使用した（参考例）。

【0039】

表１に示すように、ジフルオロメタンを使用した参考例（陰性対照）においてはジフル
オロメタンを細胞培養溶液に溶解しても、心筋細胞の拍動数に変動は殆ど確認されなかっ
た。心筋細胞に無害な気体を細胞培養液表面にフローするのみでは、心筋細胞に影響はな
く、心筋細胞の健全な状態が保持されていることが確認された。

【0040】

一方で、心臓に影響を及ぼすとされるクロロジフルオロメタンを使用した実施例におい
ては、フロー開始より１０分後において、拍動数の顕著な増加が確認された（７４％増）
。以上から、本開示における毒性評価方法により、気体（クロロジフルオロメタン）が心
筋細胞に与える毒性を評価可能であることが確認された。

【0041】

【表1】

【図1】