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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022189469
(43)【公開日】2022-12-22
(54)【発明の名称】マクロファージ老化抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/706 20060101AFI20221215BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221215BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221215BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20221215BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221215BHJP
【ＦＩ】
A61K31/706
A61P43/00 107
A61P35/00
A61K9/127
C12N15/12 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021098060
(22)【出願日】2021-06-11
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100124800
【弁理士】
【氏名又は名称】諏澤 勇司
(74)【代理人】
【識別番号】100140888
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 欣乃
(72)【発明者】
【氏名】和田 はるか
(72)【発明者】
【氏名】清野 研一郎
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA95
4C076CC27
4C076FF70
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB22
4C086ZB26
(57)【要約】
【課題】良好に機能する免疫系を備える個体における腫瘍発生のメカニズムを研究し、それに基づき、癌発生及びそれに関連する症状を治療及び／又は予防するための医薬組成物を提供すること。
【解決手段】本発明の組成物は、有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチドを含む、マクロファージの老化を抑制するための組成物であり、また、癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制する組成物である。
【選択図】図２３
【解決手段】本発明の組成物は、有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチドを含む、マクロファージの老化を抑制するための組成物であり、また、癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制する組成物である。
【選択図】図２３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチドを含む、マクロファージの老化を抑制するための組成物。
【請求項2】
癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記癌が、脳腫瘍、腎臓癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌及び大腸癌からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
マクロファージ又は癌組織を標的とする薬物送達システムを有する製剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マクロファージの老化を抑制するための組成物、及び、癌を治療又は予防するための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
癌組織における癌細胞は不均一である。腫瘍開始細胞(又は癌幹細胞)の理論は、いくつかの腫瘍における癌細胞間の表現型及び機能の不均一性を説明し得る（非特許文献１）。この理論によれば、特定の腫瘍細胞（腫瘍開始細胞又は癌幹細胞）のみが腫瘍形成を開始することができる。これらの腫瘍開始細胞は多くの薬剤に対して感受性が低く、また、抵抗性が高いため、多くの患者で癌の再発の原因と考えられている。したがって、これらの腫瘍開始細胞を標的とする治療は、癌に対する重要な治療戦略である（非特許文献２）。
【0003】
腫瘍開始細胞の同定は、免疫不全動物で最も多く行われているが、実は免疫細胞は最も重要な腫瘍組織成分の一つであり、腫瘍治療の結果に影響を及ぼすことが示唆されている（非特許文献３）。したがって、宿主の免疫系が腫瘍の発生に影響を及ぼすと仮定できる。腫瘍細胞が、宿主の免疫不全レベルの増加に依存して効率的に発生することが報告されている（非特許文献４）。したがって、腫瘍は既存の宿主免疫細胞の攻撃を生き延びた腫瘍細胞のみによって形成され、これらの生き延びた腫瘍細胞は腫瘍開始細胞として認識される。すなわち、腫瘍発生及び腫瘍開始細胞の性質は、宿主の免疫系の影響を受ける。
【0004】
腫瘍発生研究で頻繁に使用される免疫不全マウスとは対照的に、健常な個体は良好に機能する免疫系を有する。免疫不全マウスで同定された腫瘍開始細胞とそのメカニズムは、免疫能が正常な個体には適用できないことがあり得る。したがって、健常な個体における腫瘍開始細胞及び腫瘍発生のメカニズムを同定することは、腫瘍生物学及び最終的には腫瘍治療法の開発において極めて重要である。
【0005】
一方で、ＮＭＮ（ニコチンアミドモノヌクレオチド、ＮＡＤの前駆体）は、細胞のエネルギー代謝に必要な補酵素「ＮＡＤ＋」の生合成中間代謝産物であるが、加齢に伴い減少することが知られている。最近の研究では、ＮＡＤ前駆体ＮＭＮのｉｎ ｖｉｖｏ分解に関与する主要な酵素はＣＤ３８であることが明らかになった（非特許文献５、６）。ＮＡＤレベルは加齢とともに低下し、加齢に関連した代謝低下に関与するため、ＮＡＤを外部から供給することは老化を防止する可能性がある（非特許文献５）。
【0006】
しかしながら、ＮＭＮは細胞の代謝改善効果を有するため、癌細胞の増殖も活性化させる可能性がある。したがって、癌治療において、ＮＡＤ発生に関与する酵素の阻害剤に関する治験が多数行われている。同様のことから、ＮＭＮを癌の発生阻害及び治療に使おうという発想はあまりない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Meacham CE, Morrison SJ. Tumourheterogeneity and cancer cell plasticity. Nature 501, 328-337 (2013).
【非特許文献2】Frank NY, Schatton T, Frank MH.The therapeutic promise of the cancer stem cell concept. J Clin Invest 120,41-50 (2010).
【非特許文献3】Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, OldLJ, Schreiber RD. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumorescape. Nat Immunol 3, 991-998 (2002).
【非特許文献4】Quintana E, Shackleton M, SabelMS, Fullen DR, Johnson TM, Morrison SJ. Efficient tumour formation by singlehuman melanoma cells. Nature 456, 593-U533 (2008).
【非特許文献5】Camacho-Pereira J, et al. CD38Dictates Age-Related NAD Decline and Mitochondrial Dysfunction through anSIRT3-Dependent Mechanism. Cell Metab 23, 1127-1139 (2016).
【非特許文献6】JohnathanR. Yarbro et al. MacrophageImmunometabolism and Inflammaging: Roles of Mitochondrial Dysfunction, CellularSenescence, CD38, and NAD. Immunometabolism. 2020; 2(3)
【非特許文献7】Takuichiro Hide et al. Sox11Prevents Tumorigenesis of Glioma-Initiating Cells by Inducing NeuronalDifferentiation. Cancer Res 2009; 69(20): 7953-7959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、良好に機能する免疫系を備える個体における腫瘍発生のメカニズムを研究し、それに基づき、癌発生及びそれに関連する症状を治療及び／又は予防するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、鋭意研究の結果、腫瘍微小環境中のマクロファージが細胞老化を起こし、結果的に免疫健常個体で腫瘍発生を許容してしまうことを見出した。さらに、マクロファージの老化を抑制するために、意外にもニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）が有効であることを見出し、本発明の完成に至った。
【0010】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチドを含む、マクロファージの老化を抑制するための組成物。
［２］
癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制する、［１］に記載の組成物。
［３］
前記癌が、脳腫瘍、腎臓癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌及び大腸癌からなる群より選択される、［２］に記載の組成物。
［４］
マクロファージ又は癌組織を標的とする薬物送達システムを有する製剤である、［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［１］
有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチドを含む、マクロファージの老化を抑制するための組成物。
［２］
癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制する、［１］に記載の組成物。
［３］
前記癌が、脳腫瘍、腎臓癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌及び大腸癌からなる群より選択される、［２］に記載の組成物。
［４］
マクロファージ又は癌組織を標的とする薬物送達システムを有する製剤である、［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明の組成物によれば、マクロファージの細胞老化を抑制し、それによって個体の免疫を活性化し、さらに、マクロファージの浸潤を有する癌を治療又は予防、或いは、癌の進行を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】予備実験例１における、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖曲線（ａ）、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞移植後のＣ５７ＢＬ／６マウスの生存率を示すグラフ（ｂ）、並びに、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存率を示すグラフ（ｃ）である。
【図2】予備実験例２における８Ｂ細胞移植後のマウス脳の蛍光顕微鏡画像である。
【図3】予備実験例２における９Ｇ細胞移植後のマウス脳の蛍光顕微鏡画像である。
【図4】実験例１における、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の全脾細胞と８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞とを共培養した後の、免疫細胞マーカーの解析結果を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図5】実験例１における、Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞の培養上清と共培養して得られたマクロファージの形態を示す位相差顕微鏡画像である。
【図6】実験例１における、８Ｂ－Ｍφ又は９Ｇ－ＭφをＳＡ－β－Ｇａｌで染色し顕微鏡画像（（ａ）左側の画像）、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の割合（（ａ）右側のグラフ）、並びに、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞の移植後に形成された脳腫瘍をＳＡ－β－Ｇａｌ染色染色し顕微鏡画像（ｂ）である。
【図7】実験例１における、８Ｂ上清－Ｍφ、９Ｇ上清－Ｍφ、Ｍ０－Ｍφ、Ｍ１－Ｍφ及びＭ２－Ｍφにおける各種細胞老化に関連する遺伝子の発現を解析したグラフである。
【図8】実験例１における、８Ｂ上清又は９Ｇ上清で共培養した細胞における各種遺伝子の発現を解析したフローサイトメトリーブロット（ａ）、及び、各細胞集団をＤｉｆｆ－ｑｕｉｃｋ染色した結果を示す顕微鏡画像（ｂ）である。
【図9】実験例１における、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植した後の蛍光顕微鏡画像（ａ）、ＣＤ３ε＋細胞におけるＣＤ３ζ＋細胞の割合を示すグラフ（（ｂ）の左側）、並びに、ＣＤ３ε＋集団におけるＣＤ３ζ＋又はＣＤ３ζ－細胞中のＩＦＮγ＋細胞の割合を示すグラフ（（ｂ）の右側）である。
【図10】実験例２における、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞によって分泌されるサイトカインをサイトカイン／ケモカインアレイアレイにより解析した結果を示すグラフである。
【図11】実験例２における、混合サイトカイン及び５つのサイトカインのそれぞれを除いた混合サイトカインによって誘導したＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図12】実験例２における、５つの細胞シグナル経路阻害剤によるＩＬ－６分泌への影響を示すグラフである。
【図13】実験例２における、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞におけるＲＯＳ産生を示すグラフである。
【図14】実験例３における、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ及び８Ｂ－ｍｏｃｋによるＩＬ－６分泌量を示すグラフ（ａ）、及び、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ及び８Ｂ－ｍｏｃｋのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖能を示すグラフ（ｂ）である。
【図15】実験例３における、Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ－ｍｏｃｋ培養上清又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞培養上清で培養した後の細胞形態を示す位相差顕微鏡画像である。
【図16】実験例３における、Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ－ｍｏｃｋ培養上清又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞培養上清で培養した後の細胞の遺伝子発現を解析したグラフである。
【図17】実験例３における、８Ｂ－ｍｏｃｋ細胞又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞を、免疫不全マウスＮＯＤ／ＳＣＩＤ又は免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植し田後のマウスの生存率を記録したグラフである。
【図18】実施例１における、８Ｂ上清又は９Ｇ上清培養ＭφのＣＤ３８ｍ発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図19】実施例１における、ＮＭＮ添加／非添加の８Ｂ上清中培養したＦ４／８０＋細胞を観察した顕微鏡画像である。
【図20】実施例１における、ＮＭＮ添加／非添加の８Ｂ上清中培養したＦ４／８０＋細胞におけるＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図21】実施例１における、ＮＭＮ添加／非添加の８Ｂ上清中培養したＦ４／８０＋細胞におけるアルギナーゼ－１陽性細胞を示すフローサイトメトリーブロット、並びに、アルギナーゼ－１陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図22】実施例１における、８Ｂ－Ｍφ又はＭ－ＣＳＦ－ＭφにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図23】実施例１における、８Ｂ細胞を免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植したのち、ＮＭＮ又は生理食塩水を投与した際の生存率を示すグラフである。
【図24】実施例１における、ＢＡＬＢ／ｃ免疫応答性マウスにＣＴ２６細胞を皮下注射したのち、ＮＭＮ又は生理食塩水を投与した際の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の組成物は、マクロファージの老化を抑制するための組成物であり、有効成分としてニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を含む。
【0014】
マクロファージの老化とは、いわゆる細胞老化を意味し、細胞の扁平化、肥大化、細胞分裂抵抗性及びβ-ガラクトシダーゼ活性陽性等を特徴とする。マクロファージの老化は、その形態によって、例えば、細胞の平坦化若しくは肥大化によって判別することができる。また、老化したマクロファージに選択的に発現するマーカー、例えば、強力な免疫抑制分子であるアルギナーゼ－１（Ａｒｇｉｎａｓｅ－１）、及び細胞周期進行の調節因子であるｐ２１等の発現量の増加によっても決定することができる。特に、アルギナーゼ－１の発現が陽性であり、抑制性マクロファージであるＭ２マクロファージのマーカーであるＲｅｔｎｌα（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ａｌｐｈａ）の発現が陰性であることを確認することで、老化マクロファージと同様にアルギナーゼ１を発現するＭ２マクロファージとの差別化が可能であるため、マクロファージの老化の判定に有効である。
【0015】
本発明者らは、後述の実験によって、腫瘍細胞由来のＩＬ－６によってマクロファージ老化を引き起こし、老化マクロファージは免疫抑制分子を高発現し、Ｔ細胞のＣＤ３ζ発現を低下させ、不活性化させることを証明した。このことにより、局所に免疫特権部位が形成され、免疫健常個体においても腫瘍の発生及び増殖を許容させていると考えられる。一方で、腫瘍随伴老化マクロファージはＣＤ３８を高発現することを発見し、ＣＤ３８は老化に伴い発現が増加するＮＡＤａｓｅであり、ＮＡＤを減少させ、各種の老化関連現象を誘導すると考えられる。ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）はＮＡＤの前駆体であり、細胞や生体に投与することでＮＡＤを増加させる。ＮＭＮ添加で、マクロファージの老化を抑制し、老化回避したマクロファージではＡｒｇｉｎａｓｅ－１の発現が低下し、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化能が回復する。その結果、ＮＭＮの投与は、マクロファージの老化を抑制し、免疫特権部位の発生を阻止することで腫瘍発生に対する免疫監視を有効化させる働きがあると考えられる。また、上記推測されるメカニズムに鑑みて、ＮＡＤを増加させることができる他の物質も、ＮＭＮと同様にマクロファージの老化を抑制し、腫瘍発生を抑制できる可能性がある。
【0016】
すなわち、本発明の組成物は、癌を治療若しくは予防する又は癌の進行を抑制するための組成物であり、有効成分としてＮＭＮを含む。癌の治療効果又は再発予防効果又は癌の進行の抑制効果は、画像診断等で腫瘍サイズの縮小又は再発の無いこと又は転移の無いことを確認すること、腫瘍マーカーが正常化することなどの補助手段を用い、医師が判断する。
【0017】
本発明における癌は特に限定されないが、マクロファージを含めた免疫細胞の浸潤を有する癌であることが好ましい。このような癌（腫瘍）としては、脳腫瘍、腎臓癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌及び大腸癌からなる群より選択されることが好ましく、特に脳腫瘍又は大腸癌であることが好ましい。
【0018】
組成物におけるＮＭＮは、対象動物によって異なり得るが、例えばヒトの場合、１００ｍｇ／Ｋｇ／日～１０００ｍｇ／日、好ましくは２５０ｍｇ／日～５００ｍｇ／日の配合量となるように、配合されていることが好ましい。
【0019】
本発明の組成物は、医薬組成物であってもよく、医薬組成物としては、有効成分のニコチンアミドモノヌクレオチドの他に、製薬上許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、医薬組成物の製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、例えば、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等を用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、他のマクロファージ老化防止成分、他の抗がん剤を含んでいてもよい。
【0020】
本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されず、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。剤形も特に限定されず、ドリンク剤、シロップ、ゼリー、凍結乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等の剤形であってもよい。
【0021】
本発明の医薬組成物は、有効性及び安全性を高めるため、マクロファージ又は癌組織を標的とする薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム、ＤＤＳ）を有する製剤であることが好ましい。このような薬物送達システムを有する製剤は、特に限定されず、既知のＤＤＳ手法に基づく、マクロファージ又は癌組織を特異的又は選択的に送達される製剤であればよい。例えば、リポソーム化製剤等を挙げることができる。リポソーム製剤とは、リポソームに封入した有効成分（すなわち、ＮＭＮ）を含有する医薬組成物である。一般的に、癌組織は正常組織よりも、血管壁の間隙が大きい（数十ナノメートル）ため、１０～１００ｎｍの粒子径を有するリポソーム製剤であれば、血管から漏れ出し、癌組織に留まりやすくなると思われる。一方、マクロファージへのＤＤＳは、マクロファージの貪食能を利用して、マクロファージに貪食されやすい径及び脂質組成を有するリポソーム製剤であれば、マクロファージに効率よく取り込まれる。腫瘍随伴マクロファージを標的とした場合、リポソーム製剤の粒子径が１００ｎｍ程度であることが好ましい。
【0022】
ＮＭＮのリポソーム製剤の製造方法としては、特に限定されず、一般的なリポソーム製剤の製造方法であればよい。例えば、送達目的に応じて、適宜な各脂質の比（モル比又は重量比）を決め、所定の平均粒子径を有するリポソームの形成と同時に、又は当該リポソームを形成した後に、ＮＭＮをリポソームに封入することによって製造することができる。リポソーム製剤は、有効成分のＮＭＮ及びリポソームを構成する脂質の他に、必要に応じてｐＨ調整剤、安定化剤などの添加剤を含んでもよい。
【0023】
本発明の組成物が食品組成物であってもよく、特に、保健、健康維持、健康増進等を目的とする食品、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品又は栄養機能食品等であってよい。本発明の食品組成物は、サプリメントである場合、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、散剤、ドリンク剤、ゼリー等の形態であってもよい。
【0024】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例0025】
予備実験例１ マウス誘導性膠芽腫細胞株８Ｂ及び９Ｇ
免疫応答性個体における腫瘍開始の必要性を分析するために、本発明者らが以前樹立した膠芽腫細胞株８Ｂ及び９Ｇ（非特許文献７）を使用した。該細胞株は、ｐ５３をノックアウトしたＣ５７ＢＬ／６マウス胎仔の神経幹細胞にＨ－ＲａｓＬ６１遺伝子を強制発現させて得られたものである。なお、すべての動物実験は北海道大学動物実験委員会の承認を受けた。
免疫応答性個体における腫瘍開始の必要性を分析するために、本発明者らが以前樹立した膠芽腫細胞株８Ｂ及び９Ｇ（非特許文献７）を使用した。該細胞株は、ｐ５３をノックアウトしたＣ５７ＢＬ／６マウス胎仔の神経幹細胞にＨ－ＲａｓＬ６１遺伝子を強制発現させて得られたものである。なお、すべての動物実験は北海道大学動物実験委員会の承認を受けた。
【0026】
８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を９６ウェルプレートに１０４個／１００μＬ／ウェルで播種し、グリオーマ培地（５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２及び５ｍｌのＤＭＥＭ培地中に０．５％のＮ２サプリメント（ＷＡＫＯ）、３１．５μｇ／ｍｌのＮ―アセチルシステイン（ナカライテスク）、２．５μＭのホルスコリン（ＷＡＫＯ）、５ｎｇ／ｍｌのビオチン（ＷＡＫＯ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ナカライテスク）、１％のグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２．５μｇ／ｍｌのヘパリン、５％のウシ胎仔血清（ＳＩＧＭＡ、米国）、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＥＧＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国）、１０ｎｇ／ｍｌのマウスｂＦＧＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国））を含む）にて、３７℃、５％ＣＯ２で１週間培養した。細胞数を毎日カウントし、その結果を図１の（ａ）に示す。図中のエラーバーは、単一の実験における３つのウェルの計数からの標準偏差を示す。図１の（ａ）から、細胞株８Ｂ及び９Ｇはｉｎ ｖｉｔｒｏでほぼ同様の増殖プロフィールを示したことが分かった。
【0027】
８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を免疫応答性マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー株式会社）の脳に移植した。具体的には、１０３個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を３μＬの生理食塩水に懸濁し、ハミルトンシリンジを用いて、穿孔（Ｉｄｅａｌマイクロドリル、穿孔径０．６ｍｍ）により形成された頭蓋骨孔を通して、ドミトール／ミダゾラム／ベトルファールの三剤混合麻酔（投与量各：０．３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウスの脳（ｎ＝２７）に移植した。８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞をマウス脳に３０秒間を掛けて注入し、シリンジをさらにその場に３０秒間留置した。移植後のマウスの生存を記録し、その結果を図１の（ｂ）に示す（＊＊ｐ＜０．０１、一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。図１の（ｂ）から、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、８Ｂ細胞を移植したマウスの生存率が９Ｇ細胞を移植したマウスの半分以下であった。すなわち、免疫応答性マウスにおいて、８Ｂは腫瘍形成性であったのに対して、９Ｇは腫瘍形成性ではなかった若しくは腫瘍形成が弱かったことが分かった。
【0028】
同様に、１０３個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を、麻酔した免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ（日本クレア）の脳（ｎ＝５）に移植し、移植後の生存率を記録し、その結果を図１の（ｃ）に示す（ｎｓ：有意差なし、一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。図１の（ｃ）から、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞のどちらも腫瘍を形成し、最終的にすべてのマウスが死亡したことが分かった。すなわち、免疫応答性マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスでの結果とは対照的に、免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでは８Ｂ細胞も９Ｇ細胞も腫瘍形成性であった。これらの結果は、宿主の免疫不全のレベルが腫瘍細胞株の腫瘍形成能力に影響を及ぼしていることを示唆した。
【0029】
さらに、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞における、周知の膠芽腫開始細胞のマーカーであるＣＤ１３３の発現を抗体染色によって検出した。しかしながら、どちらの細胞においてもＣＤ１３３の発現が検出されなかった（データを示さず）。
【0030】
予備実験例２ ８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞が形成した腫瘍微小環境への免疫細胞の浸潤
予備実験例１と同様に、１０３個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植した。移植２８日後、移植した全脳組織を摘出し、浸潤免疫細胞を種々の免疫細胞マーカーにて免疫蛍光染色した。
予備実験例１と同様に、１０３個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植した。移植２８日後、移植した全脳組織を摘出し、浸潤免疫細胞を種々の免疫細胞マーカーにて免疫蛍光染色した。
【0031】
摘出した全脳組織試料をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標） ＯＣＴ（サクラファインテックジャンパン株式会社）に埋め込んだ。次に、５μｍ厚の切片をヘマトキシリン／エオジンで染色した。免疫組織化学分析のために、切片を一次抗体で染色し、次いで蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標） ５５５と結合した適切な二次抗体で処理した。使用した一次抗体は、抗マウスＣＤ３抗体（１７Ａ２）、抗マウスＣＤ１９抗体（６Ｄ５）、抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（１Ａ８）、抗マウスＬｙ６Ｃ抗体（ＨＫ１．４）、抗マウスＦ４／８０抗体（ＢＭ８）、抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０）、抗マウスＣＤ１６９抗体（３Ｄ６．１１２）、抗マウスＣＤ１１Ｃ抗体（Ｎ４１８）であった。これらの一次抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国）から購入した。二次抗体として、抗マウスＣＤ１１ｃ抗体に対してはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標） ５５５標識抗ハムスターＩｇＧ抗体を、それ以外の抗体に対してはＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標） ５５５標識抗ラットＩｇＧ抗体を使用した。これらの二次抗体はサーモフィッシャー社（米国）から購入した。細胞核は４´，６－ジアミジノ－２－フェニルイドル二塩酸塩（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で染色した。
【0032】
蛍光染色した細胞は、蛍光顕微鏡（カールツアイス社（ドイツ）、Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１）にて観察した。その代表的な蛍光画像を図２（８Ｂ）及び図３（９Ｇ）に示す。図２及び図３の結果から、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞が形成した脳腫瘍組織のどちらにおいても、ＣＤ１１ｂ陽性（ＣＤ１１ｂ＋）細胞、Ｆ４／８０陽性（Ｆ４／８０＋）細胞の顕著な浸潤が認められ、また、ＣＤ１１ｃ陽性（ＣＤ１１ｃ＋）細胞の少数の集団が確認された。さらに、少数のＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）Ｔ細胞及びいくつかのＣＤ１９陽性（ＣＤ１９＋）細胞又はＬｙ６Ｇ陽性（Ｌｙ６Ｇ＋）細胞も観察された。ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０は主にマクロファージ、ＣＤ１１ｃは樹状細胞、ＣＤ３は主にＴ細胞、ＣＤ１９はＢ細胞、Ｌｙ６Ｇは主に顆粒球のマーカーとして知られている。したがって、予備実験例２の結果は、膠芽腫モデルにおいて腫瘍へのマクロファージ等の免疫細胞の浸潤が存在し、腫瘍細胞と免疫細胞との相互作用がある可能性が高いことを示唆した。
【0033】
実験例１ ８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞によるマクロファージに対する影響
腫瘍細胞と免疫細胞との相互作用を確認するために、腫瘍細胞と脾臓免疫細胞との共培養実験を行った。
腫瘍細胞と免疫細胞との相互作用を確認するために、腫瘍細胞と脾臓免疫細胞との共培養実験を行った。
【0034】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を採取した。脾臓は単一細胞となるようにすりガラスで圧迫してすりつぶし、全細胞を採集した。採集した全脾細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；同人化学）で蛍光標識した。次いで、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のウシ胎仔血清（ＳＩＧＭＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ナカライテスク）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ナカライテスク）、１％の非必須アミノ酸（ナカライテスク）、５０μＭの２－メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）１％のＬ－グルタミンを含む）中、３７℃、５％ＣＯ２で、４×１０６個のマウス全脾細胞と、０．８×１０６個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞と４日間共培養した。
【0035】
得られた細胞を、種々の免疫細胞マーカーで染色し、各免疫細胞におけるＣＦＳＥ蛍光の減少をフローサイトメトリーで解析した。フローサイトメトリーは、フローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）又はＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて実施し、データはＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、米国）を用いて分析した。使用した一次抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した、抗マウスＣＤ３抗体（１７Ａ２）、抗マウスＣＤ４抗体（ＲＭ４－５）、抗マウスＣＤ８抗体（５３－６．７）、抗マウスＣＤ４５Ｒ抗体（Ｂ２２０）、抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０）、抗マウスＣＤ１１Ｃ抗体（Ｎ４１８）、抗マウスＦ４／８０抗体（ＢＭ８）、及び抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（１Ａ８）であった。対応するアイソタイプコントロール抗体もＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。生細胞を、前方及び側方散乱、並びにＤＡＰＩ又はヨウ化プロピジウム取り込みの欠如に基づいてゲートした。全ての抗体を１：１００希釈で使用した。
【0036】
フローサイトメトリーの結果を図４に示す。図４では、８Ｂ細胞と共培養して得られた細胞（８Ｂ共培養細胞）における免疫細胞の増殖を破線のヒストグラムで示し、９Ｇ細胞と共培養して得られた細胞（９Ｇ共培養細胞）を実線のヒストグラムで示す。Ｆ４／８０＋細胞又はＣＤ１１ｂ＋細胞はマクロファージ（Ｍφ）であり、９Ｇ共培養ではＭφは効率的に増殖したものの、８Ｂ共培養では増殖が抑制された（図４）。さらに、全脾細胞を後述の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞の培養上清を含む培地で１１日間培養し、得られた細胞を同様に免疫染色し、フローサイトメトリーにより解析した結果、生成したＣＤ１１ｂ＋細胞の前方散乱及び側方散乱を示したことが確認された（データを示さず）。すなわち、８Ｂ細胞の代わりに８Ｂ細胞の培養上清を用いた場合においても、マクロファージの増殖の抑制が認められた。これらの結果から、腫瘍細胞により分泌される何等かの可溶性因子がマクロファージの挙動に影響することを示唆した。
【0037】
Ｆ４／８０＋細胞を、キャップ式磁性アタッチメント（ＭＡＣＳ）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（登録商標）、ドイツ）を用いて磁気的に選別した。得られたＦ４／８０＋細胞（マウスマクロファージ）を８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞の培養上清を含む培地と共に１４日間培養した。培養上清を含む培地としては、８×１０６個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を、１０ｍＬのグリオーマ培地中で４日間培養した後、上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、得られた培養上清に対し２０％（ｖ／ｖ）のＲＰＭＩ１６４０培地を含有する培地を混合したものを使用した。
【0038】
培養後得られたＦ４／８０＋細胞（マクロファージ）の形態を光学顕微鏡（ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社）で観察し、結果を図５に示す。細胞塗抹標本には、サイトスピン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、細胞染色にはＤｉｆｆ－Ｑｕｉｋ ｓｔａｉｎ（商標、シスメックス株式会社）を用いた。図５から、８Ｂ細胞培養上清で培養したマクロファージ（８Ｂ－Ｍφ）と９Ｇ細胞培養上清で培養したマクロファージ（９Ｇ－Ｍφ）とは明らかに形態が異なっていたことが分かった。８Ｂ－Ｍφの大部分は、９Ｇ－Ｍφと比較して平坦で肥大した外観を示し、この結果はフローサイトメトリーの結果（データを示さず）とも一致した。
【0039】
８Ｂ－Ｍφの形態は、老化様状態の細胞の形態と似ていたため、老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－Ｇａｌ）アッセイを用いて、Ｍφが老化状態であるかどうか調べた。Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞の培養上清と共に１４日間培養して得られた８Ｂ－Ｍφ又は９Ｇ－Ｍφを回収し、下記のようにＳＡ－β－Ｇａｌで染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いで、５ｍＭ フェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５ｍｇ／ｍＬのＸ－Ｇａｌを含む水溶液に添加し、細胞を３７℃で１６時間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡（ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社）下で観察した。顕微鏡画像を図６ （ａ）（左側の画像）に示す。
【0040】
また、顕微鏡下で少なくとも５５０個の細胞を６つの異なる視野で計数し、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の割合を算出した。算出結果を図６ （ａ）（右側のグラフ）に示す。白丸は、各視野からのＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の割合（％）を示し、黒棒は割合の平均値を示す（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【0041】
図６ （ａ）から、平坦化及び肥大化したＭφはβ－ガラクトシダーゼ活性を示し、β－ガラクトシダーゼ陽性Ｍφの割合は、９Ｂ－Ｍφより８Ｇ－Ｍφのほうが高かったことが分かった。
【0042】
さらに、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞をマウス脳へ移植後に形成された脳腫瘍に対しても同様にＳＡ－β－Ｇａｌ染色を行い、顕微鏡にて観察した（図６ （ｂ））。図６ （ｂ）から、は、８Ｂ移植脳の腫瘍周辺においてβ－ｇａｌ陽性（染色）細胞が認められたものの、９Ｇ移植脳では有意なβ－ｇａｌ陽性（染色）細胞は認められなかった。
【0043】
また、上記マウス全脾細胞由来のＦ４／８０＋細胞を８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞の培養上清を含む培地と共に培養した。さらに、Ｒｉｑｕｅｌｍｅら（Ｒｉｑｕｅｌｍｅ Ｐ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３， ２１：４０９－４２２．）の方法に従って、Ｆ４／８０＋Ｍφにそれぞれ（１）０．１％生理食塩水、（２）２５ｎｇ／ｍｌのインターフェロンγ及び１００μｇ／ｍｌのリポポリサッカライド、又は、（３）２５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－４を添加し、２４時間培養して、（１）Ｍ０－Ｍφ、（２）Ｍ１－Ｍφ、（３）Ｍ２－Ｍφを誘導した。
【0044】
Ｍφにおける細胞老化に関連する遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した。Ｔｒｉｐｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、細胞からＲＮＡを抽出、単離した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いて逆転写を行った。ＰＣＲ分析は、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳｔｅｐ Ｏｎｅ（商標）リアルタイムＰＣシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。使用したプライマーは、以下のとおりであった。
ｐ２１フォーワードプライマー：5’-CTGAGCGGCCTGAAGATTCC-3’（配列番号１）
ｐ２１リバースプライマー：5’-CCAATCTGCGCTTGGAGTGA-3’（配列番号２）
ｐ１６Ｉｎｋ４ａフォーワードプライマー：5’-GGGTTTCGCCCAACGCCCCGA-3’（配列番号３）
ｐ１６Ｉｎｋ４ａリバースプライマー：5’-TGCAGCACCACCAGCGTGTCC-3’（配列番号４）
ｐ１９Ａｒｆフォーワードプライマー：5’-GATCTTGAGAAGAGGGCCGC-3’（配列番号５）
ｐ１９Ａｒｆリバースプライマー：5’-TCTGCACCGTAGTTGAGCAG-3’（配列番号６）
Ｃｄｋｎ１ｃフォーワードプライマー：5’-TGAAGGACCAGCCTCTCTCG-3’（配列番号７）
Ｃｄｋｎ１ｃリバースプライマー：5’-TTCGACGCCTTGTTCTCCTG-3’（配列番号８）
Ｇｌｂ１フォーワードプライマー： 5’-ACATGTTTATAGGTGGGACCAA-3’（配列番号９）
Ｇｌｂ１リバースプライマー：5’-ACTTTCTCAGAGCAACTTTTCCA-3’（配列番号１０）
Ｃｅｂｐβフォーワードプライマー：5’-CGCCTTATAAACCTCCCGCT-3’（配列番号１１）
Ｃｅｂｐβリバースプライマー：5’-TGGCCACTTCCATGGGTCTA-3’（配列番号１２）
ｐ２１フォーワードプライマー：5’-CTGAGCGGCCTGAAGATTCC-3’（配列番号１）
ｐ２１リバースプライマー：5’-CCAATCTGCGCTTGGAGTGA-3’（配列番号２）
ｐ１６Ｉｎｋ４ａフォーワードプライマー：5’-GGGTTTCGCCCAACGCCCCGA-3’（配列番号３）
ｐ１６Ｉｎｋ４ａリバースプライマー：5’-TGCAGCACCACCAGCGTGTCC-3’（配列番号４）
ｐ１９Ａｒｆフォーワードプライマー：5’-GATCTTGAGAAGAGGGCCGC-3’（配列番号５）
ｐ１９Ａｒｆリバースプライマー：5’-TCTGCACCGTAGTTGAGCAG-3’（配列番号６）
Ｃｄｋｎ１ｃフォーワードプライマー：5’-TGAAGGACCAGCCTCTCTCG-3’（配列番号７）
Ｃｄｋｎ１ｃリバースプライマー：5’-TTCGACGCCTTGTTCTCCTG-3’（配列番号８）
Ｇｌｂ１フォーワードプライマー： 5’-ACATGTTTATAGGTGGGACCAA-3’（配列番号９）
Ｇｌｂ１リバースプライマー：5’-ACTTTCTCAGAGCAACTTTTCCA-3’（配列番号１０）
Ｃｅｂｐβフォーワードプライマー：5’-CGCCTTATAAACCTCCCGCT-3’（配列番号１１）
Ｃｅｂｐβリバースプライマー：5’-TGGCCACTTCCATGGGTCTA-3’（配列番号１２）
【0045】
【0046】
また、上記と同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の全脾細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞と４日間共培養した。得られた細胞から、休止又は増殖したＣＤ１１ｂ＋細胞を、上記と同様にフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ蛍光減少に基づいて選別した。抗マウスＬｙ６Ｃ抗体として、クローンＨＫ１．４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国）を使用した。結果を図８に示す。増殖したＣＤ１１ｂ＋細胞（図８のゲートＩ）はさらにＬｙ６Ｃ陽性及びＬｙ６Ｃ陰性画分（図８のゲートＩＩ、ゲートＩＩＩ）に細分された。さらに、各分画化細胞型をＤｉｆｆ－ｑｕｉｃｋ染色を用いて染色し、形態学的分析を行った（図８ （ｂ））。
【0047】
図８ （ａ）は、種々のマーカーでソーティングした結果を示し、図８ （ｂ）はＤｉｆｆ－ｑｕｉｃｋ染色したゲートＩ、ゲートＩＩ及びゲートＩＩＩの細胞集団を顕微鏡（ＢＸ５３、オリンパス株式会社）で観察した画像を示す。図８から、増殖しなかったＭφ（ゲートＩ）及び増殖してＬｙ６Ｃを発現したＭφ（ゲートＩＩ）は、８Ｂ上清及び９Ｇ上清培養における老化細胞と同様に円形を呈したことが分かった。また、８Ｂ上清培養における増殖したＬｙ６Ｃ陰性Ｍφも円形を呈したが、９Ｇ上清培養におけるＬｙ６Ｃ陰性（ゲートＩＩＩ）Ｍφは仮足を有し、明らかに老化状態にないことを示唆した（図８ （ｂ））。以上より、８Ｂ－Ｍφが老化様の特徴を有することを示唆した。
【0048】
歴史的に、Ｍφの多くの分類方法が提案されており、その主なものはＭ１／Ｍ２である。腫瘍関連Ｍφは一般にＭ２Ｍφに分類されるため、腫瘍開始能力を有する８Ｂ細胞は、Ｍ２表現型を有するＭφを誘導すると予想される。しかしながら、本発明者らの実験によれば、８Ｂ－Ｍφはアルギナーゼ－１（Ａｒｇ１）を発現したものの、Ｉｒｆ４、ＲｅｔｎｌαなどのＭ２－Ｍφ関連遺伝子のほとんどを発現せず、また、Ｍ１関連遺伝子も発現しなかった（データを示さず）。さらに、９Ｇ－Ｍφも、Ｍ１／Ｍ２分類に適合する典型的な遺伝子プロフィールを発現しなかった（データを示さず）。したがって、８Ｂ－Ｍφ及び９Ｇ－Ｍφは、それらの遺伝子発現パターンに基づいてＭ１又はＭ２として分類することはできない。
【0049】
また、免疫能が正常な個体では、８Ｂ細胞が形成した腫瘍（８Ｂ腫瘍）において、ＣＤ３ε陽性Ｔ細胞の浸潤が認められたものの（データを示さず）、腫瘍の増殖は持続し（図１）、腫瘍組織におけるＴ細胞の抑制が示唆された。アルギナーゼ－１は、Ｔ細胞シグナル伝達における重要な分子であるＣＤ３ζの発現をダウンレギュレート（下方制御）し、これらの細胞の低応答性を誘導する強力な免疫抑制分子であることが知られている。全脾細胞を８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞と７日間共培養した。ＣＤ３ε陽性Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋Ｔ細胞）における細胞内ＣＤ３ζ発現をフローサイトメトリーにより解析した。その結果、予想通り、全脾細胞を８Ｂと共に培養した場合は、ＣＤ３ε陽性Ｔ細胞はＣＤ３ζ発現を喪失したものの、９Ｇ細胞との共培養においてはＣＤ３ζ発現を保持した（データを示さず）。
【0050】
上記と同様に、１０３個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植した。２８日後、マウスの脳を採取した。腫瘍領域のＣＤ３ε＋細胞におけるＣＤ３ζ発現を蛍光免疫組織化学により解析した。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３ζモノクローナル抗体（Ｈ１４６－９６８）は、Ａｂｃａｍ（米国）から購入した。図９ （ａ）は、蛍光顕微鏡画像であり、図９ （ｂ）の左側のグラフはＣＤ３ε＋細胞におけるＣＤ３ζ＋細胞の割合を細胞数に基づいて計算し、平均及び標準偏差は４つの独立した視野の結果に基づいて計算した。（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。図９によれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける８Ｂ－腫瘍組織において、ＣＤ３ε＋Ｔ細胞の約７０％がＣＤ３ζ発現を喪失したことを明らかにした。
【0051】
また、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性を理解するために、８Ｂ腫瘍から採取したＴ細胞を分析した。Ｘ線照射された８Ｂ細胞で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを週１回、計２週間免疫した。最後の免疫の１週間後、脾臓を採取した。採集された全脾細胞を８Ｂ細胞と共に４日間共培養し、次いで、Ｔ細胞をＧｏｌｇｓｔｏｐ（登録商標）試薬の存在下でＰＭＡ／イオノマイシンで５時間刺激し、細胞内ＩＦＮγ発現をフローサイトメトリーによって測定した（ＰＥ標識抗ＩＦＮγ抗体はクローン：ＸＭＧ１．２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国））を使用）。ＣＤ３ε＋集団におけるＣＤ３ζ＋又はＣＤ３ζ－細胞中のＩＦＮγ＋細胞の割合を棒グラフで示す（図９ （ｂ）の右側のグラフ、＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。その結果、ＩＦＮ－γ産生は、ＣＤ３ζ陽性Ｔ細胞と比較して、ＣＤ３ζ陰性Ｔ細胞において約１０倍低かった。このように、Ｔ細胞は８Ｂ腫瘍に高度に浸潤したものの、これらのＴ細胞のほとんどはＣＤ３ζ発現を失い、機能不全になった。
【0052】
実験例１は、８Ｂ細胞は、老化様Ｍφ由来アルギナーゼ－１による浸潤Ｔ細胞の機能不全を誘導することによって、免疫応答性マウスにおいて腫瘍を発生させることを示唆した。
【0053】
実験例２ ８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞における分泌サイトカインの解析
８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞によって分泌されるサイトカインを、サイトカイン／ケモカインアレイにより解析した。８×１０６個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を、１０ｍＬのグリオーマ培地中で４日間培養した後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。得られた上清を、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びフローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。その結果を図１０に示す。図１０から、８Ｂ細胞によって、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ１及びＣｘｃｌ１０が選択的に分泌され、かつ、８Ｂ細胞によるＣｃｌ２の分泌量が９Ｇ細胞の２倍であったことが分かった。これらのサイトカインのうち、ＩＬ－６及びＣｘｃｌ１は老化関連サイトカイン／ケモカインであることが知られている。
８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞によって分泌されるサイトカインを、サイトカイン／ケモカインアレイにより解析した。８×１０６個の８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を、１０ｍＬのグリオーマ培地中で４日間培養した後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。得られた上清を、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びフローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。その結果を図１０に示す。図１０から、８Ｂ細胞によって、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ１及びＣｘｃｌ１０が選択的に分泌され、かつ、８Ｂ細胞によるＣｃｌ２の分泌量が９Ｇ細胞の２倍であったことが分かった。これらのサイトカインのうち、ＩＬ－６及びＣｘｃｌ１は老化関連サイトカイン／ケモカインであることが知られている。
【0054】
次に、８Ｂ細胞によって分泌されるサイトカインのうち、Ｍφの老化様状態を誘導するのに重要であろうサイトカインを同定した。マウス全脾細胞を、８Ｂ細胞分泌サイトカインにおける５つの主要な因子、Ｃｃｌ２（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｃｘ－１（５ｎｇ／ｍＬ）、Ｃｘ－１０（５ｎｇ／ｍＬ）、Ｃｃｌ５（５ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－６（１ｎｇ／ｍＬ）の混合サイトカインを含む培地（基本培地）中で培養した。これらのサイトカインはＢｉｏＬｅｇｅｎｄより購入した。基本培地は、８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞培養に使用したグリオーマ培地に上記５つのサイトカイン、さらに、Ｍφが生存するように、Ｍ－ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－３４（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地であった。対照として、混合サイトカインを含まない基本培地（サイトカインなし）を使用した。また、基本培地中の混合サイトカインから、上記５つの主要な因子をそれぞれ除いたもの（－Ｃｃｌ２、－Ｃｘ－１、－Ｃｘ－１０、－Ｃｃｌ５、及び、－ＩＬ－６）も使用した。生成したＭφをＳＡ－β－Ｇａｌアッセイで分析した。ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞を６つの視野から計数し、β－ガラクトシダーゼ陽性Ｍφ細胞（ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性Ｍφ）の割合を算出し、図１１に示す。
【0055】
図１１から、混合サイトカインからＣｃｌ２又はＩＬ－６のいずれかを除去した後、ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性Ｍφの数は減少した。尚、ＩＬ－６の除去でＳＡ－β－Ｇａｌ陽性Ｍφは、サイトカインなしと同程度まで低下したことが分かった。さらに、９Ｇ細胞分泌サイトカインもＣｃｌ２を含むことから、ＩＬ－６がＭφを老化様状態に誘導する原因因子であると推測される。
【0056】
次に、８Ｂ細胞においてＩＬ－６の選択的発現を誘導するシグナル伝達経路の同定を試みた。５つの細胞シグナル経路阻害剤（各２０μＭ）：ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ１／２阻害剤；ＡｄｏｏＱ）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２阻害剤；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又はＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤；ＡｄｏｏＱ）を８Ｂ培地に添加した。対照として、溶媒（ジメチルスルホキシド；ＤＭＳＯ）を培地に添加した。２４時間後、培地を捨て、各種阻害剤又は溶媒を含む新鮮な培地に培地交換した。さらに２４時間後、各培養上清中のＩＬ－６蓄積量を、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びフローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて分析した。測定結果を図１２ （ａ）に示す。また、各培養条件における細胞増殖は、細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ；Ｍｅｒｃｋ）を用いて、使用説明書のプロトコールに従ってモニターした。測定結果を図１２ （ａ）に示す。図１２ （ｂ）は、種々の阻害剤の存在下での８Ｂ細胞によるＩＬ－６分泌は、ＭＴＴアッセイに基づく細胞数を反映した単位（ｕｎｉｔ）で示す。単位は次のように計算された。
単位（ｕｎｉｔ）＝ＩＬ－６（ｎｇ／ｍＬ）／ＭＴＴアッセイにおける５７０ｎｍでの吸収
単位（ｕｎｉｔ）＝ＩＬ－６（ｎｇ／ｍＬ）／ＭＴＴアッセイにおける５７０ｎｍでの吸収
【0057】
図１２によれば、全ての阻害剤は、溶媒よりも相対的に細胞毒性が高かったが、ＩＬ－６分泌は、Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２阻害剤）及びＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）によって維持された。対照的に、ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）は、ＩＬ－６分泌を著しく上方制御したが、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）は、ＩＬ－６分泌の完全な喪失をもたらした。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達は、８Ｂ細胞におけるＩＬ－６分泌に必須であることを示唆した。
【0058】
ＩＬ－６産生８Ｂ細胞及び非産生９Ｇ細胞の両方は、同じ細胞株に由来する。異なるＩＬ－６分泌の原因は不明である。Ｏｈｓａｗａら（Ｏｈｓａｗａ Ｓ， Ｎａｔｕｒｅ ４９０， ５４７－５５１ （２０１２）．）は、ショウジョウバエ細胞におけるＲａｓの構成的活性化及びミトコンドリア機能障害が、ｕｐｄ（ヒト／マウスＩＬ－６のオーソログ）分泌及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成をもたらしたことを報告した。８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞は両方とも構成的活性Ｒａｓを有するため、それぞれのミトコンドリア機能障害の差が異なるＩＬ－６産生をもたらすと推測された。ミトコンドリア機能障害は細胞内に活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積をもたらすため、ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、８Ｂ細胞及び９Ｇ細胞におけるＲＯＳ産生を測定し、比較した。
【0059】
８Ｂ細胞又は９Ｇ細胞を、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含まないグリオーマ培地で一晩培養し、次いで、４００μＭ又は４０００μＭのＮＡＣを添加し、２時間培養した。細胞をＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色溶液でさらに１時間培養し、次いで、フローサイトメトリーによってＲＯＳレベルを分析した。結果を図１３に示す。図１３から、予想通り８Ｂ細胞において、９Ｇ細胞よりも高いレベルのＲＯＳが蓄積された。上昇したＲＯＳレベルがｐ３８活性化を誘導することを考慮すると、ＲＯＳ－ｐ３８軸の活性化は、９Ｇと比較して８Ｂにおける選択的ＩＬ－６分泌のメカニズムであることが示唆された。
【0060】
実験例３ ８ＢによるＩＬ－６分泌と免疫応答性動物における腫瘍開始との関連性
８Ｂによって分泌されるＩＬ－６が、Ｍφにおける老化誘導及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成能に及ぼす影響について検討した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Ｏｒｉｇｅｎｅ）によって、ＩＬ－６ノックアウト８Ｂ細胞（８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ）を調製し、Ｉｌ６ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｋｉｔ（ＣＲＩＳＰＲ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ社（米国）、カタログ番号ＫＮ３０８２９３）を用いて、スクランブルガイドＲＮＡでトランスフェクトした８Ｂ細胞を疑似トランスフェクタント（８Ｂ－ｍｏｃｋ）として調製した。
８Ｂによって分泌されるＩＬ－６が、Ｍφにおける老化誘導及びｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成能に及ぼす影響について検討した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Ｏｒｉｇｅｎｅ）によって、ＩＬ－６ノックアウト８Ｂ細胞（８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ）を調製し、Ｉｌ６ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｋｉｔ（ＣＲＩＳＰＲ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ社（米国）、カタログ番号ＫＮ３０８２９３）を用いて、スクランブルガイドＲＮＡでトランスフェクトした８Ｂ細胞を疑似トランスフェクタント（８Ｂ－ｍｏｃｋ）として調製した。
【0061】
両細胞株におけるＩＬ－６分泌量をＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びフローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定し（図１４ （ａ））、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖能をＭＴＴアッセイによって測定した（図１４ （ｂ））。図１４（ｂ）から、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ及び８Ｂ－ｍｏｃｋはｉｎ ｖｉｔｒｏで同等に増殖したことが分かった。
【0062】
次に、８×１０６個の８Ｂ－ｍｏｃｋ又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞を１０ｍＬのグリオーマ培地中で４日間培養した後、上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、得られた培養上清に対し２０％（ｖ／ｖ）のＲＰＭＩ１６４０培地を含有する培地を、培養上清を含む培地とした。この培養上清を含む培地１ｍＬを用いて、マウス全脾細胞からキャップ式磁性アタッチメント（ＭＡＣＳ）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（登録商標）、ドイツ）を用いて磁気的に選別した０．５×１０６個のＦ４／８０＋細胞を１４日間培養した。１４日後、生成したＭφを位相差顕微鏡（ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社）で観察した（図１５）。図１５から、８Ｂ－ｍｏｃｋ培養上清ではＭφが平坦で肥大した外観を呈し、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ培養上清では仮足を有したことが認められた。８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ培養上清を用いて培養して得られたＭφ老化特徴を失ったことを判明した。したがって、８Ｂ細胞によって分泌されたＩＬ－６がＭφにおける老化誘導の原因因子であることが示唆された。
【0063】
また、８Ｂ－ｍｏｃｋ培養上清又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ培養上清で培養したＭφの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した（Ａｒｇ１：ＧＴＡＴＧＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧ、ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＧ）。結果を図１６に示す。図１６から、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ－Ｍφでは、Ｇｌｂ１、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１及びＡｒｇ１の発現は８Ｂ－ｍｏｃｋ－Ｍφより低かったことが分かった。
【0064】
次に、１０３個の８Ｂ－ｍｏｃｋ細胞又は８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞を、免疫不全マウスＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ｎ＝９（８Ｂ－ｍｏｃｋ）、ｎ＝１１（８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ））、又は免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１８（８Ｂ－ｍｏｃｋ）、ｎ＝１９（８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ））の脳に移植し、移植後のマウスの生存率を記録した（図１７、＊＊ｐ＜０．０１、ｌｏｇ－ｌａｎｋ検定）。図１７から、８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞及び８Ｂ－ｍｏｃｋ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍形成性を発揮し、全てのマウスは、腫瘍接種後２００日までに死亡した。一方、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、８Ｂ－ｍｏｃｋ細胞のみが依然として腫瘍形成性を発揮し、ほとんどのマウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと同様の時間経過で死亡したのに対して、約６０％のマウスが８Ｂ－ＩＬ－６－ＫＯ細胞の接種後４００日以上まで生存しており、明らかに低い腫瘍形成性を示した。すなわち、ＩＬ－６を分泌しなかった腫瘍細胞は、免疫不全マウスでは腫瘍を形成することができたが、免疫応答性マウスでは腫瘍を形成することができなかった。反対に、腫瘍細胞によるＩＬ－６分泌は、免疫不全マウスのみならず、免疫応答性マウスにおいても腫瘍形成を可能にした。したがって、腫瘍細胞によるＩＬ－６分泌は、免疫応答性マウスにおける腫瘍開始能力を左右する。これらの結果は、ＩＬ－６分泌性腫瘍細胞が、老化様免疫抑制性マクロファージを誘導することによって、その周囲を「免疫特権部位」に変化させ、免疫応答性個体においてさえも腫瘍開始の機会を創出できることを示唆した。
【0065】
実施例１ ＮＭＮによる作用
８Ｂ上清で培養した老化様Ｍφにおける発現表面蛋白質をスクリーニングした。上記のように、マウス全脾細胞から磁気的に選別Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ上清又は９Ｇ上清で培養し、得られたＭφを抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（クローン：９０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（米国））で染色し、フローサイトメトリー（フローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国））で検出した。その結果を図１８に示す。図１８から、老化様８Ｂ－Ｍφが９Ｇ－Ｍφと比較してより高いレベルでＣＤ３８を発現することを見出した（図１８）。
８Ｂ上清で培養した老化様Ｍφにおける発現表面蛋白質をスクリーニングした。上記のように、マウス全脾細胞から磁気的に選別Ｆ４／８０＋細胞を８Ｂ上清又は９Ｇ上清で培養し、得られたＭφを抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（クローン：９０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（米国））で染色し、フローサイトメトリー（フローサイトメトリーＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国））で検出した。その結果を図１８に示す。図１８から、老化様８Ｂ－Ｍφが９Ｇ－Ｍφと比較してより高いレベルでＣＤ３８を発現することを見出した（図１８）。
【0066】
マウス全脾細胞由来Ｆ４／８０＋細胞を、８Ｂ上清中で１４日間培養し、培養期間中に週３回、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の終濃度が１ｍＭとなるように添加した。対照として、同量の生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を添加した。１４日間培養後、上記と同様にＳＡ－β－Ｇａｌアッセイを実施した。得られた細胞を位相差顕微鏡（ＣＫＸ５３、オリンパス株式会社）で観察し（図１９）、さらにＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞及び陰性細胞を１０の視野から計数し、総数から陽性細胞の割合を算出し、３つの独立した培養からの％ＳＡ－β－Ｇａｌ陽性細胞の平均値（ＳＤ）を図２０に示す（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。さらに、得られた細胞のアルギナーゼ－１発現をフローサイトメトリーで測定し、フローサイトメトリーのソート結果、及び、３つの独立したフローサイトメトリー分析からの平均値（ＳＤ）を図２１に示す（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【0067】
８Ｂ－Ｍφ培養にＮＭＮを添加すると、仮足を有するＭφが得られた（図１９）。また、ＳＡ－β－Ｇａｌ－陽性老化様Ｍφの数は、ＮＭＮの添加後に減少した（図２０）。さｒさに、ＮＭＮの存在下で培養された８Ｂ－Ｍφにおけるアルギナーゼ－１発現は、対照のＳａｌｉｎｅ培養物と比較して、アルギナーゼ－１発現は約三分の一まで減少した（図２１）。アルギナーゼ－１は、ＣＤ３ζ発現を減少させることによってＴ細胞活性化を阻止するため、ＮＭＮ処理は、老化様Ｍφ由来アルギナーゼ－１に囲まれたＴ細胞におけるＴ細胞応答を改善し得ることを示唆した。実際、８Ｂ－Ｍφ培養物へのＮＭＮの添加は、樹状細胞の樹状突起に似た仮足を有するＭφをもたらした（図１９）。この結果から、ＮＭＮ処理は８Ｂ－Ｍφの抗原提示能を改善すると推測した。
【0068】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を８Ｂ細胞培養上清中で７日間培養し、培養の０日目、１日目、３日目及び６日目にβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の終濃度が１ｍＭとなるように添加した。対照として、同量の生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を添加した。また、脾細胞をＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で７日間培養することによってＭ－ＣＳＦ－Ｍφを得た。接着したＭφを収集し、抗原提示分析に使用した。対照として、ＢＡＬＢ／ｃ由来のＴ細胞を使用した。Ｔ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から、抗Ｔｈｙ１．２ ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる磁気的に選別によって収集した。収集したＢＡＬＢ／ｃ Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、得られたＣＦＳＥ標識Ｔｈｙ１＋Ｔ細胞と、上記得られた抗原提示細胞（応答体：刺激体＝１：２）とを４日間共培養した。次いで、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞増殖を、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて、ＣＦＳＥ蛍光の減少によって分析した。結果を図２２（＊＊ｐ＜０．０１、ＮＳ：有意差なし、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ試験）に示す。
【0069】
図２２から、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍ－ＣＳＦ誘導Ｍφ共培養物中で効率的に増殖し、ＮＭＮ処理培養物及び生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）処理８Ｂ－Ｍφ共培養物中では約三分の一まで減少した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍ－ＣＳＦ誘導Ｍφ共培養物と比較して、生理食塩水処理８Ｂ－Ｍφ共培養物において約二分の一まで増殖低下を示した。特に、ＮＭＮ処理８Ｂ－Ｍφ共培養におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、Ｍ－ＣＳＦ誘導Ｍφ共培養で得られたレベルに回復した。ＮＭＮ処理は、８Ｂ－Ｍφの抗原提示能力を改善したことを示唆した。
【0070】
１０４個の８Ｂ細胞を免疫応答性マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスの脳に移植した。移植したマウスに、１０ｍｇのＮＭＮ（ｎ＝６）又は生理食塩水（ｎ＝６）（２００μｌ／マウス）を週３回、腹腔内投与し、マウスの生存を記録し、図２３（＊ｐ＜０．０５、ｌｏｇ－ｌａｎｋ検定）に示す。生理食塩水投与群では、約７０％のマウスが腫瘍開始を示し、その結果死亡した。対照的に、ＮＭＮ治療群では、腫瘍開始はマウスの約２０％にしか認められず、生存期間は生理食塩水群と比較して著しく改善された（図２３）。
【0071】
ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞はＩＬ－６を分泌するため、腫瘍微小環境におけるＩＬ－６を介したＭφ老化誘導が期待できる。したがって、同系ＢＡＬＢ／ｃ免疫応答性マウスにＣＴ２６細胞を皮下注射し、腫瘍開始に対するＮＭＮ治療の効果を評価した。５×１０４個のＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ（米国））を同系免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。死亡するまでＮＭＮ（ｎ＝４）（１０ｍｇ／マウス）又は生理食塩水（ｎ＝４）（２００μｌ／マウス）を週３回腹腔内投与した。腫瘍開始は、目視及び触診を用いて評価し、結果を図２４（＊＊ｐ＜０．０５、ｌｏｇ－ｌａｎｋ検定）に示す。このモデルでは腫瘍開始を完全に抑制することは困難であったが、ＮＭＮ投与は腫瘍開始を有意に遅らせた（図２４）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】