特開 2022-47372 アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法、並びに該方法に用いるための組成物及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022047372

(43)【公開日】2022-03-24

(54)【発明の名称】アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法、並びに該方法に用いるための組成物及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/46 20060101AFI20220316BHJP

   G01N 33/84 20060101ALI20220316BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20220316BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/46

G01N33/84 Z

G01N33/68

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020153255

(22)【出願日】2020-09-11

(71)【出願人】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(71)【出願人】

【識別番号】510060844

【氏名又は名称】学校法人電子開発学園

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100150898

【弁理士】

【氏名又は名称】祐成 篤哉

(74)【代理人】

【識別番号】100114292

【弁理士】

【氏名又は名称】来間 清志

(72)【発明者】

【氏名】山本 万里

(72)【発明者】

【氏名】西平 順

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 浩二

(72)【発明者】

【氏名】上島 希実

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045DA20

2G045DB08

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ32

4B063QR12

4B063QS02

4B063QS10

4B063QS36

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】本発明の課題は、健常者群等からＭＣＩ等のアミロイドβと関連する疾患又は状態の発症リスクの高い者を簡便・安価に発見する方法の提供である。
【解決手段】本発明は、被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼの量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼの量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法。

【請求項2】

前記被検体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記被検体が６０歳以上のヒトである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３２６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記被検体が男性のヒトであり、前記血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３０６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記アミロイドβと関連する疾患又は状態の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験が行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記追加試験が、前記被検体から単離された血液中のマグネシウムの量を、前記アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とすることを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２ｍｇ／ｄＬ以上であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記被検体が女性のヒトであり、前記血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２４ｍｇ／ｄＬ以上であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

前記追加試験が、認知機能検査である、Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ試験及び時計描画試験からなる群から選択される１つ以上である、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)、脳血管アミロイドアンギオパチー、及びグアムパーキンソン認知症複合からなる群から選択される神経障害又は進行性核上性麻痺、多発性硬化症、封入体筋炎（ＩＢＭ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病（２型糖尿病）、老人性心アミロイドーシス、内分泌腫瘍、緑内障、眼アミロイドーシス、原発性網膜変性、黄斑変性、視神経ドルーゼン、視神経症、視神経炎、又は格子状異栄養である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態の発症についての前記被験体のリスクを測定ないし発見するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を前記被験体において発見するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を有する被験体を選択するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を予防又は治療するための摂取物に対する前記被験体の反応を測定、評価ないしモニタリングするためのもの、あるいは、前記被験体における前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態の経過を測定、評価ないしモニタリングするためのものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に用いるための組成物であって、該組成物は、前記コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、組成物。

【請求項14】

前記反応物質は、前記コリンエステラーゼの基質を含む、請求項１３記載の組成物。

【請求項15】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであって、該キットは、前記コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、キット。

【請求項16】

前記反応物質は、前記コリンエステラーゼの基質を含む、請求項１５記載のキット。

【請求項17】

請求項７～９のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、更に、前記マグネシウムを定量するための試薬を含む、請求項１５又は１６に記載の試験キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法、並びに該方法に用いるための組成物及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

認知症は高齢化率が増えるのに従って発症リスクが高まる疾病である。世界の認知症患者は、２０１７年で４７００万人いるとされ、２０３０年に７５００万人、２０５０年に１億３１００万人に増えると予想されている。また、認知症の増加で医療・介護給付費が２０３０年に世界で２兆ドル、２０２５年に日本で１０．７兆円に達する可能性が指摘されている。

【0003】

日本は全人口における認知症有病率が２．３３％であり、ＯＥＣＤ加盟国（１．４８％）のうちで最も高い割合となっている。日本の認知症の中では、アルツハイマー型（ＡＤ）が５０％、レビ－小体型が２０％、血管性が１５％、その他が１５％であり、ＡＤ型認知症の治療、予防が重要である。ＡＤは脳にアミロイドβ（Ａβ）が蓄積し、神経原繊維が変化し、記憶を司る海馬が縮小して起こるという「アミロイドカスケード仮説」が支持されている。

【0004】

認知症の前段階に適切な予防／治療をすることで認知機能が回復する軽度認知障害（ＭＣＩ）という状態があり、この段階で改善できれば認知症の発症タイミングを遅延させることができることがわかっている。ＭＣＩから認知症に進展する人の割合は年平均で１０％、５年間で約４０％と言われている。また、ＭＣＩで適切な処置をすれば１６－４１％の人が回復することが日本神経学会、認知症疾患診療ガイドライン２０１７に示されている。そのため、このＭＣＩを早期に発見・評価して予防措置を行えば、認知症患者を大幅に減少させられるので、発症リスクの高い健常者の早期発見法の開発が強く期待されている。

【0005】

認知症の検査・診断では、記憶や言語のテスト、血液検査、脳画像検査（ＣＴ、ＭＲＩ）、脳血流ＳＰＥＣＴ（シンチグラフィ）検査、ドパミントランスポータシンチグラフィ（発現量の低下を検査）、ＭＩＢＧ心筋シンチグラフィ検査（心筋交感神経検査）などが実施されている。

【0006】

ＭＣＩのリスクを判定する血液検査として、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡ１；Ａβペプチドを脳から髄液中に排出するタンパク質）、補体タンパク質（Ｃ３；Ａβを捕食処理するタンパク質）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；Ａβと結合して毒性を弱めるタンパク質）を測定するもの（ＭＣＩスクリーニング検査）やＡＰＯＥ遺伝子の型の検査（Ｅ４ホモでリスクが１５倍になる）が実用化されている。

【0007】

認知症の早期発見技術について、研究も進められており、例えば、血清中のＦＡＢＰ、ｓＴＮＦＲ１、ＴＮＣ、ＩＣＡＭ－１、サイトカイン類などのタンパク質の発現レベルをバイオマーカーとして測定して軽度認知障害を判定する方法（特許文献１）、赤血球中プラズマローゲンの値で認知症を診断する技術（特許文献２）、嗅覚組織のｍｉＲ－２０６の発現レベルで軽度認知障害を診断する方法（特許文献３）等が提案されている。また、血清マグネシウム値が基準値内０．７～１．１０ｍｍｏｌ／Ｌ（１．７～２．７ｍｇ／ｄＬ）であっても０．７９ｍｍｏｌ／Ｌ以下又は１．９ｍｇ／ｄＬ以下である場合に認知症リスクを３２％増加し、０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上又は２．２ｍｇ／ｄＬ以上である場合に認知症リスクを３０％増加することが報告されている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表２０１９－５２２１９３号公報

【特許文献2】国際公開第２０１２／０９０６２５号

【特許文献3】特表２０１８－５１５１４５号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｉｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｄｅｍｅｎｔｉａ．２０１７、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、８９（１６）、１７１６－１７２２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかしながら、ＭＣＩのリスク判定を行う検査は血液検査を含め、概して高価であり、安価、安全に検査ができないという問題がある。そこで、本発明は、健常者群等からＭＣＩ等のアミロイドβと関連する疾患又は状態の発症リスクの高い者を簡便・安価に発見する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、血液中のコリンエステラーゼの量がアミロイドβの脳内蓄積量と相関し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。

【0012】

［１］ 被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼの量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法。
［２］ 前記被検体が哺乳動物である、上記［１］に記載の方法。
［３］ 前記被検体が６０歳以上のヒトである、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３２６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］ 前記被検体が男性のヒトであり、前記血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３０６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 前記アミロイドβと関連する疾患又は状態の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験が行われる、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］ 前記追加試験が、前記被検体から単離された血液中のマグネシウムの量を、前記アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とすることを含む、上記［６］に記載の方法。
［８］ 前記血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２ｍｇ／ｄＬ以上であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、上記［７］に記載の方法。
［９］ 前記被検体が女性のヒトであり、前記血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２４ｍｇ／ｄＬ以上であることを、前記被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とする、上記［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］ 前記追加試験が、認知機能検査である、Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ試験及び時計描画試験からなる群から選択される、上記［６］に記載の方法。
［１１］ 前記疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)、脳血管アミロイドアンギオパチー、及びグアムパーキンソン認知症複合からなる群から選択される神経障害又は進行性核上性麻痺、多発性硬化症、封入体筋炎（ＩＢＭ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病（２型糖尿病）、老人性心アミロイドーシス、内分泌腫瘍、緑内障、眼アミロイドーシス、原発性網膜変性、黄斑変性、視神経ドルーゼン、視神経症、視神経炎、又は格子状異栄養である、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］ 前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態の発症についての前記被験体のリスクを測定ないし発見するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を前記被験体において発見するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を有する被験体を選択するためのもの、前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を予防又は治療するための摂取物に対する前記被験体の反応を測定、評価ないしモニタリングするためのもの、あるいは、前記被験体における前記アミロイドβと関連する疾患若しくは状態の経過を測定、評価ないしモニタリングするためのものである、上記［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。

【0013】

［１３］ 上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法に用いるための組成物であって、該組成物は、前記コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、組成物。
［１４］ 前記反応物質は、前記コリンエステラーゼの基質を含む、上記［１３］記載の組成物。
［１５］ 上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであって、該キットは、前記コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、キット。
［１６］ 前記反応物質は、前記コリンエステラーゼの基質を含む、上記［１５］記載のキット。
［１７］ 請求項７～９のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、更に、前記マグネシウムを定量するための試薬を含む、上記［１５］又は［１６］に記載の試験キット。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、健常者群等からＭＣＩ等のアミロイドβと関連する疾患又は状態の発症リスクの高い者を簡便・安価に発見する方法を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。

【0016】

＜アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法＞
本発明の第一の態様は、被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法である。

【0017】

本発明者らは、血液中のコリンエステラーゼの量がアミロイドβの脳内蓄積量ないしアミロイドβの脳内蓄積量を示す値、例えば、後述のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と相関し得ることを見出し、血液検査において、簡便で安価に測定できる血液中のコリンエステラーゼの量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とすることができることを見出したものである。

【0018】

アミロイドβは、脳内で生成する前駆体タンパク質ＡＰＰの部分断片であり、βセクレターゼ及びγセクレターゼによる連続した切断によって産生、分泌される。４０個前後のアミノ酸で構成され、多数のペプチドが存在するが、その中でも、Ａβ１－４０、Ａβ１－４２及びそれらの前駆体であるＡＰＰ６６９－７１１がアルツハイマー病変を検出する良好な血液バイオマーカーであることが知られている。

【0019】

アミロイドβと関連する疾患又は状態は、アミロイドβの脳内蓄積量と相関する可能性が高いとされ、脳内のアミロイドβの蓄積は、例えば、血中アミロイドβの量の測定により推測することができる。血中アミロイドβの量は、例えば、アミロイドβの中でもＭＣＩやアルツハイマー型認知症その他の認知症等のアミロイドβと関連する疾患又は状態の発症と特に関係が深いＡβ１－４２及びＡＰＰ６６９－７１１の２つの値をスケーリングしてスコア化したＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ（コンポジット・バイオマーカー）値により推測することができる。本発明の第一の態様は、アミロイドβの脳内蓄積量ないしＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と、被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼの量（濃度）とを相関させることを含むものであってもよい。

【0020】

被検体としては、哺乳動物等の動物が挙げられ、アミロイドβと関連する疾患又は状態を生じ得る動物であれば特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類のほか、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ等の非ヒトの哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトとしては、アミロイドβの脳内蓄積量、ないし、アミロイドβと関連する疾患又は状態との相関、具体的には正の相関が高い点で、６０歳以上のヒトが好ましく、血液中のコリンエステラーゼの量とアミロイドβの脳内蓄積量、ないし、アミロイドβと関連する疾患又は状態との相関、具体的には正の相関が高い点で、男性のヒトがより好ましく、６０歳以上の男性のヒトが更に好ましい。

【0021】

血液中のコリンエステラーゼの量としては、具体的には、血漿中又は血清中のコリンエステラーゼの量であってよく、血清中のコリンエステラーゼの量であることが好ましい。本発明の第一の態様は、血液中のコリンエステラーゼの量を取得、測定ないし決定することを含むものであってもよい。

【0022】

血液、血漿及び血清の取得方法は特に限定されず、従来公知の方法、例えば、臨床検査用検体として血液を取得（採血）する方法、血液から臨床検査用検体として取得する血漿、血清の分離方法に準じることができる。例えば、血液をＥＤＴＡ管やヘパリン管等に採り、遠心分離することにより、血漿を得ることができる。また、血液を試験管等に採り、遠心分離することにより、血清を得ることができる。

【0023】

血液中、血漿中ないし血清中のコリンエステラーゼの量の測定方法としては、コリンエステラーゼを定量できる方法であれば特に限定されず、例えば、コリンエステラーゼを定量するためのキット又は検査用組成物、例えば、コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含むキット又は検査用組成物により定量する方法等が挙げられる。該反応物質は、コリンエステラーゼの基質を含むものであってよく、該基質としては、例えば、後述のｐ－ヒドロキシベンゾイルコリンヨウ素塩（ｐＨＢＣ）等が挙げられる。

【0024】

血液中、血漿中ないし血清中のコリンエステラーゼの量の測定方法としては、例えば、一般の血液検査において採用される方法、具体的には、ＵＶ法、ＪＳＣＣ標準化対応法（ｐＨＢＣ基質法ともいう。）等が挙げられる。該ＪＳＣＣ標準化対応法は、例えば、血液検査用コリンエステラーゼキット、又は「セロテック」ＣｈＥ－ＣＬ、「セロテック」ＣｈＥ－ＭＬ（セロテック社製）等の体外診断用医薬品等の検査用組成物を用いると、簡便・安価に測定することができる。該キットないし検査用組成物は、検体中のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ、非特異的コリンエステラーゼ）がｐ－ヒドロキシベンゾイルコリンヨウ素塩（ｐＨＢＣ）を基質としてｐ－ヒドロキシ安息香酸とコリンを生成すること、該ｐ－ヒドロキシ安息香酸にｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐＨＢＨ）が作用することにより３，４－ジヒドロキシ安息香酸を生成し、同時にβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型四ナトリウム四水和物（β－ＮＡＤＰＨ）がβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（β－ＮＡＤＰ）となることを利用し、該β－ＮＡＤＰＨの減少に伴う吸光度の減少速度を測定することによりコリンエステラーゼ活性値を求めるものである。尚、副反応を阻害するためプロトカテキン酸－３，４－ジオキシゲナーゼ（ＰＣＯ）を添加して、３，４－ジヒドロキシ安息香酸を分解し、β－カルボキシムコン酸としている。ｐＨＢＨ、ＮＡＤＰＨ、ＰＣＯを含む第１試薬、ｐＨＢＣを含む第２試薬と血清等とを混合して反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度によりコリンエステラーゼの濃度を求めることができる。

【0025】

血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３２６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とすることができる。上記血清中のコリンエステラーゼの量は、ヒト、例えば男女合わせたヒト、具体的には６０歳以上のヒト、特に６０歳以上の男女合わせたヒトのものであることが好ましい。

【0026】

なかでも、被検体が男性のヒト、例えば６０歳以上の男性のヒトである場合、血液中のコリンエステラーゼの量が、該血液から得られる血清中のコリンエステラーゼの量として３０６ ＩＵ／Ｌ以下であることを、該被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とすることができる。

【0027】

上記３２６ ＩＵ／Ｌ以下ないし３０６ ＩＵ／Ｌ以下という値は、従来、正常範囲とされており、しかも、例えば男性のヒトにおいて基準値とされていた２４５～４９５ ＩＵ／Ｌの範囲内の中でも高い値ほどアミロイドβの脳内蓄積量との相関が高い可能性があるとの見解があったにもかかわらず、本発明者らがアミロイドβの脳内蓄積量ないしアミロイドβの脳内蓄積量を示す値、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と相関し得ることを新たに見出したものである。

【0028】

本発明の第一の態様は、アミロイドβと関連する疾患又は状態の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験が行われるものであってもよい。

【0029】

上記追加試験は、アミロイドβと関連する疾患又は状態に関する少なくとも１つの追加バイオマーカーを検出することを含むものであってよい。該追加バイオマーカーとしては、例えば、被検体から単離された血液中のマグネシウム（Ｍｇ）が挙げられ、具体的には、本発明の第一の態様は、被検体から単離された血液中のマグネシウムの量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とすることを含むものであってもよく、これによりアミロイドβと関連する疾患又は状態の指標としての精度が高くなることが期待される。

【0030】

血液中のマグネシウムの量としては、具体的には、血漿中又は血清中のマグネシウムの量であってよく、血清中のマグネシウムの量であることが好ましい。
血液、及び血清の取得方法は特に限定されず、例えば、コリンエステラーゼについて上述した方法と同様の方法を適用することができる。

【0031】

血液中、血漿中ないし血清中のマグネシウムの量の測定方法としては、マグネシウムを定量できる方法であれば特に限定されず、例えば、マグネシウムを定量するためのキット又は検査用組成物、例えば、マグネシウムを定量するための試薬を含むキット又は検査用組成物により定量する方法等が挙げられる。該試薬としては、例えば、キシリルアゾバイオレット、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）等が挙げられる。

【0032】

血液中、血漿中ないし血清中のマグネシウムの量の測定方法としては、例えば、一般の血液検査において採用される方法、具体的には、キシリジルブルー法（発色液：キシリジルアゾバイオレットＩ）、酵素法等が挙げられる。これらの方法は、例えば、血液検査用キット又は体外診断用医薬品等の検査用組成物を用いると、簡便・安価に測定することができる。
キシリジルブルー法は、マグネシウムがアルカリ条件下でキシリルアゾバイオレットと結合して赤色のキレート化合物を形成することを利用し、該赤色を吸光度（５２０ｎｍ、８００ｎｍ）で測定することを含む方法である。

【0033】

酵素法は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）がイソクエン酸を基質としてマグネシウムの存在下に２－オキソグルタル酸を生成し、それと同時に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に変わること、該反応速度がマグネシウム濃度に比例し、該ＮＡＤＰＨが３４０ｎｍに吸収極大を有することを利用し、該吸光度の増加速度を測定して検体中のマグネシウム濃度を求めるものである。例えば、Ｄ－イソクエン酸－１カリウム塩、及びＩＣＤＨを含む酵素試薬液Ｉ、ＮＡＤＰを含む酵素試薬液ＩＩと血清等とを混合して反応させ、３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度によりマグネシウム濃度を求めることができる。

【0034】

上述の追加試験として、血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２ｍｇ／ｄＬ以上であることを、被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とすることを含むことが好ましい。上記血清中のマグネシウムの量は、ヒト、例えば男女合わせたヒト、具体的には６０歳以上のヒト、特に６０歳以上の男女合わせたヒトのものであることが好ましい。

【0035】

なかでも、被検体が女性のヒト、例えば６０歳以上の女性のヒトである場合、血液中のマグネシウムの量が、該血液から得られる血清中のマグネシウムの量として２．２４ｍｇ／ｄＬ以上であることを、該被検体におけるアミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の指標とすることができる。

【0036】

また、アミロイドβと関連する疾患又は状態の診断を容易にするための少なくとも１つの追加試験は、認知機能検査である、Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ試験及び時計描画試験からなる群から選択される１つ以上であってもよく、これらの追加試験は、上述の少なくとも１つの追加バイオマーカーの検出を含む追加試験の代りに又は追加して行ってもよく、費用、簡便さ、被検体のニーズ等に応じて適宜選択することができるが、アミロイドβと関連する疾患又は状態の可能性の精度を高め得る点で、追加して行う又は併用することが好ましい。

【0037】

上記追加試験としては、被検体がヒトである場合、Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験が好ましい。Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験は、被検体に３つの言葉を記憶させ、覚えている言葉の数に応じ０～３点で評価する「言葉の記憶」試験と、１１時１０分の時計を描くことができるか否かに応じ０点か２点で評価する「時計描画」試験との合計点で判断する試験であり、「言葉の記憶」試験で覚えている言葉の数が少ないほど、また、「言葉の記憶」及び「時計描画」の両方を間違うほど、ＭＣＩやアルツハイマー型認知症その他の認知症等の可能性が高いとされ、その傾向は被検者が６０歳以上である場合に強い。

【0038】

アミロイドβと関連する疾患又は状態としては、認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)、脳血管アミロイドアンギオパチー、及びグアムパーキンソン認知症複合からなる群から選択される神経障害又は進行性核上性麻痺、多発性硬化症、封入体筋炎（ＩＢＭ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病（２型糖尿病）、老人性心アミロイドーシス、内分泌腫瘍、緑内障、眼アミロイドーシス、原発性網膜変性、黄斑変性、視神経ドルーゼン、視神経症、視神経炎、又は格子状異栄養等が挙げられる。上記認知症としては、典型的には、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病；ＡＤ）等が挙げられる。なかでも、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病；ＡＤ）等の認知症が好適であり、軽度認知障害（ＭＣＩ）が望ましい。

【0039】

即ち、本発明の第一の態様は、上述のとおり、被検体から単離された血液中のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の量を、アミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする方法であるが、具体的には、該コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の量を、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病；ＡＤ）等の認知症その他の上記疾患若しくは状態を被検体が発症している又は将来発症するリスクがあることの指標とすることができる方法である。

【0040】

本発明の第一の態様の上記方法は、例えば、アミロイドβと関連する疾患若しくは状態の発症についての健常者等の被験体のリスクを測定、発見（早期発見を含む）、決定ないし判断するためのもの、アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を被験体において決定、判断ないし発見（早期発見を含む）するためのもの、アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を有する被験体を選択（ないしスクリーニング）するためのもの、アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を予防又は治療するための摂取物（例えば、食品、サプリメント、医薬品）に対する被験体の反応（例えば、摂取物により該予防又は治療の効果があるかどうか）を測定、評価ないしモニタリングするためのもの、あるいは、被験体におけるアミロイドβと関連する疾患若しくは状態の経過（投薬等の治療開始後を含む。）を測定、評価ないしモニタリングするためのものとして、それぞれ好適である。

【0041】

本発明の第一の態様の上記方法は、インビトロで検査でき、非侵襲で安全であり、簡便で安価な血液検査を行うことにより、これらの目的を達成し、又は、これらの目的の支援を行うことができる。本発明の第一の態様の上記方法は、アミロイドβと関連する疾患若しくは状態を診断する方法、事前診断する方法、これら診断を支援ないし補助する方法等としても好適である。

【0042】

＜組成物＞
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様の方法に用いるための組成物であって、血液中、血漿中ないし血清中の少なくともコリンエステラーゼの量を測定することができる組成物である。該組成物は、典型的には、コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、組成物である。該組成物としては、例えば、本発明の第一の態様の方法において、血液中、血漿中ないし血清中のコリンエステラーゼの量の測定に用いることができる、体外診断用医薬品等の検査用組成物として説明したものが挙げられる。

【0043】

＜キット＞
本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様の方法に用いるためのキットであって、血液中、血漿中ないし血清中の少なくともコリンエステラーゼの量を測定することができるキットである。該キットは、典型的には、コリンエステラーゼの存在を検出する反応物質、及び該コリンエステラーゼを定量するための試薬を含む、キットである。該キットとしては、例えば、本発明の第一の態様の方法において、血液中、血漿中ないし血清中のコリンエステラーゼの量の測定に用いることができる、検査用のキットとして説明したものが挙げられる。

【0044】

該キットは、例えば、本発明の第一の態様の方法において、アミロイドβと関連する疾患又は状態の診断を容易にするための追加試験として、被検体から単離された血液中のマグネシウムの量をもアミロイドβと関連する疾患又は状態の指標とする場合、更に、血液中、血漿中ないし血清中のマグネシウムを定量することができるものであってよい。該マグネシウムを定量することができるものとしては、典型的には、該マグネシウムを定量するための試薬を含むものであり、例えば、本発明の第一の態様の方法において、血液中、血漿中ないし血清中のマグネシウムの量の測定に用いることができる、検査用のキットとして説明したものが挙げられる。

【実施例0045】

以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0046】

１．アミロイドβの量の測定
４７４名の健常者（ヒト。軽度認知障害（ＭＣＩ）の患者を含み得るが、認知症とは診断されていない健常者。）の血液中に存在する微量のアミロイドβ含量の分析を次のようにして行った。
被験者の血漿に、抗アミロイドβモノクローナル抗体を結合した磁気ビーズを処理した後、免疫沈降（ＩＰ）を行い、アミロイドβを磁気ビーズから溶出した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）によりＡβ１－４０、Ａβ１－４２及びそれらの前駆体であるＡＰＰ６６９－７１１の３種のペプチドを測定し、ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２及びＡβ１－４０／Ａβ１－４２２種のバイオマーカー値を算出した。それぞれの値をｚ－ｓｃｏｒｅ化（データセットの値を平均値＝０、標準偏差＝１になるよう変換した値）して大きくスケールの異なる値をスケーリングした後、平均化した値をＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値として算出した。尚、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値は、４０歳代の平均が男性で－０．５４２、女性で－０．７１８であり、５０歳代の平均が男性で－０．３１６、女性で－０．５０４であり、６０歳代の平均が男性で－０．３４０、女性で－０．３５７であり、７０歳代の平均が男性で－０．１９５、女性で－０．１８４であった。

【0047】

２．バイオマーカー値の取得
各被験者の血中コリンエステラーゼ濃度をＪＳＣＣ標準化対応法により測定した。また、各被験者の血中マグネシウム濃度を酵素法により測定した。

【0048】

３．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値とバイオマーカー値との相関解析
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と正の相関を有するバイオマーカーを探索すべく、上記４７４名の被験者を４０歳代、５０歳代、６０歳代以上の世代ごとに、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と血液検査データとの関係を調査した。解析は、世代ごとにＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値の平均値等を計算し、平均値未満の被験者グループと平均値以上の被験者グループとの間で、検査値に有意差があるかどうかについて検定を行った（ｔ－検定）。

【0049】

解析の結果、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値を平均値未満と平均値以上とで分けた場合には相関は顕著ではなかったが、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が０以上の被験者群と０未満の被験者群との間に、血中コリンエステラーゼ濃度と血中マグネシウム濃度の各平均値に差が見られた。結果を表１に示す。表１において、ｐ値（ｐ－ｖａｌ）が小さい方が有意差が強く、ｐ値が０．０５以下の場合に特に統計的に有意な差があることを示す。
尚、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値は年代が高くなるに伴い上昇していた。その変化は女性で大きい傾向があった。更に、アルツハイマー型認知症は、ＡｐｏＥ遺伝子にＥ４型を持つ人でリスクが上昇することが知られている。６０歳代以上の被験者では、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が０以上の被験者はＡｐｏＥにＥ４型を持つ被験者の割合が高かった。

【0050】

【表1】

【0051】

表１からわかるように、血清コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）濃度は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が高い被験者で低い傾向にあり、具体的には、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が０以上の被験者（６０歳代以上の男女混合）において３２６ ＩＵ／Ｌ以下であり、該被検者体を男女に分けて解析すると、男性の場合に正の相関が顕著であり、３０６ ＩＵ／Ｌ以下であった。
また、別の解析から、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値と、血清マグネシウム濃度とに正の相関が見られた。血中マグネシウム濃度は年齢とともに増加傾向にある。６０歳代以上では、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が高めの被験者は、血中マグネシウム濃度が有意に高い。具体的には、血清マグネシウム濃度は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値が０以上の被験者（６０歳代以上の男女混合）において２．２ｍｇ／ｄＬ以上であり、該被検者体を男女に分けて解析すると、女性の場合に正の相関が顕著であり、２．２４ｍｇ／ｄＬ以上であった。

【0052】

４．マグネシウム摂取量とＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値及び血中マグネシウム量への影響
４７４名の被験者中の任意について、平均的な一日の朝食、昼食、夕食及び間食の各成分と量とを記録することにより、食事からのマグネシウム摂取量を「日本食品標準成分表（７訂）」により算出した。
その結果、食事からのマグネシウム摂取量と、上述のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値又は血中マグネシウム濃度との関係は見られなかった。

【0053】

以上の結果から、血中コリンエステラーゼ濃度及び血中マグネシウム濃度は、アミロイドβの蓄積を示す指標となり得ることがわかった。具体的には、６０歳以上の被験者（健常者）において、血清コリンエステラーゼが３２６ ＩＵ／Ｌ以下の人（男女混合）、具体的には３０６ ＩＵ／Ｌ以下の男性は、ＭＣＩないし認知症の発症リスクが高いと評価でき、該評価は、血清マグネシウムが２．２ｍｇ／ｄＬ以上の人（男女混合）、具体的には２．２４ｍｇ／ｄＬ以上の女性とも相関することがわかった。

【0054】

５．Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験
上記被験者に対し、Ｍｉｎｉ－ｃｏｇ試験を行った。結果を、上述で得られたアミロイドβの量としてアミロイドβ量の平均（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値の平均）と併記して表２及び表３に示す。

【0055】

【表2】

【0056】

【表3】

【0057】

表２と表３との比較からわかるように、６０歳代以上では、言葉の記憶と時計描画の両方間違う被験者が多い傾向があった。両方間違う被験者は、認知機能の低下が明らかなケースであることが推測される。また、被験者に健常者が多いため、全体での明確な傾向は見られなかったが、認知機能低下の傾向が強いと推測されるＭｉｎｉ－ｃｏｇ試験での２問の不正解者については、数は多くないものの、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値（アミロイドβ量）との相関がみられた。
以上から、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値（アミロイドβ量）と認知機能との相関がある程度わかった。
従って、６０歳代以上を中心に、男女差はあるものの血中コリンエステラーゼ濃度の測定により、また必要に応じて更に血中マグネシウム濃度を測定することにより、従来高価なアミロイドβ量ないしＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ値を測定しなくても、認知機能低下を検知できる可能性があることがわかった。