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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022175086
(43)【公開日】2022-11-25
(54)【発明の名称】合成ＤＮＡ分子の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221117BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20221117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12P19/34 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021081230
(22)【出願日】2021-05-12
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】岡村 好子
(72)【発明者】
【氏名】高橋 宏和
(72)【発明者】
【氏名】堀尾 京平
(72)【発明者】
【氏名】猿渡 雄哉
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA21
4B064CC24
(57)【要約】
【課題】クローニング工程やシークエンス工程を必要とせずに、目的のＤＮＡ分子を正確且つ短時間で得られるようにする。
【解決手段】所望の配列からなる合成ＤＮＡ分子の製造方法は、所望の配列の一部をそれぞれが有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を所望の配列通りに並べた場合に隣接するオリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチドに複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、アニーリングする工程の後に、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、複数のスプリントオリゴヌクレオチドを相補鎖として含む環状１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えている。
【選択図】図１
【解決手段】所望の配列からなる合成ＤＮＡ分子の製造方法は、所望の配列の一部をそれぞれが有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を所望の配列通りに並べた場合に隣接するオリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチドに複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、アニーリングする工程の後に、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、複数のスプリントオリゴヌクレオチドを相補鎖として含む環状１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えている。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
所望の配列からなる合成ＤＮＡ分子の製造方法であって、
前記所望の配列の一部をそれぞれが有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、
前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を前記所望の配列通りに並べた場合に隣接する前記鋳型オリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、
前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドに前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、
前記アニーリングする工程の後に、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドを相補鎖として含む環状１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、
前記環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えていることを特徴とする合成ＤＮＡ分子の製造方法。
前記所望の配列の一部をそれぞれが有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、
前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を前記所望の配列通りに並べた場合に隣接する前記鋳型オリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、
前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドに前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、
前記アニーリングする工程の後に、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドを相補鎖として含む環状１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、
前記環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えていることを特徴とする合成ＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項2】
前記鋳型オリゴヌクレオチドは、複数のコアオリゴヌクレオチド及びランナーオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の合成ＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項3】
前記ライゲーションにより得られた前記環状１本鎖ＤＮＡを希釈する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の合成ＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項4】
前記２本鎖ＤＮＡを、マルチプルディスプレースメント増幅（ＭＤＡ）法又はマルチプリープライムローリングサークル増幅法（ＭＰＲＣＡ）法によって増幅することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の合成ＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項5】
合成した前記２本鎖ＤＮＡを、切断及び脱リン酸化の制御とエクソヌクレアーゼ処理とにより必要とする１本鎖ＤＮＡ配列を作製し、該１本鎖ＤＮＡ配列を前記環状１本鎖ＤＮＡの材料として用いて、前記合成２本鎖ＤＮＡを合成することを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の合成ＤＮＡ分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、合成ＤＮＡ分子の製造方法に関し、特に長鎖の合成ＤＮＡ分子の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に、ＤＮＡを合成する場合はポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲ）法が広く用いられている。また近年、鋳型ＤＮＡが手元に存在しないためＰＣＲ法では得ることができない遺伝子や、配列情報しか無い遺伝子の下流アプリケーションにおける配列利用のために種々の合成ＤＮＡ分子の作製方法が考案されてきている。その中でも最も多く利用されている方法としてPolymerase Cycling Assembly（ＰＣＡ）法が知られている（非特許文献１等）。ＰＣＡ法では、複数の配列が正確な８０塩基～２００塩基のオリゴヌクレオチドを互いに１５塩基～３０塩基程度オーバーラップするように合成し、それぞれのオーバーラップ領域の３’末端からＤＮＡポリメラーゼによって延長させる。これにより数ｋｂの長さのＤＮＡを合成することが可能となる。
【0003】
ＰＣＡ法の他に、合成ＤＮＡ分子の作製方法としてはLigation Chain Reaction（ＬＣＲ）法が知られている（非特許文献２等）。ＬＣＲ法は、複数の６０塩基～１００塩基のオリゴヌクレオチドを準備し、耐熱リガーゼを利用して熱サイクルを５０回以上繰り返して、ライゲーション効率を高めて上記複数のオリゴヌクレオチドを互いにつなぐことにより、最終的に所望のＤＮＡ配列を得る方法である。得られたＤＮＡ配列は、鋳型として用いてＰＣＲ法によって末端から増幅、又はベクターに繋げて大腸菌内で増幅を行う。
【0004】
これらの他に、Patch Oligodeoxynucleotide Synthesis（ＰＯＳ）法も知られている（非特許文献３等）。ＰＯＳ法は、上記ＬＣＲ法と異なり正鎖及び逆鎖の両方ではなく、片方の鎖のみをライゲーションでつなぎ、その後にＰＣＲ法によって末端から増幅することによって目的のＤＮＡを得ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Gene, 164, p49-53, 1995.
【非特許文献2】ACS Synthetic Biology, 3, 2, p97-106, 2014.
【非特許文献3】Biotechnology Letters, 34, p721-728, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記非特許文献１に示すＰＣＡ法では、合成する配列にもよるが、通常ＰＣＡ法によって正確に合成できるＤＮＡの長さは２ｋｂ～３ｋｂ程度であり、これ以上の長さのＤＮＡをＰＣＡ法のみで合成することは困難であり、合成する長さが長くなるほどにエラーの発生確率が高くなり好ましくない。従って、オリゴヌクレオチド合成不良由来の変異もあいまってこのようなエラーが無いことを確認するための大腸菌等のホスト細胞へのクローニングやシークエンス確認が必要となり、結果的に所望のＤＮＡの作製に時間がかかることとなる。
【0007】
また、上記非特許文献２に示すＬＣＲ法では、合成オリゴヌクレオチドを目的のＤＮＡの正鎖と逆鎖との両方の全領域分を用意する必要があり、さらに、工程の最後にＰＣＲ法によって目的の長さを有する伸長鎖のみを分離する必要がある。このため、エラーの有無の確認のための大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程及びシークエンス工程も必要となり、結果的に時間及びコストがかかる。ＰＣＲを工程に含まない場合でも、合成オリゴヌクレオチド由来のエラーを排除するためには大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程が必須であり、結果的に時間とコストの削減にはつながっていない。この変異の排除のため大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程は、非常に手間が掛かかるにもかかわらず、機械化による全自動化が難しい作業となっており、ハイスループット化の妨げになっていることが指摘されてきた。
【0008】
また、上記非特許文献３では、ＰＯＳ法を用いてＹＦＰ遺伝子（６７８ｂｐ）及びラットのｃａｔｅｎｉｎβ１（２３５２ｂｐ）の合成に成功しているが、エラー率は算出されていない。ＰＯＳ法もＬＣＲ法と同様に、工程の最後にＰＣＲ法によって二本鎖化され且つ目的の長さを有する伸長鎖のみを分離する必要がある。このため、ＰＣＡ法と同様にエラーの有無の確認のための大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程及びシークエンス工程も必要となり、結果的に時間及びコストがかかる。
【0009】
以上のように、従来の合成ＤＮＡ分子の製造方法では、ＰＣＲ法を用いる必要があるため、結果的に大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程やシークエンス工程といった目的の結果物が得られているか否かの確認工程を必要とし、その結果、多くの時間とコストを必要とすることとなる。また、いずれの方法にせよ、合成したオリゴヌクレオチドに一定程度含まれる合成不良由来の変異のみならず、ＰＣＲ中の変異の排除のために、ベクターへのクローニングと大腸菌等のホスト細胞への導入、その後単一クローンの単離及びシークエンス決定による変異の排除が必須である。結果的に多種多様な配列を合成するための、全自動化プラットフォームが形成できない。
【0010】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、所望の結果物が得られているか否かを確認するための大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程を必要とせずに、最低限のシークエンス工程で目的のＤＮＡ分子が多種多様であっても、該ＤＮＡ分子を正確且つ短時間で得られるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、所望の配列を有するオリゴヌクレオチド同士を、該オリゴヌクレオチド同士の端部に相補的な配列を有するスプリントオリゴヌクレオチドを介してライゲーションすることのみで１本鎖ＤＮＡを合成し、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、合成された１本鎖ＤＮＡを鋳型としてスプリントオリゴヌクレオチドが結合された領域からポリメラーゼ反応を開始させることで、所望の配列を有する長鎖ＤＮＡを正確且つ簡便に合成できることを見出して本発明を完成した。
【0012】
具体的に、本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法は、所望の配列からなる合成ＤＮＡ分子の製造方法であって、前記所望の配列の一部をそれぞれが有する複数の鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を前記所望の配列通りに並べた場合に隣接する鋳型オリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチドに前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、前記アニーリングする工程の後に、前記複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、前記複数のスプリントオリゴヌクレオチドを相補鎖として含む環状１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、前記環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えていることを特徴とする。
【0013】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法では、従来のようにＰＣＲ法を利用するのではなく、ライゲーション反応によって所望の配列を有するオリゴヌクレオチド同士を結合して１本鎖ＤＮＡを伸長及び環状化し、得られた環状化１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する。ライゲーション反応は塩基の変異導入リスクがほぼ無く、また、φ２９ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１０００倍以上の忠実度が保証されており、現在市販されているいずれのＰＣＲ酵素よりも信頼性が高く、塩基の変異導入リスクを回避することができる。特に環状化１本鎖ＤＮＡを鋳型とすると、環状ＤＮＡを鋳型として繰り返し使用するマルチプリープライムローリングサークル増幅（ＭＰＲＣＡ）法を利用できるため２本鎖ＤＮＡの増幅効率を向上することができる。従って、本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法によると、所望の配列の長鎖ＤＮＡを正確に合成できるため、従来のＰＣＲ法を利用した方法のように得られた合成ＤＮＡの配列の確認作業としての大腸菌等のホスト細胞へのクローニング工程と単一クローンの単離を不要とすることができて、さらに本方法で作成された２本鎖ＤＮＡは未精製でも直接シークエンス工程に持ち込めることから、結果的に合成に関わる時間を短縮でき合成コストも低減することができる。また、ホスト細胞を経由するクローニング工程が必要ないため、多種多様な配列を合成するための、全自動化プラットフォームの作成が可能となる。
【0014】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法において、前記鋳型オリゴヌクレオチドは、複数のコアオリゴヌクレオチド及びランナーオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。
【0015】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法は、前記ライゲーションにより得られた前記環状１本鎖ＤＮＡを希釈する工程をさらに含むことが好ましい。
【0016】
このようにすると、環状化が成功した１本鎖ＤＮＡ産物を希釈して使用することにより、合成オリゴヌクレオチドに僅かに含まれる合成不良のオリゴヌクレオチドを、確率論的に除去できるため、高効率で所望の２本鎖ＤＮＡを合成することができる。
【0017】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法において、前記２本鎖ＤＮＡを、マルチプルディスプレースメント増幅（ＭＤＡ）法又はマルチプリープライムローリングサークル増幅法（ＭＰＲＣＡ）法によって増幅することが好ましい。
【0018】
これらの方法を用いることによって、所望の２本鎖ＤＮＡを効率良く得ることができる。
【0019】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法において、合成した前記２本鎖ＤＮＡを、切断及び脱リン酸化の制御とエクソヌクレアーゼ処理とにより必要とする１本鎖ＤＮＡ配列を作製し、該１本鎖ＤＮＡ配列を前記環状１本鎖ＤＮＡの材料として用いて、前記合成２本鎖ＤＮＡを合成することが好ましい。
【発明の効果】
【0020】
本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法によると、所望のＤＮＡを従来の方法よりも正確に、短い合成時間で且つ、低いコストで合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】本発明の一実施形態に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法における２本鎖ＤＮＡ分子の合成工程を説明するための概要図である。
【図2】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーション生成物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図3】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーションの改良した生成物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図4】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士の環状化ライゲーション生成物を２本鎖ＤＮＡとして増幅した後に制限酵素により切断した後の生成物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図5】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士の環状化ライゲーション生成物を、段階希釈し２本鎖ＤＮＡとして増幅した後に制限酵素により切断した後の生成物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図6】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士の環状化ライゲーション生成物を、希釈前（上段）と限界希釈（下段）して２本鎖ＤＮＡとして増幅した後に、シークエンス反応を行い全自動シークエンサーで得られた結果を示すデータ図である。
【図7】実施例において作製した鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーション生成物を環状化した後に制限酵素により切断した後の生成物としての２本鎖ＤＮＡ及びエクソヌクレアーゼ処理による１本鎖ＤＮＡを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図8】実施例において作製した４種の１本鎖ＤＮＡの組み合わせのライゲーション産物をさらにライゲーションし２本鎖ＤＮＡとして増幅によって得られた生成物をさらに制限酵素により切断した後の生成物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【図9】実施例において作製した種の鋳型オリゴヌクレオチドの組み合わせのライゲーション産物をさらにライゲーションして得られた生成物を鋳型としてＰＣＲを行って得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0023】
本発明の一実施形態に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法の概要を図１に示す。図１に示すように、本実施形態に係る製造方法は、所望の配列からなる合成ＤＮＡ分子の製造方法であって、所望の配列の一部をそれぞれが有する所望の配列である複数のコアオリゴヌクレオチドとそれらを環状にするためのランナーオリゴヌクレオチドとからなる鋳型オリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士を前記所望の配列通りに並べた場合に隣接する鋳型オリゴヌクレオチド同士の端部の配列に相補的な配列を有する複数のスプリントオリゴヌクレオチドを準備する工程と、複数の鋳型オリゴヌクレオチドに複数のスプリントオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、アニーリングする工程の後に、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして、複数のスプリントオリゴヌクレオチドを含む環状化された１本鎖ＤＮＡを合成する工程と、環状化１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する工程とを備えていることを特徴とするものである。
【0024】
本実施形態において、鋳型オリゴヌクレオチドは、所望の配列通りに常法によって１塩基ずつ正確に合成された１０～１００塩基程度の合成オリゴＤＮＡである。複数の鋳型オリゴヌクレオチドは、それぞれ最終的に合成したいＤＮＡ分子の配列の一部からなり、それらの複数の鋳型オリゴヌクレオチドの配列によって、所望のＤＮＡ分子の全配列をカバーし得る。言い換えると、複数の鋳型オリゴヌクレオチドを繋ぐことによって所望のＤＮＡ分子の全配列となり得る。
【0025】
本実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、所望の配列通りに常法によって１塩基ずつ正確に合成された約２０から３０塩基前後の合成オリゴＤＮＡであり、図１に示すようにcircular assembling into ordered sequence （ＣＡＩＯＳ）法で鋳型オリゴヌクレオチドを接続するために用いられるオリゴＤＮＡである。スプリントオリゴヌクレオチドは、上記鋳型オリゴヌクレオチドの端部の配列と相補的な配列を有するものである。より具体的には、所望のＤＮＡ分子の配列に従って上記複数の鋳型オリゴヌクレオチドを整列させた場合に、隣接する鋳型オリゴヌクレオチド同士の端部に相補的である。言い換えると、スプリントオリゴヌクレオチドは、当該隣接する鋳型オリゴヌクレオチドの構成物であるコアオリゴヌクレオチド又はランナーオリゴヌクレオチドの端部に跨るようにアニーリングできる配列を有する。
【0026】
本実施形態において、鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドは、上述の通りアニーリングされるが、その際の溶媒や温度条件は特に限定されず、当業者に周知の方法で最適な条件が適宜選択可能である。当該アニーリング工程により、各鋳型オリゴヌクレオチドの端部に対して、それらと相補的な配列を有するスプリントオリゴヌクレオチドがアニーリングされることとなる。
【0027】
本実施形態において、アニーリング工程によって得られたスプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士がライゲーションにより接続される。当該ライゲーションのための溶媒やリガーゼ及び温度条件は、特に限定されないが、当業者に周知の方法で最適な条件が適宜選択可能である。なお、必要に応じて実際のライゲーション工程の前に、鋳型オリゴヌクレオチドの５’末端に対してリン酸化処理を行うことが好ましい。本実施形態において、当該ライゲーション工程により、上記スプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士が接続される。具体的に、所望のＤＮＡ分子の配列に従って、隣接する配列を有する鋳型オリゴヌクレオチド同士が接続される。これは、鋳型オリゴヌクレオチドの端部にスプリントオリゴヌクレオチドがアニーリングしているため、鋳型オリゴヌクレオチドの端部同士がスプリントオリゴヌクレオチドによる二本鎖を介して隣接してニックと呼ばれる切れ目が生成され、このニック部分がリガーゼにより結合されることにより、鋳型オリゴヌクレオチド同士が接続されることなり、鋳型オリゴヌクレオチドを含む鎖は、環状化される。
【0028】
本実施形態において、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションした後に、環状化１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する。φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１０００倍以上の忠実度が保証されており、現在市販されているいずれのＰＣＲ酵素よりも信頼性が高く、塩基の変異導入リスクを回避することができて好ましい。また、φ２９ＤＮＡポリメラーゼによる反応は等温反応であるため、熱サイクルを必要とせず好ましい。φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた２本鎖ＤＮＡの合成には、マルチプルディスプレースメント増幅（ＭＤＡ）法又はマルチプリープライムローリングサークル増幅法（ＭＰＲＣＡ）法等を用いることができる。
【0029】
ＭＤＡ法は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素とランダムプライマーとを用いたＤＮＡ増幅方法として知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2002年、第99巻、p5261-5266）。ＭＤＡ法は、一般に、（１）変性した一本鎖ＤＮＡにランダムにプライマーがアニールする。（２）アニールしたプライマーからＤＮＡ合成が開始され、合成方向に存在する他のプライマーによって先に合成されている相補鎖ＤＮＡを鋳型ＤＮＡ鎖からはがしながら、ＤＮＡ合成が続く。また、剥がされたＤＮＡ鎖にも新たにプライマーがアニールする。（３）剥がされたＤＮＡ鎖にアニールしたプライマーからもＤＮＡ合成が行われ、これら一連の反応が連鎖的に起きる。初期鋳型は最も３’末端からの合成が終了した後、二度と使用されることはない。これは剥がされたＤＮＡ鎖でも同様である。
【0030】
本実施形態において、図１に示すように、複数の鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションして得られた１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮＡに合成する前に、環状化する工程を有する。そうすると、環状ＤＮＡを鋳型として繰り返し使用するＭＰＲＣＡ法を利用できるため２本鎖ＤＮＡの増幅効率を向上することができる。ＭＰＲＣＡ法は、上述の通り、環状ＤＮＡを鋳型として繰り返し使用してＤＮＡを増幅する方法であって、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法の応用法として知られている（Genome Research、2001年、第11巻、p.1095－1099）。ＲＣＡ法は、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型として、鋳型にハイブリダイズしたプライマーの３’末端を基点にＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを合成し、環状の鋳型を一周してプライマーの５’末端にＤＮＡポリメラーゼが戻ってきたときに、前方にあるＤＮＡ鎖をポリメラーゼが２本鎖ＤＮＡを引き剥がしつつＤＮＡを合成する鎖置換をしながらＤＮＡ合成を続け、環状ＤＮＡの相補鎖配列がタンデムな状態で並んだ長鎖の一本鎖ＤＮＡを合成する方法である。一方、ＭＰＲＣＡ法は、鋳型となる環状ＤＮＡに対して、複数個所を開始点として複数の特異的プライマーを用いてＲＣＡを実施する方法である。これは、各環状鋳型上の複数の成長点で合成が一段と速やかに進行するという利点を有する。本実施形態では、鋳型オリゴヌクレオチドにアニーリングしたスプリントオリゴヌクレオチドが上記複数個所の開始点を担うことができる。
【0031】
また、本実施形態において、上記のようにして得られた環状化された１本鎖ＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡの合成前に希釈して用いられることが好ましい。このようにすると、合成オリゴヌクレオチドに僅かに含まれる合成不良のオリゴヌクレオチドを、希釈によって確率論的に除去できるため、高効率で所望の２本鎖ＤＮＡを合成することができる。
【0032】
また、本実施形態において、得られた２本鎖ＤＮＡをさらに再度の２本鎖ＤＮＡの合成に用いることが好ましい。具体的に、図１に示すように、所望の配列である複数のコアオリゴヌクレオチドとそれらを環状にするためのランナーオリゴヌクレオチドをライゲーションして環状化し、ＭＰＲＣＡ法により２本鎖ＤＮＡを合成した後に、ランナーオリゴヌクレオチドとコアオリゴヌクレオチドとの接続部を所定の制限酵素により切断する。その後、脱リン酸化した上でもう一方のランナーオリゴヌクレオチドとコアオリゴヌクレオチドとの接続部を所定の制限酵素で切断してランナーオリゴヌクレオチドを除去する。その後、所定のエキソヌクレアーゼ（例えばラムダエキソヌクレアーゼ）によって一本鎖にし、その後、さらに所望の配列からなるオリゴヌクレオチド同士をライゲーションして環状化し、ＭＰＲＣＡ法により２本鎖ＤＮＡを合成することを繰り返す。これにより、さらに長鎖の２本鎖ＤＮＡを正確な配列で簡便且つ速やかに合成することができる。
【実施例0033】
以下に、本発明に係る合成ＤＮＡ分子の製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【0034】
（オリゴヌクレオチド）
本実施例において、鋳型オリゴヌクレオチドとは複数のコアオリゴヌクレオチドだけで構成されている混合物と、複数のコアオリゴヌクレオチドとランナーオリゴヌクレオチドの混合物の、両形態の総称として用いている。本実施例において用いたコアオリゴヌクレオチドを表１に示し、コアオリゴヌクレオチドに対するスプリントオリゴヌクレオチドを表２に示し、コアオリゴヌクレオチドとランナーオリゴヌクレオチドに対するスプリントオリゴヌクレオチドを表３に示し、ランナーオリゴヌクレオチドを表４に示した、また以下の実験で用いるこれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを、直鎖状の連結は表５に、１回目の環状化の連結は表６に示す。さらに、１回目の環状化及び２本鎖ＤＮＡ合成から作成された１本鎖ＤＮＡの連結に用いられたスプリントオリゴヌクレオチドを表７に示し、用いられたオリゴヌクレオチドの組み合わせを表８に示す。
本実施例において、鋳型オリゴヌクレオチドとは複数のコアオリゴヌクレオチドだけで構成されている混合物と、複数のコアオリゴヌクレオチドとランナーオリゴヌクレオチドの混合物の、両形態の総称として用いている。本実施例において用いたコアオリゴヌクレオチドを表１に示し、コアオリゴヌクレオチドに対するスプリントオリゴヌクレオチドを表２に示し、コアオリゴヌクレオチドとランナーオリゴヌクレオチドに対するスプリントオリゴヌクレオチドを表３に示し、ランナーオリゴヌクレオチドを表４に示した、また以下の実験で用いるこれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを、直鎖状の連結は表５に、１回目の環状化の連結は表６に示す。さらに、１回目の環状化及び２本鎖ＤＮＡ合成から作成された１本鎖ＤＮＡの連結に用いられたスプリントオリゴヌクレオチドを表７に示し、用いられたオリゴヌクレオチドの組み合わせを表８に示す。
【0035】
【表1】
【0036】
【表2】
【0037】
【表3】
【0038】
【表4】
【0039】
【表5】
【0040】
【表6】
【0041】
【表7】
【0042】
【表8】
【0043】
表１及び表２からわかるように、Ｂ８９はＭｔｈ ｆｏｒ ｐＧＥＸ２及びＴ９０、Ｂ９０はＴ９０及びＴ９１、Ｂ９１はＴ９１及びＴ９２、Ｂ９２はＴ９２及びＴ９３の５’端又は３’端にそれぞれアニーリング可能な配列となっている。また、Ｂ９４は、Ｔ９４及びＴ９５、Ｂ９５はＴ９５及びＴ９６、Ｂ９６はＴ９６及びＴ９７、Ｂ９７はＴ９７及びＴ９８の５’端又は３’端にそれぞれアニーリング可能な配列となっている。また、Ｂ９９はＴ９９及びＴ１００、Ｂ１００はＴ１００及びＴ１０１、Ｂ１０１はＴ１０１及びＴ１０２、Ｂ１０２はＴ１０２及びＴ１０３の５’端又は３’端にそれぞれアニーリング可能な配列となっている。また、Ｂ１０４はＴ１０４及びＴ１０５、Ｂ１０５はＴ１０５及びＴ１０６、Ｂ１０６はＴ１０６及びＴ１０７、Ｂ１０７はＴ１０７及びＴ１０８の５’端又は３’端にそれぞれアニーリング可能な配列となっている。なお、Ｂ８９ｉ、Ｂ９１ｉ、Ｂ１０２ｉ、Ｂ１０４ｉ、Ｂ１０５ｉ及びＢ１０７ｉは、Ｔｍ値を改善するために、それぞれＢ８９、Ｂ９１、Ｂ１０２、Ｂ１０４、Ｂ１０５及びＢ１０７を５ｍｅｒ長くしたものである。
【0044】
＜直鎖状での予備試験＞
（鋳型オリゴヌクレオチドのリン酸化）
まず、各鋳型オリゴヌクレオチド同士が、スプリントオリゴヌクレオチドを介して接続して所望の通りの合成産物が得られるかを、以下の通りに確認した。後の鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーションのために鋳型オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化を行った。そのために、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）にそれぞれ５０μＭを５μＬずつ準備し、それぞれに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン)、１０ｍＭのＡＴＰ、を５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、３２．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、各オリゴヌクレオチドの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
（鋳型オリゴヌクレオチドのリン酸化）
まず、各鋳型オリゴヌクレオチド同士が、スプリントオリゴヌクレオチドを介して接続して所望の通りの合成産物が得られるかを、以下の通りに確認した。後の鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーションのために鋳型オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化を行った。そのために、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）にそれぞれ５０μＭを５μＬずつ準備し、それぞれに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸マグネシウム、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン)、１０ｍＭのＡＴＰ、を５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs)を２μＬ、３２．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、各オリゴヌクレオチドの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
【0045】
（アニーリング）
上記リン酸化処理の後、各鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチド（直鎖）をアニーリングするために以下の処理を行った。まず各チューブに１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、２Ｍグルタミン酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、１００ｍＭ硫酸アンモニウム）を１μＬずつ分注した。上記１μＭの各鋳型オリゴヌクレオチド混合液４．５μＬを１０×アニーリングバッファーを分注したチューブにそれぞれ移し、さらに、各チューブに１μＭのスプリントオリゴヌクレオチド混合液を４．５μＬずつ加えた。なお、ＭｔｈＬ＿１に対してＢ＿Ｍｔｈ＿１を加え、ＭｔｈＬ＿２に対してＢ＿Ｍｔｈ＿２を加え、ＭｔｈＬ＿３に対してＢ＿Ｍｔｈ＿３を加え、ＭｔｈＬ＿４に対してＢ＿Ｍｔｈ＿４を加えた。その後、各チューブを９５℃で４分間加熱し、ゆっくりと温度を下げて１０℃にして１０分間維持し、鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
上記リン酸化処理の後、各鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチド（直鎖）をアニーリングするために以下の処理を行った。まず各チューブに１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、２Ｍグルタミン酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、１００ｍＭ硫酸アンモニウム）を１μＬずつ分注した。上記１μＭの各鋳型オリゴヌクレオチド混合液４．５μＬを１０×アニーリングバッファーを分注したチューブにそれぞれ移し、さらに、各チューブに１μＭのスプリントオリゴヌクレオチド混合液を４．５μＬずつ加えた。なお、ＭｔｈＬ＿１に対してＢ＿Ｍｔｈ＿１を加え、ＭｔｈＬ＿２に対してＢ＿Ｍｔｈ＿２を加え、ＭｔｈＬ＿３に対してＢ＿Ｍｔｈ＿３を加え、ＭｔｈＬ＿４に対してＢ＿Ｍｔｈ＿４を加えた。その後、各チューブを９５℃で４分間加熱し、ゆっくりと温度を下げて１０℃にして１０分間維持し、鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
【0046】
（ライゲーション）
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（直鎖）にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後の各チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、各チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（直鎖）にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後の各チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、各チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。
【0047】
（合成産物の確認）
まず、上記ライゲーション工程によって、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）中のスプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士が所望の通りライゲーションされているか否かを、常法のポリアクリルアミド電気泳動法を用いて確認した。その結果を図２に示す。
まず、上記ライゲーション工程によって、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）中のスプリントオリゴヌクレオチドにアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士が所望の通りライゲーションされているか否かを、常法のポリアクリルアミド電気泳動法を用いて確認した。その結果を図２に示す。
【0048】
図２において、レーン１、レーン２、レーン３、レーン４はそれぞれＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４のライゲーション反応物であり、レーンＭはマーカーである。図２に示すように、各鋳型オリゴヌクレオチドの長さである６０ｂｐよりも明らかに長いヌクレオチドが生成されており、各鋳型オリゴヌクレオチドの組み合わせ中の５種類の鋳型オリゴヌクレオチドが接続された３００ｂａｓｅ程度の長さの生成物の存在も認められた（図２の矢印部分）。しかしながら、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４のライゲーション反応物はＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２の反応物に比べ、目的の３００ｂａｓｅ程度の長さの生成物量が少ないことが明らかとなった。そこで各スプリントオリゴヌクレオチドのＴｍ値を計算したところ、ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿３、及びＭｔｈＬ＿４用のスプリントオリゴヌクレオチドの一部で明らかに低いＴｍ値を示した物に対して、Ｔｍを上げるためにオリゴの長さを５ｍｅｒ伸ばしたスプリントオリゴヌクレオチド（Ｂ８９ｉ、Ｂ９１ｉ、Ｂ１０２ｉ、Ｂ１０４ｉ、Ｂ１０５ｉ及びＢ１０７ｉ）を作成した。これらを含む表５に示すＭｔｈＬ＿１Ｒ（図３のレーン１）、ＭｔｈＬ＿２（図３のレーン２）、ＭｔｈＬ＿３Ｒ（図３のレーン３）及びＭｔｈＬ＿４Ｒ（図３のレーン４）の組み合わせを用いて再度同一の反応を行ったところ、ＭｔｈＬ＿３Ｒ、ＭｔｈＬ＿４Ｒのライゲーション反応物量が有意に改善されたことが明らかとなった（図３の矢印の部分）。
【0049】
＜１回目の環状化及び増幅＞
（鋳型オリゴヌクレオチドのリン酸化）
続いて、上記直鎖状での試験に用いた鋳型オリゴヌクレオチド及びスプリントオリゴヌクレオチドと共に環状化用のオリゴヌクレオチドを利用して、オリゴヌクレオチドの環状化及び増幅を繰り返すことで所望の長鎖の合成産物が得られるかを試験した。以下、その方法及び結果を示す。まず、後の鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーションのためにコアオリゴヌクレオチド及びランナーオリゴヌクレオチド(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｗｉｔｈ ＴｙｐｅＩＩＳ＿Ｒ)の５’末端のリン酸化を行った。そのために、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）にさらランナーオリゴヌクレオチドにそれぞれ５０μＭを５μＬずつ準備し、それぞれに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸マグネシウムを加え、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン）、１０ｍＭのＡＴＰ、を５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を２μＬ、３２．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、各オリゴヌクレオチドの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
（鋳型オリゴヌクレオチドのリン酸化）
続いて、上記直鎖状での試験に用いた鋳型オリゴヌクレオチド及びスプリントオリゴヌクレオチドと共に環状化用のオリゴヌクレオチドを利用して、オリゴヌクレオチドの環状化及び増幅を繰り返すことで所望の長鎖の合成産物が得られるかを試験した。以下、その方法及び結果を示す。まず、後の鋳型オリゴヌクレオチド同士のライゲーションのためにコアオリゴヌクレオチド及びランナーオリゴヌクレオチド(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｗｉｔｈ ＴｙｐｅＩＩＳ＿Ｒ)の５’末端のリン酸化を行った。そのために、鋳型オリゴヌクレオチドの各組み合わせ（ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４）にさらランナーオリゴヌクレオチドにそれぞれ５０μＭを５μＬずつ準備し、それぞれに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸マグネシウムを加え、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン）、１０ｍＭのＡＴＰ、を５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を２μＬ、３２．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、各オリゴヌクレオチドの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
【0050】
（アニーリング）
上記リン酸化処理の後、各鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチド（環状）をアニーリングするために以下の処理を行った。まず各チューブに１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８），２Ｍグルタミン酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、１００ｍＭ硫酸アンモニウム）を１μＬずつ分注した。上記１μＭの各鋳型オリゴヌクレオチド混合液４．５μＬを１０×アニーリングバッファーを分注したチューブにそれぞれ移し、さらに、各チューブに１μＭのスプリントオリゴヌクレオチド混合液を４．５μＬずつ加えた。なお、ＭｔｈＬ＿１に対してＢ＿Ｍｔｈ＿１＿ＲＣを加え、ＭｔｈＬ＿２に対してＢ＿Ｍｔｈ＿２＿Ｃを加え、ＭｔｈＬ＿３に対してＢ＿Ｍｔｈ＿３＿ＲＣを加え、ＭｔｈＬ＿４に対してＢ＿Ｍｔｈ＿４＿ＲＣを加えた。その後、各チューブを９５℃で４分間加熱し、ゆっくりと温度を下げて１０℃にして１０分間維持し、鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
上記リン酸化処理の後、各鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチド（環状）をアニーリングするために以下の処理を行った。まず各チューブに１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８），２Ｍグルタミン酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)、１００ｍＭ硫酸アンモニウム）を１μＬずつ分注した。上記１μＭの各鋳型オリゴヌクレオチド混合液４．５μＬを１０×アニーリングバッファーを分注したチューブにそれぞれ移し、さらに、各チューブに１μＭのスプリントオリゴヌクレオチド混合液を４．５μＬずつ加えた。なお、ＭｔｈＬ＿１に対してＢ＿Ｍｔｈ＿１＿ＲＣを加え、ＭｔｈＬ＿２に対してＢ＿Ｍｔｈ＿２＿Ｃを加え、ＭｔｈＬ＿３に対してＢ＿Ｍｔｈ＿３＿ＲＣを加え、ＭｔｈＬ＿４に対してＢ＿Ｍｔｈ＿４＿ＲＣを加えた。その後、各チューブを９５℃で４分間加熱し、ゆっくりと温度を下げて１０℃にして１０分間維持し、鋳型オリゴヌクレオチドとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
【0051】
（環状化と増幅）
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（環状化）にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後の各チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、各チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。ＭＰＲＣＡ法で増幅するために、この環状化反応液６μＬに対し５×ＲＡ ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、４０ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと１００μＭの６Ｒ５Ｓプライマー２μＬを加え、各チューブを９５℃で４分間加熱し、４℃に急冷した。各チューブに、１０×ＲＣＡ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭ塩化マグネシウム）２μＬと、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ２μＬと、１００ｍＭのＤＴＴ１μＬと、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ（１００ｎｇ）と蒸留水３．９μＬとを加え、３０℃で１６時間反応させて、増幅産物して環状化１本鎖ＤＮＡ配列がタンデムリピートの状態の２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。増幅後蒸留水１８０μＬが入っている別チューブに増幅産物を移し、１５分間ボルテックスミキサーで攪拌することで、増幅産物の粘度を減少させた。
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（環状化）にアニーリングされた鋳型オリゴヌクレオチド同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後の各チューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、各チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。ＭＰＲＣＡ法で増幅するために、この環状化反応液６μＬに対し５×ＲＡ ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、４０ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと１００μＭの６Ｒ５Ｓプライマー２μＬを加え、各チューブを９５℃で４分間加熱し、４℃に急冷した。各チューブに、１０×ＲＣＡ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭ塩化マグネシウム）２μＬと、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ２μＬと、１００ｍＭのＤＴＴ１μＬと、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ（１００ｎｇ）と蒸留水３．９μＬとを加え、３０℃で１６時間反応させて、増幅産物して環状化１本鎖ＤＮＡ配列がタンデムリピートの状態の２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。増幅後蒸留水１８０μＬが入っている別チューブに増幅産物を移し、１５分間ボルテックスミキサーで攪拌することで、増幅産物の粘度を減少させた。
【0052】
（増幅産物の確認）
ランナーオリゴヌクレオチド中に設けたＢｓａＩサイトで切断するために、希釈産物２５μＬを取り出して別チューブに移し、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）５μＬ、制限酵素（ＢｓａＩ（New England Biolabs））１μＬ、さらに蒸留水１９μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で１時間処理した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。その結果を図４に示す。
ランナーオリゴヌクレオチド中に設けたＢｓａＩサイトで切断するために、希釈産物２５μＬを取り出して別チューブに移し、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）５μＬ、制限酵素（ＢｓａＩ（New England Biolabs））１μＬ、さらに蒸留水１９μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で１時間処理した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。その結果を図４に示す。
【0053】
図４において、レーン１、レーン２、レーン３、レーン４はそれぞれＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４のライゲーション及び環状化処理物であり、レーンＭはマーカーである。図４に示すように、全てのレーンで各鋳型オリゴヌクレオチドの組み合わせ中の５種類の鋳型オリゴヌクレオチドが接続されたおおよそ３００ｂｐの長さの生成物の存在が認められた。
【0054】
どのような合成方法で作成されたオリゴヌクレオチドであっても、おおよそ全体の分子数に対して０．２～０．３％程度の割合で、合成不良のオリゴヌクレオチドが含まれているとされている。従って、増幅に用いる環状化処理物の鋳型量を１０～１００コピー程度に限定した場合、確率論的に合成不良のオリゴヌクレオチドを増幅から排除出来る。そこで図４で用いた環状化処理物を段階希釈して、増幅限界点を決定した。その結果、ＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４のライゲーション及び環状化処理物のいずれにおいても、１０６～１０７倍希釈した鋳型でも目的の増幅産物が確認された（図５）。そこで、希釈前の環状化処理物と１０６希釈した環状化処理物の増幅産物をシークエンス反応によって配列を確認したところ、希釈前由来の物では１ベースの欠損がある合成不良のオリゴヌクレオチド由来のピークシグナルがメインピークシグナルの下に確認された（図６、上段）。一方で１０６希釈した環状化処理物の増幅産物では、合成不良のオリゴヌクレオチド由来と思われる弱いシグナルは確認出来なかった（図６、下段）。このことから、環状化産物を希釈して増幅に用いることで、合成不良のオリゴヌクレオチドを確率論的に排除出来ることが示された。
【0055】
（１本鎖化処理）
希釈した増幅産物２５μＬに対して、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）４．３μＬ、ＢｓａＩ ２μＬ、Ｑｕｉｃｋ ＣＩＰ（New England Biolabs）２μＬ、及び蒸留水１６．７μＬを加え、全量を５０μＬとした。その後、各チューブを３７℃で２時間処理した後、８０℃で２０分間処理して両酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。残りの切断溶液にさらに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）１μＬ、制限酵素ＢｂｓＩ（New England Biolabs）１μＬ、さらに蒸留水８μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で１時間処理した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。残りの切断溶液にさらに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）１μＬ、ラムダエクソヌクレアーゼ（New England Biolabs）１μＬ、さらに蒸留水８μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で３０分間処理した後、７５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。１本鎖化が行われたかどうかは、一部（約１０μＬ）を用いて常法のポリアクリルアミド電気泳動法を用いて確認した。その結果を図７に示す。
希釈した増幅産物２５μＬに対して、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）４．３μＬ、ＢｓａＩ ２μＬ、Ｑｕｉｃｋ ＣＩＰ（New England Biolabs）２μＬ、及び蒸留水１６．７μＬを加え、全量を５０μＬとした。その後、各チューブを３７℃で２時間処理した後、８０℃で２０分間処理して両酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。残りの切断溶液にさらに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）１μＬ、制限酵素ＢｂｓＩ（New England Biolabs）１μＬ、さらに蒸留水８μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で１時間処理した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。残りの切断溶液にさらに１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）１μＬ、ラムダエクソヌクレアーゼ（New England Biolabs）１μＬ、さらに蒸留水８μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で３０分間処理した後、７５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。１本鎖化が行われたかどうかは、一部（約１０μＬ）を用いて常法のポリアクリルアミド電気泳動法を用いて確認した。その結果を図７に示す。
【0056】
図７において、レーンＧ１、レーンＧ２、レーンＧ３、レーンＧ４はそれぞれＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４のライゲーション及び環状化処理物であり、そのうちｄｓは２本鎖ＤＮＡであり、ｓｓは１本鎖ＤＮＡであり、レーンＭはマーカーである。図７に示すように、全てのレーンで各鋳型オリゴヌクレオチドの組み合わせ中の５種類の鋳型オリゴヌクレオチドが接続された３００ｂｐの２本鎖ＤＮＡが移動度の異なる１本鎖ＤＮＡ生成物の存在が認められた。
【0057】
（１本鎖ＤＮＡの精製）
１本鎖ＤＮＡのみを回収するためにＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（New England Biolabs）を用いて、以下の精製を行った。まず、上記エクソヌクレアーゼ処理後の各チューブに対して、上記キットのＤＮＡクリーンアップバインディングバッファーを７倍量の３５０μＬ加え、ピペッティングで混合した。その後、上記キットのカラムを挿入したチューブを準備し、当該カラム上に上記混合液を移し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを通過した液体を除去し、上記キットのＤＮＡウォッシュバッファー２００μＬをカラム上に注入し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを通過した液体を除去し、再度ＤＮＡウォッシュバッファー２００μＬをカラム上に注入し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを別のチューブ内に移し、上記キットのＤＮＡ溶出バッファー１２μＬをカラム上に注入し、室温で１分間静置した後、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。これにより、２００塩基未満のヌクレオチドが除去され、２００塩基以上の１本鎖ＤＮＡのみが得られた。回収した１本鎖ＤＮＡ濃度は、Qubit（登録商標）ssDNAアッセイキット（インビトロジェン）を用いて決定し、重量濃度（ｎｇ）からモル濃度に計算で変換した。
１本鎖ＤＮＡのみを回収するためにＭｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（New England Biolabs）を用いて、以下の精製を行った。まず、上記エクソヌクレアーゼ処理後の各チューブに対して、上記キットのＤＮＡクリーンアップバインディングバッファーを７倍量の３５０μＬ加え、ピペッティングで混合した。その後、上記キットのカラムを挿入したチューブを準備し、当該カラム上に上記混合液を移し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを通過した液体を除去し、上記キットのＤＮＡウォッシュバッファー２００μＬをカラム上に注入し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを通過した液体を除去し、再度ＤＮＡウォッシュバッファー２００μＬをカラム上に注入し、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。その後、カラムを別のチューブ内に移し、上記キットのＤＮＡ溶出バッファー１２μＬをカラム上に注入し、室温で１分間静置した後、１６０００×ｇで１分間遠心処理を行った。これにより、２００塩基未満のヌクレオチドが除去され、２００塩基以上の１本鎖ＤＮＡのみが得られた。回収した１本鎖ＤＮＡ濃度は、Qubit（登録商標）ssDNAアッセイキット（インビトロジェン）を用いて決定し、重量濃度（ｎｇ）からモル濃度に計算で変換した。
【0058】
＜２回目の環状化及び増幅＞
（鋳型１本鎖ＤＮＡのリン酸化）
回収されたＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４の１本鎖ＤＮＡは決定された濃度から、それぞれ濃度が５μＭ（５ｐｍｏｌ／μＬ）になるように液量を計算した後混合物（組み合わせ名称、 For 1.2 k）を作成し、そのうちの１０μＬに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８），１００ｍＭ酢酸マグネシウムを加え、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン）、１０ｍＭのＡＴＰを５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５ μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を２μＬ、２７．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、１本鎖ＤＮＡの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
（鋳型１本鎖ＤＮＡのリン酸化）
回収されたＭｔｈＬ＿１、ＭｔｈＬ＿２、ＭｔｈＬ＿３、ＭｔｈＬ＿４の１本鎖ＤＮＡは決定された濃度から、それぞれ濃度が５μＭ（５ｐｍｏｌ／μＬ）になるように液量を計算した後混合物（組み合わせ名称、 For 1.2 k）を作成し、そのうちの１０μＬに対して１０×リン酸化バッファー(２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８），１００ｍＭ酢酸マグネシウムを加え、１ｍｇウシ血清由来のアルブミン）、１０ｍＭのＡＴＰを５μＬずつと、１００ｍＭのＤＴＴを０．５ μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を２μＬ、２７．５μＬの蒸留水を加えて総量５０μＬとした。それらの混合液を３７℃で３０分間処理してオリゴヌクレオチドのリン酸化反応をした後に、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。この反応の結果、１本鎖ＤＮＡの濃度は１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）となった。
【0059】
上記リン酸化処理の後、１本鎖ＤＮＡとスプリントオリゴヌクレオチド（B for 1.2k）をアニーリングするために以下の処理を行った。上記リン酸化１本鎖ＤＮＡ（濃度１μＭ（１ｐｍｏｌ／μＬ）４．５μＬを取り出したチューブに１０×アニーリングバッファー（２００ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．８），２Ｍグルタミン酸カリウム、１００ｍＭ酢酸マグネシウム，１ｍＭ ＮＡＤ、１００ｍＭ硫酸アンモニウム）を１μＬ分注した。さらに、チューブに１μＭのスプリントオリゴヌクレオチド混合液（B_for 1.2k）を４．５μＬずつ加えた。その後、各チューブを９５℃、で４分間加熱し、ゆっくりと温度を下げて１０℃にして１０分間維持し、鋳型１本鎖ＤＮＡとスプリントオリゴヌクレオチドとのアニーリング工程を完了した。
【0060】
（環状化と増幅、及び確認）
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（環状化1.2k）にアニーリングされた鋳型１本鎖ＤＮＡ同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後のチューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。ＭＰＲＣＡ法で増幅するために、この環状化反応液６μＬに対し５×ＲＡ ｂｕｆｆｅｒ(１５０ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、４０ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと１００μＭの６Ｒ５Ｓプライマー２μＬを加え、各チューブを９５℃で４分間加熱し、４℃に急冷した。チューブに、１０×ＲＣＡ ｂｕｆｆｅｒ(１００ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ２μＬと、１００ｍＭのＤＴＴ１μＬと、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ（１００ ｎｇ）と蒸留水３．９μＬを加え、３０℃で１６時間反応させて、増幅産物して環状化１本鎖ＤＮＡ配列がタンデムリピートの状態の２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。
続いて、スプリントオリゴヌクレオチド（環状化1.2k）にアニーリングされた鋳型１本鎖ＤＮＡ同士をライゲーションするために以下の処理を行った。上記処理後のチューブに１０×アニーリングバッファー１μＬずつを加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（Takara）１μＬずつ加え、さらに蒸留水を８μＬずつ加えた。その後、チューブを３７℃で３０分間処理してライゲーション反応をした後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。ＭＰＲＣＡ法で増幅するために、この環状化反応液６μＬに対し５×ＲＡ ｂｕｆｆｅｒ(１５０ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ 塩化カリウム、４０ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと１００μＭの６Ｒ５Ｓプライマー２μＬを加え、各チューブを９５℃で４分間加熱し、４℃に急冷した。チューブに、１０×ＲＣＡ ｂｕｆｆｅｒ(１００ｍＭ塩酸トリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭ塩化マグネシウム) ２μＬと、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ２μＬと、１００ｍＭのＤＴＴ１μＬと、ピロフォスファターゼ（New England Biolabs）０．１μＬ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ（１００ ｎｇ）と蒸留水３．９μＬを加え、３０℃で１６時間反応させて、増幅産物して環状化１本鎖ＤＮＡ配列がタンデムリピートの状態の２本鎖ＤＮＡを得た。反応後、６５℃で１０分間処理して酵素を失活させ、１２℃に冷却した。
【0061】
ＭＰＲＣＡ法による増幅をした後に、増幅産物は蒸留水１８０μＬを加えて粘度を低下させた後、２５μＬを取り出して別チューブに移し、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（New England Biolabs）５μＬ、制限酵素ＢａｍＨＩ１（New England Biolabs）１μＬ、さらに蒸留水１９μＬを加え全量を５０μＬとし各チューブを３７℃で１時間処理した後、６５℃で２０分間処理して酵素を失活させ、その後に１２℃に冷却した。一部（約１０μＬ）を用いて、常法のアガロースゲル電気泳動法で切断の確認を行った。その結果を図８に示す。
【0062】
図８において、レーン１は上記結果物であり、レーンＭはマーカーである。図８に示すように、約１２００ｂｐの位置にバンドが認められ、すなわちこの結果から上記方法により４種の３００ｂｐのオリゴヌクレオチドが結合したＤＮＡが得られたといえる。
【0063】
次に、上記図８の試験により得られた１．２ｋｂのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。まず、Ｍｔｈ ｆｏｒ ｐＧＥＸ２中の開始コドンからＴ１０８中の終始コドンまでの約１．１ｋｂ、及び当該開始コドンから約１７０ｂｐ内側から終始コドンまでの約９７０ｂｐを通常のＰＣＲ法で増幅し、その結果物に対してアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図９のＡに示す。
【0064】
図９のＡにおいて、レーン１は開始コドンから終始コドンまでを増幅したＰＣＲ産物であり、レーン２は開始コドンから約１７０ｂｐ内側から終始コドンまでを増幅したＰＣＲ産物であり、レーンＭはマーカーであり、上側の矢印は１．１ｋｂの位置を示し、下側の矢印は約９７０ｂｐの位置を示す。図９のＡに示すように、いずれのＰＣＲ産物も目的の長さ（１．１ｋｂ、９７０ｂｐ）よりも短いことが明らかである。なお、図示はしないが、これらのＰＣＲ産物のシークエンスの結果、約５６０ｂｐの欠損が確認された（開始コドンから２５２ｂｐ目から８５３ｂｐ目まで）。
【0065】
この欠損部分はＭｔｈＬ＿３及びＭｔｈＬ＿４の領域であるため、次に、特にＭｔｈＬ＿３の領域を増幅できるように、この領域の上流２か所及び下流２か所にプライマーを設計し、計４種類のＰＣＲを行った。なお、それぞれの予想サイズは、３９７ｂｐ、５８５ｂｐ、４８２ｂｐ及び５００ｂｐとなるように設計した。これらのＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動を行った結果を図９のＢに示す。
【0066】
図９のＢにおいて、レーン１は予想サイズが３９７ｂｐのＰＣＲ産物、レーン２は予想サイズが５８５ｂｐのＰＣＲ産物、レーン３は予想サイズが４８２ｂｐのＰＣＲ産物、レーン４は予想サイズが５００ｂｐのＰＣＲ産物、レーンＭはマーカーである。図９のＢに示すように、いずれのＰＣＲ産物も目的の長さよりも短いことが明らかとなった。
【0067】
図２～図７の結果から、本発明に係る方法によると所望の配列（鋳型オリゴヌクレオチド）同士を互いにスプリントオリゴヌクレオチドを介してライゲーション及び２本鎖ＤＮＡの増幅をすることができ、さらに、図８の結果から、それらの工程により得られた生成物同士をさらにライゲーション及び２本鎖ＤＮＡの増幅を繰り返すことにより長鎖ＤＮＡを合成することが可能となることが証明された。一方、図９に示すように、本発明に係る方法により得られた１．２ｋｂのＤＮＡはＰＣＲ法により増幅することはできず、すなわち、従来のＰＣＡ法では合成できない可能性が高いことが明らかとなった。
【0068】
以上の通り、本発明に係る方法は、長鎖ＤＮＡを合成することが可能であり、特に塩基の変異導入リスクが無いライゲーション反応によって得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成するため、従来のＰＣＲ法を利用した方法のように得られた合成ＤＮＡの配列の確認作業としてのクローニング工程やシークエンス工程を不要とすることができる。その結果、合成時間を短縮でき、合成コストも低減することができて極めて有用であるといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】