特開2022-185222マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022185222
(43)【公開日】2022-12-14
(54)【発明の名称】マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20221207BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20221207BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20221207BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6888 Z ZNA
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021092745
(22)【出願日】2021-06-02
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】山口 華苗
(72)【発明者】
【氏名】俵田 隆哉
(72)【発明者】
【氏名】東田 悟
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】 試料中に存在するマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を特異的に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい検出方法を提供する。
【解決手段】マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチドを用いて検出する。
【選択図】 なし
【解決手段】マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチドを用いて検出する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
【請求項5】
一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
【請求項6】
前記一組のプライマーセットが、配列番号９に記載の配列にハイブリダイズする第一のプライマー、あるいは／および配列番号２４に記載の配列にハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする請求項４または５に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
【請求項7】
前記第一のプライマーが、配列番号９に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～２６塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号２４に記載の配列又は相補配列中、連続する１９～２６塩基からなることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
【請求項8】
請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、及び請求項６又は７に記載のプライマーを含んでなる、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス検出用試薬キット。
【請求項9】
配列番号１２に記載の配列である第一のプライマーと配列番号２５に記載の第二のプライマーを含んでなる、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
非結核性抗酸菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）はアブセッサス症の原因菌であり、人に病原性を示す。マイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスは他の非結核性抗酸菌と同様に環境常在菌であり、環境水、特に水道水が感染源と考えられているおり、アブセッサス症患者数は日本における非結核性抗酸菌症患者の中ではＭＡＣ症、カンサシー症に次いで多く、特にアブセッサス症は近年増加傾向にあるといわれている。アブセッサス症における感染部位は主に肺で、肺疾患を引き起し、また、稀にリンパ節、皮膚、泌尿器などへ感染して各種病変を引き起こす。また、肺アブセッサス症の臨床症状は結核とほぼ同様であることが知られている一方で、結核とは異なりヒトからヒトへの感染はしないと考えられている。したがって、結核の否定や治療方針の決定には臨床症状による診断のみではなく原因菌を同定することが非常に重要とされている。このことから、治療方針の早期策定のためにマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスを簡便、迅速かつ正確に同定することは大変重要とされている。
【0003】
一般にマイコバクテリウム・アブセッサスコンプレックスの同定検査はＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（特許文献１）、質量分析を用いた方法などにより同定されている。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションや質量分析は、多数の菌種を一度に同定することが可能であることから有用ではあるが、検体を用いた菌の培養操作が必要となるため迅速性に乏しく、早期に診断することができない問題がある。このため、培養操作を介さず迅速に検査を行うための、高感度かつ簡便な検査が望まれている。
【0004】
本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
【0005】
マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックスの属する非結核性抗酸菌は現在１９０種以上報告されており非常に多様性に富む一方で、その遺伝子配列は似通っているものも多い。したがって、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックスのみを鑑別することが可能なマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス遺伝子を、高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００６－６１１５５号公開
【特許文献2】特開２０００－１４４００号公報
【特許文献3】特開２００１－３７５００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、試料中に存在するマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌に由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
（２）前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（４）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（５）一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする（４）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（６）前記一組のプライマーセットが、配列番号９に記載の配列にハイブリダイズする第一のプライマー、あるいは／および配列番号２４に記載の配列にハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする（４）または（５）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（７）前記第一のプライマーが、配列番号９に記載の配列又は相補配列中、連続する１９～２６塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号２４に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～２６塩基からなることを特徴とする（４）から（６）のいずれかに記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（８）（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、及び（６）又は（７）に記載のプライマーを含んでなる、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス検出用試薬キット。
（９）配列番号１２に記載の配列である第一のプライマーと配列番号２５に記載の第二のプライマーを含んでなる、（８）に記載のキット。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基からなることを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
（２）前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識され、かつ相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（４）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（５）一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする（４）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（６）前記一組のプライマーセットが、配列番号９に記載の配列にハイブリダイズする第一のプライマー、あるいは／および配列番号２４に記載の配列にハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする（４）または（５）に記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（７）前記第一のプライマーが、配列番号９に記載の配列又は相補配列中、連続する１９～２６塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号２４に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～２６塩基からなることを特徴とする（４）から（６）のいずれかに記載のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法。
（８）（１）から（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、及び（６）又は（７）に記載のプライマーを含んでなる、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス検出用試薬キット。
（９）配列番号１２に記載の配列である第一のプライマーと配列番号２５に記載の第二のプライマーを含んでなる、（８）に記載のキット。
【0010】
以下に本発明を詳細に説明する。
【0011】
本発明中において試料とは、喀痰、胃液、胸水、腹水、尿などの体液や気管支洗浄液、組織、培養液などがあげられる。
【0012】
本発明において、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列とは、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡに配列のうち、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５７７５番目から１４６６０１２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列を含む連続した２５０塩基以下の塩基配列のことをいう。
【0013】
すなわち本発明では、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が検出されることになる。
【0014】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0015】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの一例として、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドがある。前記オリゴヌクレオチドはマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
【0016】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドとして、特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸と相補的な配列をもち、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５９２６番目から１４６５９４２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列中、少なくとも１４塩基からなる連続する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドをあげることができる。中でもより好ましくは、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補配列と相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド、配列番号７に記載の塩基配列またはその相補配列と相補的な配列でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0017】
本発明における条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、前述した条件下で、前記特定塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【0018】
本発明は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５９６９番目から１４６６０１０番目までの塩基配列）またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号２３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＵ４５８８９６．１の１４６５７７５番目から１４６５９１８番目までの塩基配列）またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
【0019】
その中でも第一のプライマー及び第二のプライマーが１６～２６塩基からなることが好ましい。
【0020】
第一のプライマーの一例として、配列番号１０に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１９～２６塩基であるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0021】
第ニのプライマーの一例として、配列番号２３に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１６～２６塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0022】
中でもマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号１４と６５、１４と７１、１６と６５、１６と６７、１６と７１、２２と６５、２２と６７、２２と７１、２０と６５、２０と６７、２０と６９、２０と７３、１８と６３、１８と６５、１８と６９、１２と２５、１２と２７、１２と２９、１２と３１、１２と３３、１２と３５、１２と３７、１２と３９、１２と４１、１２と４３、１２と４５、１２と４７、１２と４９、１２と５１、１２と５３、１２と５５、１２と５７、１２と５９、１２と６１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。
【0023】
本発明のプライマーセットは、ＲＴ－ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号７３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【0024】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いてマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１０記載の塩基配列またはその相補配列とで特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号２３記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号３またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列に対し、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
（１）配列番号１０記載の塩基配列またはその相補配列とで特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号２３記載の塩基配列またはその相補配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号３またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列に対し、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
【0025】
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。
【0026】
前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１４から２６塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。
【0027】
前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。
【0028】
前述した態様によるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含むマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号３～８記載の塩基配列からなるものが好ましい。
【発明の効果】
【0029】
本発明のオリゴヌクレオチドは、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にハイブリダイズすることより、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に検出させることができる。
【0030】
本発明のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを用いたマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出方法は、試料中に含まれるマイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌を迅速、高感度に検出でき、かつ偽陽性の発生も極めて少なく特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。
【実施例0031】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【0032】
実施例１ 標準ＲＮＡ調製 もしくは菌培養液の希釈物
後述の実施例で使用する、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の亜種のひとつであるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）標準ＲＮＡ、およびマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）を以下に示す方法で調製した。なお調製した標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡ
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。
（２）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。
後述の実施例で使用する、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の亜種のひとつであるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）標準ＲＮＡ、およびマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）を以下に示す方法で調製した。なお調製した標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡ
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。
（２）マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の一種であるマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡを調製した。
【0033】
実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号７に記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号３おいては５’末端から５番目のチミンと６番目のアデニンとの間に、配列番号５及び７においては、５’末端から３番目のチミンと４番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号７に記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号３おいては５’末端から５番目のチミンと６番目のアデニンとの間に、配列番号５及び７においては、５’末端から３番目のチミンと４番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
【0034】
実施例３ マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス２３Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡおよびマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ（実施例１（１）、実施例１（２））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス標準ＲＮＡおよびマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ標準ＲＮＡ（実施例１（１）、実施例１（２））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
【0035】
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号５３）を付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
７５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０３８ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号５３）を付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
７５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０３８ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
【0036】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１１．５０％ ジメチルスルホキシド
２０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１０４ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
１１．５０％ ジメチルスルホキシド
２０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１０４ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
【0037】
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．６０を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１、２及び３に示す。実験は、各々の組合せごとに２回数測定し、その平均値を使用した。「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．６０以下（陰性判定）であったことを意味する。
【0038】
マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス２３Ｓ ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０１からＡ１９、Ａ３８、Ａ３９のうち、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス２３Ｓ ｒＲＮＡを２０分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ３８、Ａ３９は１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス２３Ｓ ｒＲＮＡを平均で５分以内に検出しており、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・アブセッサス２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【0039】
マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ２３Ｓ ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせＡ２０からＡ３９のうち、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ２３Ｓ ｒＲＮＡを平均で５分以内に検出しており、マイコバクテリウム・アブセッサス サブスピーシーズ・マシリエンセ２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【0040】
【表1】
【0041】
マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックスには、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・アブセッサス、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・ボレッティ、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・マシリエンセの三種類の亜種が存在する。
【0042】
本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、検出時間が５分以内であった組合せのうちからＡ３９を用いて、 マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の亜種全種類の検出（表２）及び交差反応性（表３）を実施した。
【0043】
マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の検出については、２ＣＦＵ／ｔｅｓｔのマイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・アブセッサス、マイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・ボレッティ、あるいはマイコバクテリウム・アブセッサス・サブスピーシーズ・マシリエンセを検出した。交差反応性については、２×１０５ＣＦＵ／ｔｅｓｔの非結核性抗酸菌２０菌種を検出せず、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、マイコバクテリウム・アブセッサス コンプレックス菌の２３Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【0044】
【表2】
【0045】
【表3】
【配列表】