特開 2022-54108 ＩＩ型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022054108

(43)【公開日】2022-04-06

(54)【発明の名称】ＩＩ型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20220330BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20220330BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220330BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/6888 Z ZNA

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020161110

(22)【出願日】2020-09-25

(71)【出願人】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(71)【出願人】

【識別番号】520373338

【氏名又は名称】株式会社さくらコーポレーション

(71)【出願人】

【識別番号】000226862

【氏名又は名称】日水製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100104307

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 尚司

(72)【発明者】

【氏名】山崎 伸二

(72)【発明者】

【氏名】アワスチ シャルダ プラサダ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】II型細胞膨化致死毒素産生菌を効率良く検出する。
【解決手段】
II型細胞膨化致死毒素産生菌であるエシェリキア・アルバーティによる汚染可能性を判定する方法であって、判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、好ましくは、配列番号４８～５８で示される塩基配列を有するプライマーの何れかと、配列番号５９～６７で示される塩基配列を有するプライマーの何れかからなるプライマーセットを用いる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次のプライマーセットを用いる方法。
それぞれII型細胞膨化致死毒素遺伝子に相補的に結合可能な塩基配列を有し、
配列番号１で示される塩基配列を有する塩基数が２０～２４であるプライマーからなるプライマー群６Ｆと、配列番号３で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｆと、配列番号５で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２２のプライマーからなるプライマー群８Ｆと、配列番号６８で示される塩基配列を有するプライマー（１８４５Ｆ）からなる群から選ばれる１つのフォワード側プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する塩基数が１６～２０であるプライマーからなるプライマー群６Ｒと、配列番号４で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｒと、配列番号６で示される塩基配列を有する塩基数が１６～２１であるプライマーからなるプライマー群８Ｒと、配列番号７０で示される塩基配列を有するプライマー（ＩｃｈｉＲ）から選ばれる１つのリバース側プライマーとの組み合わせからなり、
前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、
プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群６ＦとプライマーＩｃｈｉＲ、プライマー１８４５Ｆとプライマー群７Ｒとなるプライマーセットであるか、又はこれらの当該プライマーセットの各塩基配列に１～３個の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーセット。

【請求項2】

II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次のプライマーセットを用いる方法。
配列番号７～１５で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群６Ｆと、配列番号２７～３６で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群７Ｆと、配列番号４８～５８で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群８Ｆと、配列番号６８で示される塩基配列からなるプライマー（１８４５Ｆ）とからなる群から選ばれる１つのフォワード側プライマーと、
配列番号１７～２２及び２４、２５で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群６Ｒと、配列番号３８～４６で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群７Ｒと、配列番号５９～６７で示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマー群８Ｒと、配列番号７０で示される塩基配列からなるプライマー（ＩｃｈｉＲ）からなる群から選ばれる１つのリバース側プライマーとの組み合わせからなり、
前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、
プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群６ＦとプライマーＩｃｈｉＲ、プライマー１８４５Ｆとプライマー群７Ｒとなるプライマーセットであるか、又はこれらのプライマーセットの各塩基配列に１～３個の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーセット。

【請求項3】

請求項１又は請求項２の何れかに記載の方法において、
前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、
プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒである方法。

【請求項4】

II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次の（１）～（４）のプライマーセットの何れかを用いる方法。
（１）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号１７、配列番号３８、配列番号５９、配列番号７０の何れかで示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（２）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８又は５９で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（３）配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８又は５９で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（４）配列番号６８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット

【請求項5】

前記II型細胞膨化致死毒素産生菌は、エシェリキア・アルバーティである請求項１～４の何れか１項に記載の方法。

【請求項6】

II型細胞膨化致死毒素遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマーセットであって、
それぞれII型細胞膨化致死毒素遺伝子に相補的に結合可能な塩基配列を有し、
配列番号１で示される塩基配列を有する塩基数が２０～２４であるプライマーからなるプライマー群６Ｆと、配列番号３で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｆと、配列番号５で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２２のプライマーからなるプライマー群８Ｆと、配列番号６８で示される塩基配列を有するプライマー（１８４５Ｆ）からなる群から選ばれる１つのフォワード側プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する塩基数が１６～２０であるプライマーからなるプライマー群６Ｒと、配列番号４で示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｒと、配列番号６で示される塩基配列を有する塩基数が１６～２１であるプライマーからなるプライマー群８Ｒと、配列番号７０で示される塩基配列を有するプライマー（ＩｃｈｉＲ）から選ばれる１つのリバース側プライマーとの組み合わせからなり、
前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、
プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群６ＦとプライマーＩｃｈｉＲ、プライマー１８４５Ｆとプライマー群７Ｒとなるプライマーセットであるか、又はこれらの当該プライマーセットの各塩基配列に１～３個の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーセット。

【請求項7】

II型細胞膨化致死毒素遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号７～１５で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群６Ｆと、配列番号２７～３６で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群７Ｆと、配列番号４８～５８で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群８Ｆと、配列番号６８で示される塩基配列を有するプライマー（１８４５Ｆ）とからなる群から選ばれる１つのフォワード側プライマーと、
配列番号１７～２２及び２４、２５で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群６Ｒと、配列番号３８～４６で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群７Ｒと、配列番号５９～６７で示される塩基配列を有するプライマーからなるプライマー群８Ｒと、配列番号７０で示される塩基配列を有するプライマー（ＩｃｈｉＲ）からなる群から選ばれる１つのリバース側プライマーとの組み合わせからなり、
前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、
プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群６ＦとプライマーＩｃｈｉＲ、プライマー１８４５Ｆとプライマー群７Ｒとなるプライマーセットであるか、又はこれらのプライマーセットの各塩基配列に１～３個の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーセット。

【請求項8】

次の（１）～（４）の何れかで示されるプライマーセット。
（１）配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号１７、配列番号３８、配列番号５９、配列番号７０の何れかで示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（２）配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８又は５９で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（３）配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８又は５９で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット
（４）配列番号６８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーと、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプライマー又は当該塩基配列に１～３の塩基が挿入、欠損又は置換されたプライマーからなるプライマーセット

【請求項9】

II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定するための測定キットであって、
請求項６～８の何れか１項に記載のプライマーセットを含む測定キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はII型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、食中毒の原因菌の一つとしてエシェリキア・アルバーティ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ）が注視されている。この細菌（以下「アルバーティ菌」と言う場合がある。）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７などと同様に腸管性出血を引き起こす可能性が高く、大腸菌と生化学的性状が酷似しているだけでなく、共通の病原因子として腸粘膜への接着に関するインチミンをコードしたｅａｅ遺伝子や、細胞膨化致死毒素（Ｃｙｔｏｌｅｔｈａｌ Ｄｉｓｔｅｎｄｉｎｇ Ｔｏｘｉｎ：ＣＤＴ）関わる遺伝子（ｃｄｔ遺伝子）も保有することからも、両者を厳密に区別することが必要とされる。

【0003】

両者を区別する方法として、特許文献１にはアルバーティ菌が分解しない糖とｐＨ指示薬を含む培地が開示されている。この培地を用いて培養することで、エシェリキア属の細菌群からエシェリキア・アルバーティを検出することができる。ところが、この培地においては、赤痢菌やプロビデンシア菌も同じようなコロニーを形成するために、エシェリキア・アルバーティであることを特異的に検出する必要が求められる。

【0004】

ＣＤＴを産生する細菌は大腸菌やアルバーティ菌の他にも多数存在することが知られているが、大腸菌が産生するとされる５つのタイプのｃｄｔ（ｃｄｔＩ～Ｖ）遺伝子のうち、ｃｄｔ－Ｉ遺伝子、ｃｄｔ－III遺伝子、ｃｄｔ－IV遺伝子、ｃｄｔ－Ｖ遺伝子は、アルバーティ菌が保有するｃｄｔ遺伝子と相同性が低く、大腸菌の特定の株が保有するｃｄｔ－II遺伝子と相同性が高いことが明らかにされている（非特許文献１）。非特許文献１には、この知見を元にｃｄｔ－III遺伝子、ｃｄｔ－Ｖ遺伝子に加え、プロビデンシア・アルカリファシエンス（P.alcalifaciens）のｃｄｔ遺伝子を対象にして、アルバーティ菌が保有するｃｄｔ－II遺伝子を検出できるＰＣＲ法（Ｅａｃｄｔ ＰＣＲ法）並びにネスティッドＰＣＲ法（Ｎｅｓｔｅｄ Ｅａｃｄｔ ＰＣＲ法）が開発されたことが明らかにされている。また、非特許文献２には当該Ｅａｃｄｔ ＰＣＲ法に用いられた配列番号６９に示された塩基配列からなるプライマーと配列番号７０に示された塩基配列からなるプライマーが開示されている。

【0005】

しかしながら、前者のＥａｃｄｔ ＰＣＲ法では検出下限が十分ではないだけでなく、後者のネスティッドＰＣＲ法では２段階の増幅が必要であるために、１段階の増幅でｃｄｔ－II遺伝子を他の４つのタイプのｃｄｔ遺伝子と区別して検出できる新たなプライマーが求められる。さらにｃｄｔ－II遺伝子にも一塩基多型などの変異があることが想定されるため、できる限り多くのｃｄｔ－II遺伝子を検出できる方法が望まれる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１９－０２４４１８

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】安田 憲朋、II型細胞膨化致死毒素遺伝子保有大腸菌の菌種再同定から見出したEscherichia albertiiの検出法の開発と応用、インターネット、＜URL：https://www.osakafu-u.ac.jp/osakafu-content/uploads/sites/428/k1798.pdf＞

【非特許文献2】Atsushi Hinenoya et al.、 Diagnostic Microbiology and Infection Disease 95(2019) 119-124

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本願発明は、上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、ネスティッドＰＣＲではなく１段階の増幅で検出が可能なＰＣＲでII型細胞膨化致死毒素産生菌を特異的に検出できるＰＣＲ用のプライマーを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本願発明は、II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、特定のプライマーセットを用いる方法である。

【発明の効果】

【0010】

本願発明によると、種々のＣＤＴ産生菌からII型細胞膨化致死毒素（II型ＣＤＴ）遺伝子（ｃｄｔ－II遺伝子）を特異的に検出し、当該ＣＤＴ産生菌による汚染可能性を迅速に判定できる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１はｃｄｔ－II遺伝子に対してプライマーが結合する箇所及び増幅領域を示した説明図である。

【図2】図２はｃｄｔ－II遺伝子の塩基配列の一部及びプライマーが結合する箇所を示した説明図である。

【図3】図３は種々のプライマーセットを用いた増幅産物の電気泳動画像である。レーン１はアルバーティ菌を、レーン２はプロビデンシア・ルスティガニを、レーン３は大腸菌を、レーン４は対照である蒸留水を、レーンＭ１、レーンＭ２はそれぞれマーカーを示す。

【図4】図４は種々のプライマーセットを用いて得られた融解曲線の代表例を示す画像である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本願発明に係る方法は、II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、特定のプライマーセットを用いる方法である。

【0013】

II型細胞膨化致死毒素遺伝子（ｃｄｔ－II遺伝子）は公知である。非特許文献１によれば、ｃｄｔ－II遺伝子は大腸菌の一種であるＣＴＥＣ－II（II型細胞膨化致死毒素産生大腸菌）が保有しているとされているが、ＣＴＥＣ－IIはアルバーティ菌である可能性が高く、ｃｄｔ－IIが検出された場合にはアルバーティ菌による汚染があったと推定し得る。

【0014】

本願発明において、II型ＣＤＴ産生菌による汚染とは、生死を問わず試料中にｃｄｔ－II遺伝子を保有する細菌が存在することだけでなく、ｃｄｔ－II遺伝子を保有する細菌の混入や対象遺伝子を含む異物の混入などによって試料中に対象遺伝子が存在することを意味し、汚染可能性があるとは何らかの理由から当該細菌によって汚染されたことが推定されることを意味する。従って、本願発明の方法により汚染されていると判定された場合であっても、必ずしも生菌の存在があったと断定することはできず、他の方法による細菌による汚染の確定が必要とされる。

【0015】

本願発明に係る方法は、判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有する。この工程はいわゆるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）と言われる方法である。この工程において本願発明では以下のプライマーセットが用いられる。

【0016】

用いられるプライマーセットは、望ましくはそれぞれｃｄｔ－II遺伝子に対して相補的に結合可能な塩基配列を有する。相補的に結合可能であるとはＰＣＲを行う当業者が通常用いる意味で用いられ、各プライマーがｃｄｔ－II遺伝子に相対する塩基同士が結合し得ることを意味するが、本願発明におけるプライマーは完全に相補的に結合せずとも、１～３個の塩基が挿入、脱落、置換されたとしてもｃｄｔ－II遺伝子の一部領域を増幅できるものであればよい。ｃｄｔ－II遺伝子はII型ＣＤＴを産生する遺伝子であり、ｃｄｔ－II遺伝子には一塩基が異なる種々の多型が存在する。本願発明におけるプライマーセットは図２に示されたコンセンサス配列（配列番号７１）を有するｃｄｔ－II遺伝子に対して相補的に結合するが、当該コンセンサス配列と異なる塩基配列を有するｃｄｔ－II遺伝子の一部領域も増幅し得る。なお、配列番号７１に示された塩基配列はｃｄｔ－II遺伝子のコンセンサス配列（センス鎖）のうち、５´末端から数えて１３００番目の塩基から１９４０番目までの６４１塩基を示している。

【0017】

本願発明に係るプライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列を有する塩基数が２０～２４であるプライマーからなるプライマー群６Ｆと、配列番号３に示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｆと、配列番号５に示される塩基配列を有する塩基数が１７～２２のプライマーからなるプライマー群８Ｆと、配列番号６８に示される塩基配列（TAATGATTCGAACGCCAAAC）を有するプライマー（１８４５Ｆ）とからなる群から選ばれる１つのフォワード側プライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有する塩基数が１６～２０であるプライマーからなるプライマー群６Ｒと、配列番号４に示される塩基配列を有する塩基数が１７～２１であるプライマーからなるプライマー群７Ｒと、配列番号６に示される塩基配列を有する塩基数が１６～２１であるプライマーからなるプライマー群８Ｒと、配列番号７０に示される塩基配列（CTATTTCCCATCCAATAGTCT）を有するプライマー（ＩｃｈｉＲ）から選ばれる１つのリバース側プライマーとの組み合わせからなり、前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーの組み合わせが、プライマー群６Ｆとプライマー群６Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群６Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群７Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒ、プライマー群６ＦとプライマーＩｃｈｉＲ、プライマー１８４５Ｆとプライマー群７Ｒとなるプライマーセットである。

【0018】

より具体的に言うと、前記フォワード側プライマーは、例えば、前記プライマー群６Ｆでは配列番号７～１５で示される塩基配列を有するプライマーから選択され、前記プライマー群７Ｆでは配列番号２７～３６で示される塩基配列を有するプライマーから選択され、前記プライマー群８Ｆでは配列番号４８～５８で示される塩基配列を有するプライマーから選択され得る。また、前記リバース側プライマーは、例えば、前記プライマー群６Ｒでは配列番号１７～２２及び２４、２５で示される塩基配列を有するプライマーから選択され、前記プライマー群７Ｒでは配列番号３８～４６で示される塩基配列を有するプライマーから選択され、プライマー群８Ｒでは配列番号５９～６７で示される塩基配列を有するプライマーから選択され得る。

【0019】

本願発明においてフォワード側プライマー、リバース側プライマーはいわゆる当業者が通常用いる意味で用いられ、フォワード側プライマーはｃｄｔ－II遺伝子のアンチセンス鎖に結合するように設計されたプライマーを意味し、リバース側プライマーはｃｄｔ－II遺伝子のセンス鎖に結合するように設計されたプライマーを意味する。

【0020】

図１、図２には各プライマーがｃｄｔ－II遺伝子へ結合する位置を示した。図１に示された数字は、ｃｄｔ－II遺伝子の５´末端からの塩基位置を示している。また、図１、図２に示された６Ｆ、７Ｆ、８Ｆ、６Ｒ、７Ｒ、８Ｒはそれぞれ前記プライマー群６Ｆ、プライマー群７Ｆ、プライマー群８Ｆ、プライマー群６Ｒ、プライマー群７Ｒ、プライマー群８Ｒの各群においてそれぞれ代表的なプライマーである配列番号７に記載された塩基配列（TCAGATAGATGAATTAGGAAAAG）からなるプライマー（６Ｆ）、配列番号２７に記載された塩基配列（TGTGAAAACACCTGAAGAAG）からなるプライマー（７Ｆ）、配列番号４８に記載された塩基配列（GAGAGACTATTGGATGGGAAA）からなるプライマー（８Ｆ）、配列番号１７に記載された塩基配列（TTCTTCAGGTGTTTTCACA）からなるプライマー（６Ｒ）、配列番号３８に記載された塩基配列（CGTCATTTTTAGCAGGTTCC）からなるプライマー（７Ｒ）、配列番号５９に記載された塩基配列（TGGTCTGTGTTTGGCGTTCG）からなるプライマー（８Ｒ）の結合位置を示す。

【0021】

本願発明では、フォワード側プライマーとリバース側プライマーの組み合わせは、前記の組み合わせであればいずれの組み合わせでもよいが、好ましくはプライマー群７Ｆとプライマー群７Ｒの組み合わせであるか、プライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒの組み合わせであり、望ましくはプライマー群８Ｆとプライマー群８Ｒの組み合わせである。

【0022】

対象となる試料は、ｃｄｔ－II遺伝子を保有する細菌（生菌、死菌を問わず）が存在し得る試料に限られず、ｃｄｔ－II遺伝子が存在し得る試料であればよく、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど各種動物の吐瀉物、糞、食品等であり得る。増幅には、これらの試料を直接サンプルとして用いてもよいが、好ましくはこれらの試料から抽出された増幅用のテンプレートＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）が用いられる。テンプレートＤＮＡの抽出、作製も特段限定されることなく、常法によって得られる。

【0023】

用いられるプライマーの濃度やテンプレートの使用量も限定されず、適宜調整され得る。本願発明においても、その増幅には前記プライマー（プライマーセット）の他に、ＰＣＲにおいて通常用いられる緩衝剤やＤＮＡポリメラーゼなどが用いられる。これらの緩衝剤やＤＮＡポリメラーゼも限定されず、また使用濃度も適宜当業者によって決定され得る。

【0024】

緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス－トリシン（ＢＩＳ－ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）が挙げられる。また、ＰＣＲの反応液中には、１.０～５ｍＭ程度のＭｇ^２＋を含ませて反応させるのが好ましく、さらもＫＣｌも含ませて反応させることもできる。

【0025】

ＤＮＡポリメラーゼとして、公知である好ましくは耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用でき、例えば、上市されているもの（以下はそれぞれ商品名である）として、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、抽出物に限らず組換え体によるものであってもよく、天然のポリメラーゼのアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよい。ＤＮＡポリメラーゼは１種又は２種以上が用いられる。

【0026】

増幅工程における増幅条件（増幅温度や増幅サイクル、保持時間など）はＰＣＲを行う当業者の常識に基づいて設定され得る。その一例として実施例に記載の条件が示される。

【0027】

汚染可能性は増幅工程により増幅された増幅産物の有無やその量で判定される。増幅産物の有無やその量を判定する方法として、増幅工程後の反応液中の増幅産物を電気泳動して判定する電気泳動法、蛍光物質を利用したサイクリングプローブ法やプローブ法（５´ヌクレアーゼ法）、インターカレーター法が示される。これらの判定方法はいずれも公知である。汚染可能性の判定にはいずれの判定方法を用いることもできるが、リアルタイムＰＣＲに比較的簡便な方法として利用できるインターカレーター法が好ましい。

【0028】

インターカレーター法に用いられるインターカレーターは、２本鎖ＤＮＡ間に挿入されることで蛍光を発し、２本鎖ＤＮＡが解離することで消光する蛍光物質であれば、特に限定されることなく用いられる。例えば、上市されているもの（以下はそれぞれ商品名である）として、例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＥＲ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＬＣＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ、ＳＹＴＯ ９、ＳＹＴＯ １０、ＳＹＴＯ １３、ＳＹＴＯ １４、ＳＹＴＯ ８２、ＦＵＮ－１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。もちろん、増幅産物の有無などを判定できる方法であれば例示の方法でなくとも差し支えない。また、インターカレーター法では融解曲線解析が行われるが、融解曲線解析時の条件も融解曲線解析を行う当業者の常識に基づいて設定され得る。ＰＣＲにおける増幅や融解曲線解析には市販のリアルタイムＰＣＲ装置が用いられ、融解曲線解析には用いられたリアルタイムＰＣＲ装置の操作マニュアルに従った条件が設定され得る。

【0029】

本願発明における測定用キットは、ｃｄｔ－II遺伝子による汚染可能性を判定するための測定用キットであって、少なくとも一組の前記プライマーセットを含む。この測定用キットは、対象試料中に存在するｃｄｔ－II遺伝子を増幅し、ｃｄｔ－II遺伝子を保有する菌による汚染可能性を調べるために使用されるキットであって、前記プライマーセットの他に、緩衝剤やＤＮＡポリメラーゼ、増幅産物を検出するためのサイクリングプローブやインターカレーターなどを含み得る。

【0030】

次に本願発明について以下の実施例に基づいてさらに説明するが、本願発明は下記の実施例に限定されることのないのは言うまでもない。

【実施例0031】

由来が公知であるアルバーティ菌であると同定された表１に示す３８菌株についてｃｄｔ－II遺伝子の塩基配列を解析することで、ｃｄｔ－II遺伝子の塩基配列（コンセンサス配列：Majority配列）を求めた。なお、コンセンサス配列を決定した３８菌株のアルバーティ菌には、基準株（ＡＴＣＣ）であるE. albertii（Albert19982）が含まれるが、他の３７菌株は、その全てが当該基準株の塩基配列と同じ塩基配列を有するものではなく、図１に示す塩基配列（比較的保存性が高いと認められた１３００～１９４０番目の塩基）の領域を含めてｃｄｔ－II遺伝子の随所に一塩基多型が認められた。このｃｄｔ－II遺伝子のコンセンサス配列並びにｃｄｔ－Ｉ遺伝子（NT3363-cdtI）、ｃｄｔ－III遺伝子（PII4-cdtIII）、ｃｄｔ－IV遺伝子（P159-cdtIV）、ｃｄｔ－V遺伝子（P336-cdtV）の各塩基配列、アルバーティ菌のｃｄｔ－II遺伝子と比較的相同性が高いとされているプロビデンシア・ルスティガニ（Providencia rustigianii：ＪＨＩ株）のｃｄｔ遺伝子（JHI-Prcdt）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（P. alcalifaciens：ＡＨ３１株）のｃｄｔ遺伝子（AH31-Pacdt）の塩基配列から、表２に示すＳｅｔ１～Ｓｅｔ８までのプライマーセットを作成してリアルタイムＰＣＴを行った。表２のサンプル名（Sample Name）中の各セットにはフォワード側（上段）の開始位置とプライマーの塩基数及びリバース側（下段）の開始位置とプライマーの塩基数を示し、例えばＳｅｔ６のフォワード側プライマーは１６７２番目の塩基から始まる２３個の塩基で構成される配列番号７に示す塩基配列を有するプライマー（６Ｆ）、リバース側プライマーは１８１６番目の塩基から始まる１９個の塩基で構成される配列番号１７に示す塩基配列を有するプライマー（６Ｒ）を示し、Ｓｅｔ７のフォワード側プライマーは１７９８番目の塩基から始まる２０個の塩基で構成される配列番号２７に示す塩基配列を有するプライマー（７Ｆ）、リバース側プライマーは１９１５番目から始まる２０個の塩基で構成される配列番号３８に示す塩基配列を有するプライマー（７Ｒ）を、Ｓｅｔ８のフォワード側プライマーは１７７０番目から始まる２１個の塩基で構成される配列番号４８に示す塩基配列を有するプライマー（８Ｆ）、リバース側プライマーは１８７２番目から始まる２０個の塩基で構成される配列番号５９に示す塩基配列を有するプライマー（８Ｒ）を示す。その結果、Ｓｅｔ１～Ｓｅｔ５のプライマーセットでは融解曲線解析におけるＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離すると判断される温度：℃）において十分な分離が見られなかったり、増幅産物の電気泳動画像（図示せず）から他の菌種と区別してアルバーティ菌を検出できないと判断された。

【0032】

【表1】

【0033】

【表2】

【0034】

次に上記のＳｅｔ６～Ｓｅｔ８のプライマーセットを用いて、特異性の検討、つまり他の菌種と区別して検出できるか否かの検討を行った。対象とした菌種は表３に示すとおり、E. albertiiの３９菌株とE. albertii以外の２６菌種２８菌株の全６７菌株である。

【0035】

鋳型ＤＮＡは細菌から常法に従って調製し、鋳型ＤＮＡ溶液１μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Go Taq qPCR Master Mix：プロメガ社製商品名）１０μＬ、フォワード側プライマー溶液（１０μＭ）及びリバース側プライマー溶液（１０μＭ）各７μＬに水を加えて全量２０μＬとした反応液を調製した。

【0036】

当該溶液について表４に示す条件により増幅を行い、その後融解曲線解析を行った（以下、同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行った。）。その結果、いずれのプライマーセットを用いた場合でも全てのアルバーティ菌によるＴｍ値を観測し、ｃｄｔ－II遺伝子を増幅できた。一方、他の２８菌株においてはＴｍ値が観測されず、アルバーティ菌の保有するｃｄｔ－II遺伝子のみを検出できることが確認された。

【表3】

【0037】

【表4】

【0038】

次に、Ｓｅｔ８のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ（Real-Time PCR）と非特許文献１におけるＥａｃｄｔ法（ＩｃｈｉＦとＩｃｈｉＲのプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ）との比較を行った。対象としてアルバーティ菌による感染が多く見られるアライグマを用いた。アライグマの直腸をスワブして検体を採取した後、検体をＰＢＳに懸濁させた後ＴＳＢで１０倍に希釈した。遠心分離後、沈殿物を水酸化ナトリウム液で分解、酸で中和することで鋳型ＤＮＡを調製した。その結果を表５に示す。その結果、陽性の検出率がＥａｃｄｔ法で６７％であったのが、７７％に向上した。なお、非特許文献１におけるＩｃｈｉＦとＩｃｈｉＲのプライマーセットは、CTEC-II（ｃｄｔ－ＩＩ遺伝子保有大腸菌）に分類されていた大腸菌が保有するｃｄｔ－ＩＩ遺伝子における保存性が高い領域から設計された。

【0039】

【表5】

【実施例0040】

セット６～８のプライマーセットを元にして表６～８に示す改変プライマーを作製し、E. albertii AKT5の検出を試みた。表６はセット６のプライマー（1672F：図１中の６Ｆと1816R：図１中の６Ｒ）を元にした改変プライマーを、表７はセット７のプライマー（1798F：図１の７Ｆと1915R：図１の７Ｒ）を、表８はセット８のプライマー（1770F：図１の８Ｆと1872R：図１の８Ｒ）を元にした改変プライマーをそれぞれ使用した場合を示す。各表の上段はフォワード側プライマーを、各表の下段はリバース側プライマーを示し、各表において改変後のフォワード側プライマーに対して改変前のリバース側プライマーを組み合わせたプライマーセットとしてリアルタイムＰＣＲを行い、改変後のリバース側プライマーに対して改変前のフォワードプライマーを組み合わせたプライマーセットとしてそれぞれリアルタイムＰＣＲを行った。表にあるかっこ内の数字はＴｍ値を示す。

【0041】

【表6】

【0042】

【表7】

【0043】

【表8】