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特開2022-180851プライマーセット、リアルタイムＰＣＲ用プローブ、及びリアルタイムＰＣＲ用キット、並びにそれらの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022180851
(43)【公開日】2022-12-07
(54)【発明の名称】プライマーセット、リアルタイムＰＣＲ用プローブ、及びリアルタイムＰＣＲ用キット、並びにそれらの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20221130BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20221130BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221130BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221130BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20221130BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12N15/53
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021087573
(22)【出願日】2021-05-25
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100196405
【弁理士】
【氏名又は名称】小松 邦光
(72)【発明者】
【氏名】芝池 博幸
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 健二
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】本発明は、効率的にカワヒバリガイの存在を検出する方法を提供することを目的としている。
【解決手段】本発明のプライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを含んでいる。また、本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブは、配列番号３で示される塩基配列を含みかつ前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含んでいる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明のプライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを含んでいる。また、本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブは、配列番号３で示される塩基配列を含みかつ前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含んでいる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット。
【請求項2】
カワヒバリガイのシトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項3】
配列番号３で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブと組み合わせて使用するための、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項4】
配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
【請求項5】
カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、請求項４に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
【請求項6】
配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むフォワードプライマーと組み合わせて使用するための、請求項４又は５に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、リアルタイムＰＣＲ用キット。
【請求項8】
請求項４～６のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに含む、請求項７に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
【請求項9】
カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、請求項７又は８に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
【請求項10】
カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含む、方法。
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含む、方法。
【請求項11】
前記増幅工程において、請求項４～６のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記検出工程が、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量する工程を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記試料が、環境サンプルである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程を含む、方法。
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程を含む、方法。
【請求項15】
前記増幅工程において、請求項４～６のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プライマーセット、リアルタイムＰＣＲ用プローブ、及びリアルタイムＰＣＲ用キット、並びにそれらの用途、特にそれらを用いてカワヒバリガイ（Ｌｉｍｎｏｐｅｒｎａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ）のシトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
カワヒバリガイは、中国及び韓国原産の小さな淡水二枚貝種であるが、日本を含むアジア諸国や南アメリカに分布を広げている侵略的外来種である。日本では外来生物法により特定外来生物に指定されており、水利施設における通水障害の原因となっている。一般に外来種対策は、根絶可能性や費用対効果の観点から侵入の初期段階に実施することが望ましいとされている。しかし、現地で目視によりカワヒバリガイを探索したり、顕微鏡下で幼生を同定・計数する従来の調査手法は、調査に要する時間と労力が大きい上に検出感度が低く、侵入後かなりの時間が経過してから生息が確認される場合が多かった。
【0003】
そこで、カワヒバリガイを効率的に検出する方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、カワヒバリガイの幼生を採集し、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に特異的なプライマーを用いて、通常のＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法により当該幼生の存在を検出する方法が記載されている。また、非特許文献１～３には、採水した環境サンプル中の環境ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）を解析対象とし、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に特異的なプライマーを用いて、通常のＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法によりカワヒバリガイの存在を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１０－１３０９７７号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Pie, M., et al., Anais da Academia Brasileira de Ciencias (2017) 89(2): 1041-1045
【非特許文献2】Xia, A., et al., Ecology and Evolution (2018) 8: 11799-11807
【非特許文献3】Xia, A., et al., Biological Invasions (2018) 20: 437-447
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
カワヒバリガイの検出感度の向上と調査にかかる労力の軽減は依然として求められている。本発明は、効率的にカワヒバリガイの存在を検出する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のプライマーセット又は特定のプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、カワヒバリガイの存在を特異的にかつ高感度で検出できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示すプライマーセット、リアルタイムＰＣＲ用プローブ、及びリアルタイムＰＣＲ用キット、並びに、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出する方法、及びカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する方法を提供するものである。
〔１〕配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット。
〔２〕カワヒバリガイのシトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔１〕に記載のプライマーセット。
〔３〕配列番号３で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブと組み合わせて使用するための、前記〔１〕又は〔２〕に記載のプライマーセット。
〔４〕配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔５〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔４〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔６〕配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むフォワードプライマーと組み合わせて使用するための、前記〔４〕又は〔５〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔７〕前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、リアルタイムＰＣＲ用キット。
〔８〕前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに含む、前記〔７〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
〔９〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔７〕又は〔８〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
〔１０〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含む、方法。
〔１１〕前記増幅工程において、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記検出工程が、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量する工程を含む、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記試料が、環境サンプルである、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程を含む、方法。
〔１５〕前記増幅工程において、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１〕配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセット。
〔２〕カワヒバリガイのシトクロームオキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＩ）遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔１〕に記載のプライマーセット。
〔３〕配列番号３で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブと組み合わせて使用するための、前記〔１〕又は〔２〕に記載のプライマーセット。
〔４〕配列番号３で示される塩基配列を含み、かつ、前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔５〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔４〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔６〕配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むフォワードプライマーと組み合わせて使用するための、前記〔４〕又は〔５〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブ。
〔７〕前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、リアルタイムＰＣＲ用キット。
〔８〕前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに含む、前記〔７〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
〔９〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するための、前記〔７〕又は〔８〕に記載のリアルタイムＰＣＲ用キット。
〔１０〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含む、方法。
〔１１〕前記増幅工程において、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記検出工程が、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量する工程を含む、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記試料が、環境サンプルである、前記〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する方法であって、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて増幅する工程を含む、方法。
〔１５〕前記増幅工程において、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載のリアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに使用する、前記〔１４〕に記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明のプライマーセットを用いることで、カワヒバリガイの存在を特異的にかつ高感度で検出することができ、ＣＯＩ遺伝子のコピー数の定量も可能となる。また、本発明のプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、カワヒバリガイの存在を特異的にかつ高感度で検出することができる。したがって、効率的な野外調査が可能となり、カワヒバリガイの侵入の早期発見及び早期駆除を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】９種の二枚貝のＣＯＩミトコンドリア遺伝子の部分配列の多重アライメント結果を示す。下線部は、それぞれ順にフォワードプライマー、プローブ、及びリバースプライマーの位置を示す。また、ハイフンは配列ギャップを示し、アスタリスクは共通配列を示す。
【図2】本発明のプライマーセットを使用したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動結果を示す。Ｍ：１００ｂｐＤＮＡラダー（太いバインドは５００ｂｐ）、レーン１：タイワンシジミ、レーン２：マガキ、レーン３：ムラサキイガイ、レーン４：ドリイガイ、レーン５：コウロエンカワヒバリガイ、レーン６及び７：カワヒバリガイ（別個のＰＣＲ由来の産物）。
【図3】テンプレートとして使用した標準プラスミド（白丸）のＣＯＩ遺伝子のコピー数及びＣｔ値に基づく検量線を示す。黒丸はスタンダードＤＮＡのＣｔ値に基づく検量線上のプロットである。
【図4】カワヒバリガイを１個体（▲）又は５個体（○）含む水槽において時間に応じて変化するｅＤＮＡの濃度を示す。
【図5】野外調査を行って水を採取した日本国茨城県つくば市の１５か所の貯水池の位置を示す。
【図6】野外調査における幼生密度とｅＤＮＡ濃度との関係を示す（スピアマンの順位相関、ｐ＜０．００５）。
【図7】本発明のプライマーセット及びプローブを使用したリアルタイムＰＣＲによりｅＤＮＡが検出された貯水池の中で、従来の方法によりカワヒバリガイが検出された又は検出されなかった貯水池におけるｅＤＮＡ濃度の箱ひげ図を示す（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０５）。箱内の水平線はメジアンを示し、箱は第一四分位数及び第二四分位数を示す。上及び下に伸びる垂直線は、それぞれ最大値及び最小値を表す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のプライマーセットは、塩基配列５’－ＣＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡ－３’（配列番号１）を含むオリゴヌクレオチドと、塩基配列５’－ＡＡＣＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣ－３’（配列番号２）を含むオリゴヌクレオチドとを含んでいる。前記プライマーセットは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に特異的であり（図１）、ＰＣＲ法により当該遺伝子の７４ｂｐフラグメントを増幅することができる。各オリゴヌクレオチドは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の断片を増幅することができる限り、その末端において１又は数個の塩基が欠失又は付加されたものであってもいいが、好ましくは、前記プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを含んでいる。
本発明のプライマーセットは、塩基配列５’－ＣＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡ－３’（配列番号１）を含むオリゴヌクレオチドと、塩基配列５’－ＡＡＣＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＣ－３’（配列番号２）を含むオリゴヌクレオチドとを含んでいる。前記プライマーセットは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に特異的であり（図１）、ＰＣＲ法により当該遺伝子の７４ｂｐフラグメントを増幅することができる。各オリゴヌクレオチドは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の断片を増幅することができる限り、その末端において１又は数個の塩基が欠失又は付加されたものであってもいいが、好ましくは、前記プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを含んでいる。
【0011】
本発明のプライマーセットによるＰＣＲのテンプレートとなるＤＮＡは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を含んでいる限り特に制限されず、カワヒバリガイの生活史の各段階のいずれに由来するものでもよく、カワヒバリガイの個体を直接は含まない環境サンプル中のｅＤＮＡであってもよい。なお、水や土壌などの環境サンプルには、そこに生息する生物から放出された体液、代謝物、及び糞便などが含まれており、それらに由来するＤＮＡをｅＤＮＡと呼んでいる。環境サンプル中においては様々な種類の生物に由来するｅＤＮＡが混在しており、ｅＤＮＡは環境要因によって容易に分解され得るものであるが、本発明のプライマーセットを用いれば、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に特徴的な比較的短い領域を選択的に増幅できるため、カワヒバリガイの存在を高感度に検出することができる。
【0012】
本発明のプライマーセットは、通常のＰＣＲ法だけでなくリアルタイムＰＣＲ法に使用することもできる。リアルタイムＰＣＲ法においては、当技術分野で通常用いられる検出法を特に制限されることなく採用することができ、例えば、インターカレーター法又はハイブリダイゼーション法などによってカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を検出してもよい。ハイブリダイゼーション法で用いられるプローブは、特に制限されないが、例えば、塩基配列５’－ＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＣ－３’（配列番号３）を含むオリゴヌクレオチドを含むリアルタイムＰＣＲ用プローブであってもよい。
【0013】
別の態様では、本発明は、リアルタイムＰＣＲ用プローブにも関しており、当該プローブは、配列番号３で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備えるオリゴヌクレオチドを含んでいる。前記蛍光物質としては、リアルタイムＰＣＲ法におけるレポーターとして通常用いられるものを特に制限されることなく採用することができるが、例えば、前記蛍光物質は、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＮＥＤ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃｙ３、及びＣｙ５などであってもよい。また、前記クエンチャー物質は、前記蛍光物質の蛍光を消失させることができる限り特に制限されず、例えば、ＴＡＭＲＡなどの蛍光を有するクエンチャーであってもいいし、ＢＨＱ（ＢＨＱ－１～３）、ＮＦＱ、ＱＳＹ、及びＥｃｌｉｐｓｅなどの非蛍光クエンチャーであってもよい。ある態様では、前記リアルタイムＰＣＲ用プローブのオリゴヌクレオチドは、Ｔｍを高くするためのマイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）をさらに備えており、好ましくは、前記非蛍光クエンチャーと組み合わせてＭＧＢを備えている。前記リアルタイムＰＣＲ用プローブのオリゴヌクレオチドは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子に結合することができる限り、その末端において１又は数個の塩基が欠失又は付加されたものであってもいいが、好ましくは、当該オリゴヌクレオチドは、配列番号３で示される塩基配列からなっている。
【0014】
本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するために用いられるものである。ある態様では、前記リアルタイムＰＣＲ用プローブは、配列番号１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むフォワードプライマーと組み合わせて使用される。前記リアルタイムＰＣＲ用プローブは、前記フォワードプライマーに近い位置に設計されているため、当該フォワードプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲにおいて、より特異的にシグナルを発することができる。
【0015】
また別の態様では、本発明は、前記プライマーセットを含むリアルタイムＰＣＲ用キットにも関している。このリアルタイムＰＣＲ用キットは、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出するために用いられるものである。リアルタイムＰＣＲ法においては、当技術分野で通常用いられる検出法を特に制限されることなく採用することができ、例えば、インターカレーター法又はハイブリダイゼーション法などによってカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を検出してもよい。ある態様では、前記リアルタイムＰＣＲ用キットは、前記リアルタイムＰＣＲ用プローブをさらに含んでいる。
【0016】
本発明のリアルタイムＰＣＲ用キットは、本発明の目的を損なわない限り、当技術分野で通常用いられる任意の試薬をさらに含んでもよい。前記任意の試薬は、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＭｇＣｌ2、又はそれらの混合液などであってもよい。
【0017】
さらに別の態様では、本発明は、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子をリアルタイムＰＣＲ法で検出する方法にも関しており、
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記プライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含んでいる。ある態様では、前記検出工程は、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する工程を含む。
試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記プライマーセットを用いて増幅する工程と、
増幅したＤＮＡを検出する工程と
を含んでいる。ある態様では、前記検出工程は、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する工程を含む。
【0018】
さらなる態様では、本発明は、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を定量する方法にも関しており、試料中のカワヒバリガイ由来のＤＮＡを、前記プライマーセットを用いて増幅する工程を含んでいる。前記定量方法においては、標準テンプレートを増幅して得られたＤＮＡの量と、前記試料に由来する増幅したＤＮＡの量とを比較し、検量線を用いるなどして、カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量することができる。前記定量方法で採用される定量手段としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動によるバンド強度の分析や、リアルタイムＰＣＲ法による分析を採用してもよい。
【0019】
本発明の検出方法又は定量方法で行われるリアルタイムＰＣＲ法においては、当技術分野で通常用いられる検出法を特に制限されることなく採用することができ、例えば、インターカレーター法又はハイブリダイゼーション法などによってカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子を検出してもよい。ある態様では、前記増幅工程において、前記リアルタイムＰＣＲ用プローブがさらに使用され、当該プローブによってカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子が検出される。
【0020】
ある態様では、前記試料は環境サンプルであり、その中に含まれるｅＤＮＡがＰＣＲ法のテンプレートＤＮＡとなる。環境サンプルからｅＤＮＡを抽出する方法は、特に制限されず、例えば、環境サンプルが水である場合、それをガラス繊維フィルターなどのフィルターで濾して、細胞や組織などからのＤＮＡ抽出に用いられる通常の方法を用いればよい。
【0021】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例0022】
１．プライマーセット及びリアルタイムＰＣＲ用プローブの設計
種特異的なプライマーセット及びリアルタイムＰＣＲ用プローブを設計するために、タイワンシジミ（Ｃｏｒｂｉｃｕｌａ ｆｌｕｍｉｎａｅ）、ヤマトシジミ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、イワガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｎｉｐｐｏｎａ）、カワヒバリガイ、ホトトギスガイ（Ｍｕｓｃｕｌｉｓｔａ ｓｅｎｈｏｕｓｉａ）、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）、キタノムラサキイガイ（Ｍ．ｔｒｏｓｓｕｌｕｓ）、ミドリイガイ（Ｐｅｒｎａ ｖｉｒｉｄｉｓ）、及びコウロエンカワヒバリガイ（Ｘｅｎｏｓｔｒｏｂｕｓ ｓｅｃｕｒｉｓ）の９種の二枚貝のＣＯＩミトコンドリア遺伝子（それぞれアクセション番号ＡＢ４９８０１７、ＡＢ４９８０１８、ＡＦ３００６１６、ＡＢ４９８０１１、ＡＢ４９８０１３、ＡＢ４９８０１４、ＡＢ４９８０１６、ＡＢ４９８０１５、及びＡＢ４９８０１２）の部分配列を、生命情報・ＤＤＢＪセンターから取得した。これらの配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗで整列させてカワヒバリガイの配列に特徴的な領域を見出し、かつ、水界生態系ではＤＮＡは分解されやすいことを考慮して可能な限り短いフラグメント長となるような領域を検討するなどして、本発明のプライマーセット及びリアルタイムＰＣＲ用プローブを設計した。カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の７４ｂｐフラグメントを増幅するプライマー及びそれらと組み合わせて使用するリアルタイムＰＣＲ用プローブの配列を表１に示し、それらが設計された位置を図１に示す。
種特異的なプライマーセット及びリアルタイムＰＣＲ用プローブを設計するために、タイワンシジミ（Ｃｏｒｂｉｃｕｌａ ｆｌｕｍｉｎａｅ）、ヤマトシジミ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、イワガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｎｉｐｐｏｎａ）、カワヒバリガイ、ホトトギスガイ（Ｍｕｓｃｕｌｉｓｔａ ｓｅｎｈｏｕｓｉａ）、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）、キタノムラサキイガイ（Ｍ．ｔｒｏｓｓｕｌｕｓ）、ミドリイガイ（Ｐｅｒｎａ ｖｉｒｉｄｉｓ）、及びコウロエンカワヒバリガイ（Ｘｅｎｏｓｔｒｏｂｕｓ ｓｅｃｕｒｉｓ）の９種の二枚貝のＣＯＩミトコンドリア遺伝子（それぞれアクセション番号ＡＢ４９８０１７、ＡＢ４９８０１８、ＡＦ３００６１６、ＡＢ４９８０１１、ＡＢ４９８０１３、ＡＢ４９８０１４、ＡＢ４９８０１６、ＡＢ４９８０１５、及びＡＢ４９８０１２）の部分配列を、生命情報・ＤＤＢＪセンターから取得した。これらの配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗで整列させてカワヒバリガイの配列に特徴的な領域を見出し、かつ、水界生態系ではＤＮＡは分解されやすいことを考慮して可能な限り短いフラグメント長となるような領域を検討するなどして、本発明のプライマーセット及びリアルタイムＰＣＲ用プローブを設計した。カワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の７４ｂｐフラグメントを増幅するプライマー及びそれらと組み合わせて使用するリアルタイムＰＣＲ用プローブの配列を表１に示し、それらが設計された位置を図１に示す。
【0023】
【表1】
【0024】
２．種特異性の確認
項目１で設計した本発明のプライマーセットの種特異性を確認するために、タイワンシジミ、マガキ、ムラサキイガイ、ミドリイガイ、コウロエンカワヒバリガイ、及びカワヒバリガイの筋肉組織からＤＮＡを抽出し、表２に記載の条件でＰＣＲを行った。そして、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
項目１で設計した本発明のプライマーセットの種特異性を確認するために、タイワンシジミ、マガキ、ムラサキイガイ、ミドリイガイ、コウロエンカワヒバリガイ、及びカワヒバリガイの筋肉組織からＤＮＡを抽出し、表２に記載の条件でＰＣＲを行った。そして、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
【0025】
【表2】
【0026】
結果を図２に示す。本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、カワヒバリガイ由来のＤＮＡ（レーン６及び７）は増幅されたが、その他の二枚貝由来のＤＮＡは増幅されなかった（レーン１～５）。したがって、本発明のプライマーセットは、カワヒバリガイ由来のＤＮＡだけを特異的に増幅できると考えられる。
【0027】
３．ＣＯＩ遺伝子の定量
項目１で設計したプローブ用の配列の５’末端に６－ＦＡＭレポーター色素を結合し、３’末端にクエンチャーとしてＭＧＢ－ＮＦＱを結合して、本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブを調製した。そして、項目２のＰＣＲ産物、すなわちカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の部分配列である７４ｂｐのＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、常法によってプラスミドにクローニングした。精製したプラスミドのＤＮＡ配列をシーケンサーで確認して、検量線作成用の標準プラスミドを調製した。また、カワヒバリガイの組織からスタンダードＤＮＡを調製した。標準プラスミドの希釈系列（１０1～１０6個／反応）又はスタンダードＤＮＡ（１０2～１０-4ｎｇ／μＬ）の希釈系列をテンプレートＤＮＡとして使用し、表３の条件でＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓTMリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムス社）により定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、シグナルが閾値を超えたときのサイクル数（Ｃｔ値）を記録した。
項目１で設計したプローブ用の配列の５’末端に６－ＦＡＭレポーター色素を結合し、３’末端にクエンチャーとしてＭＧＢ－ＮＦＱを結合して、本発明のリアルタイムＰＣＲ用プローブを調製した。そして、項目２のＰＣＲ産物、すなわちカワヒバリガイのＣＯＩ遺伝子の部分配列である７４ｂｐのＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、常法によってプラスミドにクローニングした。精製したプラスミドのＤＮＡ配列をシーケンサーで確認して、検量線作成用の標準プラスミドを調製した。また、カワヒバリガイの組織からスタンダードＤＮＡを調製した。標準プラスミドの希釈系列（１０1～１０6個／反応）又はスタンダードＤＮＡ（１０2～１０-4ｎｇ／μＬ）の希釈系列をテンプレートＤＮＡとして使用し、表３の条件でＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓTMリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムス社）により定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、シグナルが閾値を超えたときのサイクル数（Ｃｔ値）を記録した。
【0028】
【表3】
【0029】
テンプレートとして使用した標準プラスミド（白丸）の１反応あたりの個数（ＣＯＩ遺伝子のコピー数）及びＣｔ値をプロットして検量線（ｙ＝－３．２５・ｌｏｇ10ｘ＋４０．５９、Ｒ2＝０．９８８）を作成した。結果を図３に示す。この検量線を利用して、スタンダードＤＮＡ（黒丸）中のＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量することができた。本発明のプライマーセット及びプローブを用いれば、１００ｆｇ／ＬしかＤＮＡが含まれていない試料においても、カワヒバリガイ由来のＣＯＩ遺伝子のコピー数を定量することができる。
【0030】
４．水槽実験
霞ヶ浦から採取したカワヒバリガイを常法により５日間飼育して順応させた後、１個体又は５個体ずつそれぞれ３つの実験用水槽に入れて飼育した。ブランクとしてはカワヒバリガイを含まない水槽を用意した。実験用水槽には９Ｌの蒸留水が入れられており、カワヒバリガイの平均湿重量は、水槽あたりそれぞれ１．４６±０．５３ｇ及び６．８７±０．３４ｇ（平均±ＳＤ）だった。各水槽から、０、２、１２、２４、及び４８時間後に、ｅＤＮＡを含む２５０ｍＬの水を採取した。フィルターフォルダー（ステリフィルフォルダー、ＥＭＤミリポア社）にガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｆ、ＧＥヘルスケア社）をセットし、真空ポンプを用いて採取した水を濾過した。試料を含むフィルターディスクをピンセットで取り出し、アルミホイルで包んで、次に使用するまで－２３℃で保管した。当該フィルターディスクから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて常法によりＤＮＡを抽出し、項目３に記載の方法に従ってｑＰＣＲを行った。統計解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．４．０（Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて一般化線形混合モデル（ＧＬＭＭ）により行った。
霞ヶ浦から採取したカワヒバリガイを常法により５日間飼育して順応させた後、１個体又は５個体ずつそれぞれ３つの実験用水槽に入れて飼育した。ブランクとしてはカワヒバリガイを含まない水槽を用意した。実験用水槽には９Ｌの蒸留水が入れられており、カワヒバリガイの平均湿重量は、水槽あたりそれぞれ１．４６±０．５３ｇ及び６．８７±０．３４ｇ（平均±ＳＤ）だった。各水槽から、０、２、１２、２４、及び４８時間後に、ｅＤＮＡを含む２５０ｍＬの水を採取した。フィルターフォルダー（ステリフィルフォルダー、ＥＭＤミリポア社）にガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｆ、ＧＥヘルスケア社）をセットし、真空ポンプを用いて採取した水を濾過した。試料を含むフィルターディスクをピンセットで取り出し、アルミホイルで包んで、次に使用するまで－２３℃で保管した。当該フィルターディスクから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて常法によりＤＮＡを抽出し、項目３に記載の方法に従ってｑＰＣＲを行った。統計解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．４．０（Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて一般化線形混合モデル（ＧＬＭＭ）により行った。
【0031】
結果を図４に示す。水槽にカワヒバリガイを移してから２時間でｅＤＮＡ濃度の上昇が検出された。また、５個体を含む水槽のｅＤＮＡ濃度は、１個体を含む水槽のｅＤＮＡ濃度よりも有意に高かった（ＧＬＭＭ、ｐ＝０．０００２１２）。対照の水槽及びカワヒバリガイを入れる前の水槽においては、リアルタイムＰＣＲ法によるポジティブなシグナルは検出されなかった。
【0032】
５．野外調査
２０１７年の８月から９月にかけて、日本の茨城県つくば市にある１５の農業用貯水池（図５）において、目視調査、幼生採集、及びｅＤＮＡ法によりカワヒバリガイの野外調査を行った。これらの貯水池は、霞ヶ浦と通じている桜川の下流領域から取水しているが、霞ヶ浦においては２００５年からカワヒバリガイが見つかっており、桜川の取水口にもカワヒバリガイが生息している。このため、いずれの貯水池においても、カワヒバリガイが検出される可能性がある。
２０１７年の８月から９月にかけて、日本の茨城県つくば市にある１５の農業用貯水池（図５）において、目視調査、幼生採集、及びｅＤＮＡ法によりカワヒバリガイの野外調査を行った。これらの貯水池は、霞ヶ浦と通じている桜川の下流領域から取水しているが、霞ヶ浦においては２００５年からカワヒバリガイが見つかっており、桜川の取水口にもカワヒバリガイが生息している。このため、いずれの貯水池においても、カワヒバリガイが検出される可能性がある。
【0033】
具体的には、貯水池の岸からハンドネットを用いて１０分間目視で探索し、カワヒバリガイの存在又は不存在を決定した。また、自由遊泳性のカワヒバリガイ幼生の密度を把握するため、各サンプリング場所において、プランクトンネット（直径２０ｃｍ、メッシュサイズ７２μｍ、離合社）を使って試料を採集した。底から表層に向けて（深さに応じて）プランクトンネットを数回垂直に引き上げて、およそ１００～２００Ｌの水を濾した。採集した試料は８０％エタノールで保存した。そして、実験室においてＤ型幼生の数を双眼顕微鏡下で数えて、幼生密度を計算した。
【0034】
さらに、１Ｌの表層水を岸から手を伸ばして瓶に採取した。採取した水は保冷材で冷やして実験室に持ち帰り、項目４に記載の方法と同様にして、その日のうちにガラス繊維フィルターで濾過した。試料のコンタミネーションがないことを確認するために、蒸留水の試料とカワヒバリガイを含まない雨水タンクの試料という２種類の陰性対照群を準備した。そして、項目４に記載の方法と同様にしてＤＮＡを抽出し、項目３に記載の方法に従ってｑＰＣＲを行った。
【0035】
従来の調査手法（目視調査又は幼生採集）に基づいてカワヒバリガイを検出した貯水池の割合と、ｅＤＮＡの存在に基づいてカワヒバリガイを検出した貯水池の割合は、フィッシャーの正確確率検定により比較した。幼生密度とｅＤＮＡ濃度の間の相関は、スピアマンの順位相関により調べた。カワヒバリガイのｅＤＮＡが検出された貯水池の中で、従来の調査手法によりカワヒバリガイが見つかった貯水池及び見つからなかった貯水池のｅＤＮＡ濃度は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて比較した。これらの統計解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．４．０（Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて行った。
【0036】
結果を表４に示す。目視調査では、Ｐ１及びＰ２の場所でカワヒバリガイが検出され、幼生調査では、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ１０の場所でカワヒバリガイが検出された。すなわち、従来の調査手法では、１５か所の貯水池のうち５か所でカワヒバリガイが検出された。他方、本発明のプライマーセット及びプローブを使用してｑＰＣＲを行うと、従来の調査手法でカワヒバリガイが検出された５か所を含む９か所の貯水池でカワヒバリガイのｅＤＮＡを検出することができた。従来の調査手法又はｅＤＮＡの存在でカワヒバリガイが検出された貯水池の割合は、有意に異なっていた（フィッシャーの正確確率検定、ｐ＜０．０５、ｎ＝１５）。また、ｅＤＮＡ濃度と幼生濃度との間には有意な相関関係が見出された（スピアマンの順位相関、ｐ＜０．００５、図６）。そして、従来の調査手法ではカワヒバリガイが検出されなかった４か所の貯水池のｅＤＮＡ濃度は、従来の調査手法でカワヒバリガイが検出された５か所の貯水池のｅＤＮＡ濃度よりも有意に低かった（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０５、図７）。
【0037】
【表4】
【0038】
本発明のプライマーを用いてｅＤＮＡをｑＰＣＲにより検出する方法は、従来の調査手法と比較して安定的に高感度で結果を得ることができた。また、試料のサンプリングが簡便であり、野外調査に適していると考えられる。
【0039】
以上より、本発明のプライマーセットを用いることで、カワヒバリガイの存在を特異的にかつ高感度で検出することができ、ＣＯＩ遺伝子のコピー数の定量も可能となることが分かった。また、本発明のプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで、カワヒバリガイの存在を特異的にかつ高感度で検出することができることが分かった。したがって、効率的な野外調査が可能となり、カワヒバリガイの侵入の早期発見及び早期駆除を図ることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】