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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022182819
(43)【公開日】2022-12-08
(54)【発明の名称】ケラチノサイト分化誘導剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/661 20060101AFI20221201BHJP
A61K 8/55 20060101ALI20221201BHJP
A61Q 7/00 20060101ALI20221201BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20221201BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20221201BHJP
【ＦＩ】
A61K31/661
A61K8/55 ZNA
A61Q7/00
A23L33/10
A61P17/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021090560
(22)【出願日】2021-05-28
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ「画期的医薬品等の創出をめざす脂質の生理活性と機能の解明」研究開発領域」「脂質による体表面バリア形成の分子機構の解明」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】000002901
【氏名又は名称】株式会社ダイセル
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】向井 克之
(72)【発明者】
【氏名】五十嵐 靖之
(72)【発明者】
【氏名】湯山 耕平
(72)【発明者】
【氏名】門出 健次
(72)【発明者】
【氏名】村井 勇太
【テーマコード（参考）】
4B018
4C083
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE02
4B018MD07
4B018MD45
4B018ME14
4B018MF10
4C083AD571
4C083CC37
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA42
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA92
(57)【要約】 （修正有）
【課題】より効率的にケラチノサイト分化誘導が可能な有効成分を提供する。
【解決手段】スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤とする。好ましくは、スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が植物由来であり、より好ましくは、スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸である、ケラチノサイト分化誘導剤とする。
【選択図】なし
【解決手段】スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤とする。好ましくは、スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が植物由来であり、より好ましくは、スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸である、ケラチノサイト分化誘導剤とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項2】
前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が植物由来である、請求項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項3】
前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸である、請求項２に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項4】
前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が動物由来である、請求項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項5】
前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸である、請求項４に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項6】
医薬品である、請求項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項7】
飲食品である、請求項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【請求項8】
化粧品である、請求項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ケラチノサイト分化誘導剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトの皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織の三層から構成され、なかでも表皮は、皮膚の最外層に位置し、外界との境目になる器官であり、水分蒸散、微生物や物理化学的な刺激等から生体を防御するバリアとしての役割を果たしている。
【0003】
表皮は、内側から「基底層」、「有棘層」、「顆粒層」および「角質層（角層）」に分けられ、主にケラチノサイト（角化細胞）と呼ばれる細胞から構成されている。ケラチノサイトは、最下層の基底層では分裂能力を有する未熟な細胞として単層を形成し、分裂増殖して上層に押し上げられながらその過程で細胞分化（「角化」）を起こして、最終的に核のない死細胞である角質細胞となり、垢となって脱落していく。表皮では、このケラチノサイトの増殖、移動、分化、そして脱落の過程が一定の周期で生じて常に角質層が円滑にターンオーバーすることによって恒常性が保たれているが、例えば加齢や疾患等によって、ケラチノサイトの増殖や分化が抑制されると、皮膚の機能が十分果たせなくなる。このように、ケラチノサイトの分化促進は、皮膚の新陳代謝の促進、皮膚のバリア機能の維持、および皮膚の創傷の治癒において重要である。
【0004】
ケラチノサイトの分化を促進しうる薬剤について、これまでに種々研究されている。例えば、特許文献１には、プロラクチンが皮膚繊維芽細胞からのコラーゲン産生促進作用ならびに表皮ケラチノサイトの分化促進作用を有することが開示されている。また、特許文献２には、植物由来セラミドを有効成分とするケラチノサイト分化誘導剤が開示されており、具体的に、未分化ヒト正常表皮角化細胞（ケラチノサイト、ＮＨＥＫ）を培養した培地１ｍＬに５ｍＭのセラミド溶液を５μＬ加えた場合に、植物由来セラミドではケラチノサイト分化誘導能が認められ、動物由来セラミドではケラチノサイト分化誘導能が認められないことが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００９－１４９５５７号公報
【特許文献2】特開２０１８－１７７６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述のとおり植物由来セラミドにはケラチノサイト分化誘導剤の有効成分としての機能が認められるが、ケラチノサイト分化誘導能を発現させるには細胞実験でも２５μＭ程度が必要となる点で、効果発現の効率に改善の余地がある。
【0007】
本開示は、より効率的に（つまり、より少量で）ケラチノサイト分化誘導が可能な有効成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、鋭意検討の結果、植物性セラミドの代謝物である植物性スフィンゴイド塩基をリン酸化した構造とすることによって、植物性セラミドよりも１オーダー又は２オーダーもの少ない量であってもケラチノサイトの分化誘導が可能となることを予期せず見出した。さらに、ケラチノサイト分化誘導が無い動物性セラミドの代謝物である動物性スフィンゴイド塩基をリン酸化した構造とすることによって、少量であってもケラチノサイトの分化誘導能を発現することも予期せず見出した。本開示はこの知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
【0009】
即ち、本開示は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤。
項２． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が植物由来である、項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項３． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸である、項２に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項４． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が動物由来である、項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項５． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸である、項４に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項６． 医薬品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項７． 飲食品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項８． 化粧品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項１． スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤。
項２． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が植物由来である、項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項３． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸である、項２に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項４． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸のスフィンゴイド塩基が動物由来である、項１に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項５． 前記スフィンゴイド塩基－１－リン酸が、トランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸である、項４に記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項６． 医薬品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項７． 飲食品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
項８． 化粧品である、項１～５のいずれかに記載のケラチノサイト分化誘導剤。
【発明の効果】
【0010】
本開示によれば、より効率的にケラチノサイト分化誘導が可能な有効成分が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】動物型Ｓ１Ｐ及び植物型Ｓ１Ｐのケラチノサイト分化誘導効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本開示は、スフィンゴイド塩基－１－リン酸を含む、ケラチノサイト分化誘導剤である。以下、本開示のケラチノサイト分化誘導剤の実施形態について詳述する。
【0013】
有効成分
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基－１－リン酸は、セラミドの代謝物に相当するスフィンゴイド塩基の１位の炭素原子に結合した水酸基がリン酸化した構造を有する。スフィンゴイド塩基は、少なくとも１位と３位の炭素原子に水酸基が結合し且つ２位の炭素原子にアミノ基が結合した長鎖アミノアルコールである。スフィンゴイド塩基の炭素数としては特に限定されないが、例えば１２～２２、好ましくは１６～１９、より好ましくは１８が挙げられる。スフィンゴイド塩基としては、植物性セラミドの代謝物である植物性スフィンゴイド塩基であってもよいし、動物性セラミドの代謝物である動物性スフィンゴ塩基であってもよい。
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の有効成分であるスフィンゴイド塩基－１－リン酸は、セラミドの代謝物に相当するスフィンゴイド塩基の１位の炭素原子に結合した水酸基がリン酸化した構造を有する。スフィンゴイド塩基は、少なくとも１位と３位の炭素原子に水酸基が結合し且つ２位の炭素原子にアミノ基が結合した長鎖アミノアルコールである。スフィンゴイド塩基の炭素数としては特に限定されないが、例えば１２～２２、好ましくは１６～１９、より好ましくは１８が挙げられる。スフィンゴイド塩基としては、植物性セラミドの代謝物である植物性スフィンゴイド塩基であってもよいし、動物性セラミドの代謝物である動物性スフィンゴ塩基であってもよい。
【0014】
上記植物性セラミドの由来植物としては特に限定されず、例えば、コンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋、タロイモ等の芋類；コメ、コムギ等の穀類；アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、ゴマ、コマツナ、コリアンダー、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられ、ケラチノサイト分化誘導効果をより一層効率的に発現させる観点から、より好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類；コメ；コムギ、より好ましくは芋類、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。
【0015】
植物性セラミドの代謝物である植物由来のスフィンゴイド塩基の具体例としては特に限定されないが、通常、少なくとも８－９位炭素間結合が二重結合であるものが挙げられ、具体的には、４－ヒドロキシ－トランス－８－スフィンゲニン、４－ヒドロキシ－シス－８－スフィンゲニン、トランス－８－スフィンゲニン、シス－８－スフィンゲニン、トランス－４，トランス－８－スフィンガジエニン、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン、シス－８－スフィンゲニン等が挙げられる。これらの中でも、ケラチノサイト分化誘導効果をより一層効率的に発現させる観点から、より好ましくはトランス－４，シス－８－スフィンガジエニン、トランス４－トランス８－スフィンガジエニン、シス－８－スフィンゲニンが挙げられ、さらに好ましくはトランス－４，シス－８－スフィンガジエニンが挙げられる。
【0016】
すなわち、本開示の好ましい実施形態における有効成分の具体例としては、下記式（i）に示すトランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸、下記式（ii）に示すトランス４－トランス８－スフィンガジエニン－１－リン酸、下記式（iii）に示すシス－８－スフィンゲニン－１－リン酸が挙げられ、特に好ましくは下記式（i）に示すトランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸が挙げられる。
【0017】
【化1】
【0018】
上記動物性セラミドの由来動物としては特に限定されず、例えば、ウニ、ヒトデ、タコ、イカ等の棘皮動物及び軟体動物、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ等の哺乳動物等が挙げられる。
【0019】
動物性セラミドの代謝物である動物由来のスフィンゴイド塩基の具体例としては、通常、少なくとも４－５位炭素間結合が二重結合であるものが挙げられ、具体的には、スフィンゴシン（トランス－４－スフィンゲニン）が挙げられる。
【0020】
すなわち、本開示の好ましい実施形態における有効成分の別の具体例としては、下記式（iv）に示すトランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸が挙げられる。
【0021】
【化2】
【0022】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤において、有効成分は、スフィンゴイド塩基－１－リン酸のいずれか１種を単独で用いてもよいし、異なる２種以上を組み合わせて用いてもよい。ケラチノサイト分化誘導効果をより一層効率的に発現させる観点から、上記の有効成分の中でも、好ましくは植物由来のスフィンゴイド塩基－１－リン酸が挙げられる。
【0023】
スフィンゴイド塩基－１－リン酸の合成方法としては、スフィンゴ糖脂質を原料とする方法、及び長鎖エナールと４－カルボニルオキサゾリジン化合物とを原料とする方法等が挙げられる。
【0024】
スフィンゴイド塩基－１－リン酸の合成方法のうち、スフィンゴ糖脂質を原料とする方法の具体例としては、スフィンゴ糖脂質を加水分解に供し、糖及び脂肪酸を遊離させる工程、加水分解物からスフィンゴイド塩基を回収する工程、及びスフィンゴイド塩基をリン酸化する工程を含む方法が挙げられる。
【0025】
上記のスフィンゴイド糖脂質は、セラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質であり、糖としては、グルコース、ガラクトース、又は糖鎖等が挙げられる。この合成方法において、原料となるスフィンゴイド糖脂質としては、上記の植物又は動物から抽出して調製したものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。
【0026】
スフィンゴイド塩基－１－リン酸の合成方法のうち、長鎖エナールと４－カルボニルオキサゾリジン化合物とを原料とする方法の具体例としては、長鎖エナールと４－カルボニルオキサゾリジン化合物とをアルドール縮合してエノンを合成する工程と、エノンのカルボニル基を還元する工程と、オキサゾリジン環を開環して水酸基を生じさせる工程と、水酸基をリン酸化する工程とを含む。
【0027】
上記の長鎖エナールは、合成すべきスフィンゴイド塩基－１－リン酸の炭素数より３少ない炭素数のエナール（二重結合を有する長鎖アルデヒド）である。上記の４－カルボニルオキサゾリジン化合物は、オキサゾリジン環を基本骨格とし、オキサゾリジン環の２位の水素の少なくともいずれかがアルキル基で置換されていてもよく、３位にＮ－保護基を有し、α水素を有するカルボニル基が４位に結合している化合物である。上記保護基としては、アミノ窒素の保護基となりうる基であれば特に限定されず、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル基、２－（ｐ－ビフェニル）インプロピルオキシカルボニル基等が挙げられる。上記アルキル基としては、炭素数１～６、好ましくは１～５、より好ましくは１～４、さらに好ましくは１～３、一層好ましくは１～２のアルキル基が挙げられる。α水素を有するカルボニル基としては、例えば２－モノ－又はジーアルコキシホスホリルアセチル基、好ましくは２－ジアルコキシホスホリルアセチル基が挙げられる。当該アルコキシ基としては、炭素数１～６、好ましくは１～５、より好ましくは１～４、さらに好ましくは１～３、一層好ましくは１～２のアルコキシ基が挙げられる。
【0028】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤におけるスフィンゴイド塩基－１－リン酸の含有量としては、本開示の効果を奏する限りにおいて特に制限されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができる。
【0029】
添加成分
本開示のケラチノサイト分化誘導剤は、前述したスフィンゴイド塩基－１－リン酸以外に、本開示の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本開示のケラチノサイト分化誘導剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本開示のケラチノサイト分化誘導剤の剤型等に応じて適宜設定される。
本開示のケラチノサイト分化誘導剤は、前述したスフィンゴイド塩基－１－リン酸以外に、本開示の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本開示のケラチノサイト分化誘導剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本開示のケラチノサイト分化誘導剤の剤型等に応じて適宜設定される。
【0030】
剤型・製剤形態・用途
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の剤型については、特に制限されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、ケラチノサイト分化誘導剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の剤型については、特に制限されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、ケラチノサイト分化誘導剤の種類や用途に応じて適宜設定すればよい。
【0031】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の投与方法としては、特に制限されず、適用する疾患の種類等に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、経鼻投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易な点で、経皮投与、経口投与が好ましい。
【0032】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の製剤形態については、特に制限されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、噴霧剤、乳液剤、懸濁液剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本開示のケラチノサイト分化誘導剤の投与形態が経皮投与である場合は、経皮投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、化粧品、医薬品（外用医薬品）等の皮膚外用剤が挙げられる。
【0033】
例えば、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を化粧品として使用する場合、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に制限されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）などが挙げられる。
【0034】
また、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を医薬品（外用医薬品）に使用する場合、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を単独で、又は他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤や添加成分等と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような外用医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、乳液剤、懸濁液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤などの経皮投与製剤などが挙げられる。
【0035】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤が皮膚外用剤の製剤形態である場合、有効成分であるスフィンゴイド塩基－１－リン酸の含有量としては、ケラチノサイトの分化が誘導される限り特に制限されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１～９０質量％が挙げられ、好ましくは０．２～５０質量％、より好ましくは０．５～３０質量％が挙げられる。
【0036】
また、本開示のケラチノサイト分化誘導剤の製剤形態について、例えば、本開示のケラチノサイト分化誘導剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、飲食品及び医薬品（内服用医薬品）が挙げられる。
【0037】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤を飲食品として使用する場合、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤が挙げられる。
【0038】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤を医薬品（内服用医薬品）として使用する場合、本開示のケラチノサイト分化誘導剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用医薬品の中でも、好ましくはカプセル剤、更に好ましくはソフトカプセル剤が挙げられる。
【0039】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤が飲食品又は医薬品（内服用医薬品）の製剤形態である場合、有効成分であるスフィンゴイド塩基－１－リン酸の含有量としては、ケラチノサイトの分化が誘導される限り特に制限されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１～９０質量％が挙げられ、好ましくは０．２～５０質量％、より好ましくは０．５～３０質量％が挙げられる。
【0040】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤は、ケラチノサイトの分化誘導の用途に使用される。また、本開示のケラチノサイト分化誘導剤は、ケラチノサイトの分化を誘導することによって改善が見込まれる症状や疾患の治療又は予防目的で使用することができる。具体的には、本開示のケラチノサイト分化誘導剤は、皮膚の老化、シミ、シワ、たるみ、そばかす等の防止；乾癬、角化症、皮膚炎等の皮膚疾患の改善等に好適に適用することができる。
【0041】
本開示のケラチノサイト分化誘導剤の使用量については、特に制限されず、製剤形態、用途、投与対象等に応じて、ケラチノサイトの分化を誘導できる有効量を適宜設定すればよい。
【0042】
本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
【実施例0043】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
【0044】
［合成例］
本開示のスフィンゴイド塩基－１－リン酸を、以下のようにして合成した。
本開示のスフィンゴイド塩基－１－リン酸を、以下のようにして合成した。
【0045】
化合物（１）の合成
１００mLのナス型フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－４－（２－（ジメトキシホスホリル）アセチル）－２，２－ジメチルオキサゾリジン－３－カルボン酸エステル（９３０ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）及び（Ｚ）－ペンタデカ－５－エナール（４７６ｍｇ，２．１２ｍｍｏｌ）を１：１の体積比率のテトラヒドロフラン／水溶媒３０ｍＬに溶解させ、炭酸カリウム（１．８３ｇ，１３．２５ｍｍｏｌ）を加えて、反応温度を４０℃に上げ、１２時間反応させた。反応後、溶媒をエバポレータで除去し、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積比１０：１）で精製することで、化合物（１）（８１０ｍｇ，収率８７％）を無色油状で得た。
１００mLのナス型フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－４－（２－（ジメトキシホスホリル）アセチル）－２，２－ジメチルオキサゾリジン－３－カルボン酸エステル（９３０ｍｇ，２．６５ｍｍｏｌ）及び（Ｚ）－ペンタデカ－５－エナール（４７６ｍｇ，２．１２ｍｍｏｌ）を１：１の体積比率のテトラヒドロフラン／水溶媒３０ｍＬに溶解させ、炭酸カリウム（１．８３ｇ，１３．２５ｍｍｏｌ）を加えて、反応温度を４０℃に上げ、１２時間反応させた。反応後、溶媒をエバポレータで除去し、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積比１０：１）で精製することで、化合物（１）（８１０ｍｇ，収率８７％）を無色油状で得た。
【0046】
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ = 7.01 - 6.81 (m, 1 H), 6.31 - 6.18 (m, 1 H), 5.51 - 5.20 (m, 2 H), 4.73 - 4.41 (m, 1 H), 4.12 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 4.00 - 3.81 (m, 1 H), 2.31 - 1.12 (m, 35 H), 0.89 (t, 3H).
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 188.1, 186.1, 146.7, 130.5, 126.4, 125.5, 94.1, 81.4, 66.9, 64.1, 32.7-24.1.
HRMS (m/z): [M+H]+ calculated for C26H46NO4: 435.3347; found 435.3343.
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 188.1, 186.1, 146.7, 130.5, 126.4, 125.5, 94.1, 81.4, 66.9, 64.1, 32.7-24.1.
HRMS (m/z): [M+H]+ calculated for C26H46NO4: 435.3347; found 435.3343.
【0047】
【化3】
【0048】
化合物（２）の合成
０．２Ｍ Ｚｎ（ＢＨ4）2のテトラヒドロフラン溶液を-78℃にて攪拌し、化合物（１）（７３３ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら加えた。反応温度を徐々に０℃に上げ、その後、６時間、攪拌させた。飽和塩化アンモニウム水溶液をゆっくり滴下し、反応をクエンチ後、反応化合物を酢酸エチルにて抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥させた。酢酸エチルをエバポレーターで除去後、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝体積比６：１)で精製することで、化合物（２）（５８０ｍｇ，収率７８％）を無色油状で得た。
０．２Ｍ Ｚｎ（ＢＨ4）2のテトラヒドロフラン溶液を-78℃にて攪拌し、化合物（１）（７３３ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら加えた。反応温度を徐々に０℃に上げ、その後、６時間、攪拌させた。飽和塩化アンモニウム水溶液をゆっくり滴下し、反応をクエンチ後、反応化合物を酢酸エチルにて抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥させた。酢酸エチルをエバポレーターで除去後、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル＝体積比６：１)で精製することで、化合物（２）（５８０ｍｇ，収率７８％）を無色油状で得た。
【0049】
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ = 5.86 - 5.12 (m, 4 H), 4.22 - 3.74 (m, 4H), 2.17 - 0.61 (m, 35 H), 0.89 (t, 3H).
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 186.1, 132.1, 131.5, 131.4, 127.7, 93.4, 80.1, 73.5, 64.6, 62.1, 32.5-21.2, 21.6, 13.1.
HRMS (m/z): [M+H]+ calculated for C26H48NO4: 447.3821; found 447.3834.
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 186.1, 132.1, 131.5, 131.4, 127.7, 93.4, 80.1, 73.5, 64.6, 62.1, 32.5-21.2, 21.6, 13.1.
HRMS (m/z): [M+H]+ calculated for C26H48NO4: 447.3821; found 447.3834.
【0050】
【化4】
【0051】
化合物（３）の合成
化合物（２）（３９８ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、そこにｐ－トルエンスルホン酸（５０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を加え、２４時間、室温で攪拌した。炭酸水素ナトリウムにて反応を中和後、メタノールをエバポレーターで除去し、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積６：１→１：１）で精製することで、化合物（３）（２５１ｍｇ，収率６９％）を無色油状で得た。
化合物（２）（３９８ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、そこにｐ－トルエンスルホン酸（５０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を加え、２４時間、室温で攪拌した。炭酸水素ナトリウムにて反応を中和後、メタノールをエバポレーターで除去し、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積６：１→１：１）で精製することで、化合物（３）（２５１ｍｇ，収率６９％）を無色油状で得た。
【0052】
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ = 5.87 - 5.10 (m, 4 H), 4.20 (br. s., 1 H), 3.92 - 3.40 (m, 5 H), 2.07 (br. s., 4 H), 2.00 - 1.87 (m, 2 H), 1.40 (br. s., 9 H), 1.23 (br. s., 14 H), 0.84 (t, J = 6.6 Hz, 3 H).
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 156.3, 133.0, 129.5, 128.5, 79.6, 74.0, 62.3, 55.6, 32.4, 31.9, 29.7, 29.5, 29.3, 28.3, 27.3, 26.7, 22.6, 14.0.
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 156.3, 133.0, 129.5, 128.5, 79.6, 74.0, 62.3, 55.6, 32.4, 31.9, 29.7, 29.5, 29.3, 28.3, 27.3, 26.7, 22.6, 14.0.
【0053】
【化5】
【0054】
化合物（４）の合成
化合物（３）（１７０ｍｇ，０．４２７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却後、Ｎ－メチルイミダゾール（５０．６μＬ，０．６４２ｍｍｏｌ）とジメチルクロロホスホネート（５５．３μＬ，０．５１３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、加えた。反応温度を室温に上げ、1時間攪拌後、再び反応温度を０℃に冷やした。飽和塩化アンモニウム水溶液をゆっくり滴下し、反応をクエンチ後、反応化合物をジクロロメタンにて抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥させた。ジクロロメタンをエバポレーターで除去後、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積比１：２）で精製することで、化合物（４）（１７４ｍｇ，収率８０％）を無色油状で得た。
化合物（３）（１７０ｍｇ，０．４２７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却後、Ｎ－メチルイミダゾール（５０．６μＬ，０．６４２ｍｍｏｌ）とジメチルクロロホスホネート（５５．３μＬ，０．５１３ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、加えた。反応温度を室温に上げ、1時間攪拌後、再び反応温度を０℃に冷やした。飽和塩化アンモニウム水溶液をゆっくり滴下し、反応をクエンチ後、反応化合物をジクロロメタンにて抽出し、硫酸マグネシウムにて乾燥させた。ジクロロメタンをエバポレーターで除去後、残った反応物残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝体積比１：２）で精製することで、化合物（４）（１７４ｍｇ，収率８０％）を無色油状で得た。
【0055】
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ = 5.78 - 5.11 (m, 4 H), 4.32 - 4.17 (m, 1 H), 4.13 - 4.01 (m, 2 H), 3.74 (brs, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 3.70 (s, 3 H), 3.62 (br. s., 1 H), 2.04 (br. s., 4 H), 1.94 (q, J = 6.7 Hz, 2 H), 1.37 (br. s., 9 H), 1.28 - 1.15 (m, 14 H), 0.81 (t, J = 7.1 Hz, 3 H).
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 155.6, 133.4, 130.5, 129.2, 128.5, 79.4, 72.2, 66.7, 66.6, 55.0, 54.4, 32.4, 31.8, 29.6, 29.5, 29.5, 29.2, 28.3, 28.2, 27.2, 26.7, 22.6.
13C NMR (126MHz, CDCl3) δ = 155.6, 133.4, 130.5, 129.2, 128.5, 79.4, 72.2, 66.7, 66.6, 55.0, 54.4, 32.4, 31.8, 29.6, 29.5, 29.5, 29.2, 28.3, 28.2, 27.2, 26.7, 22.6.
【0056】
【化6】
【0057】
化合物（５）の合成
化合物（４）（６３ｍｇ，０．１２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶解し、0℃に冷却後、テトラメチルシリルブロミド（７８μＬ，０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、加えた。反応温度を室温に上げ、３時間攪拌後、アセトニトリルをエバポレーターで除去した。さらに９５：５の体積比率のメタノール/水溶液（５ｍＬ）を反応系に加え、１時間、室温で攪拌し、過剰のテトラメチルシリルブロミドを分解後、溶媒をエバポレーターで除去し、反応物残渣を得た。残渣物はアンバライトＸＡＤ４樹脂に供し、メタノール水溶液（０％から５０体積％の濃度勾配をかけた。）によって溶出することで、化合物（i）（３２．３ｍｇ，６８％）を白色粘性状で得た。以下において、化合物（i）を「植物型Ｓ１Ｐ」とも記載する。
化合物（４）（６３ｍｇ，０．１２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶解し、0℃に冷却後、テトラメチルシリルブロミド（７８μＬ，０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、加えた。反応温度を室温に上げ、３時間攪拌後、アセトニトリルをエバポレーターで除去した。さらに９５：５の体積比率のメタノール/水溶液（５ｍＬ）を反応系に加え、１時間、室温で攪拌し、過剰のテトラメチルシリルブロミドを分解後、溶媒をエバポレーターで除去し、反応物残渣を得た。残渣物はアンバライトＸＡＤ４樹脂に供し、メタノール水溶液（０％から５０体積％の濃度勾配をかけた。）によって溶出することで、化合物（i）（３２．３ｍｇ，６８％）を白色粘性状で得た。以下において、化合物（i）を「植物型Ｓ１Ｐ」とも記載する。
【0058】
1H NMR (500MHz, CD3OD): δ = 5.91 (m, 1 H), 5.34 - 5.59 (m, 3 H), 4.14 - 4.38 (m, 2 H), 4.09 (m, 1 H), 3.42 (m, 1 H), 1.92 - 2.18 (m, 6 H), 1.31 (brs., 14 H), 0.85 - 0.97 (t, 3 H).
13C NMR (126MHz, CD3OD): δ = 134.9, 130.1, 128.4, 127.2, 69.2, 62.6, 55.6, 32.2, 31.7, 29.5, 29.4, 29.1, 28.9, 26.9, 26.3, 22.4, 13.1.
13C NMR (126MHz, CD3OD): δ = 134.9, 130.1, 128.4, 127.2, 69.2, 62.6, 55.6, 32.2, 31.7, 29.5, 29.4, 29.1, 28.9, 26.9, 26.3, 22.4, 13.1.
【0059】
【化7】
【0060】
［試験例］
以下のスフィンゴイド塩基－１－リン酸を用い、ケラチノサイト分化誘導能を試験した。なお、スフィンゴイド塩基の記載形式である「ｄｗ：ｘ」において、ｗは１分子当たりのスフィンゴイド部分の炭素数を表し、ｘは不飽和結合の数を表す。
以下のスフィンゴイド塩基－１－リン酸を用い、ケラチノサイト分化誘導能を試験した。なお、スフィンゴイド塩基の記載形式である「ｄｗ：ｘ」において、ｗは１分子当たりのスフィンゴイド部分の炭素数を表し、ｘは不飽和結合の数を表す。
【0061】
・植物型Ｓ１Ｐ：上記合成例で得られた化合物（i）であり、ｄ１８：２4t8c－１Ｐとも表される。また、トランス－４，シス－８－スフィンガジエニン－１－リン酸、又は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ，８Ｚ）－２－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａ－４，８－ｄｉｅｎ－１－ｙｌ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅと称呼される。
・動物型Ｓ１Ｐ：化合物（iv）であり、ｄ１８：２4t－１Ｐとも表される。また、トランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸、又は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ，８Ｚ）－２－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａ－４，８－ｄｉｅｎ－１－ｙｌ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅと称呼される。
・動物型Ｓ１Ｐ：化合物（iv）であり、ｄ１８：２4t－１Ｐとも表される。また、トランス－４－スフィンゲニン－１－リン酸、又は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ，８Ｚ）－２－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａ－４，８－ｄｉｅｎ－１－ｙｌ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅと称呼される。
【0062】
１２ウェルプレート（培養面積３．８ｃｍ2）に、ヒト皮膚ケラチノサイト(ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５：Ｅｖｅｒｃｙｔｅ製)細胞を１ウェルあたり０．４×１０5個となるように播種し、ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ製）の培地１ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で終夜培養した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた動物型Ｓ１Ｐ（ｄ１８：２4t－１Ｐ）又は植物型Ｓ１Ｐ（ｄ１８：２4t8c－１Ｐ）を終濃度０．１μＭ又は１μＭとなるようにＫＧＭ－Ｇｏｌｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔの培地１ｍＬに加えて攪拌し、動物型Ｓ１Ｐ又は植物型Ｓ１Ｐの懸濁液を調製した。コントロールには同体積のＤＭＳＯを用いた。各ウェルの培地を除去した後、調製した動物型Ｓ１Ｐ又は植物型Ｓ１Ｐの懸濁液を１ｍＬずつ加え、２４時間３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
【0063】
２４時間後に、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて全ＲＮＡ溶液を精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＴＢ Ｇｒｅｅｎ(R) Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）を用いて定量ＰＣＲを行った。
【0064】
具体的には、ＰＣＲ用９６ウェルプレートにＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ５μＬ、水３．４μＬ、ｃＤＮＡ溶液１μＬ、１０μＭフォワード及びリバースプライマーの混合溶液０．４μＬ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ０．２μＬを加え、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製リアルタイム定量ＰＣＲシステムＭｘ３０００Ｐを用いて標準プログラムでＰＣＲを行い、比較Ｃｔ法でＩＮＶ（ｉｎvｏｌｕｃｒｉｎ）のｍＲＮＡ量を比較定量した。ＩＮＶは、細胞表面で皮膚バリアを担う表皮セラミドの足場になるタンパク質であり、ＮＨＥＫの分化が進むことで発現量が増大する遺伝子であり、この遺伝子の発現量が増大すると、ＮＨＥＫの分化が進んでいる（つまり、ケラチノサイト分化誘導能が認められる）と判断できる。また、内部標準として60SリボソームタンパクＰ０（ＲＰＬＰ０）を用い、同様にしてその発現量を測定した。ｍＲＮＡ量は、各遺伝子のコントロール群のｍＲＮＡ量を１としたときの相対量で示した。得られた値について、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定による有意差検定を行った。なお、使用したプライマーに関する情報を表１に示す。
【0065】
【表1】
【0066】
結果を図１に示す。図１から明らかなとおり、未分化ＮＨＥＫを動物型Ｓ１Ｐ又は植物型Ｓ１Ｐで処理することで、コントロール群と比べて、ＩＮＶの発現量が有意に増大することが認められた。つまり、動物型Ｓ１Ｐ及び植物型Ｓ１Ｐいずれについてもケラチノサイト分化誘導が認められた。
【0067】
また、植物型Ｓ１Ｐの０．１μＭ処理濃度におけるＩＮＶ発現量が動物型Ｓ１Ｐの１μＭ処理濃度におけるＩＮＶ発現量と同等であったことから、植物型Ｓ１Ｐのほうが一層高いケラチノサイト分化誘導効果が認められた。
【配列表フリーテキスト】
【0068】
配列番号１は、ＩＮＶ用フォワードプライマーである。
配列番号２は、ＩＮＶ用リバースプライマーである。
配列番号３は、ＲＰＬＰ０用フォワードプライマーである。
配列番号４は、ＲＰＬＰ０用リバースプライマーである。
配列番号２は、ＩＮＶ用リバースプライマーである。
配列番号３は、ＲＰＬＰ０用フォワードプライマーである。
配列番号４は、ＲＰＬＰ０用リバースプライマーである。
【図1】
【配列表】