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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022047279
(43)【公開日】2022-03-24
(54)【発明の名称】慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220316BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 S
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020153097
(22)【出願日】2020-09-11
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構「免疫アレルギー疾患等実用化研究事業」「脂質によるアレルギー疾患の新規調節機構の解明と治療戦略の基盤構築」産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】岡山 吉道
(72)【発明者】
【氏名】伊東 真奈
(72)【発明者】
【氏名】照井 正
(72)【発明者】
【氏名】豊島 翔太
(72)【発明者】
【氏名】田杭 真帆
(72)【発明者】
【氏名】村上 誠
(72)【発明者】
【氏名】三木 寿美
(72)【発明者】
【氏名】武富 芳隆
(57)【要約】
【課題】ＣＳＵ及びＡＤ等の慢性皮膚疾患の客観的な評価が可能な、慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法を提供する。
【解決手段】５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種の特異的結合物質を含む、慢性皮膚疾患の検査キット。また、被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法。
【選択図】なし
【解決手段】５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種の特異的結合物質を含む、慢性皮膚疾患の検査キット。また、被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、
慢性皮膚疾患の検査キット。
慢性皮膚疾患の検査キット。
【請求項2】
５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、及びリポキシンＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含み、
慢性特発性蕁麻疹を鑑別するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
慢性特発性蕁麻疹を鑑別するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
【請求項3】
リポキシンＡ４に対する特異的結合物質を含み、
慢性特発性蕁麻疹の重症度を評価するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
慢性特発性蕁麻疹の重症度を評価するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
【請求項4】
レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、
アトピー性皮膚炎を鑑別するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
アトピー性皮膚炎を鑑別するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
【請求項5】
レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、
アトピー性皮膚炎の重症度を評価するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
アトピー性皮膚炎の重症度を評価するために用いられる、
請求項１に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
【請求項6】
被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、
慢性皮膚疾患の評価方法。
慢性皮膚疾患の評価方法。
【請求項7】
前記酸化脂肪酸が、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、及びリポキシンＡ４からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記測定された前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、前記被験者が、慢性特発性蕁麻疹に罹患している可能性が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
前記測定された前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、前記被験者が、慢性特発性蕁麻疹に罹患している可能性が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
【請求項8】
前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、
前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者における慢性特発性蕁麻疹の重症度が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者における慢性特発性蕁麻疹の重症度が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
【請求項9】
前記酸化脂肪酸が、レゾルビンＤ２であり、
前記測定されたレゾルビンＤ２の濃度に基づいて、前記被験者が、アトピー性皮膚炎に罹患している可能性が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
前記測定されたレゾルビンＤ２の濃度に基づいて、前記被験者が、アトピー性皮膚炎に罹患している可能性が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
【請求項10】
前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、
前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者におけるアトピー性皮膚炎の重症度が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者におけるアトピー性皮膚炎の重症度が評価される、
請求項６に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
蕁麻疹とは、そう痒を伴った一過性の紅斑と膨疹が出没を繰り返す皮膚疾患である。蕁麻疹は、明らかな外部誘因がない特発性蕁麻疹と、特定刺激や負荷により誘発される刺激誘発性蕁麻疹とに分類される。また、特発性蕁麻疹は、６週間以上症状が継続する慢性のものと、症状の継続が６週間未満である急性のものとに分類される。慢性特発性蕁麻疹（chronic spontaneous urticaria：ＣＳＵ）は、明らかな外部誘因がなく、症状が６週間以上継続する蕁麻疹である。日本では、ＣＳＵは、蕁麻疹全体の５３．５％を占めている。ＣＳＵでは、症状が毎日またはほぼ毎日出現し、痒みや膨疹が繰り返されるため、患者のＱＯＬの低下や労働生産性の低下に繋がっている。
【0003】
ＣＳＵの治療には、一般的に抗ヒスタミン剤が使用される。また、最近、抗ＩｇＥモノクローナル抗体製剤であるオマリズマブが、ＣＳＵの症状を軽減することが認められた。オマリズマブは、ヒトＩｇＥ分子のＣε３に特異性を有するマウスモノクローン抗体ベースとして、９５％をヒトＩｇＧ１分子構造に置換したヒト化抗体であり、元々、気管支喘息に対して効能が認められた抗体製剤である。日本では、オマリズマブは、既存治療に抵抗性のＣＳＵに対して、適用が認められている。
【0004】
ＣＳＵは、上記のとおり、明らかな誘因がなく、そう痒を伴った一過性の紅斑と膨疹が出没を繰り返す症状が６週間以上持続するものであるが、視覚的に鑑別が難しい疾患が存在する。しかしながら、ＣＳＵの疾患鑑別のためのバイオマーカーは存在していない。
【0005】
また、ＣＳＵの治療方法の選択には、ＣＳＵの重症度を把握する必要がある。ＣＳＵの重症度の評価方法としては、過去１週間の蕁麻疹の数や期間から重症度を算定する７－ｄａｙ ｕｒｔｉｃａｒｉａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ（ＵＳＡ７）（非特許文献１）、及び過去４週間のＱＯＬを所定の質問に対する患者の回答で評価するｕｒｔｉｃａｒｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｅｓｔ（ＵＣＴ）（非特許文献２）の２種類が、広く用いられている。しかしながら、これらの評価方法は、患者の自己申告によるものであり、ＣＳＵの重症度を客観的に評価できるバイオマーカーは知られていない。
【0006】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、憎悪と軽快とを繰り返すそう痒のある湿疹を主病変とする疾患であり、患者の多くは、アトピー素因を有する。ＡＤは、１）そう痒、２）特徴的皮膚湿疹と分布、３）慢性・反復性経過、の３基本項目により診断され、前記３基本項目を満たすものは、症状の軽重を問わず、ＡＤと診断されるが、視覚的に鑑別が難しい疾患が存在する。しかしながら、ＡＤの疾患鑑別のためのバイオマーカーは存在していない。
【0007】
ＡＤには、いくつかの重症度評価方法があるが、それらは、皮疹の面積を計算したり、過去１週間のＱＯＬを質問で評価したりする方法であり、客観的に評価できる方法ではない。ＡＤの病勢を反映するバイオマーカーとして、血清ＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）値があるが、個人差が大きく、一個人において時間的経過を追うのには有用であるが、他者との比較に使用することは難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Zuberbier T et al., EAACI/GA(2)LEN/EDF/WAO guideline: definition, classification and diagnosis of urticaria. Allergy. 2009 Oct;64(10):1417-26.
【非特許文献2】Weller K et al., Development and validation of the Urticaria Control Test: a patient-reported outcome instrument for assessing urticaria control. J Allergy Clin Immunol. 2014 May;133(5):1365-72.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記のように、ＣＳＵ及びＡＤは、視覚的に鑑別が難しい疾患が存在するが、疾患鑑別に使用可能なバイオマーカーは知られていない。そのため、ＣＳＵ又はＡＤの疾患鑑別のためのバイオマーカーは有用である。
【0010】
また、ＣＳＵ及びＡＤの重症度の評価は、患者の自己申告又は視覚的観察に基づいて行われており、客観的に重症度を評価可能なバイオマーカーは知られていない。そのため、ＣＳＵ又はＡＤの重症度を評価するためのバイオマーカーは有用である。
【0011】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、ＣＳＵ及びＡＤ等の慢性皮膚疾患の客観的な評価が可能な、慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は以下の態様を含む。
［１］５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、慢性皮膚疾患の検査キット。
［２］５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、及びリポキシンＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含み、
慢性特発性蕁麻疹を鑑別するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［３］リポキシンＡ４に対する特異的結合物質を含み、慢性特発性蕁麻疹の重症度を評価するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［４］レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、アトピー性皮膚炎を鑑別するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［５］レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、アトピー性皮膚炎の重症度を評価するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［６］被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法。
［７］前記酸化脂肪酸が、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、及びリポキシンＡ４からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記測定された前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、前記被験者が、慢性特発性蕁麻疹に罹患している可能性が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［８］前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者における慢性特発性蕁麻疹の重症度が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［９］前記酸化脂肪酸が、レゾルビンＤ２であり、前記測定されたレゾルビンＤ２の濃度に基づいて、前記被験者が、アトピー性皮膚炎に罹患している可能性が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［１０］前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者におけるアトピー性皮膚炎の重症度が評価される［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［１］５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、慢性皮膚疾患の検査キット。
［２］５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、及びリポキシンＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含み、
慢性特発性蕁麻疹を鑑別するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［３］リポキシンＡ４に対する特異的結合物質を含み、慢性特発性蕁麻疹の重症度を評価するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［４］レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、アトピー性皮膚炎を鑑別するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［５］レゾルビンＤ２に対する特異的結合物質を含み、アトピー性皮膚炎の重症度を評価するために用いられる、［１］に記載の慢性皮膚疾患の検査キット。
［６］被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法。
［７］前記酸化脂肪酸が、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、及びリポキシンＡ４からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記測定された前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、前記被験者が、慢性特発性蕁麻疹に罹患している可能性が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［８］前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者における慢性特発性蕁麻疹の重症度が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［９］前記酸化脂肪酸が、レゾルビンＤ２であり、前記測定されたレゾルビンＤ２の濃度に基づいて、前記被験者が、アトピー性皮膚炎に罹患している可能性が評価される、［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
［１０］前記酸化脂肪酸が、リポキシンＡ４であり、前記測定されたリポキシンＡ４の濃度に基づいて、前記被験者におけるアトピー性皮膚炎の重症度が評価される［６］に記載の慢性皮膚疾患の評価方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、ＣＳＵ及びＡＤ等の慢性皮膚疾患の客観的な評価が可能な、慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＣＳＵ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。
【図2】ＣＳＵ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。
【図3】ＣＳＵ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
【図4】ＣＳＵ患者の血漿中のＬＸＡ４濃度とＵＡＳ７との相関を示すグラフである。
【図5】ＣＳＵ患者に対するオマリズマブ投与と血漿採取のスケジュールを示す。
【図6】オマリズマブ投与前と投与後のＵＡＳ７スコア及びＵＣＴスコアの変化を示す。
【図7】オマリズマブ投与前と投与後の血漿中のＬＸＡ４濃度の変化を示す。
【図8】ＡＤ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。
【図9】ＡＤ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。
【図10】ＡＤ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿試料において、リピドミクス解析を行った結果を示す。リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
【図11】ＡＤ患者の血漿中のＲｖＤ２濃度とＥＡＳＩスコアとの相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
［慢性皮膚疾患の検査キット］
本発明の第１の態様は、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種の特異的結合物質を含む、慢性皮膚疾患の検査キットである。
本発明の第１の態様は、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸に対する特異的結合物質、リポキシンＡ４に対する特異的結合物質、及びレゾルビンＤ２に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種の特異的結合物質を含む、慢性皮膚疾患の検査キットである。
【0016】
本態様の検査キットにおいて、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸（以下、「５－ＨＥＴＥ」ともいう）に対する特異的結合物質は、被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥの濃度を測定するために用いることができる。
本態様の検査キットにおいて、リポキシンＡ４（以下、「ＬＸＡ４」ともいう）に対する特異的結合物質は、被験者の血液試料において、ＬＸＡ４の濃度を測定するために用いることができる。
本態様の検査キットにおいて、レゾルビンＤ２（以下、「ＲｖＤ２」）に対する特異的結合物質は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定するために用いることができる。
本態様の検査キットにおいて、リポキシンＡ４（以下、「ＬＸＡ４」ともいう）に対する特異的結合物質は、被験者の血液試料において、ＬＸＡ４の濃度を測定するために用いることができる。
本態様の検査キットにおいて、レゾルビンＤ２（以下、「ＲｖＤ２」）に対する特異的結合物質は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定するために用いることができる。
【0017】
５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２は、慢性皮膚疾患の鑑別マーカー及び／又は重症度マーカーとして使用することができる。
５－ＨＥＴＥ（（5S,6E,8Z,11Z,14Z)-5-Hydroxyicosa-6,8,11,14-tetraenoic acid）は、アラキドン酸の代謝産物である。５－ＨＥＴＥは、好ましくは、ＣＳＵの鑑別マーカーとして用いることができる。
ＬＸＡ４（(5S,6R,7E,9E,11Z,13E,15S)-5,6,15-trihydroxyicosa-7,9,11,13-tetraenoic acid）は、アラキドン酸の代謝産物である。ＬＸＡ４は、好ましくは、ＣＳＵの鑑別マーカー又は重症度マーカーとして用いることができる。
ＲｖＤ２（（4Z,7S,8E,10Z,12E,14E,16R,17S,19Z)-7,16,17-trihydroxydocosa-4,8,10,12,14,19-hexaenoic acid）は、ドコサヘキサエン酸の代謝産物である。ＲｖＤ２は、好ましくは、アトピー性皮膚炎の鑑別マーカー又は重症度マーカーとして用いることができる。
５－ＨＥＴＥ（（5S,6E,8Z,11Z,14Z)-5-Hydroxyicosa-6,8,11,14-tetraenoic acid）は、アラキドン酸の代謝産物である。５－ＨＥＴＥは、好ましくは、ＣＳＵの鑑別マーカーとして用いることができる。
ＬＸＡ４（(5S,6R,7E,9E,11Z,13E,15S)-5,6,15-trihydroxyicosa-7,9,11,13-tetraenoic acid）は、アラキドン酸の代謝産物である。ＬＸＡ４は、好ましくは、ＣＳＵの鑑別マーカー又は重症度マーカーとして用いることができる。
ＲｖＤ２（（4Z,7S,8E,10Z,12E,14E,16R,17S,19Z)-7,16,17-trihydroxydocosa-4,8,10,12,14,19-hexaenoic acid）は、ドコサヘキサエン酸の代謝産物である。ＲｖＤ２は、好ましくは、アトピー性皮膚炎の鑑別マーカー又は重症度マーカーとして用いることができる。
【0018】
本態様の検査キットにおいて検査される慢性皮膚疾患は、好ましくは、ＣＳＵ又はＡＤである。慢性皮膚疾患がＣＳＵである場合、本検査キットは、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、及びＬＸＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。慢性皮膚疾患がＡＤである場合、本検査キットは、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
【0019】
本態様の検査キットは、慢性皮膚疾患の鑑別又は重症度を評価するために用いることができる。
本態様の検査キットがＣＳＵを鑑別するために用いられる場合、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、及びＬＸＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＣＳＵの重症度を評価するために用いられる場合、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＡＤを鑑別するために用いられる場合、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＡＤの重症度を評価するために用いられる場合、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＣＳＵを鑑別するために用いられる場合、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、及びＬＸＡ４に対する特異的結合物質からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＣＳＵの重症度を評価するために用いられる場合、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＡＤを鑑別するために用いられる場合、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
本態様の検査キットがＡＤの重症度を評価するために用いられる場合、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
【0020】
本態様の検査キットが、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別及び重症度の評価のいずれにも使用することができる。本態様の検査キットが、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質に加えて、さらに、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質を含む場合、ＬＸＡ４及び５－ＨＥＴＥの両方の血中濃度に基づいて、ＣＳＵの鑑別を行うことができるため、より正確な鑑別が可能となる。
本態様の検査キットが、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価のいずれにも使用することができる。
本態様の検査キットが、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。
本態様の検査キットが、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別及び重症度の評価に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。
本態様の検査キットが、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別及び重症度の評価に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。この場合、ＣＳＵの鑑別をより正確に行うことができる。
本態様の検査キットが、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価のいずれにも使用することができる。
本態様の検査キットが、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。
本態様の検査キットが、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別及び重症度の評価に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。
本態様の検査キットが、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質、及びＲｖＤ２に対する特異的結合物質を含む場合、ＣＳＵの鑑別及び重症度の評価に使用できるとともに、アトピー性皮膚炎の鑑別及び重症度の評価にも使用することができる。この場合、ＣＳＵの鑑別をより正確に行うことができる。
【0021】
＜特異的結合物質＞
本明細書において、「特異的結合物質」とは、特定の物質に対する特異的結合性を有する物質を意味する。物質Ａに対する特異的結合物質は、物質Ａに対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
したがって、「５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質」は、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合性を有する物質を意味する。５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質は、５－ＨＥＴＥに対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
「ＬＸＡ４に対する特異的結合物質」は、ＬＸＡ４に対する特異的結合性を有する物質を意味する。ＬＸＡ４に対する特異的結合物質は、ＬＸＡ４に対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
「ＲｖＤ２に対する特異的結合物質」は、ＲｖＤ２に対する特異的結合性を有する物質を意味する。ＲｖＤ２に対する特異的結合物質は、ＲｖＤ２に対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
本明細書において、「特異的結合物質」とは、特定の物質に対する特異的結合性を有する物質を意味する。物質Ａに対する特異的結合物質は、物質Ａに対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
したがって、「５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質」は、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合性を有する物質を意味する。５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質は、５－ＨＥＴＥに対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
「ＬＸＡ４に対する特異的結合物質」は、ＬＸＡ４に対する特異的結合性を有する物質を意味する。ＬＸＡ４に対する特異的結合物質は、ＬＸＡ４に対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
「ＲｖＤ２に対する特異的結合物質」は、ＲｖＤ２に対する特異的結合性を有する物質を意味する。ＲｖＤ２に対する特異的結合物質は、ＲｖＤ２に対して高い結合親和性を有するが、他の物質に対しては結合親和性が低い物質である。
【0022】
特異的結合物質の具体例としては、例えば、抗体又はアプタマーが挙げられる。
【0023】
本明細書において、抗体は、必ずしもインタクトな抗体である必要はなく、抗原に対する結合能を保持した抗体断片も包含する。抗体断片としては、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、抗体は、キメラ抗体等の改変抗体であってもよい。抗体は、抗原により動物を免疫する方法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等の公知の方法により作製することができる。
【0024】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合性を有する物質であり、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponentialenrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【0025】
本態様のキットにおいて、特異的結合物質は、抗体であってもよく、アプタマーであってもよいが、抗体であることが好ましい。本態様のキットは、５－ＨＥＴＥに対する特異的結合物質として、５－ＨＥＴＥに対する抗体又はアプタマーを含むことが好ましく、５－ＨＥＴＥに対する抗体を含むことがより好ましい。本態様のキットは、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質として、ＬＸＡ４に対する抗体若しくはアプタマーを含むことが好ましく、ＬＸＡ４に対する抗体を含むことがより好ましい。本態様のキットは、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質として、ＲｖＤ２に対する抗体若しくはアプタマーを含むことが好ましく、ＲｖＤ２に対する抗体を含むことがより好ましい。
【0026】
本態様の検査キットにおいて、前記５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、又はＲｖＤ２（以下、まとめて[マーカー酸化脂肪酸]という場合がある）に対する特異的結合物質は、支持体に固定化されていてもよい。支持体は、本態様の検査キットを適用する方法に応じて、適宜選択することができる。支持体としては、例えば、ウェルプレート（例、９６ウェルマイクロプレートなど）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ポリフッ化ビニリデン膜など）、スライドガラス、磁気ビーズ、ラテックス粒子等が挙げられる。マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質を支持体に固定化する方法は、支持体の材質に応じて、適宜、公知の方法を選択することができる。
マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質が、支持体に固定化されている場合、Ｂ／Ｆ分離により、前記酸化脂肪酸を、試料中から分離することができる。
マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質が、支持体に固定化されている場合、Ｂ／Ｆ分離により、前記酸化脂肪酸を、試料中から分離することができる。
【0027】
マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質が支持体に固定されている場合、本態様の検査キットは、前記支持体に固定された特異的結合物質（一次特異的結合物質）とは異なるエピトープに結合するマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質（二次特異的結合物質）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗５－ＨＥＴＥ抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗５－ＨＥＴＥ抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗ＬＸＡ４抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗ＬＸＡ４抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗ＲｖＤ２抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗ＲｖＤ２抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗５－ＨＥＴＥ抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗５－ＨＥＴＥ抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗ＬＸＡ４抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗ＬＸＡ４抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
例えば、本態様の検査キットが、支持体に固定された抗ＲｖＤ２抗体（一次抗体）を含む場合、さらに、前記一次抗体とは異なるエピトープに結合する抗ＲｖＤ２抗体（二次抗体）を含んでいてもよい。
【0028】
マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質は、標識化されたものであってもよい。標識化のための標識物質は、特に限定されず、公知のものを用いればよい。標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’ ,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７などの蛍光標識；ヨウ素１２５などの放射性同位体標識；ルテニウム錯体などの電気化学発光標識；ビオチン；金属ナノ粒子等が挙げられる。マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質の標識化は、標識物質の種類に応じて、適宜、公知の方法を選択して行うことができる。なお、標識物質としてビオチンを用いる場合には、本態様の検査キットは、さらに、標識化されたアビジンを含んでいてもよい。アビジンの標識物質としては、上記例示した標識物質のうちビオチン以外の標識物質が例示される。
本態様の検査キットが二次特異的結合物質を含む場合、当該二次特異的結合物質は、標識化されていることが好ましい。
本態様の検査キットが二次特異的結合物質を含む場合、当該二次特異的結合物質は、標識化されていることが好ましい。
【0029】
＜他の要素＞
本態様の検査キットは、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質に加えて、他の要素を含んでいてもよい。他の要素としては、例えば、酸化脂肪酸の検出試薬、標識物質の検出試薬、マーカー酸化脂肪酸の標準試料、血液試料調製試薬、酸化脂肪酸抽出試薬、希釈液、バッファー類、支持体、使用説明書等が挙げられる。
本態様の検査キットは、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質に加えて、他の要素を含んでいてもよい。他の要素としては、例えば、酸化脂肪酸の検出試薬、標識物質の検出試薬、マーカー酸化脂肪酸の標準試料、血液試料調製試薬、酸化脂肪酸抽出試薬、希釈液、バッファー類、支持体、使用説明書等が挙げられる。
【0030】
酸化脂肪酸の検出試薬は、例えば、支持体に固定されたマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質により、マーカー脂肪酸を支持体に捕捉した後、捕捉されたマーカー脂肪酸を検出するために用いることができる。酸化脂肪酸の検出試薬は、特に限定されないが、例えば、Ｓｕｌｆｏ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｖａｎｉｌｌｉｎ法に用いる試薬（バニリン、硫酸）等が挙げられる。
【0031】
標識物質の検出試薬は、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質又は二次特異的結合物質の標識化に用いた標識物質を検出するための試薬である。例えば、標識物質が酵素標識である場合、検出試薬は当該酵素の基質を含む。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、検出試薬としては、ＴＭＢ（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）、ＯＰＤ（o-phenylenediamine dihydrochloride）、ＡＢＴＳ（2,2'-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline-6 sulfonic acid] diammonium salt）等が挙げられる。また、酵素標識がアルカリホスファターゼである場合、検出試薬としては、ｐＮＰＰ（p-Nitrophenyl-phosphate；ニトロフェニルリン酸）等が挙げられる。
【0032】
マーカー酸化脂肪酸の標準試料は、マーカー酸化脂肪酸の標準曲線を作成するための試薬である。マーカー酸化脂肪酸の標準試料としては、５－ＨＥＴＥの精製品、ＬＸＡ４の精製品、及びＲｖＤ２の精製品等が挙げられる。
【0033】
血液試料調製試薬は、被験者から採取した血液から血液試料を調製するための試薬である。本態様の検査キットに適用する血液試料としては、例えば、血漿が挙げられる。そのため、血液試料調製試薬としては、被験者から採血した血液から血漿試料を調製するための試薬が挙げられる。そのような試薬としては、例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡ、及びクエン酸ナトリウム等が挙げられる。また、血液試料調製試薬としては、例えば、血液又は血漿の希釈液等が挙げられる。希釈液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（Ｔｒｉ－ＨＣｌなど）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの公知の緩衝液等が例示される。
【0034】
酸化脂肪酸抽出試薬は、血漿試料等から酸化脂肪酸を抽出するための試薬である。酸化脂肪酸の抽出試薬としては、例えば、Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法に用いる試薬等が挙げられる。そのような試薬としては、クロロホルム、及びメタノールが挙げられる。また、酸化脂肪酸抽出試薬は、酸化脂肪酸抽出用のカラム等であってもよい。
【0035】
バッファー類としては、マーカー酸化脂肪酸とマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質との結合反応に用いられるバッファー、及びマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質に結合する標識物質を検出するための反応に用いられるバッファー等が挙げられる。バッファー類の具体例としては、例えば、ブロッキングバッファー、洗浄バッファー等が挙げられる。これらのバッファー類は、イムノアッセイ等に一般的に用いられるものを特に制限なく用いることができる。
【0036】
支持体は、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質を固定化するために用いられる。支持体としては、上記に例示したものが挙げられる。
【0037】
本態様の検査キットは、ＥＬＩＳＡキットであってもよい。本態様の検査キットがＥＬＩＳＡキットである場合、例えば、支持体に固定化されたマーカー酸化脂肪酸に対する一次特異的結合物質、標識化されたマーカー酸化脂肪酸に対する二次特異的結合物質、及び二次特異的結合物質に結合する標識の検出試薬等を含み得る、ＥＬＩＳＡキットは、さらに、血液試料調製試薬、酸化脂肪酸抽出試薬、希釈液、マーカー酸化脂肪酸の標準試料、及びバッファー類（ブロッキングバッファー、洗浄バッファー等）等を含んでいてもよい。
【0038】
本態様の検査キットは、後述の［慢性皮膚疾患の評価方法］に記載の方法に用いることができる。
【0039】
［慢性皮膚疾患の評価方法］
本発明の第２の態様は、被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法である。
本発明の第２の態様は、被験者の血液試料において、５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸、リポキシンＡ４、及びレゾルビンＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の評価方法である。
【0040】
＜被験者の血液試料＞
本態様の評価方法で用いる試料は、被験者の血液試料である。
「被験者」とは、本態様の評価方法により慢性皮膚疾患について評価される対象である。被験者は、慢性皮膚疾患を有する患者であることが好ましい。前記慢性皮膚疾患は、ＣＳＵ又はＡＤであってもよく、ＣＳＵ又はＡＤに類似の症状を有する慢性皮膚疾患であってもよい。
「血液試料」とは、血液成分の少なくとも一部を含む試料を意味し、全血、血清、及び血漿のいずれであってもよく、これらを希釈したものであってもよい。血液試料は、好ましくは血清又は血漿であり、より好ましくは血漿である。
被験者の血液試料は、被験者から採取された血液成分を含む試料であり、好ましくは被験者から採取された血液から調製された血漿である。血液から血漿を調製する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。血液からの血漿の分離方法としては、例えば、血液にヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム等を添加して、遠心分離する方法等が挙げられる。前記遠心分離は、マーカー酸化脂肪酸の分解を抑制する観点から、冷却下（例えば、４℃）で行うことが好ましい。
本態様の評価方法で用いる試料は、被験者の血液試料である。
「被験者」とは、本態様の評価方法により慢性皮膚疾患について評価される対象である。被験者は、慢性皮膚疾患を有する患者であることが好ましい。前記慢性皮膚疾患は、ＣＳＵ又はＡＤであってもよく、ＣＳＵ又はＡＤに類似の症状を有する慢性皮膚疾患であってもよい。
「血液試料」とは、血液成分の少なくとも一部を含む試料を意味し、全血、血清、及び血漿のいずれであってもよく、これらを希釈したものであってもよい。血液試料は、好ましくは血清又は血漿であり、より好ましくは血漿である。
被験者の血液試料は、被験者から採取された血液成分を含む試料であり、好ましくは被験者から採取された血液から調製された血漿である。血液から血漿を調製する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。血液からの血漿の分離方法としては、例えば、血液にヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム等を添加して、遠心分離する方法等が挙げられる。前記遠心分離は、マーカー酸化脂肪酸の分解を抑制する観点から、冷却下（例えば、４℃）で行うことが好ましい。
【0041】
マーカー酸化脂肪酸は不安定な物質であるため、マーカー酸化脂肪酸の分解を抑制する観点から、被験者から血液を採取後すぐに、前記血液から血漿を調製することが好ましい。また、調製した血漿は、調整後すぐに、マーカー脂肪酸の測定を行うか、急速凍結（例えば、－２０℃）にて保存することが好ましい。
【0042】
＜測定工程：工程（ａ）＞
被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【0043】
マーカー酸化脂肪酸の測定方法としては、例えば、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質を用いる方法、質量分析（ＥＳＩ－ＭＳなど）による方法、薄層クロマトグラフィーによる方法、及び液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法等が挙げられる。
【0044】
上記の中でも、簡便に行えることから、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質を用いる方法が好ましい。当該方法は、上記第１の態様の検査キットを用いて行うことができる。
例えば、支持体結合させたマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質に、被験者の血液試料を接触させる。これにより、前記特異的結合物質に、マーカー酸化脂肪酸が結合して、前記支持体にマーカー酸化脂肪酸が捕捉される。次いで、前記支持体に、マーカー酸化脂肪酸に対する標識化された二次特異的結合物質を接触させる。これにより、支持体に捕捉されたマーカー酸化脂肪酸に前記二次特異的結合物質が結合する。次いで、前記二次特異的結合物質に結合する標識物質を測定することにより、血液試料中のマーカー酸化脂肪酸の測定を行うことができる。
前記マーカー脂肪酸として、５－ＨＥＴＥを用いた場合には、被験者の血液試料中の５－ＨＥＴＥの濃度を測定することができる。
前記マーカー脂肪酸として、ＬＸＡ４を用いた場合には、被験者の血液試料中のＬＸＡ４の濃度を測定することができる。
前記マーカー脂肪酸として、ＲｖＤ２を用いた場合には、被験者の血液試料中のＲｖＤ２の濃度を測定することができる。
例えば、支持体結合させたマーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質に、被験者の血液試料を接触させる。これにより、前記特異的結合物質に、マーカー酸化脂肪酸が結合して、前記支持体にマーカー酸化脂肪酸が捕捉される。次いで、前記支持体に、マーカー酸化脂肪酸に対する標識化された二次特異的結合物質を接触させる。これにより、支持体に捕捉されたマーカー酸化脂肪酸に前記二次特異的結合物質が結合する。次いで、前記二次特異的結合物質に結合する標識物質を測定することにより、血液試料中のマーカー酸化脂肪酸の測定を行うことができる。
前記マーカー脂肪酸として、５－ＨＥＴＥを用いた場合には、被験者の血液試料中の５－ＨＥＴＥの濃度を測定することができる。
前記マーカー脂肪酸として、ＬＸＡ４を用いた場合には、被験者の血液試料中のＬＸＡ４の濃度を測定することができる。
前記マーカー脂肪酸として、ＲｖＤ２を用いた場合には、被験者の血液試料中のＲｖＤ２の濃度を測定することができる。
【0045】
マーカー酸化脂肪酸を、マーカー酸化脂肪酸に対する特異的結合物質を用いて測定する方法の具体例としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免測定法（ＲＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）等が挙げられる。
【0046】
被験者の血液試料は、マーカー酸化脂肪酸の測定を行う前に、酸化脂肪酸の抽出を行ってもよい。マーカー酸化脂肪酸の分解を抑制する観点からは、マーカー酸化脂肪酸の測定を行う前に、酸化脂肪酸の抽出を行うことが好ましい。酸化脂肪酸の抽出は、Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法等の公知の方法により行うことができ、市販の脂質抽出キット等を使用してもよい。
【0047】
＜慢性皮膚疾患の評価＞
本態様の評価方法により評価される慢性皮膚疾患は、ＣＳＵであってもよく、ＡＤであってもよく、ＣＳＵ又はＡＤに類似の症状を有する慢性皮膚疾患であってもよい。
本態様の評価方法では、慢性皮膚疾患が、ＣＳＵである可能性について評価されてもよい。また、被験者がＣＳＵに罹患している可能性について評価されてもよい。また、ＣＳＵの重症度について評価されてもよい。
本態様の評価方法では、慢性皮膚疾患が、ＡＤである可能性について評価されてもよい。また、被験者がＡＤに罹患している可能性について評価されてもよい。また、ＡＤの重症度について評価されてもよい。
本態様の評価方法により評価される慢性皮膚疾患は、ＣＳＵであってもよく、ＡＤであってもよく、ＣＳＵ又はＡＤに類似の症状を有する慢性皮膚疾患であってもよい。
本態様の評価方法では、慢性皮膚疾患が、ＣＳＵである可能性について評価されてもよい。また、被験者がＣＳＵに罹患している可能性について評価されてもよい。また、ＣＳＵの重症度について評価されてもよい。
本態様の評価方法では、慢性皮膚疾患が、ＡＤである可能性について評価されてもよい。また、被験者がＡＤに罹患している可能性について評価されてもよい。また、ＡＤの重症度について評価されてもよい。
【0048】
慢性皮膚疾患がＣＳＵである可能性を評価する場合、又は被験者がＣＳＵに罹患している可能性を評価する場合、本工程において、５－ＨＥＴＥ及びＬＸＡ４からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸を測定することができる。この場合、５－ＨＥＴＥ及びＬＸＡ４の両方を測定することにより、慢性皮膚疾患がＣＳＵである可能性、又は被験者がＣＳＵに罹患している可能性をより正確に評価することができる。
被験者の有するＣＳＵの重症度を評価する場合、本工程において、ＬＸＡ４を測定することができる。
慢性皮膚疾患がＡＤである可能性を評価する場合、又は被験者がＡＤに罹患している可能性を評価する場合、本工程において、ＲｖＤ２を測定することができる。
被験者の有するＡＤの重症度を評価する場合、本工程において、ＬＸＡ４を測定することができる。
被験者の有するＣＳＵの重症度を評価する場合、本工程において、ＬＸＡ４を測定することができる。
慢性皮膚疾患がＡＤである可能性を評価する場合、又は被験者がＡＤに罹患している可能性を評価する場合、本工程において、ＲｖＤ２を測定することができる。
被験者の有するＡＤの重症度を評価する場合、本工程において、ＬＸＡ４を測定することができる。
【0049】
本工程において、ＬＸＡ４を測定することにより、被験者がＣＳＵに罹患している可能性、及び被験者がＣＳＵに罹患していた場合の重症度を同時に評価することができる。さらに、本工程において、５－ＨＥＴＥを測定することにより、被験者がＣＳＵに罹患している可能性をより正確に評価することができる。
本工程において、ＲｖＤ２を測定することにより、被験者がＡＤに罹患している可能性、及び被験者がＡＤに罹患していた場合の重症度を同時に評価することができる。
本工程において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２の全てを測定することにより、被験者がＣＳＵに罹患している可能性、及び被験者がＣＳＵに罹患していた場合の重症度、並びに被験者がＡＤに罹患している可能性、及び被験者がＡＤに罹患していた場合の重症度を評価することができる。
本工程において、ＲｖＤ２を測定することにより、被験者がＡＤに罹患している可能性、及び被験者がＡＤに罹患していた場合の重症度を同時に評価することができる。
本工程において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２の全てを測定することにより、被験者がＣＳＵに罹患している可能性、及び被験者がＣＳＵに罹患していた場合の重症度、並びに被験者がＡＤに罹患している可能性、及び被験者がＡＤに罹患していた場合の重症度を評価することができる。
【0050】
＜他の工程＞
本態様の評価方法は、上記測定工程（工程（ａ））に加えて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、前記測定工程で測定された、前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、慢性皮膚疾患を評価する工程、及び前記慢性皮膚疾患の評価結果に基づいて、慢性皮膚疾患を治療する工程等が挙げられる。
本態様の評価方法は、上記測定工程（工程（ａ））に加えて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、前記測定工程で測定された、前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、慢性皮膚疾患を評価する工程、及び前記慢性皮膚疾患の評価結果に基づいて、慢性皮膚疾患を治療する工程等が挙げられる。
【0051】
≪評価工程：工程（ｂ）≫
本態様の評価方法では、前記測定工程で測定された、前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、慢性皮膚疾患を評価する工程を含むことが好ましい。
本態様の評価方法では、前記測定工程で測定された、前記酸化脂肪酸の濃度に基づいて、慢性皮膚疾患を評価する工程を含むことが好ましい。
【0052】
例えば、上記測定工程において測定された５－ＨＥＴＥ及びＬＸＡ４からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の血中濃度に基づいて、慢性皮膚疾患がＣＳＵである可能性、又は被験者がＣＳＵに罹患している可能性を評価することができる。例えば、５－ＨＥＴＥの血中濃度が、健常人における５－ＨＥＴＥの血中濃度と比較して、上昇している場合、被験者の有する慢性皮膚疾患はＣＳＵであると評価することができる。あるいは、被験者が、ＣＳＵに罹患している可能性が高いと評価することができる。また、例えば、ＬＸＡ４の血中濃度が、健常人におけるＬＸＡ４の血中濃度と比較して、低下している場合、被験者の有する慢性皮膚疾患はＣＳＵであると評価することができる。前記健常人における前記酸化脂肪酸の血中濃度は、複数の健常人の血液試料において測定された血中濃度から算出された基準値であってもよく、表５に示されるようなカットオフ値であってもよい。
【0053】
また、例えば、上記測定工程において測定されたＬＸＡ４の血中濃度に基づいて、被験者の有するＣＳＵの重症度を評価することができる。例えば、ＬＸＡ４の血中濃度を、予め定めたＣＳＵの重症度基準値と比較して、ＣＳＵの重症度を評価することができる。例えば、ＬＸＡ４の血中濃度が、予め定めたＣＳＵの重症度基準値と比較して、上昇している場合、ＣＳＵの重症度が高い評価することができる。ＣＳＵの重症度基準値は、例えば、ＣＳＵの重症度が既知である患者のＬＸＡ４の濃度に基づいて、定められた値とすることができる。例えば、ＵＡＳ７又はＵＳＴの各スコア区分の患者群におけるＬＸＡ４の血中濃度に基づいて、ＬＸＡ４のＣＳＵ重症度基準値をそれぞれ設定してもよい。あるいは、オマリズマブを投与してＣＳＵの症状が改善した患者におけるＬＸＡ４の血中濃度に基づいて、ＬＸＡ４のＣＳＵ重症度基準値を設定してもよい。前記ＣＳＵ重症度基準値は、複数の患者の血中濃度値を統計処理して算出されたカットオフ値であることが好ましい。
また、ＬＸＡ４の血中濃度を複数の患者で測定した場合には、当該患者間の前記血中濃度を比較して、前記血中濃度が高い順にＣＳＵの重症度が高い、と評価してもよい。
また、１人の患者について、経時的にＬＸＡ４の血中濃度を測定した場合には、各測定時点における前記血中濃度の変化に基づいて、ＣＳＵの重症度の変化を評価してもよい。例えば、前回測定時よりも前記血中濃度が高くなった場合には、ＣＳＵの重症度が高くなったと評価することができ、前記測定時よりも前記血中濃度が低くなった場合には、ＣＳＵの重症度が低くなったと評価することができる。
また、ＬＸＡ４の血中濃度を複数の患者で測定した場合には、当該患者間の前記血中濃度を比較して、前記血中濃度が高い順にＣＳＵの重症度が高い、と評価してもよい。
また、１人の患者について、経時的にＬＸＡ４の血中濃度を測定した場合には、各測定時点における前記血中濃度の変化に基づいて、ＣＳＵの重症度の変化を評価してもよい。例えば、前回測定時よりも前記血中濃度が高くなった場合には、ＣＳＵの重症度が高くなったと評価することができ、前記測定時よりも前記血中濃度が低くなった場合には、ＣＳＵの重症度が低くなったと評価することができる。
【0054】
また、例えば、上記測定工程において測定されたＲｖＤ２の血中濃度に基づいて、慢性皮膚疾患がＡＤである可能性、又は被験者がＡＤに罹患している可能性を評価することができる。例えば、ＲｖＤ２の血中濃度が、健常人におけるＲｖＤ２の血中濃度と比較して、上昇している場合、被験者の有する慢性皮膚疾患はＡＤであると評価することができる。あるいは、被験者が、ＡＤに罹患している可能性が高いと評価することができる。前記健常人における前記酸化脂肪酸の血中濃度は、複数の健常人の血液試料において測定された血中濃度から算出された基準値であってもよく、表７に示されるようなカットオフ値であってもよい。
【0055】
また、例えば、上記測定工程において測定されたＲｖＤ２の血中濃度に基づいて、被験者の有するＡＤの重症度を評価することができる。例えば、ＲｖＤ２の血中濃度を、予め定めたＡＤの重症度基準値と比較して、ＡＤの重症度を評価することができる。例えば、ＲｖＤ２の血中濃度が、予め定めたＡＤの重症度基準値と比較して、上昇している場合、ＡＤの重症度が高いと評価することができる。ＡＤの重症度基準値は、例えば、ＡＤの重症度が既知である患者のＲｖＤ２の濃度に基づいて、定められた値とすることができる。例えば、ＥＡＳＩの各スコア区分の患者群におけるＲｖＤ２の血中濃度に基づいて、ＲｖＤ２のＡＤ重症度基準値をそれぞれ設定してもよい。前記ＡＤ重症度基準値は、複数の患者の血中濃度値を統計処理して算出されたカットオフ値であることが好ましい。
また、ＲｖＤ２の血中濃度を複数の患者で測定した場合には、当該患者間の前記血中濃度を比較して、前記血中濃度が高い順にＣＳＵの重症度が高い、と評価してもよい。
また、１人の患者について、経時的にＲｖＤ２の血中濃度を測定した場合には、各測定時点における前記血中濃度の変化に基づいて、ＣＳＵの重症度の変化を評価してもよい。例えば、前回測定時よりも前記血中濃度が高くなった場合には、ＣＳＵの重症度が高くなったと評価することができ、前記測定時よりも前記血中濃度が低くなった場合には、ＣＳＵの重症度が低くなったと評価することができる。
また、ＲｖＤ２の血中濃度を複数の患者で測定した場合には、当該患者間の前記血中濃度を比較して、前記血中濃度が高い順にＣＳＵの重症度が高い、と評価してもよい。
また、１人の患者について、経時的にＲｖＤ２の血中濃度を測定した場合には、各測定時点における前記血中濃度の変化に基づいて、ＣＳＵの重症度の変化を評価してもよい。例えば、前回測定時よりも前記血中濃度が高くなった場合には、ＣＳＵの重症度が高くなったと評価することができ、前記測定時よりも前記血中濃度が低くなった場合には、ＣＳＵの重症度が低くなったと評価することができる。
【0056】
≪治療工程：工程（ｃ）≫
本態様の評価方法は、前記評価工程（工程（ｂ））において行われた慢性皮膚疾患の評価に基づいて、被験者に治療を実施する工程を含んでいてもよい。
本態様の評価方法は、前記評価工程（工程（ｂ））において行われた慢性皮膚疾患の評価に基づいて、被験者に治療を実施する工程を含んでいてもよい。
【0057】
例えば、評価工程においてＣＳＵに罹患している、又はＣＳＵの重症度が高いと評価された被験者に対しては、オマリズマブ投与等の治療を実施することができる。また、例えば、評価工程においてＣＳＵの重症度が低いと評価された患者に対しては、抗ヒスタミン剤投与等の治療を実施することができる。本工程において選択される治療は、前記のものに限定されず、ＣＳＵの重症度に応じて、適切な治療方法を選択して実施することができる。
【0058】
例えば、評価工程においてＡＤに罹患している、又はＡＤの重症度が高いと評価された被験者に対しては、ＡＤの重症度の重症度に応じて、ステロイド剤又は免疫調整剤の投与等の治療を実施することができる。本工程において選択される治療は、前記のものに限定されず、ＡＤの重症度に応じて、適切な治療方法を選択して実施することができる。
【0059】
本態様の評価方法によれば、血液試料において、酸化脂肪酸マーカーを測定するという簡易な方法で、慢性皮膚疾患の評価を行うことができる。本態様による評価方法によれば、血液中の酸化脂肪酸マーカーの濃度という客観的な指標を用いるため、従来、自己申告や視覚による観察で評価されていたＣＳＵ又はＡＤの重症度を、客観的に評価することができ、適切な治療法を選択するためのデータを提供することができる。
【0060】
［他の態様］
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の検査方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、及びＬＸＡ４からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、ＣＳＵに罹患している可能性の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＬＸＡ４かの濃度を測定する工程を含む、ＣＳＵの重症度の重症度の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、ＡＤに罹患している可能性の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、ＡＤの重症度の重症度の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＳＵ患者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患を診断するためのデータの収集方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＣＳＵ患者の血液試料において、ＬＸＡ４の濃度を測定する工程を含む、前記治療によるＣＳＵの治療効果を評価する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＡＤ患者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、前記治療によるＡＤの治療効果を評価する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＳＵ患者の血液試料の検査方法であって、前記血液試料のＬＸＡ４の濃度を測定する工程と、前記ＬＸＡ４の濃度とＣＳＵの重症度とを相関させる工程とを含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＡＤ患者の血液試料の検査方法であって、前記血液試料のＲｖＤ２の濃度を測定する工程と、前記ＲｖＤ２の濃度と前記治療によるＡＤの治療効果とを相関させる工程とを含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される酸化脂肪酸に対する特異的結合物質からなる慢性皮膚疾患の診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、５－ＨＥＴＥ、及びＬＸＡ４からなる群より選択される酸化脂肪酸に対する特異的結合物質からなるＣＳＵの診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質からなるＣＳＵの重症度診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質からなるＡＤの診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質からなるＡＤの重症度診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患の検査方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、及びＬＸＡ４からなる群より選択される少なくとも１種の酸化脂肪酸の濃度を測定する工程を含む、ＣＳＵに罹患している可能性の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＬＸＡ４かの濃度を測定する工程を含む、ＣＳＵの重症度の重症度の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、ＡＤに罹患している可能性の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、被験者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、ＡＤの重症度の重症度の高い血液試料を特定する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＳＵ患者の血液試料において、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む、慢性皮膚疾患を診断するためのデータの収集方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＣＳＵ患者の血液試料において、ＬＸＡ４の濃度を測定する工程を含む、前記治療によるＣＳＵの治療効果を評価する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＡＤ患者の血液試料において、ＲｖＤ２の濃度を測定する工程を含む、前記治療によるＡＤの治療効果を評価する方法を提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＳＵ患者の血液試料の検査方法であって、前記血液試料のＬＸＡ４の濃度を測定する工程と、前記ＬＸＡ４の濃度とＣＳＵの重症度とを相関させる工程とを含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、治療を受けたＡＤ患者の血液試料の検査方法であって、前記血液試料のＲｖＤ２の濃度を測定する工程と、前記ＲｖＤ２の濃度と前記治療によるＡＤの治療効果とを相関させる工程とを含む方法を提供する。
他の態様において、本発明は、５－ＨＥＴＥ、ＬＸＡ４、及びＲｖＤ２からなる群より選択される酸化脂肪酸に対する特異的結合物質からなる慢性皮膚疾患の診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、５－ＨＥＴＥ、及びＬＸＡ４からなる群より選択される酸化脂肪酸に対する特異的結合物質からなるＣＳＵの診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＬＸＡ４に対する特異的結合物質からなるＣＳＵの重症度診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質からなるＡＤの診断薬を提供する。
他の態様において、本発明は、ＲｖＤ２に対する特異的結合物質からなるＡＤの重症度診断薬を提供する。
【実施例0061】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0062】
＜リピドミクス解析による慢性皮膚疾患マーカーの探索＞
≪対象者≫
慢性特発性蕁麻疹（ＣＳＵ）患者６７人、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者２０人、健常人（ＮＣ）２７人をリピドミクス解析の対象とした。ＣＳＵ患者については、採血前４週間以内に免疫抑制剤（コルチコステロイド、シクロスポリン）を使用した患者を除外した。ＮＣは、慢性蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎の既往がなく、現在も蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎を発症していない人を対象とした。
≪対象者≫
慢性特発性蕁麻疹（ＣＳＵ）患者６７人、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者２０人、健常人（ＮＣ）２７人をリピドミクス解析の対象とした。ＣＳＵ患者については、採血前４週間以内に免疫抑制剤（コルチコステロイド、シクロスポリン）を使用した患者を除外した。ＮＣは、慢性蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎の既往がなく、現在も蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎を発症していない人を対象とした。
【0063】
≪ＣＳＵの重症度評価≫
ＣＳＵの重症度の評価は、７－ｄａｙ Ｕｒｔｉｃａｒｉａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＵＡＳ７）及びＵｒｔｉｃａｒｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｅｓｔ（ＵＣＴ）により行った。
ＣＳＵの重症度の評価は、７－ｄａｙ Ｕｒｔｉｃａｒｉａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＵＡＳ７）及びＵｒｔｉｃａｒｉａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｅｓｔ（ＵＣＴ）により行った。
【0064】
（ＵＡＳ３７）
ＵＡＳ７は、ＣＳＵ患者自身が、表１に示す基準に従って１日毎に膨疹とかゆみの点数をつけ、７日分の点数を合計したスコアにより重症度を評価する方法である。前記スコアに基づく重症度は、以下のように評価される。スコアの点数が高いほど、病勢のコントロールは不良とされる。
スコア ２８～４２：重症
スコア １６～２７：中等症
スコア ７～１５：軽症
スコア ０～６：コントロールされている
ＵＡＳ７は、ＣＳＵ患者自身が、表１に示す基準に従って１日毎に膨疹とかゆみの点数をつけ、７日分の点数を合計したスコアにより重症度を評価する方法である。前記スコアに基づく重症度は、以下のように評価される。スコアの点数が高いほど、病勢のコントロールは不良とされる。
スコア ２８～４２：重症
スコア １６～２７：中等症
スコア ７～１５：軽症
スコア ０～６：コントロールされている
【0065】
【表1】
【0066】
（ＵＣＴ）
ＵＣＴは、ＣＳＵ患者が、表２に示す４つの質問に回答することで、過去４週間の疾患の状態の点数をつけ、４つの質問の回答点数を合計したスコアにより重症度を評価する方法である。スコアの点数が低いほど、病勢のコントロールは不良とされる。
ＵＣＴは、ＣＳＵ患者が、表２に示す４つの質問に回答することで、過去４週間の疾患の状態の点数をつけ、４つの質問の回答点数を合計したスコアにより重症度を評価する方法である。スコアの点数が低いほど、病勢のコントロールは不良とされる。
【0067】
【表2】
【0068】
≪ＡＤの重症度評価≫
ＡＤの重症度評価は、ＥＡＳＩ（Ｅｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）により行った。ＥＡＳＩは、４箇所の身体部位における湿疹面積により、ＡＤの重症度を評価する評価指標である。頭頚部、体幹（陰部そ含む）、上肢、及び下肢（臀部を含む）の４箇所の身体部位のそれぞれについて、表３に従い、湿疹面積の部分スコアを評価する。また、紅斑、浮腫／丘疹、掻破痕、及び苔癬化の４つの徴候の重症度を、表４に従い評価する。評価した部分スコア及び４つの徴候の重症度をスコア表に記録し、ＥＡＳＩ最終スコアを算出する。
ＡＤの重症度評価は、ＥＡＳＩ（Ｅｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）により行った。ＥＡＳＩは、４箇所の身体部位における湿疹面積により、ＡＤの重症度を評価する評価指標である。頭頚部、体幹（陰部そ含む）、上肢、及び下肢（臀部を含む）の４箇所の身体部位のそれぞれについて、表３に従い、湿疹面積の部分スコアを評価する。また、紅斑、浮腫／丘疹、掻破痕、及び苔癬化の４つの徴候の重症度を、表４に従い評価する。評価した部分スコア及び４つの徴候の重症度をスコア表に記録し、ＥＡＳＩ最終スコアを算出する。
【0069】
【表3】
【0070】
【表4】
【0071】
≪リピドミクス解析≫
エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を、既報の方法に従って行った（Murase R et al., Sci Rep. 2017 Sep 25;7(1):12261.）。簡単に説明すると、リン脂質の検出のために、対象者から得た血漿を１０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で希釈した。次いで、Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒの方法（Bligh EG, Dyer WJ. Can. J. Biochem. Physiol. 1959; 37: 911-917.）により脂質を抽出した。得られた脂質について、液体クロマトグラフィー（ＬＣ；ＮｅｘｅｒａＸ２システム；島津製作所）を備えた４０００Ｑ－ＴＲＡＰ四重極－線形イオントラップハイブリッド質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を用いて質量分析した。
脂質試料を、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに連結したＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム（内径１×１５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。オートサンプラーにより注入されたサンプル（１０μＬ）を、移動相Ａ（アセトニトリル／メタノール／水＝１：１：１［ｖ／ｖ／ｖ］；５μＭリン酸及び１ｍＭギ酸アンモニウム含有）及び移動相Ｂ（２－プロパノール；５μＭリン酸及び１ｍＭギ酸アンモニウム含有）を用いた段階勾配によって、５０℃、０．２ｍＬ／分の流速で分離した。
エレクトロスプレーイオン化－タンデム質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を、既報の方法に従って行った（Murase R et al., Sci Rep. 2017 Sep 25;7(1):12261.）。簡単に説明すると、リン脂質の検出のために、対象者から得た血漿を１０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で希釈した。次いで、Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒの方法（Bligh EG, Dyer WJ. Can. J. Biochem. Physiol. 1959; 37: 911-917.）により脂質を抽出した。得られた脂質について、液体クロマトグラフィー（ＬＣ；ＮｅｘｅｒａＸ２システム；島津製作所）を備えた４０００Ｑ－ＴＲＡＰ四重極－線形イオントラップハイブリッド質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を用いて質量分析した。
脂質試料を、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに連結したＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム（内径１×１５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。オートサンプラーにより注入されたサンプル（１０μＬ）を、移動相Ａ（アセトニトリル／メタノール／水＝１：１：１［ｖ／ｖ／ｖ］；５μＭリン酸及び１ｍＭギ酸アンモニウム含有）及び移動相Ｂ（２－プロパノール；５μＭリン酸及び１ｍＭギ酸アンモニウム含有）を用いた段階勾配によって、５０℃、０．２ｍＬ／分の流速で分離した。
【0072】
脂肪酸及びそれらの酸化代謝物を検出するために、血漿を１０倍量のメタノールで希釈した。－２０℃で一晩インキュベートした後、混合物に水を加えてメタノールの最終濃度が１０％（ｖ／ｖ）となるようにした。１０％メタノール中の試料を、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）にアプライし、１０ｍＬのヘキサンで洗浄し、３ｍＬのギ酸メチルで溶出し、Ｎ２ガス下で乾燥し、６０％メタノールに溶解した。次いで、試料を上記のようにＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに連結したＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８カラム（内径１×１５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。オートサンプラーにより注入された試料（１０μＬ）を、移動相Ｃ（水；０．１％酢酸含有）及び移動相Ｄ（アセトニトリル／メタノール＝４：１［ｖ／ｖ］）の段階勾配によって、４５℃、０．２ｍＬ／分の流速で分離した。内部標準として、ｄ５－標識ＥＰＡ及び１７：０ＬＰＣ（１ｎｍｏｌ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を各試料に添加した。
【0073】
同定は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジション及びリテンションタイムを用いて行った。
定量化は、ＭＲＭトランジションのピーク面積及び各化合物の標品を用いて得られた検量線に基づいて行った。その近似曲線を1次方程式で表し、Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ （ＡＵＣ）の値を代入してサンプルあたりｐｍｏｌ／ｍｌとして濃度を算出した。
定量化は、ＭＲＭトランジションのピーク面積及び各化合物の標品を用いて得られた検量線に基づいて行った。その近似曲線を1次方程式で表し、Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ （ＡＵＣ）の値を代入してサンプルあたりｐｍｏｌ／ｍｌとして濃度を算出した。
【0074】
≪統計学的解析≫
統計学的解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＭＤＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。群間の比較は、Ｋｒｕｓｋａｌ－ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔを用いた。相関の評価には、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数を用いた。ｐ値が０．０５未満の場合を、統計学的に有意な差が認められると判断した。
統計学的解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＭＤＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。群間の比較は、Ｋｒｕｓｋａｌ－ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔを用いた。相関の評価には、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数を用いた。ｐ値が０．０５未満の場合を、統計学的に有意な差が認められると判断した。
【0075】
＜ＣＳＵマーカーの探索＞
図１～３に、ＣＳＵ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿を用いたリピドミクス解析の結果を示す。図１は、アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。図２は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。図３は、リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
図１～３に、ＣＳＵ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿を用いたリピドミクス解析の結果を示す。図１は、アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。図２は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。図３は、リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
【0076】
図１～３の結果から、ＣＳＵ患者と健常人との間で、血漿中濃度に有意差が認められた８個の脂質メディエーターについて、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）による解析を行った。その結果を表５に示す。
【0077】
【表5】
【0078】
表５に示す脂質メディエーターのうち、５－ＨＥＴＥは、健常人と比較してＣＳＵ患者の血漿中濃度が有意に高く、またカットオフ値が２０ｐｍｏｌ／Ｌ以上であった。表５に示す脂質メディエーターのうち、ＬＸＡ４は、健常人と比較してＣＳＵ患者の血漿中濃度が有意に低く、またカットオフ値が２０ｐｍｏｌ／Ｌ以上であった。そのため、これらの２つの脂質メディエーターをＣＳＵの鑑別マーカーとして選択した。このうち、５－ＨＥＴＥは、健常人との間で有意差が大きく、ＣＳＵの鑑別マーカーとして優れていると考えられた。
【0079】
＜ＣＳＵ重症度マーカーの探索＞
ＣＵＳ患者における血漿中の濃度が、ＣＳＵの重症度の指標であるＵＳＡ７スコアと相関のある脂質メディエーターの探索を行った。その結果、ＬＸＡ４、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥの３つの脂質メディエーターが、ＵＡＳ７スコアと相関していた。図４は、ＬＸＡ４の血漿中の濃度とＵＡＳ７スコアとの相関を示すグラフである。
ＣＵＳ患者における血漿中の濃度が、ＣＳＵの重症度の指標であるＵＳＡ７スコアと相関のある脂質メディエーターの探索を行った。その結果、ＬＸＡ４、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥの３つの脂質メディエーターが、ＵＡＳ７スコアと相関していた。図４は、ＬＸＡ４の血漿中の濃度とＵＡＳ７スコアとの相関を示すグラフである。
【0080】
≪オマリズマブ投与によるＣＳＵ重症度マーカーの評価≫
オマリズマブの投与が行われたＣＳＵ患者１４例を対象とした。初回投与から４週間隔でオマリズマブ３００ｍｇを皮下注射した。オマリズマブ投与前と３回目投与時の直前に、患者から血漿を採取した（図５参照）。
オマリズマブの投与が行われたＣＳＵ患者１４例を対象とした。初回投与から４週間隔でオマリズマブ３００ｍｇを皮下注射した。オマリズマブ投与前と３回目投与時の直前に、患者から血漿を採取した（図５参照）。
【0081】
（オマリズマブ投与による重症度の変化）
オブリズマブ投与前と投与後（３回目投与時の直前）のＵＡＳ７スコア及びＵＣＴスコアの変化を図６に示す。ＵＡＳ７スコアは投与後に低くなり、ＵＣＴスコアは投与後に高くなった。これらの変化は、オブリズマブ投与により、ＣＳＵの重症度が改善したことを示す。オマリズマブの投与前と投与後のＵＡＳ７スコア及びＵＣＴスコアの平均値を表６に示す。
オブリズマブ投与前と投与後（３回目投与時の直前）のＵＡＳ７スコア及びＵＣＴスコアの変化を図６に示す。ＵＡＳ７スコアは投与後に低くなり、ＵＣＴスコアは投与後に高くなった。これらの変化は、オブリズマブ投与により、ＣＳＵの重症度が改善したことを示す。オマリズマブの投与前と投与後のＵＡＳ７スコア及びＵＣＴスコアの平均値を表６に示す。
【0082】
【表6】
【0083】
（オマリズマブ投与による重症度マーカーの変化）
ＬＸＡ４、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥの３つの脂質メディエーターについて、オブリズマブ投与前と投与後（３回目投与時の直前）の血漿中の濃度の変化を調べた。その結果、ＬＸＡ４の血漿中濃度は、オブリズマブ投与前と比較して、投与後で有意に低下することが確認できた。図７に、ＬＸＡ４の血漿中濃度の変化を示す。この結果は、ＬＸＡ４の血漿中濃度が、ＣＳＵの重症度の改善に伴って低下することを示す。
一方、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥは、オブリズマブの投与前後で、有意な変化は認められなかった。
これらの結果から、ＬＸＡ４を、ＣＳＵの重症度マーカーとして選択した。
ＬＸＡ４、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥの３つの脂質メディエーターについて、オブリズマブ投与前と投与後（３回目投与時の直前）の血漿中の濃度の変化を調べた。その結果、ＬＸＡ４の血漿中濃度は、オブリズマブ投与前と比較して、投与後で有意に低下することが確認できた。図７に、ＬＸＡ４の血漿中濃度の変化を示す。この結果は、ＬＸＡ４の血漿中濃度が、ＣＳＵの重症度の改善に伴って低下することを示す。
一方、１２－ＨＥＴＥ、及び１２－ＨＥＰＥは、オブリズマブの投与前後で、有意な変化は認められなかった。
これらの結果から、ＬＸＡ４を、ＣＳＵの重症度マーカーとして選択した。
【0084】
＜ＡＤマーカーの探索＞
図８～１０に、ＡＤ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿を用いたリピドミクス解析の結果を示す。図８は、アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。図９は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。図１０は、リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
図８～１０に、ＡＤ患者及び健常人（ＮＣ）の血漿を用いたリピドミクス解析の結果を示す。図８は、アラキドン酸（ＡＡ）代謝物の解析結果である。図９は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）代謝物の解析結果である。図１０は、リノール酸（ＬＡ）及びリノレイン酸（ＬＮ）代謝物の解析結果である。
【0085】
図８～１０の結果から、ＡＤ患者と健常人との間で、血漿中濃度に有意差が認められた２２個の脂質メディエーターについて、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）による解析を行った。その結果を表７に示す。
【0086】
【表7】
【0087】
表７に示す脂質メディエーターのうち、ＲｖＤ２は、健常人と比較して、ＡＤ患者の血漿中濃度が有意に高くなったのは、ＲｖＤ２のみであった。そのため、ＲｖＤ２を、ＡＤの鑑別マーカーとして選択した。
【0088】
＜ＡＤ重症度マーカーの探索＞
ＡＤ患者における血漿中の濃度が、ＡＤの重症度の指標であるＥＡＳＩスコアと相関のある脂質メディエーターの探索を行った。その結果、ＲｖＤ２が、あるＥＡＳＩスコアと相関していた。図１１は、ＲｖＤ２の血漿中の濃度とＥＡＳＩスコアとの相関を示すグラフである。
これらの結果から、ＲｖＤ２を、ＡＤの重症度マーカーとして選択した。
ＡＤ患者における血漿中の濃度が、ＡＤの重症度の指標であるＥＡＳＩスコアと相関のある脂質メディエーターの探索を行った。その結果、ＲｖＤ２が、あるＥＡＳＩスコアと相関していた。図１１は、ＲｖＤ２の血漿中の濃度とＥＡＳＩスコアとの相関を示すグラフである。
これらの結果から、ＲｖＤ２を、ＡＤの重症度マーカーとして選択した。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明によれば、ＣＳＵ及びＡＤ等の慢性皮膚疾患の客観的な評価が可能な、慢性皮膚疾患の検査キット、及び慢性皮膚疾患の評価方法が提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】