(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022183626
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】ミクログリア活性化抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/047 20060101AFI20221206BHJP
A61K 31/215 20060101ALI20221206BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20221206BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221206BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20221206BHJP
A61P 25/28 20060101ALN20221206BHJP
A61P 25/16 20060101ALN20221206BHJP
A61P 27/02 20060101ALN20221206BHJP
A61K 36/82 20060101ALN20221206BHJP
A61K 36/185 20060101ALN20221206BHJP
A61K 133/00 20060101ALN20221206BHJP
A61K 127/00 20060101ALN20221206BHJP
【ＦＩ】
A61K31/047 ZNA
A61K31/215
A61K31/704
A61P43/00 105
A23L33/105
A61P25/28
A61P25/16
A61P27/02
A61K36/82
A61K36/185
A61K133:00
A61K127:00
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021091052
(22)【出願日】2021-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】000231637
【氏名又は名称】株式会社ニップン
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100156982
【弁理士】
【氏名又は名称】秋澤 慈
(72)【発明者】
【氏名】林 遼太郎
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018MD08
4B018MD48
4B018ME14
4B018MF01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
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4C086ZA16
4C086ZB21
4C088AB12
4C088AB45
4C088AC03
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4C088BA11
4C088BA13
4C088BA21
4C088NA14
4C088ZA01
4C088ZA15
4C088ZA16
4C088ZA33
4C088ZB21
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA14
4C206DB03
4C206DB52
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA01
4C206ZA15
4C206ZA16
4C206ZA33
4C206ZC41
(57)【要約】 （修正有）
【課題】天然物由来の素材から得られ、安全性が高く継続的に摂取可能であるミクログリア活性化抑制剤を提供する。
【解決手段】下記式で表されるＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含み、前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、Ｒ1-バリゲノールの配糖体又はアシル化体である、ミクログリア活性化抑制剤。
【選択図】なし
【解決手段】下記式で表されるＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含み、前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、Ｒ1-バリゲノールの配糖体又はアシル化体である、ミクログリア活性化抑制剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式ＩのＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含み、前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、Ｒ1-バリゲノールの配糖体又はアシル化体である、ミクログリア活性化抑制剤
式I
式I
【請求項2】
前記Ｒ1-バリゲノールの配糖体又はアシル化体が、下記の化合物から選択される、請求項１に記載の、ミクログリア活性化抑制剤
【請求項3】
請求項１又は請求項２に記載のミクログリア活性化抑制剤を含む、ミクログリア活性化抑制用食品。
【請求項4】
請求項１又は請求項２に記載のミクログリア活性化抑制剤を含む、医薬。
【請求項5】
ミクログリア活性化を介した疾患の予防、または緩和のための請求項３に記載の食品。
【請求項6】
ミクログリア活性化を介した疾患の予防、緩和、または治療のための請求項４に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＲ1-バリゲノール及び／又はその誘導体を有効成分とするミクログリア活性化抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ミクログリアは中枢神経系の免疫担当細胞であり、異物や老廃物に対する自然免疫作用、栄養因子の産生などの神経保護機能を有している。一方で、ミクログリアは活性化により一酸化窒素や炎症性サイトカイン(ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β等)を産生し、神経障害作用により神経変性疾患を引き起こすことが知られている。
非特許文献１では一酸化窒素を介した神経細胞のアポトーシスによってパーキンソン病等の神経変性疾患が引き起こされることが示唆されている。
非特許文献２ではミクログリアが産生するＩＬ－１β等の炎症性サイトカインがアルツハイマー病などの中枢神経系の炎症を伴う障害を引き起こすことが示唆されている。
非特許文献３ではミクログリアが引き起こす神経炎症が緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜変性疾患を引き起こすことが示されている。
非特許文献４ではミクログリアを介した炎症性サイトカインの制御は疾患のあらたな治療標的になり得ることが示されており、ミクログリアの活性化を抑制することができれば中枢神経系の異常状態のリスク低減、予防、治療効果が期待される。
ミクログリアの活性化については非特許文献５で示されるようにミノサイクリンなどの医薬品によってミクログリアの活性が抑制されることが知られている。
ミクログリアの活性化は継続的に抑制されることが必要であるため、継続的に摂取が可能で安全性が高い天然物由来成分などのミクログリア活性化抑制物質が求められている。
ミクログリアの活性化を抑制する天然物由来の物質としてトリテルペン類が挙げられる。例えば、非特許文献６、７で示されるようにトリテルペン類の１種であるオレアノール酸やカミヤツデ(Ｔｅｔｒａｐａｎａｘ ｐａｐｙｒｉｆｅｒ)由来のトリテルペン類が報告されている。しかし、これらのトリテルペン類はミクログリアに対して細胞毒性を示すという問題がある。より効果的にミクログリアの活性化を抑制し、少ない配合量でミクログリアの活性化を抑制する物質が求められている。
Ｒ1-バリゲノール（Ｒ1-ｂａｒｒｉｇｅｎｏｌ）及びその配糖体やアシル化体などの誘導体は、茶花やトベラの葉などに含まれている天然成分であり、Ｒ1-バリゲノールは抗菌活性等（非特許文献８）、Ｒ1-バリゲノールの配糖体は腸運動亢進作用や遊離脂肪酸産生作用等（特許文献１）、抗高脂血症、胃腸保護作用、膵リパーゼ阻害作用、摂食抑制効果等（非特許文献９）を示すことが知られている。しかしながらＲ1-バリゲノール及びその誘導体がミクログリアに対する毒性やミクログリア活性化抑制作用を有することは報告されていない。
非特許文献１では一酸化窒素を介した神経細胞のアポトーシスによってパーキンソン病等の神経変性疾患が引き起こされることが示唆されている。
非特許文献２ではミクログリアが産生するＩＬ－１β等の炎症性サイトカインがアルツハイマー病などの中枢神経系の炎症を伴う障害を引き起こすことが示唆されている。
非特許文献３ではミクログリアが引き起こす神経炎症が緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜変性疾患を引き起こすことが示されている。
非特許文献４ではミクログリアを介した炎症性サイトカインの制御は疾患のあらたな治療標的になり得ることが示されており、ミクログリアの活性化を抑制することができれば中枢神経系の異常状態のリスク低減、予防、治療効果が期待される。
ミクログリアの活性化については非特許文献５で示されるようにミノサイクリンなどの医薬品によってミクログリアの活性が抑制されることが知られている。
ミクログリアの活性化は継続的に抑制されることが必要であるため、継続的に摂取が可能で安全性が高い天然物由来成分などのミクログリア活性化抑制物質が求められている。
ミクログリアの活性化を抑制する天然物由来の物質としてトリテルペン類が挙げられる。例えば、非特許文献６、７で示されるようにトリテルペン類の１種であるオレアノール酸やカミヤツデ(Ｔｅｔｒａｐａｎａｘ ｐａｐｙｒｉｆｅｒ)由来のトリテルペン類が報告されている。しかし、これらのトリテルペン類はミクログリアに対して細胞毒性を示すという問題がある。より効果的にミクログリアの活性化を抑制し、少ない配合量でミクログリアの活性化を抑制する物質が求められている。
Ｒ1-バリゲノール（Ｒ1-ｂａｒｒｉｇｅｎｏｌ）及びその配糖体やアシル化体などの誘導体は、茶花やトベラの葉などに含まれている天然成分であり、Ｒ1-バリゲノールは抗菌活性等（非特許文献８）、Ｒ1-バリゲノールの配糖体は腸運動亢進作用や遊離脂肪酸産生作用等（特許文献１）、抗高脂血症、胃腸保護作用、膵リパーゼ阻害作用、摂食抑制効果等（非特許文献９）を示すことが知られている。しかしながらＲ1-バリゲノール及びその誘導体がミクログリアに対する毒性やミクログリア活性化抑制作用を有することは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００９-５７３６５号公報
【特許文献2】特開２０２０-１８３３４６号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Nakato R et al. Sci Rep. 5:14812, 2015
【非特許文献2】Shaftel SS et al. J Neuroinflammation. 5:7, 2008
【非特許文献3】Maderia MH et al. Mediators Inflamm. 2015:673090, 2015
【非特許文献4】最上ら 日薬理誌．Vol.150, p.26, 2017
【非特許文献5】Tikka TM et al. J Immunol. 166(12):7527-33, 2001
【非特許文献6】Castellano JM et al. Biomolecules. 9(11):683, 2019
【非特許文献7】Cho N et al. Molecules. 21(4):459, 2016
【非特許文献8】Oh JH, et al. Molecules. 19(3):3607-3616, 2014 Published 2014 Mar 24. doi:10.3390/molecules19033607
【非特許文献9】Matsuda H, et al. J Nat Med. 70(4):689-701. doi:10.1007/s11418-016-1021-1, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、天然物由来の素材から得られ、安全性が高く継続的に摂取可能であるミクログリア活性化抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、各種食用素材由来の抽出物について、iｎ ｖｉｔｒｏでの系を用いてミクログリア活性化抑制を持つ成分の探索を行った。その結果、容易に入手することができ、また食用とし得る天然物由来の素材、すなわち茶花やトベラの葉由来の式Ｉの化合物Ｒ1-バリゲノール及び／又はその誘導体を含む組成物がミクログリア活性化抑制作用を有することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
[１]下記の式ＩのＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含み、前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、Ｒ1－バリゲノールの配糖体又はアシル化体である、ミクログリア活性化抑制剤
式I
[２]前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、下記の化合物から選択される、[１]に記載の、ミクログリア活性化抑制剤。
[３][１]又は[２]に記載のミクログリア活性化抑制剤を含む、ミクログリア活性化抑制用食品。
[４][１]又は[２]に記載のミクログリア活性化抑制剤を含む、医薬。
[５]ミクログリア活性化を介した疾患の予防、または緩和のための[３]に記載の食品。
[６]ミクログリア活性化を介した疾患の予防、緩和、または治療のための[４]に記載の医薬。
すなわち本発明は以下の通りである。
[１]下記の式ＩのＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含み、前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、Ｒ1－バリゲノールの配糖体又はアシル化体である、ミクログリア活性化抑制剤
式I
[２]前記Ｒ1-バリゲノール誘導体が、下記の化合物から選択される、[１]に記載の、ミクログリア活性化抑制剤。
[４][１]又は[２]に記載のミクログリア活性化抑制剤を含む、医薬。
[５]ミクログリア活性化を介した疾患の予防、または緩和のための[３]に記載の食品。
[６]ミクログリア活性化を介した疾患の予防、緩和、または治療のための[４]に記載の医薬。
【発明の効果】
【0007】
本発明のＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含むミクログリア活性化抑制剤はミクログリア活性化抑制作用を有し、ミクログリアの活性化により引き起こされる異常や疾患を効果的に予防、改善することが可能となる。また本発明のミクログリア活性化抑制剤は、食経験のある天然物（食品素材）由来の成分を含む為、安価に、長期間にわたって継続的に摂取することができる。
ミクログリアの活性化により引き起こされる異常や疾患として、具体的には一酸化窒素、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-αの産生による中枢神経系の炎症や、神経変性疾患が挙げられる。このような神経変性疾患としてパーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳卒中、脳梗塞、脳虚血、レビー小体型認知症、前頭側頭認知症、統合失調症、うつ病、依存症及びてんかん等が挙げられる。また中枢神経以外にも緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜変性疾患においてミクログリアによる神経炎症が原因となっていることが知られており、網膜変性疾患に対しても予防や進行の抑制又は治療が可能である。
本発明により、ミクログリアの活性化による一酸化窒素、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-αの産生を抑制することで、中枢神経系の炎症を予防、改善し、神経変性疾患の予防や進行の抑制又は治療が可能である。
ミクログリアの活性化により引き起こされる異常や疾患として、具体的には一酸化窒素、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-αの産生による中枢神経系の炎症や、神経変性疾患が挙げられる。このような神経変性疾患としてパーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳卒中、脳梗塞、脳虚血、レビー小体型認知症、前頭側頭認知症、統合失調症、うつ病、依存症及びてんかん等が挙げられる。また中枢神経以外にも緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜変性疾患においてミクログリアによる神経炎症が原因となっていることが知られており、網膜変性疾患に対しても予防や進行の抑制又は治療が可能である。
本発明により、ミクログリアの活性化による一酸化窒素、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-αの産生を抑制することで、中枢神経系の炎症を予防、改善し、神経変性疾患の予防や進行の抑制又は治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】Ｒ1-バリゲノールによる一酸化窒素産生量を検討した結果を示す。ＬＰＳ添加群（ＬＰＳ（＋））の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示す。
【図2】Ｒ1-バリゲノールによる炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量の検討結果を示す。ＬＰＳ無添加群のｍＲＮＡ発現量を１とした際の各群のｍＲＮＡ発現量を示している。
【図3】オキシトシンによる一酸化窒素産生量を検討した結果を示す。ＬＰＳ添加群（ＬＰＳ（＋））の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示す。
【図4】Ｒ1-バリゲノールと各トリテルペン類による一酸化窒素産生量を比較検討した結果を示す。ＬＰＳ添加群（ＬＰＳ（＋））の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示す。
【図5】Ｒ1-バリゲノールと各トリテルペン類の細胞毒性試験の結果を示す。記載されている数値は各群の細胞生存率の平均値である。ＬＰＳ添加群（ＬＰＳ（＋））の細胞生存率を１００とした場合の各群の細胞生存率を示す。
【図6】Ｒ1-バリゲノールの濃度別の細胞毒性試験の結果を示す。ＬＰＳ添加群（ＬＰＳ（＋））の細胞生存率を１００とした場合の各群の細胞生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明のミクログリア活性化抑制剤は、下記の式ＩのＲ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を含む。
式I
式I
【0010】
本発明において、Ｒ1-バリゲノール誘導体はＲ1-バリゲノールの配糖体又はアシル化体であり、好ましくはＲ1-バリゲノールの１以上の水酸基に１分子以上の糖が結合した配糖体であり及び／又はＲ1-バリゲノールの１以上の水酸基が炭素数１～５の直鎖状又は分岐状のアルキル基またはアルケニル基がカルボニル基に結合してなるアシル基でアシル化されたアシル化体である。
Ｒ1-バリゲノール誘導体は、さらに好ましくはＲ1-バリゲノールの３位の水酸基に１分子以上の糖が結合した配糖体であり及び／又はＲ1-バリゲノールの２１位又は２２位の少なくとも１以上の水酸基が炭素数１～５の直鎖状又は分岐状のアルキル基またはアルケニル基がカルボニル基に結合してなるアシル基でアシル化されたアシル化体である。Ｒ1-バリゲノールの誘導体は、天然物に含まれる成分として含まれるものであれば特に限定されない。
水酸基に結合する糖は好ましくはアラビノース、キシロース、ガラクトース、グルクロン酸である。さらに好ましくは４分子の糖が結合している。水酸基に結合するアシル基としては、炭素数１～３のアルキル基あるいは炭素数２～５のアルケニル基がカルボニル基に結合した基であることが好ましく、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、アクリロイル基、メタクリル基、クロトノイル基、２－メチルクロトノイル基、３－メチルクロトノイル基などが挙げられる。
Ｒ1-バリゲノールの骨格の位置番号は以下のとおりである。
Ｒ1-バリゲノールの誘導体は好ましくは下記の化合物から選択される。
Ｒ1-バリゲノール誘導体は、さらに好ましくはＲ1-バリゲノールの３位の水酸基に１分子以上の糖が結合した配糖体であり及び／又はＲ1-バリゲノールの２１位又は２２位の少なくとも１以上の水酸基が炭素数１～５の直鎖状又は分岐状のアルキル基またはアルケニル基がカルボニル基に結合してなるアシル基でアシル化されたアシル化体である。Ｒ1-バリゲノールの誘導体は、天然物に含まれる成分として含まれるものであれば特に限定されない。
水酸基に結合する糖は好ましくはアラビノース、キシロース、ガラクトース、グルクロン酸である。さらに好ましくは４分子の糖が結合している。水酸基に結合するアシル基としては、炭素数１～３のアルキル基あるいは炭素数２～５のアルケニル基がカルボニル基に結合した基であることが好ましく、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、アクリロイル基、メタクリル基、クロトノイル基、２－メチルクロトノイル基、３－メチルクロトノイル基などが挙げられる。
Ｒ1-バリゲノールの骨格の位置番号は以下のとおりである。
【0011】
本発明のミクログリア活性化抑制剤は、ミクログリア活性化抑制作用を有する。当該作用は、一酸化窒素やＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-αなどの炎症性サイトカインなどを指標とし公知の方法によって評価することが可能である（例えば特許文献３）。
【0012】
また、配糖体は腸内細菌で加水分解を受けてからアグリコーンが吸収されるとされており、Ｒ1-バリゲノールの配糖体である化合物（例えば、化合物（１）チャカサポニンＩＩ（ｃｈａｋａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩ）、化合物（２）チャカサポニンＩＩＩ（ｃｈａｋａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩＩ）、化合物（３）デスアシルフロラテアサポニンＢ(ｄｅｓａｃｙｌ-ｆｌｏｒａｔｈｅａｓａｐｏｎｉｎ Ｂ)）についても経口投与でＲ1-バリゲノールと同様の効果が期待できる。また、アシル化体は体内のエステラーゼによって加水分解されＲ1-バリゲノールが生成することから、Ｒ1-バリゲノールのアシル化体である化合物（例えば、化合物（１）チャカサポニンＩＩ（ｃｈａｋａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩ）、化合物（２）チャカサポニンＩＩＩ（ｃｈａｋａｓａｐｏｎｉｎ ＩＩＩ）、化合物（４）２１-Ｏ-アンゲロイル-Ｒ1-バリゲノール（２１-Ｏ-ａｎｇｅｌｏｙｌ-Ｒ1-ｂａｒｒｉｇｅｎｏｌ）についても経口投与でＲ1-バリゲノールと同様の効果が期待できる。
【0013】
本発明において、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体は天然物由来の素材である茶の花部及びトベラの葉部より抽出して得られる抽出物から精製することができる。
茶はツバキ科ツバキ属の植物チャノキ（学名Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、トベラはトベラ科トベラ属の植物トベラ（学名Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍ ｔｏｂｉｒａ）である。抽出試料として例えば茶の花部、トベラの葉部を用いることが出来る。本発明においてこれらの抽出試料の保存状態、粉砕方法、品種または産地は特に限定されない。
茶はツバキ科ツバキ属の植物チャノキ（学名Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、トベラはトベラ科トベラ属の植物トベラ（学名Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍ ｔｏｂｉｒａ）である。抽出試料として例えば茶の花部、トベラの葉部を用いることが出来る。本発明においてこれらの抽出試料の保存状態、粉砕方法、品種または産地は特に限定されない。
【0014】
抽出物は、当業者に公知の抽出方法によって得ることができ、例えば抽出方法として、有機溶媒抽出、超臨界流体抽出法、加温加圧抽出法などを挙げることができる。上記抽出方法は、それぞれを単独で用いてもよいし、複数の抽出方法を組合せて用いてもよい。
本発明において、特に好ましい抽出方法は溶媒抽出である。溶媒抽出は当業者に知られる一般的な手法を用いて行うことができる。具体的には、まず、粉砕物または乾燥破砕物に水と有機溶媒とを添加して、室温または加温にて抽出する。
抽出溶媒としては、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトン、水などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよい。好ましくは、食品等への使用の安全性からエタノールを用いるのが望ましい。添加する溶媒の量は、抽出素材の重量の１～１００倍、好ましくは５～５０倍、例えば１０倍量を用いる。
抽出方法としては、例えば、茶の花部若しくはトベラの葉部と前記抽出溶媒とを混合し、室温で１～５時間攪拌または抽出溶媒の煮沸温度で１～５時間還流して抽出を行った後、ろ過や遠心分離などにより抽出液から試料残渣を取り除き、減圧または限外ろ過により抽出物を濃縮する方法が挙げられる。また必要に応じて酸若しくはアルカリによる加水分解を行う。さらに、抽出液を乾固、凍結乾燥、スプレードライなどの一般的な方法により乾燥させることも出来る。
本発明において、特に好ましい抽出方法は溶媒抽出である。溶媒抽出は当業者に知られる一般的な手法を用いて行うことができる。具体的には、まず、粉砕物または乾燥破砕物に水と有機溶媒とを添加して、室温または加温にて抽出する。
抽出溶媒としては、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトン、水などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよい。好ましくは、食品等への使用の安全性からエタノールを用いるのが望ましい。添加する溶媒の量は、抽出素材の重量の１～１００倍、好ましくは５～５０倍、例えば１０倍量を用いる。
抽出方法としては、例えば、茶の花部若しくはトベラの葉部と前記抽出溶媒とを混合し、室温で１～５時間攪拌または抽出溶媒の煮沸温度で１～５時間還流して抽出を行った後、ろ過や遠心分離などにより抽出液から試料残渣を取り除き、減圧または限外ろ過により抽出物を濃縮する方法が挙げられる。また必要に応じて酸若しくはアルカリによる加水分解を行う。さらに、抽出液を乾固、凍結乾燥、スプレードライなどの一般的な方法により乾燥させることも出来る。
【0015】
上記のようにして得られた抽出物より、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体を適当な分離法および精製法を組み合わせて精製して用いることが可能である。当該精製法としては、例えば、液-液分配、有機溶媒沈澱、各種カラムクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化などを使用することができる。
得られた、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体は、ミクログリア活性化抑制剤としてそのまま直接摂取することも出来るし、また、公知の担体や各種基材などに配合することも出来る。
得られた、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体は、ミクログリア活性化抑制剤としてそのまま直接摂取することも出来るし、また、公知の担体や各種基材などに配合することも出来る。
【0016】
Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体の投与量または摂取量は、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量であり、その量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象の年齢、性別、体重、適用疾患およびその症状、剤形、投与方法などが考慮されるべきである。例えば、経口剤により経口投与される場合には、上記投与量または摂取量は、Ｒ1-バリゲノールの量に換算して０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。
食品に含まれる場合、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体はＲ1-バリゲノールに換算して０．０１～５０重量％、好ましくは１～３０重量％程度であり、成人１人（体重約５０ｋｇ）につき、１日当たり０．５～５０００ｍｇ、好ましくは０．５～１００ｍｇの摂取量となるように摂取すればよい。
食品に含まれる場合、Ｒ1-バリゲノール及び/又はＲ1-バリゲノール誘導体はＲ1-バリゲノールに換算して０．０１～５０重量％、好ましくは１～３０重量％程度であり、成人１人（体重約５０ｋｇ）につき、１日当たり０．５～５０００ｍｇ、好ましくは０．５～１００ｍｇの摂取量となるように摂取すればよい。
【0017】
本発明は上記ミクログリア活性化抑制剤を含有するミクログリア活性化抑制用食品に関する。本発明のミクログリア活性化抑制剤は、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補助食品、栄養機能食品等の保健機能食品、特別用途食品（例えば、病者用食品）、疾病リスク低減表示を付した食品、健康補助食品、サプリメント等として調製されてもよい。
サプリメントとして、例えば、一般的なサプリメントの製造に用いられる種々の添加剤とともに錠剤、丸状、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等の形状とすることができる。また液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
サプリメントとして、例えば、一般的なサプリメントの製造に用いられる種々の添加剤とともに錠剤、丸状、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等の形状とすることができる。また液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
【0018】
配合可能な食品に特に限定はないが、例えば、飯類、餅類、麺類、パン類およびパスタ類等の炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジュース、清涼飲料水、乳飲料、茶飲料、機能性飲料、栄養補助飲料、ノンアルコールビール等の各種飲料；ビール、発泡酒等のアルコール飲料；スープ、味噌汁、お吸い物などの飲食品；卵を用いた加工品、魚介類（イカ、タコ、貝、ウナギなど）や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味類を含む）；だし、しょうゆ、みりんその他の調味料などが挙げられる。
【0019】
また、本発明の食品は、本発明の効果を損なわない範囲で、ミクログリア活性化抑制剤の他、栄養補助成分などの他の成分を含むことができる。かかる成分には、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸等）、カロチノイド（例えばβ-カロチン、リコピン、フコキサンチン等）、ミネラル類（例えば海藻成分、ＣＣＭ、ヘム鉄、鉄塩系、乳清カルシウム、発酵乳酸カルシウム、牛骨カルシウム、珊瑚カルシウム、卵殻カルシウム等）、各種植物体並びにその抽出物、精製物および分画物（例えばオオバコ、クロレラ、スピルリナ、にんにく、いちょう葉、ギムネマ、杜仲の葉、しその葉、ハトムギ、大豆グロブリン、ルチン、緑茶抽出物、テアニン、ポリフェノール類、甘草、ユッカ、大豆サポニン、カフェイン、ホワトルベリーエキス、シャンピニオンエキス、ガルシニア・カンボジアエキス等）、微生物並びにその増殖因子および微生物生産物（例えば乳酸菌、酵母、乳酸菌増殖因子等）、食物繊維およびその酵素分解物（例えばアップルファイバー、コーンファイバー、澱粉由来の食物繊維、難消化性デキストリン、グアガム酵素分解物、サツマイモ繊維、大豆繊維、海藻繊維、きのこ繊維、茶繊維、酸性多糖類、植物粘質物、小麦フスマ等）、動物体並びにその抽出物、精製物、分解物および生産物（例えばローヤルゼリー、プロポリス、牡蠣エキス、キチン、キトサン、タウリン、コラーゲン、ゼラチン等）、各種オリゴ糖（例えばガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等）、脂質（例えば不飽和脂肪酸（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、リン脂質、サラトリム等）、各種蛋白質および蛋白分解物（例えばとうもろこし蛋白、大豆蛋白、ＴＭＰ（トータルミルクプロテイン）、ラクトアルブミン、カゼイン、ホエー、グルタチオン、大豆ペプチド、卵白ペプチド、グルタミンペプチド等）、脱脂胚芽等の小麦胚芽などが挙げられる。
【0020】
本発明は上記ミクログリア活性化抑制剤を含有する医薬に関する。本発明のミクログリア活性化抑制剤は、助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口投与または非経口投与が可能な医薬品とすることができる。例えば、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターを担体として使用できる。
【0021】
経口剤の態様とする場合は、有効成分に、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【0022】
注射剤の態様とする場合は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【0023】
外用剤の態様とする場合は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【0024】
上記本発明の食品および医薬は、上記の通り天然物由来の成分を有効成分として含むため、副作用等の心配が少なく、安価にかつ長期間にわたって継続的に摂取することができる。
【0025】
本発明の食品又は医薬は、ミクログリア活性化抑制剤によってミクログリアの活性化が抑制されることにより、ミクログリアの活性化を介した症状又は疾患の予防、緩和、または治療等に使用することができる。そのような症状又は疾患としては、以下に限定されるものではないが、例えば、中枢神経系の炎症、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳卒中、脳梗塞、脳虚血、レビー小体型認知症、前頭側頭認知症、統合失調症、うつ病、依存症及びてんかん等の神経変性疾患、緑内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの網膜変性疾患等を挙げることが出来る。
【実施例0026】
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【0027】
実施例1：ミクログリア活性化抑制試験1
ミクログリアを活性化させるためにＬＰＳ(リポポリサッカライド)を用い、ＬＰＳとサンプルを共添加することでサンプルのミクログリア活性化抑制作用を評価した。試験群はＬＰＳ無添加群(ＬＰＳ(-))、ＬＰＳ添加群(ＬＰＳ(＋))、ＬＰＳ＋サンプル添加群(ＬＰＳ（＋） ｓａｍｐｌｅ)を設定した。
ＬＰＳを１ｍｇ／ｍｌとなるように純水に溶解させＬＰＳ液とした。ＬＰＳを添加する群にはＬＰＳ液を０．１％となるように配合した。ＬＰＳを添加する群の培地中のＬＰＳの濃度は１μｇ／ｍｌとなった。
Ｒ1-バリゲノールを２、４、６、８ｍＭ となるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とした。マウスミクログリア細胞株(ＢＶ２細胞)を１０％ＦＢＳとなるように配合したＤＭＥＭ培地を用いて９６Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０4 個／ｗｅｌｌとなるように播種した。
翌日ｐｌａｔｅの培地を、サンプル液を０．５％含む１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に交換し２４時間培養した。最終的な培地中のＲ1-バリゲノールの濃度は１０、２０、３０、４０μＭとなった。
２４時間の培養後、培地中の一酸化窒素をＧｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ株式会社)を用いて測定した。また、ミクログリア中のｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (株式会社キアゲン)を用いて抽出した。抽出したＲＮＡサンプルからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(タカラバイオ株式会社)を用いてｃＤＮＡを合成した。ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ(タカラバイオ株式会社)を用いてリアルタイムＰＣＲにて定量分析を行った。
なおプライマ-は、以下のものを用いた。
「ＧＡＰＤＨ ｆｗｄ」 ＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ（配列番号：１）
「ＧＡＰＤＨ ｒｅｖ」 ＴＧＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡ（配列番号：２）
「ＩＬ-６ ｆｗｄ」 ＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号：３）
「ＩＬ-６ ｒｅｖ」 ＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号：４）
「ＩＬ-１βｆｗｄ」 ＴＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：５）
「ＩＬ-１β ｒｅｖ」 ＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＴＧＡＧＴ（配列番号：６）
「ＴＮＦ-α ｆｗｄ」 ＡＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴ（配列番号：７）
「ＴＮＦ-α ｒｅｖ」 ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧ（配列番号：８）
ミクログリアを活性化させるためにＬＰＳ(リポポリサッカライド)を用い、ＬＰＳとサンプルを共添加することでサンプルのミクログリア活性化抑制作用を評価した。試験群はＬＰＳ無添加群(ＬＰＳ(-))、ＬＰＳ添加群(ＬＰＳ(＋))、ＬＰＳ＋サンプル添加群(ＬＰＳ（＋） ｓａｍｐｌｅ)を設定した。
ＬＰＳを１ｍｇ／ｍｌとなるように純水に溶解させＬＰＳ液とした。ＬＰＳを添加する群にはＬＰＳ液を０．１％となるように配合した。ＬＰＳを添加する群の培地中のＬＰＳの濃度は１μｇ／ｍｌとなった。
Ｒ1-バリゲノールを２、４、６、８ｍＭ となるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とした。マウスミクログリア細胞株(ＢＶ２細胞)を１０％ＦＢＳとなるように配合したＤＭＥＭ培地を用いて９６Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０4 個／ｗｅｌｌとなるように播種した。
翌日ｐｌａｔｅの培地を、サンプル液を０．５％含む１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に交換し２４時間培養した。最終的な培地中のＲ1-バリゲノールの濃度は１０、２０、３０、４０μＭとなった。
２４時間の培養後、培地中の一酸化窒素をＧｒｉｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｐｒｏｍｅｇａ株式会社)を用いて測定した。また、ミクログリア中のｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (株式会社キアゲン)を用いて抽出した。抽出したＲＮＡサンプルからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(タカラバイオ株式会社)を用いてｃＤＮＡを合成した。ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ(タカラバイオ株式会社)を用いてリアルタイムＰＣＲにて定量分析を行った。
なおプライマ-は、以下のものを用いた。
「ＧＡＰＤＨ ｆｗｄ」 ＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧ（配列番号：１）
「ＧＡＰＤＨ ｒｅｖ」 ＴＧＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡ（配列番号：２）
「ＩＬ-６ ｆｗｄ」 ＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号：３）
「ＩＬ-６ ｒｅｖ」 ＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号：４）
「ＩＬ-１βｆｗｄ」 ＴＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：５）
「ＩＬ-１β ｒｅｖ」 ＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＴＧＡＧＴ（配列番号：６）
「ＴＮＦ-α ｆｗｄ」 ＡＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴ（配列番号：７）
「ＴＮＦ-α ｒｅｖ」 ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧ（配列番号：８）
【0028】
一酸化窒素を測定した結果を図１に示した。ＬＰＳ添加群の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示している。ＬＰＳを添加することにより産生された一酸化窒素は、Ｒ1-バリゲノールの添加により用量依存的に抑制された。
また図２ではＬＰＳ無添加群のｍＲＮＡ発現量を１とした際の各群のｍＲＮＡ発現量を示している。炎症性サイトカインであるＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６のｍＲＮＡ発現はＬＰＳにより上昇し、Ｒ1-バリゲノールの添加によって抑制されていた。
一酸化窒素の産生及び、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６のｍＲＮＡの発現はミクログリアの活性化の指標であることから、ＬＰＳによりミクログリアが活性化し、Ｒ1-バリゲノールの添加によりミクログリアの活性化が抑制していることが示された。
また図２ではＬＰＳ無添加群のｍＲＮＡ発現量を１とした際の各群のｍＲＮＡ発現量を示している。炎症性サイトカインであるＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６のｍＲＮＡ発現はＬＰＳにより上昇し、Ｒ1-バリゲノールの添加によって抑制されていた。
一酸化窒素の産生及び、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６のｍＲＮＡの発現はミクログリアの活性化の指標であることから、ＬＰＳによりミクログリアが活性化し、Ｒ1-バリゲノールの添加によりミクログリアの活性化が抑制していることが示された。
【0029】
実施例２：ミクログリア活性化抑制試験２
オキシトシンを４ｍＭの濃度で精製水に溶解させたものをサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアにオキシトシンを添加し２４時間後の培地中の一酸化窒素量を測定した。最終的な培地中のオキシトシンの終濃度は２０μＭとなった。
一酸化窒素を測定した結果を図３に示した。ＬＰＳ添加群の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示している。ミクログリアにオキシトシンを添加したところ一酸化窒素産生は抑制されず、オキシトシンはミクログリアの活性化を抑制しなかった。したがって、本発明のＲ1-バリゲノールのミクログリア活性化抑制作用はオキシトシン受容体活性化作用とは全く異なるものであることが示された。
オキシトシンを４ｍＭの濃度で精製水に溶解させたものをサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアにオキシトシンを添加し２４時間後の培地中の一酸化窒素量を測定した。最終的な培地中のオキシトシンの終濃度は２０μＭとなった。
一酸化窒素を測定した結果を図３に示した。ＬＰＳ添加群の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示している。ミクログリアにオキシトシンを添加したところ一酸化窒素産生は抑制されず、オキシトシンはミクログリアの活性化を抑制しなかった。したがって、本発明のＲ1-バリゲノールのミクログリア活性化抑制作用はオキシトシン受容体活性化作用とは全く異なるものであることが示された。
【0030】
実施例３：ミクログリア活性化抑制試験３
トリテルペン類であるマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸、Ｒ1-バリゲノールを６ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアに添加した。最終的な培地中の各トリテルペン類の濃度は３０μＭとなった。添加２４時間後に培地中の一酸化窒素量を測定した。
一酸化窒素を測定した結果を図４に示した。ＬＰＳ添加群の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示している。Ｒ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸よりも一酸化窒素の産生を抑制していた。このことはＲ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸よりもミクログリア活性化抑制作用が高いことを示している。
トリテルペン類であるマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸、Ｒ1-バリゲノールを６ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアに添加した。最終的な培地中の各トリテルペン類の濃度は３０μＭとなった。添加２４時間後に培地中の一酸化窒素量を測定した。
一酸化窒素を測定した結果を図４に示した。ＬＰＳ添加群の一酸化窒素産生量を１とした場合の各群の一酸化窒素産生量を示している。Ｒ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸よりも一酸化窒素の産生を抑制していた。このことはＲ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸よりもミクログリア活性化抑制作用が高いことを示している。
【0031】
実施例４：ミクログリアにおける細胞毒性試験
ミクログリアにおける細胞毒性を評価するために細胞毒性試験を行った。トリテルペン類であるマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸を６ｍＭ、Ｒ1-バリゲノールを２、４、６、８ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアに添加した。最終的な培地中のマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸の濃度は３０μＭ、Ｒ1-バリゲノールの濃度は１０、２０、３０、４０μＭとなった。添加２４時間後に細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ(プロメガ株式会社)を用いて評価した。
細胞生存率を測定した結果を図５、６に示した。ＬＰＳの添加は細胞生存率に影響を与えなかった。ＬＰＳ添加群の細胞生存率を１００とした場合の各群の細胞生存率を示している。図５に示すように、Ｒ1-バリゲノール ３０μＭ添加群はＬＰＳ添加群と同等の細胞生存率であり、細胞毒性は示されなかった。一方でマスリン酸、コロソリン酸３０μＭ添加群はＲ1-バリゲノール添加群と比べて細胞生存率が減少しており、Ｒ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸よりも細胞毒性が低く、安全性が高いことが示された。
図６にはＲ1-バリゲノールの濃度別の細胞生存率を示している。いずれの濃度においてもＬＰＳ添加群と細胞生存率は同等であった。このことは１０～４０μＭの濃度ではＲ1-バリゲノールにミクログリアに対する細胞毒性が認められないことを示している。参考文献のトリテルペン類と比較すると、参考文献２（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ. ２０１６, ７；２１（４）：４５９）においてカミヤツデ由来のトリテルペン類の細胞毒性が評価されているが、カミヤツデ由来のトリテルペン類の濃度１０μＭにおいて細胞生存率９０％以下である。一方、本実施例のＲ1-バリゲノールは４０μＭにおいてもＲ1-バリゲノールを添加しないＬＰＳ添加群１００に対し９７．３という高い細胞生存率を示しており、カミヤツデ由来のトリテルペン類に比べて安全性が高いと言える。
以上の実施例で示されるように、Ｒ1-バリゲノールは既存の植物由来成分と比べて、安全かつ効果的にミクログリア活性化を抑制することができる。
ミクログリアにおける細胞毒性を評価するために細胞毒性試験を行った。トリテルペン類であるマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸を６ｍＭ、Ｒ1-バリゲノールを２、４、６、８ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させサンプル液とし、実施例１と同様の方法でミクログリアに添加した。最終的な培地中のマスリン酸、コロソリン酸、オレアノール酸の濃度は３０μＭ、Ｒ1-バリゲノールの濃度は１０、２０、３０、４０μＭとなった。添加２４時間後に細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ(プロメガ株式会社)を用いて評価した。
細胞生存率を測定した結果を図５、６に示した。ＬＰＳの添加は細胞生存率に影響を与えなかった。ＬＰＳ添加群の細胞生存率を１００とした場合の各群の細胞生存率を示している。図５に示すように、Ｒ1-バリゲノール ３０μＭ添加群はＬＰＳ添加群と同等の細胞生存率であり、細胞毒性は示されなかった。一方でマスリン酸、コロソリン酸３０μＭ添加群はＲ1-バリゲノール添加群と比べて細胞生存率が減少しており、Ｒ1-バリゲノールはマスリン酸、コロソリン酸よりも細胞毒性が低く、安全性が高いことが示された。
図６にはＲ1-バリゲノールの濃度別の細胞生存率を示している。いずれの濃度においてもＬＰＳ添加群と細胞生存率は同等であった。このことは１０～４０μＭの濃度ではＲ1-バリゲノールにミクログリアに対する細胞毒性が認められないことを示している。参考文献のトリテルペン類と比較すると、参考文献２（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ. ２０１６, ７；２１（４）：４５９）においてカミヤツデ由来のトリテルペン類の細胞毒性が評価されているが、カミヤツデ由来のトリテルペン類の濃度１０μＭにおいて細胞生存率９０％以下である。一方、本実施例のＲ1-バリゲノールは４０μＭにおいてもＲ1-バリゲノールを添加しないＬＰＳ添加群１００に対し９７．３という高い細胞生存率を示しており、カミヤツデ由来のトリテルペン類に比べて安全性が高いと言える。
以上の実施例で示されるように、Ｒ1-バリゲノールは既存の植物由来成分と比べて、安全かつ効果的にミクログリア活性化を抑制することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】