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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022174674
(43)【公開日】2022-11-24
(54)【発明の名称】ウイルス検出方法及びウイルス検出装置
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20221116BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20221116BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20221116BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12Q1/70
C12M1/34 B
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021080637
(22)【出願日】2021-05-11
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ－ａｐｐｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｎｅｔ／ｗｅｂ／ｊｓｍｂｅ２０２０／、令和２年５月１８日（掲載日） 第５９回日本生体医工学会大会 ポスター発表、令和２年５月２６日（発表日）
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100105924
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 賢樹
(72)【発明者】
【氏名】木村 雄亮
(72)【発明者】
【氏名】池内 真志
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA08
4B029BB13
4B029DG08
4B029FA15
4B029GB09
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR79
4B063QS24
4B063QS25
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】簡便な構成でウイルスを検出する。
【解決手段】ウイルス検出方法は、被験者から採取したサンプルに核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を添加し、核酸を抽出するステップと、サンプルに添加された第１の試薬を失活させるためにサンプルを加熱する第１加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬をサンプルに添加し、所定温度でサンプルを加熱する第２加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを検出するステップと、を備える。第１加熱ステップと第２加熱ステップの少なくとも一方において、発熱材から発せられる熱によりサンプルが加熱される。
【選択図】図１
【解決手段】ウイルス検出方法は、被験者から採取したサンプルに核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を添加し、核酸を抽出するステップと、サンプルに添加された第１の試薬を失活させるためにサンプルを加熱する第１加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬をサンプルに添加し、所定温度でサンプルを加熱する第２加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを検出するステップと、を備える。第１加熱ステップと第２加熱ステップの少なくとも一方において、発熱材から発せられる熱によりサンプルが加熱される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者から採取したサンプルに核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を添加し、核酸を抽出するステップと、
前記サンプルに添加された第１の試薬を失活させるために前記サンプルを加熱する第１加熱ステップと、
前記サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬を前記サンプルに添加し、所定温度で前記サンプルを加熱する第２加熱ステップと、
前記サンプルに含まれる標的ウイルスを検出するステップと、
を備え、
第１加熱ステップと第２加熱ステップの少なくとも一方において、発熱材から発せられる熱により前記サンプルが加熱される
ウイルス検出方法。
前記サンプルに添加された第１の試薬を失活させるために前記サンプルを加熱する第１加熱ステップと、
前記サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬を前記サンプルに添加し、所定温度で前記サンプルを加熱する第２加熱ステップと、
前記サンプルに含まれる標的ウイルスを検出するステップと、
を備え、
第１加熱ステップと第２加熱ステップの少なくとも一方において、発熱材から発せられる熱により前記サンプルが加熱される
ウイルス検出方法。
【請求項2】
前記第１加熱ステップにおいて、前記発熱材から発せられる熱により前記サンプル及び潜熱材が加熱され、
前記第２加熱ステップにおいて、前記潜熱材から発せられる熱により前記サンプルが加熱される
請求項１に記載のウイルス検出方法。
前記第２加熱ステップにおいて、前記潜熱材から発せられる熱により前記サンプルが加熱される
請求項１に記載のウイルス検出方法。
【請求項3】
前記第２加熱ステップにおいて、前記サンプルを収容したサンプル容器が前記潜熱材に接触するように設置される
請求項２に記載のウイルス検出方法。
請求項２に記載のウイルス検出方法。
【請求項4】
前記潜熱材は、融点が前記所定温度付近である物質を含む
請求項２又は３に記載のウイルス検出方法。
請求項２又は３に記載のウイルス検出方法。
【請求項5】
前記第２加熱ステップは、前記サンプルを収容したサンプル容器と前記潜熱材とを収納した断熱容器内で実行される
請求項２から４のいずれかに記載のウイルス検出方法。
請求項２から４のいずれかに記載のウイルス検出方法。
【請求項6】
前記第１加熱ステップにおいて、前記断熱容器の内部が加熱される
請求項５に記載のウイルス検出方法。
請求項５に記載のウイルス検出方法。
【請求項7】
被験者から採取したサンプルを収容するサンプル容器と、
前記サンプルに添加された、核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を失活させるために前記サンプルを加熱する第１加熱ステップと、前記サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬が添加された前記サンプルを加熱する第２加熱ステップの少なくとも一方において前記サンプルを加熱するための発熱材と、
前記第１加熱ステップにおいて前記サンプル容器と前記発熱材とを収納するための耐熱容器と、
を備えるウイルス検出装置。
前記サンプルに添加された、核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を失活させるために前記サンプルを加熱する第１加熱ステップと、前記サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬が添加された前記サンプルを加熱する第２加熱ステップの少なくとも一方において前記サンプルを加熱するための発熱材と、
前記第１加熱ステップにおいて前記サンプル容器と前記発熱材とを収納するための耐熱容器と、
を備えるウイルス検出装置。
【請求項8】
前記第２加熱ステップにおいて前記サンプル容器を加熱するための潜熱材を更に備える
請求項７に記載のウイルス検出装置。
請求項７に記載のウイルス検出装置。
【請求項9】
前記第２加熱ステップにおいて前記潜熱材と前記サンプル容器とを収納するための断熱容器を更に備える
請求項８に記載のウイルス検出装置。
請求項８に記載のウイルス検出装置。
【請求項10】
前記潜熱材を収容し、前記断熱容器に収納可能な熱伝導性容器を更に備える
請求項９に記載のウイルス検出装置。
請求項９に記載のウイルス検出装置。
【請求項11】
前記耐熱容器は、前記第１加熱ステップにおいて、前記サンプル容器、前記発熱材、及び前記潜熱材を収容した前記熱伝導性容器を収納可能に構成される
請求項１０に記載のウイルス検出装置。
請求項１０に記載のウイルス検出装置。
【請求項12】
前記熱伝導性容器は、厚さが５００μｍ以下である熱伝導性材料のシート又はフィルムで構成される
請求項１１に記載のウイルス検出装置。
請求項１１に記載のウイルス検出装置。
【請求項13】
前記耐熱容器は、前記第１加熱ステップにおいて、前記断熱容器を更に収納可能に構成される
請求項１１又は１２に記載のウイルス検出装置。
請求項１１又は１２に記載のウイルス検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示はウイルスを検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【0002】
顧みられない熱帯病（Neglected Tropical Diseases：ＮＴＤｓ）は、世界保健機関（ＷＨＯ）が「人類の中で制圧しなければならない熱帯病」と定義している１８の疾患の総称であり、貧困層を中心に世界の約１０億人が感染し、年間５０万人が死亡していると言われている。デング熱や狂犬病などのウイルス感染症の感染拡大や症状の重篤化を抑えるためには、早期診断が極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００７－２３６３９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
特許文献１に記載されたＬＡＭＰ法などを用いた従来のウイルス検出装置は、電気的に制御されるため、ＮＴＤｓの流行地域の多くを占める無電化地域では使用できない。無電化地域における早期診断を実現するためには、電気を使用しない簡便な構成でウイルスを検出することを可能とする技術が求められる。
【0005】
本開示は、このような課題に鑑みてなされ、その目的は、ウイルスを簡便に検出するための技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決するために、本開示のある態様のウイルス検出方法は、被験者から採取したサンプルに核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を添加し、核酸を抽出するステップと、サンプルに添加された第１の試薬を失活させるためにサンプルを加熱する第１加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬をサンプルに添加し、所定温度でサンプルを加熱する第２加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを検出するステップと、を備える。第１加熱ステップと第２加熱ステップの少なくとも一方において、発熱材から発せられる熱によりサンプルが加熱される。
【0007】
本開示の別の態様は、ウイルス検出装置である。この装置は、被験者から採取したサンプルを収容するサンプル容器と、サンプルに添加された、核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるための第１の試薬を失活させるためにサンプルを加熱する第１加熱ステップと、サンプルに含まれる標的ウイルスを増幅するための第２の試薬が添加されたサンプルを加熱する第２加熱ステップの少なくとも一方においてサンプルを加熱するための発熱材と、第１加熱ステップにおいてサンプル容器と発熱材とを収納するための耐熱容器と、を備える。
【発明の効果】
【0008】
本開示によれば、簡便な構成でウイルスを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施の形態に係るウイルス検出装置の構成を示す図である。
【図2】実施の形態に係るウイルス検出装置の構成を示す図である。
【図3】実施の形態に係るウイルス検出方法の手順を示すフローチャートである。
【図4】発熱材で耐熱容器内を加熱したときの耐熱容器内の温度変化を示す図である。
【図5】潜熱材で断熱容器内を加熱したときの断熱容器内の温度変化を示す図である。
【図6】実施例１と比較実施例１の各サンプルの検出結果を示す図である。
【図7】実施例２と比較実施例２の各サンプルの検出結果を示す図である。
【図8】実施例３と比較実施例３の各サンプルの検出結果を示す図である。
【図9】実施例４と比較実施例４の各サンプルの検出結果を示す図である。
【図10】実施例５と比較実施例５の各サンプルの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示において、被験者から採取した唾液などのサンプル中に含まれる標的ウイルスを増幅して検出する技術について説明する。実施の形態に係るウイルス検出装置は、SalivaDirect法などの方法によりサンプルに含まれるＤＮＡ及びＲＮＡを精製し、LAMP法などの方法により標的ウイルスを増幅して検出する。SalivaDirect法において、ＤＮＡ及びＲＮＡを精製する際に核酸分解酵素を失活させ、ウイルスタンパクを分解し、核酸を溶出させるためにサンプルに添加されるプロテイナーゼＫは、後続のウイルス増幅における反応を阻害するので、ウイルス増幅の前に加熱して失活させる必要がある。本実施の形態のウイルス検出装置は、この加熱を、発熱材を用いて実行する。また、本実施の形態のウイルス検出装置は、標的ウイルスを増幅して検出する方法として、サンプルに試薬を添加して一定温度で所定時間加熱するだけで標的ウイルスを増幅可能な、LAMP法などの核酸等温増幅手法を採用する。そして、この一定温度での加熱を、潜熱材を用いて実行する。この潜熱材は、プロテイナーゼＫを失活させるために発熱材により発せられた熱で融解させておく。このように、本開示の技術によれば、電気的な制御や電気を使用した加熱を要することなく、簡便にウイルスを検出することができるので、無電化地域や、災害などにより停電している地域などにおいても、標的ウイルスの感染の有無を検査することができる。これにより、標的ウイルスに感染している患者を早期に発見し、症状の重篤化や感染の拡大を防ぐことができる。
【0011】
図１及び図２は、実施の形態に係るウイルス検出装置の構成を示す。図１及び図２に示すウイルス検出装置１０は、被験者から採取された唾液に含まれるＤＮＡ及びＲＮＡをSalivaDirect法により精製し、標的ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡをLAMP法により増幅して検出する。
【0012】
ウイルス検出装置１０は、耐熱容器１１、蓋１２、断熱容器１３、ポリプロピレン容器１４、スタンド１５、発熱材１６、ポリプロピレン容器内スタンド１８、潜熱材１９、及びサンプル容器２０を備える。図１は、耐熱容器１１の蓋１２が閉じられた状態を示し、図２は、耐熱容器１１の蓋１２が開けられた状態を示す。
【0013】
図３は、実施の形態に係るウイルス検出方法の手順を示すフローチャートである。
【0014】
実験者は、被験者から唾液を採取してサンプル容器２０内に収容する（Ｓ１０）。サンプル容器２０は、容量が０．１ｍｌ～０．５ｍｌ程度のＰＣＲチューブであってもよいし、容量が１．５ｍｌ程度の大容量チューブであってもよい。また、ウイルス検出装置１０は、１００ｎｌ～１μｌ程度の量のサンプルでウイルスの検出が可能なマイクロデバイスであってもよい。
【0015】
つづいて、サンプルにプロテイナーゼＫを添加することにより、サンプル中に含まれるＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素を不活化するとともに、ウイルスタンパクを変性させて、ウイルスＤＮＡ及びＲＮＡを溶出させる（Ｓ１２）。
【0016】
つづいて、サンプルに添加したプロテイナーゼＫを失活させるために、サンプルを発熱材１６により加熱する（第１加熱ステップ）。発熱材１６は、水との化学反応により発熱する化合物を含んでもよい。発熱材１６は、例えば、生石灰とアルミニウム粉を含んでもよい。この場合、発熱材１６に水を添加することにより、下記の化学反応が起こる。
ＣａＯ＋Ｈ２Ｏ＝Ｃａ（ＯＨ）２＋１５．２ｋｃａｌ
Ａｌ＋１／２Ｃａ（ＯＨ）２＋２Ｈ２Ｏ＝１／２ＣＡＯ－Ａｌ２Ｏ３＋３／２Ｈ２＋９３．８ｋｃａｌ
ＣａＯ＋Ｈ２Ｏ＝Ｃａ（ＯＨ）２＋１５．２ｋｃａｌ
Ａｌ＋１／２Ｃａ（ＯＨ）２＋２Ｈ２Ｏ＝１／２ＣＡＯ－Ａｌ２Ｏ３＋３／２Ｈ２＋９３．８ｋｃａｌ
【0017】
蒸発を防止するためのミネラルオイルをサンプルに添加し（Ｓ１４）、サンプル容器２０をスタンド１５に設置する（Ｓ１６）。スタンド１５は、サンプル容器２０の大きさ、形状、容量などに応じて交換可能に構成されてもよい。耐熱容器１１内に、蓋を外した断熱容器１３と、ポリプロピレン容器内スタンド１８及び固体状態の潜熱材１９が収容されたポリプロピレン容器１４と、サンプル容器２０が保持されたスタンド１５と、発熱材１６とを収納する（Ｓ１８）。耐熱容器１１内に水を添加すると（Ｓ２０）、上記の化学反応により熱が発せられるので、蓋１２を閉じて（Ｓ２２）、バンドなどで蓋１２を固定し、耐熱容器１１内を９５℃で５分間加熱する（Ｓ２４）。これにより、プロテイナーゼＫが失活するので（Ｓ２６）、後続のウイルス増幅における反応阻害を防止することができる。また、このときに、ポリプロピレン容器１４内に収容された潜熱材１９が融解する（Ｓ２８）とともに、断熱容器１３の内部が加熱される（Ｓ３０）。
【0018】
耐熱容器１１及び蓋１２は、発熱材１６から発せられる熱に耐えうる材質で構成される。蓋１２には、発熱材１６から発せられる熱により蒸発した水蒸気や、発熱材１６から生成された水素などの気体を耐熱容器１１の外部に逃がすための孔１７が設けられる。
【0019】
５分経過すると、蓋１２を開けてサンプル容器２０を取り出し、反応後のサンプルにＬＡＭＰ試薬を添加する（Ｓ３０）。ＬＡＭＰ試薬は、標的遺伝子を増幅するための４種類又は６種類のプライマーと鎖置換合成酵素を含む。
【0020】
ＬＡＭＰ試薬を含むサンプルが収容されたサンプル容器をポリプロピレン容器内スタンド１８に設置する（Ｓ３２）。このとき、ポリプロピレン容器１４内の潜熱材１９は、少なくとも一部が融解して液体状態となっている。サンプル容器は、潜熱材１９に直接接触するように設置される。
【0021】
サンプル容器が保持されたポリプロピレン容器内スタンド１８及び潜熱材１９が収容されたポリプロピレン容器１４を断熱容器１３内に収納し（Ｓ３４）、蓋をしてサンプルを１時間加熱する（Ｓ３６）（第２加熱ステップ）。ポリプロピレン容器１４は、断熱容器１３の内部にちょうど収納されるような大きさ及び形状を有する。潜熱材１９は、ＬＡＭＰ法における反応温度付近の融点を有する物質を含む。ＬＡＭＰ法における最適な反応温度は、約６０～６５℃であるから、潜熱材１９は、融点が５５～７０℃、より好ましくは６０～６５℃である物質を含んでもよい。潜熱材１９は、例えば、パルミチン酸（融点６２．９℃）、マルガリン酸（融点６１℃）、カリウム（融点６４℃）、ピリジン－Ｎ－オキシド（融点６５℃）などであってもよい。パラフィンは、炭化水素の連鎖型や分子量を調整する事で、４７～７５℃の融点のものを作り出す事ができるので、融点が上記の最適な反応温度に調整されたパラフィンを潜熱材としてもよい。パルミチン酸やマルガリン酸などの水に不溶な物質は、発生した水蒸気に溶解しないので、再利用が可能である。液体状態の潜熱材１９と固体状態の潜熱材１９が共存している間は、潜熱材１９の温度が融点に保たれるので、サンプルを一定温度で加熱することができる。また、断熱容器１３内にサンプル容器及び潜熱材１９を収納するので、周囲の環境に依存することなく、サンプルを一定温度で加熱することができる。潜熱材１９とポリプロピレン容器内スタンド１８を、熱伝導率の高いポリプロピレンなどの熱伝導性材料のシート又はフィルムで構成された容器内に収容し、ポリプロピレン容器１４を断熱容器１３内に収納する二重構造を採用しているので、固体となった潜熱材１９をポリプロピレン容器１４ごと断熱容器１３から取り出すことができる。これにより、熱効率を高めつつ、潜熱材１９を再利用することができる。ポリプロピレン容器１４を構成するシート又はフィルムの厚さは５００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以下であることがより好ましい。サンプルを一定温度で所定時間加熱することが可能な量の潜熱材１９がポリプロピレン容器１４内に収容される。潜熱材１９の量は、一度に反応させるサンプル容器の数と容量に応じて調整されてもよい。
【0022】
１時間経過すると、蓋を開けてサンプル容器を取り出し、サンプルの濁度、蛍光、色などを観察してウイルスを検出する（Ｓ３８）。サンプル中に標的ウイルスが含まれる場合は、増幅反応における副産物としてピロリン酸イオンが産生される。それがサンプル内の金属イオンと結合することで、不溶性のピロリン酸マグネシウムが産出され、サンプルが白濁するので、ウイルスの有無を目視で検出することができる。また、ＬＡＭＰ試薬中にカルセイン－マンガンイオン複合体が含まれる場合は、マンガンイオンと結合して消光したカルセインが、ピロリン酸イオンにマンガンイオンを奪われて蛍光を発し、さらに反応液中のマグネシウムイオンと結合して蛍光が増強されるので、ウイルスの有無を目視で検出することができる。
【0023】
以上のように、本実施の形態のウイルス検出装置１０は、電気を使用することなく、サンプル中の標的ウイルスを検出することができる。また、発熱材１６以外の構成を何度も再利用することができるので、多数のサンプルを安価に検査することができる。
【0024】
また、断熱容器１３内に、ＬＡＭＰ試薬を収容したサンプル容器と保冷剤を収容しておくことにより、低温保存を要するＬＡＭＰ試薬を長時間保存することができる。
【0025】
［実施例］
本発明者らは、実施の形態に係るウイルス検出装置１０を試作し、実験を実施した。
本発明者らは、実施の形態に係るウイルス検出装置１０を試作し、実験を実施した。
【0026】
図４は、発熱材１６で耐熱容器１１内を加熱したときの耐熱容器１１内の温度変化を示す。加熱開始から１分程度経過すると、耐熱容器１１内の温度が約９５℃に到達し、約１４分の間は約９５℃のまま維持された。加熱開始３分後から１４分後までの平均温度は、９４．７７±０．２４℃であった。プロテイナーゼＫの失活に必要な９５℃で５分以上の加熱を発熱材１６により実行可能であることが示された。
【0027】
図５は、潜熱材１９で断熱容器１３内を加熱したときの断熱容器１３内の温度変化を示す。潜熱材１９として、融点が６２．９℃であるパルミチン酸を用いた。加熱開始２分後から６５分後までの平均温度は、６２．７３±０．６１℃であった。ＬＡＭＰ反応に必要な６０～６５℃で１時間以上の加熱を潜熱材１９により実行可能であることが示された。
【0028】
［実施例１］
１０００copies／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液（実施例１）と、健常者の唾液（比較実施例１）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
１０００copies／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液（実施例１）と、健常者の唾液（比較実施例１）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
【0029】
図６は、各サンプルの検出結果を示す。図６（ａ）は、自然光下で撮影した写真を示し、図６（ｂ）は、励起光下で撮影した写真を示す。図６（ａ）及び図６（ｂ）において、左は、アデノウイルスを含まない比較実施例１を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示し、中は、アデノウイルスを含む実施例１を従来のウイルス検出装置で検出した結果を示し、右は、アデノウイルスを含む実施例１を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示す。比較実施例１ではアデノウイルスは検出されず、実施例１ではアデノウイルスが検出された。自然光下でも目視で検出可能であった。
【0030】
［実施例２］
ＬＡＭＰ試薬付属のＰＣ ＲＮＡを含む唾液（実施例２）と、健常者の唾液（比較実施例２）をサンプルとして１．５ｍｌチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
ＬＡＭＰ試薬付属のＰＣ ＲＮＡを含む唾液（実施例２）と、健常者の唾液（比較実施例２）をサンプルとして１．５ｍｌチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
【0031】
図７は、各サンプルの検出結果を示す。図７（ａ）は、自然光下で撮影した写真を示し、図７（ｂ）は、励起光下で撮影した写真を示す。図７（ａ）及び図７（ｂ）において、左は、ＰＣ ＲＮＡを含まない比較実施例２を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示し、右は、ＰＣ ＲＮＡを含む実施例２を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示す。比較実施例２ではＰＣ ＲＮＡは検出されず、実施例２ではＰＣ ＲＮＡが検出された。自然光下でも目視で検出可能であった。１．５ｍｌチューブ内における大容量試薬でのウイルス検出も可能であることが示された。
【0032】
［実施例３］
ＬＡＭＰ試薬と保冷剤を収納した断熱容器１３を常温で０、２４、７２、１２０時間保存した。ＬＡＭＰ試薬付属のＰＣ ＲＮＡを含む唾液（実施例３）と、健常者の唾液（比較実施例３）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、それぞれのＬＡＭＰ試薬を用いて、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
ＬＡＭＰ試薬と保冷剤を収納した断熱容器１３を常温で０、２４、７２、１２０時間保存した。ＬＡＭＰ試薬付属のＰＣ ＲＮＡを含む唾液（実施例３）と、健常者の唾液（比較実施例３）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、それぞれのＬＡＭＰ試薬を用いて、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
【0033】
図８は、各サンプルの検出結果を示す。図８（ａ）は、自然光下で撮影した写真を示し、図８（ｂ）は、励起光下で撮影した写真を示す。図８（ａ）及び図８（ｂ）において、左端は、ＰＣ ＲＮＡを含まない比較実施例３の検出結果を示し、残りは、ＰＣ ＲＮＡを含む実施例３を、０、２４、７２、１２０時間保存したＬＡＭＰ試薬を用いて検出した結果を示す。比較実施例３ではＰＣ ＲＮＡは検出されず、実施例３では、いずれの場合もＰＣ ＲＮＡが検出された。断熱容器１３内に保冷剤とともに収納しておくことにより、ＬＡＭＰ試薬を１２０時間後も使用可能な状態に保存できることが示された。
【0034】
［実施例４］
ＰＣＲチューブを使用した場合の限界検出濃度を検証した。１、２、１０、２０、１００、２００copies／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液２５μｌ（実施例４）と、健常者の唾液２５μｌ（比較実施例４）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
ＰＣＲチューブを使用した場合の限界検出濃度を検証した。１、２、１０、２０、１００、２００copies／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液２５μｌ（実施例４）と、健常者の唾液２５μｌ（比較実施例４）をサンプルとしてＰＣＲチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
【0035】
図９は、各サンプルの検出結果を示す。図９（ａ）は、自然光下で撮影した写真を示し、図９（ｂ）は、励起光下で撮影した写真を示す。図９（ａ）及び図９（ｂ）において、左から順に、アデノウイルスを含まない比較実施例４、アデノウイルスを２００、１００、２０、１０、２、１copies／μｌ含む実施例４を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示す。比較実施例４と、アデノウイルスを１copy／μｌ含む実施例４ではアデノウイルスは検出されず、アデノウイルスを２copies／μｌ以上含む実施例４ではアデノウイルスが検出された。自然光下でも目視で検出可能であった。
【0036】
［実施例５］
１．５ｍｌチューブを使用した場合の限界検出濃度を検証した。０．５、１copy／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液１００μｌ（実施例５）と、健常者の唾液１００μｌ（比較実施例５）をサンプルとして１．５ｍｌチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
１．５ｍｌチューブを使用した場合の限界検出濃度を検証した。０．５、１copy／μｌのアデノウイルスＤＮＡを含む唾液１００μｌ（実施例５）と、健常者の唾液１００μｌ（比較実施例５）をサンプルとして１．５ｍｌチューブに収容し、試作したウイルス検出装置１０によりウイルスを検出した。
【0037】
図１０は、各サンプルの検出結果を示す。図１０（ａ）は、自然光下で撮影した写真を示し、図１０（ｂ）は、励起光下で撮影した写真を示す。図１０（ａ）及び図１０（ｂ）において、左から順に、アデノウイルスを含まない比較実施例５、アデノウイルスを１、及び、０．５copy／μｌ含む実施例５を試作したウイルス検出装置１０で検出した結果を示す。比較実施例５ではアデノウイルスは検出されず、アデノウイルスを０．５copy／μｌ以上含む実施例５ではアデノウイルスが検出された。自然光下でも目視で検出可能であった。
【0038】
新型コロナウイルス（covid-19）の発症時に患者の唾液中に含まれるウイルス濃度は約１０～１０００copies／μｌである。本実施の形態のウイルス検出装置１０は、新型コロナウイルスに感染した患者から採取された唾液中に含まれるウイルスを検出するのに十分な検出精度を有することが示された。
【0039】
以上、本開示を、実施例をもとに説明した。この実施例は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本開示の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【0040】
実施の形態においては、核酸精製手法としてSalivaDirect法について説明したが、他の核酸精製手法が採用されてもよい。例えば、ＦＴＡ ｃａｒｄによる精製手法などが採用されてもよい。この場合、核酸分解酵素を失活させるための手法としてプロテイナーゼＫ以外の試薬が用いられてもよい。
【0041】
実施の形態においては、核酸等温増幅手法としてLAMP法について説明したが、他の核酸等温増幅手法が採用されてもよい。例えば、SmartAmp法（最適反応温度：約６７℃）を用いる場合、潜熱材１９としてステアリン酸（融点７０℃）などを使用可能である。また、RPA法（最適反応温度：約３７℃）を用いる場合、潜熱材１９としてエルカ酸（融点３５℃）、シアバター（主成分：ステアリン酸、オレイン酸）（融点３７℃）などを使用可能である。また、WGA法（最適反応温度：約３０℃）を用いる場合、潜熱材１９としてガリウム（融点３０℃）、カプリン酸（融点３１℃）などを使用可能である。また、NASBA法（最適反応温度：４０～５５℃）を用いる場合、潜熱材１９としてラウリン酸（融点４４℃）、ネルボン酸（融点４３℃）、エライジン酸（融点４３～４５℃）、黄リン（融点４４℃）アジンホスエチル（融点５３℃）、Ｎ－ビニルアセトアミド（融点５４℃）などを使用可能である。
【符号の説明】
【0042】
１０ ウイルス検出装置、１１ 耐熱容器、１２ 蓋、１３ 断熱容器、１４ ポリプロピレン容器、１５ スタンド、１６ 発熱材、１７ 孔、１８ ポリプロピレン容器内スタンド、１９ 潜熱材、２０ サンプル容器。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
