特開 2022-61613 ＨＳＡ結合性タンパク

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022061613

(43)【公開日】2022-04-19

(54)【発明の名称】ＨＳＡ結合性タンパク

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20220412BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20220412BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20220412BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220412BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220412BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20220412BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20220412BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20220412BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C07K14/00

C12P21/02 C

A61K38/08

A61K45/00

A61P43/00 111

A61K47/64

C40B40/10

C12Q1/02

C12N15/10 210Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】31

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020169651

(22)【出願日】2020-10-07

(71)【出願人】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(71)【出願人】

【識別番号】501280921

【氏名又は名称】インタープロテイン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100104307

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 尚司

(72)【発明者】

【氏名】藤井 郁雄

(72)【発明者】

【氏名】道上 雅孝

(72)【発明者】

【氏名】叶 正茂

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ07

4B063QQ10

4B063QQ13

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QS12

4B063QS32

4B063QS38

4B064AG01

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC15

4B064CC24

4B064DA13

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA23

4C084BA26

4C084BA31

4C084CA59

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZC411

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA05

4H045BA19

4H045BA72

4H045CA10

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA45

(57)【要約】

【課題】 薬物の滞留性を上げるとされるＨＳＡ結合性タンパクを提供する。
【解決手段】 配列番号１で示されるタンパク鎖ＡのＣ末端と配列番号２で示されるタンパク鎖ＣのＮ末端の間に、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する９～１１個のアミノ酸からなるタンパク鎖Ｂがペプチド結合したタンパク。但し、配列番号１，２，３におけるアミノ酸Ｘの全ては天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であり、配列番号３におけるＮ末端のアミノ酸ＸはＧであるか欠損し、Ｎ末端から６番目のアミノ酸ＸはＶ，Ａ，Ｒの何れかであり、Ｎ末端から７番目のアミノ酸ＸはＥ，Ｖ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸ＸはＲ又はＶであるか、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸ＸはＧであるか欠損する。
【選択図】 図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＳＡに対して結合性を示すリガンドであって、配列番号３で示すアミノ酸配列（XVNFGXXLFXX）を有するリガンド。
但し、配列番号３におけるアミノ酸Ｘは、天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸ＸはＧであるか欠損し、Ｎ末端から６番目のアミノ酸ＸはＶ，Ａ，Ｒの何れかであり、Ｎ末端から７番目のアミノ酸ＸはＥ，Ｖ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸ＸはＲ又はＶであるか、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸ＸはＧであるか欠損する。

【請求項2】

ＨＳＡに対して結合性を示すリガンドであって、配列番号４（GVNFGVELFRG）、配列番号５(GVNFGVVLFRG)、配列番号６（GVNFGAELFRG）、配列番号７（GVNFGAVLFRG）、配列番号８（GVNFGRSLFVG）の何れかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有するリガンド。
但し、配列番号４～８で示されるアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸Ｇ及び／又はＮ末端から１１番目のアミノ酸Ｘは欠損していてもよい。

【請求項3】

ヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するＨＳＡ結合性タンパク。

【請求項4】

４１～４３個のアミノ酸からなるＨＳＡ結合性タンパクであって、
請求項１又は２に記載のリガンドを含むＨＳＡ結合性タンパク。

【請求項5】

配列番号１で示されるタンパク鎖ＡのＣ末端と配列番号２で示されるタンパク鎖ＣのＮ末端の間に、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク鎖Ｂがペプチド結合したタンパク。
配列番号１：CXXELXXLEXELXXLE 但し、アミノ酸Ｘの全ては天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸
配列番号２：KLXXLKXKLXXLKXXC 但し、アミノ酸Ｘの全ては天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸
配列番号３：XVNFGXXLFXX 但し、Ｎ末端のアミノ酸ＸはＧであるか欠損し、Ｎ末端から６番目のアミノ酸ＸはＶ，Ａ，Ｒの何れかであり、Ｎ末端から７番目のアミノ酸ＸはＥ，Ｖ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸ＸはＲ又はＶであるか、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸ＸはＧであるか欠損する。

【請求項6】

前記タンパクのＮ末端から４番目のアミノ酸ＥがＤに、Ｎ末端から５番目のアミノ酸ＬがＰ又はＱに、Ｎ末端から９番目のアミノ酸ＥがＫに、Ｎ末端から１２番目のアミノ酸ＬがＱ又はＲの、何れか１又は２以上の置換がなされた請求項５に記載のタンパク。

【請求項7】

前記タンパクのＮ末端から２８番目のアミノ酸ＫがＥに、Ｎ末端から２９番目のアミノ酸ＬがＲに、Ｎ末端から３３番目のアミノ酸ＫがＲに、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸ＫがＮ又はＲに、Ｎ末端から４３番目のアミノ酸ＣがＳの、何れか１又は２以上のアミノ酸の置換を有する請求項５に記載のタンパク。

【請求項8】

さらに、前記タンパクのＮ末端から４番目のアミノ酸ＥがＤに、Ｎ末端から５番目のアミノ酸ＬがＰ又はＱに、Ｎ末端から９番目のアミノ酸ＥがＫに、Ｎ末端から１２番目のアミノ酸ＬがＱ又はＲの、何れか１又は２以上の置換がなされた請求項７に記載のタンパク。

【請求項9】

前記タンパク鎖ＢのＮ末端のアミノ酸Ｘ及びＣ末端のアミノ酸Ｘの何れか一方若しくは双方のアミノ酸ＸがＧであるか欠落した請求項５～８の何れか１項に記載のタンパク。

【請求項10】

前記タンパク鎖Ｂのアミノ酸配列が、配列番号４（GVNFGVELFRG）、配列番号５(GVNFGVVLFRG)、配列番号６（GVNFGAELFRG）、配列番号７（GVNFGAVLFRG）、配列番号８（GVNFGRSLFVG）の何れかである請求項５～８の何れかに記載のタンパク。

【請求項11】

前記タンパク鎖Ｂのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端のＧが欠損した請求項１０に記載のタンパク。

【請求項12】

配列番号１で示されるアミノ酸配列中、すべてのアミノ酸ＸがＡであり、
配列番号２で示されるアミノ酸配列中、すべてのアミノ酸ＸがＡである請求項５～１１の何れかであるタンパク。

【請求項13】

配列番号１で示されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から３番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｔ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から６番目のアミノ酸ＸがＡ又はＳであり、Ｎ末端から１３番目のアミノ酸ＸがＡ又はＳであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から３番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｄ，Ｎの何れかであり、Ｎ末端から４番目のアミノ酸ＸがＡ又はＦであり、７番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｑ，Ｇ，Ｓの何れかであり、１０番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｅ，Ｐ，Ｈの何れかであり、１１番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｖ，Ｆの何れかであり、１４番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｄ，Ｎの何れかである請求項５～１１の何れかであるタンパク。

【請求項14】

置換され得るアミノ酸Ｘ以外のアミノ酸ＸがすべてＡである請求項１３に記載のタンパク。

【請求項15】

配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパクであって、
当該アミノ酸配列中、アミノ酸Ｘの全ては天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であるタンパク。

【請求項16】

配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパクであって、
配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
Ｎ末端から２８番目のアミノ酸ＫがＥに置換され、
当該アミノ酸配列中、アミノ酸Ｘの全ては天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であるタンパク。

【請求項17】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
Ｎ末端から３番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｔ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から１３番目のアミノ酸ＸがＡ又はＳである請求項１６に記載のタンパク。

【請求項18】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
Ｎ末端から９番目のアミノ酸ＥがＫに置換されるか、Ｎ末端から２９番目のアミノ酸ＬがＲに置換されるか、Ｎ末端から３３番目のアミノ酸ＫがＲに置換されるか、Ｎ末端から４０番目のアミノ酸ＫがＮに置換されるか、Ｎ末端から４３番目のアミノ酸ＣがＳに置換された請求項１５～１７の何れか１項に記載のタンパク。

【請求項19】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中のアミノ酸ＸがＡ以外のアミノ酸である場合を除いて、全てのアミノ酸ＸがＡである請求項１５～１８の何れか１項に記載のタンパク。

【請求項20】

配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパクであって、
Ｎ末端から５番目のアミノ酸ＬがＰに置換されるか、Ｎ末端から４番目のＥがＤに置換されるか、Ｎ末端から１２番目のアミノ酸ＬがＱ又はＲに置換され、
アミノ酸Ｘは天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であるタンパク。

【請求項21】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
Ｎ末端から４０番目のＫがＲに置換された請求項２０に記載のタンパク。

【請求項22】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
アミノ酸Ｘが全てＡである請求項２０又は２１に記載のタンパク。

【請求項23】

配列番号１０に示すアミノ酸配列中、
Ｎ末端から３０番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｄ，Ｎの何れかであり、Ｎ末端から３１番目のアミノ酸ＸがＡ又はＦであり、３４番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｑ，Ｇ，Ｓの何れかであり、３７番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｅ，Ｐ，Ｈの何れかであり、３８番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｖ，Ｆの何れかであり、４１番目のアミノ酸ＸがＡ，Ｄ，Ｎの何れかである請求項２０～２２の何れか１項に記載のタンパク。

【請求項24】

請求項２２又は２３に記載のタンパクにおいて、
その他のアミノ酸ＸがＡであるタンパク。

【請求項25】

配列番号１１～３５の何れかで示されるアミノ酸配列からなるタンパク。

【請求項26】

Ｎ末端から１７番目のアミノ酸Ｇ及び／又は２７番目のアミノ酸Ｇが欠損した請求項１５～２４の何れか１項に記載のタンパク。

【請求項27】

請求項３又は４に記載のタンパクのＮ末端及びＣ末端がそれぞれシステインであるタンパク又は請求項５～２６の何れかに１項に記載のタンパクのＮ末端のシステインとＣ末端のシステインの間で環を形成したタンパク。

【請求項28】

請求項３～２７の何れか１項に記載のタンパクと薬物が結合した薬物複合体。

【請求項29】

配列番号３６で示されるタンパク鎖ＡのＣ末端と配列番号３７で示されるタンパク鎖ＣのＮ末端の間に、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク鎖Ｂ（但し、タンパク鎖ＢのＮ末端及び／Ｃ末端のＧが欠損してもよい）がペプチド結合したタンパク又は請求項３～２７の何れか１項に記載のタンパクを構成するアミノ酸の少なくとも１つをその他の天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸に置換する工程と、
置換されたアミノ酸配列を有するタンパクとＨＳＡと接触させる工程と、
ＨＳＡと結合したタンパクのアミノ酸配列を決定する工程と、
決定したアミノ酸配列からタンパクを合成する工程を有する製造方法。

【請求項30】

前記置換されたアミノ酸配列を有するタンパクとＨＳＡと接触させる工程は、前記置換した後のアミノ酸配列に相当する塩基配列を有する遺伝子を導入した細胞又はファージの表層に発現されたタンパクと接触させる工程である請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

置換されるアミノ酸は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列及び／又は配列番号３７で示されるアミノ酸配列中のアラニンである請求項２９又は３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はヒト血清アルブミン結合性タンパクに関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)は血清中に含まれるタンパクの約６割を占めると言われており、脂肪酸やビリルビン，金属イオンなどと結合して血中を循環する運搬機能を有している。一般のタンパクは、細胞内に取り込まれた後リソソームにより分解されるが、ＨＳＡは細胞表面のレセプターＦｃＲｎと結合して細胞内に取り込まれるため、リソソームによる分解を免れ、再度細胞外へと放出される（ＨＳＡのリサイクリング機能）。そこで、ＨＳＡに結合性を有するタンパクに各種の薬剤を結合させることにすれば、ＨＳＡと共に細胞内に取り込まれた後に再度細胞外に放出され、薬剤の血中半減期が延長されることが期待される。例えばインスリンは血中グルコース濃度をコントロールする。糖尿病患者はそのコントロールのためにインスリン（インスリン製剤）を投与しなければならないが、ＨＳＡのリサイクリング機能が利用できればインスリンの血中半減期が延長され、投与回数の減少による患者の負担軽減や投与量（使用量）の削減に繋がる。このような観点からＨＳＡ結合性タンパクとして、例えば特許文献１や特許文献２に、特定のアミノ酸配列を含むＨＳＡ結合性のリガンドが提案されている。

【0003】

ところで、本願発明者らは、比較的低分子でかつ血中で安定な立体構造が保たれるヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するタンパク（以下「ＨＬＨタンパク」と称する。）を提案している（例えば特許文献１参照）。このＨＬＨタンパクは、α－ヘリックスを有するＡ鎖，Ｃ鎖とこれらのＡ鎖，Ｃ鎖を結ぶループ鎖とも呼ばれるＢ鎖を有している。Ａ鎖、Ｃ鎖はそれぞれ１４のアミノ酸から構成され、Ａ鎖とＣ鎖が外側を向く位置にある各７つのアラニン残基は任意のアミノ酸に置換しても安定な構造を保つ。これまでに種々の機能を果たすＨＬＨタンパクが提案されている（例えば特許文献１～３）が、これまでのところＨＳＡ結合性のＨＬＨタンパクは見いだされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２００３－５１８０７５号公報

【特許文献2】特表２００４－５３５３７３号公報

【特許文献3】特開２０１４－１１８９号公報

【特許文献4】特開２０１１－２３１０８５号公報

【特許文献5】特開２００８－２１４２５４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願発明者らは、ＨＳＡのリサイクリング機能に着目し、血中で安定な構造を有するＨＬＨタンパクとＨＳＡを結合させることができれば、各種薬剤の血中半減期を延長させることが可能であると考えた。本願発明は、種々のＨＳＡ結合性のリガンドを有するタンパク、好ましくはＨＬＨタンパク構造をとり得るタンパクを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本願発明に係るＨＳＡ結合性タンパクは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するリガンドを有し、代表的には配列番号１１に示されたアミノ酸配列を有する。

【発明の効果】

【0007】

本願発明によれば、血中半減期に寄与し得るＨＳＡ結合性タンパクが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１はファージ表層提示タンパクライブラリーに用いられたファージミドベクターのベクターマップを示す図である。

【図2】図２はエラープローンＰＣＲで用いられた酵母形質転換用ベクターのベクターマップを示す図である。

【図3】図３は相同組換え法による酵母の形質転換の手順を示す概略図である。

【図4】図４の（Ａ）～（Ｅ）はそれぞれ本願発明の実施例であるＨＳＡ結合性タンパクを提示する酵母のＨＳＡに対する親和性を示す図である。

【図5】図５はＨＳＡ結合性タンパクとインスリン複合体の合成方法を示す概略図であって、（Ａ）はインスリンのアルキン誘導体の合成工程を、（Ｂ）はＨＳＡ結合性タンパクのアジド誘導体の合成工程を、（Ｃ）は複合体の合成工程を示す図である。

【図6】図６は同上のＨＳＡ結合性タンパクとインスリン複合体がインスリン滞留性に及ぼす影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本願発明に係るＨＳＡ結合性を有するリガンドは、配列番号３に示すアミノ酸配列（但し、配列番号３を構成するアミノ酸Ｘは、天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸であり、Ｎ末端のアミノ酸ＸはＧであるか欠損し、Ｎ末端から６番目のアミノ酸ＸはＶ，Ａ，Ｒの何れかであり、Ｎ末端から７番目のアミノ酸ＸはＥ，Ｖ，Ｓの何れかであり、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸ＸはＲ又はＶであるか、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸ＸはＧであるか欠損する。）、例えば配列番号４～８に示すアミノ酸配列を有する。このリガンドを有するＨＳＡ結合性のタンパクは例えばα－ヘリックス構造を有するＡ鎖，Ｃ鎖とこれらのＡ鎖，Ｃ鎖を結ぶループ鎖とも呼ばれるＢ鎖を備えたヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するタンパクであり得る。ヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するタンパクは、好ましくは４１～４３個のアミノ酸からなるタンパクであって、例えば配列番号９に示すアミノ酸配列からなる。このヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するタンパクは、例えば、Ａ鎖に配列番号１に示すアミノ酸配列を、Ｃ鎖に配列番号２に示すアミノ酸配列を、Ｂ鎖に配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。なお、本願発明において、ＨＳＡ結合性タンパクを構成するアミノ酸は好ましくは天然に存在するタンパク中に通常見いだされるアミノ酸を意味する。

【0010】

本願発明に係るＨＳＡ結合性タンパクは、ループ部において配列番号３に示すアミノ酸配列を有することに特徴があり、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるリガンドは、実施例に示すように比較的強くＨＳＡに結合するタンパク集団において収束されたＨＳＡ結合性タンパクに共通して見いだされる配列である。ループ部は配列番号３に示すアミノ酸配列において、その両端の一方又は双方のＧが欠落していても差し支えなく、両端にあるＧはその他のアミノ酸でも差し支えない。ループ部であるＣ鎖の両端若しくは何れか一方端が欠損した場合でも２つのα－ヘリックス構造を有するＡ鎖，Ｃ鎖間の距離（互いに内側を向いた面間の距離）が大きく変わらず、安定にＨＳＡに結合すると言えるからである。

【0011】

一般にＨＬＨタンパクは、２本のα－ヘリックスの内側に存在するロイシン側鎖の疎水相互作用等により安定した立体的な構造が保持され、さらにＡ鎖のＮ末端にあるシステインとＣ鎖のＣ末端のシステインがジスルフィド結合して環状化することでさらに安定化される。従って、環状化の如何に関わらず、このような安定な立体的な構造を保つ限り、Ａ鎖及びＣ鎖である２本のα－ヘリックスを構成するアミノ酸、２本のα－ヘリックスの外側を向かうアミノ酸は任意に置換し得る。特に、本願発明の好ましい態様であるＨＳＡ結合性ＨＬＨタンパクは配列番号１１に示すアミノ酸配列（タンパクＡＹ０１）を有するが、２本のα－ヘリックスを構成するアラニンは、例えば配列番号１０に示すようにその一部のアラニン、つまりＨＬＨタンパクのＮ末端から３番目、１３番目、３０番目、３１番目、３４番目、３７番目、３８番目、４１番目（以下、アミノ酸の位置はＨＬＨタンパクのＮ末端からの位置を示す）のＡは他のアミノ酸に置換し得る。また、ＨＬＨタンパクの構造が安定化されている限りＨＳＡ結合性は維持されるために、２本のα－ヘリックスの外側を向かうアミノ酸である全てのＡ、すなわちＨＬＨタンパクのＮ末端から２番目、３番目、６番目、７番目、１０番目、１３番目、１４番目、３０番目、３１番目、３４番目、３７番目、３８番目、４１番目、４２番目のＡは、他の任意のアミノ酸に置換しても、安定な構造を保つ（配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク）。また、２本のα－ヘリックスを構成するＡ以外のアミノ酸を置換した場合であっても、前記特徴的な７つのアミノ酸配列、つまり配列番号３～８のアミノ酸配列から両端のＧを除いたアミノ酸配列をＢ鎖であるループ部に有し、２本のα－ヘリックス間の結合を良好に保つべくループ部が９～１１個のアミノ酸から構成されさえすればよい。もちろん、本願発明に係るＨＬＨタンパクは必ずしも安定な立体構造が保持されている必要はない。

【0012】

α－ヘリックスを構成するアラニンから置換され得るアミノ酸として、Ａ鎖においてＨＬＨタンパクのＮ末端から３番目のＡはＴ又はＳであってもよく、６番目のＡはＳであってもよく、１３番目のＡはＳであってもよく、Ｃ鎖においてはＨＬＨタンパクのＮ末端から３０番目のＡはＤ又はＮであってもよく、３１番目のＡはＦであってもよく、３４番目のＡはＱ，Ｇ，Ｓの何れかでもよく、３７番目のＡはＥ，Ｐ，Ｈの何れかでもよく、３８番目のＡはＶ又はＦでもよく、４１番目のＡはＤ又はＮであって、これらの置換は１箇所のみでもあり、２箇所以上でもあり得る。

【0013】

本願発明に係るＨＬＨタンパクでは、α－ヘリックスを構成するアラニン以外のアミノ酸も置換し得る。２本のα－ヘリックスにおいて置換し得るアミノ酸は、Ａ鎖においてＨＬＨタンパクのＮ末端から４番目のアミノ酸ＥはＤに、５番目のアミノ酸ＬはＰ又はＱに、９番目のアミノ酸ＥはＫに、１２番目のアミノ酸ＬはＲまたはＱに、Ｃ鎖においてＨＬＨタンパクのＮ末端から２８番目のアミノ酸ＫはＥに、２９番目のアミノ酸ＬはＲに、３３番目のアミノ酸ＫはＲに、４０番目のアミノ酸ＫはＮ又はＲに、４３番目のアミノ酸ＣはＳに置換可能であり、これらの中で１つ又は２つ以上のアミノ酸がそれぞれ置換され得る。このうち、ＨＬＨタンパクの立体構造を保つに重要であるとされるロイシン（Ｌ）の置換は、Ａ鎖，Ｃ鎖においてそれぞれ１つ又は２つであることが好ましく、望ましくは１つである。

【0014】

本願発明に係るＨＬＨタンパクは、ループ鎖であるＢ鎖においては上記配列番号４に示すアミノ酸配列のうち、１～３つのアミノ酸、特にＨＬＨタンパクのＮ末端から２２番目のＶ、２３番目のＥ、２６番目のＲが置換してもＨＳＡへの結合性が認められる。例えば、２２番目のＶはＡ又はＲに、２３番目のＥはＶ又はＳに、２６番目のＲはＶに置換したＨＬＨタンパクである。具体的には、Ｂ鎖に配列番号５～８に示すアミノ酸配列を有するタンパクである。Ｂ鎖においてアミノ酸が置換されたタンパクにおいては、α－ヘリックスであるＡ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示すものであればよいが、好ましくはＡ鎖においては配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から４番目のＥはＤに、５番目のＬはＱに置換され得る。また、好ましくはＣ鎖において配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、２８番目のＫがＥに置換されたタンパクであり、２９番目のＬがＲに置換され得る。これらの置換は１箇所でもあり、２箇所以上でもあり得る。そして、α－ヘリックスにおけるアミノ酸は６番目のアミノ酸ＸはＡ又はＳであり、３０番目のアミノ酸ＸはＡ又はＮであり、３１番目のアミノ酸ＸはＡ又はＦであり、３４番目のアミノ酸ＸはＡ又はＳであり、３７番目のアミノ酸ＸはＡ又はＨであり、３８番目のアミノ酸ＸはＡ又はＦであり、４１番目のアミノ酸ＸはＡ又はＮでもあり得る。

【0015】

より具体的にはＨＳＡ結合性のタンパクとして配列番号９又は配列番号１０を示すアミノ酸配列を有するタンパクが示される。当該アミノ酸配列中のアミノ酸ＸはＡであることが好ましいが、３番目のアミノ酸ＡはＴ又はＳに、６番目のアミノ酸ＡはＳに、１３番目のアミノ酸ＡはＳに、３０番目のアミノ酸ＡはＤ又はＮに、３１番目のアミノ酸ＡはＦに、３４番目のアミノ酸ＡはＱ又はＧ又はＳに、３７番目のアミノ酸ＡはＥ又はＰ又はＨに、３８番目のアミノ酸ＡはＶ又はＦに、４１番目のアミノ酸ＡはＤ又はＮに置換したものでもよい。さらに、Ｎ末端から２８番目のアミノ酸ＫがＥに置換し、５番目のＬがＰ又はＱに、９番目のＥがＫに、１２番目のＬがＱ又はＰに、３３番目のＫがＲに、４０番目のＫがＮ又はＱに、４３番目のＣがＳに置換したものでもよい。これらアミノ酸Ａの置換やアミノ酸Ａ以外の置換は１箇所でもあり２箇所以上でもあり得る。

【0016】

これらのうち具体的にはＨＳＡ結合性タンパクとして、配列番号１０に示すアミノ配列を有するタンパクにおいて、２８番目のアミノ酸ＫがＥに置換したタンパクが例示される。この場合においても、当該アミノ酸配列中のアミノ酸ＸはＡであることが好ましいが、３番目のアミノ酸ＡはＴ又はＳでもあり、１３番目のアミノ酸ＡはＳでもあり得る。さらに、９番目のアミノ酸ＥがＫに、２９番目のＬがＲに、３３番目のＫがＲに、４０番目のＫがＮに、４３番目のＣがＳにそれぞれ置換し得る。

【0017】

また、ＨＳＡ結合性タンパクとして、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパクにおいて、Ｎ末端から５番目のアミノ酸ＬがＰに置換したタンパクやＮ末端から４番目のアミノ酸ＥがＤに置換したタンパク、Ｎ末端から１２番目のＬがＱ又はＲに置換したタンパクも例示される。これらのタンパクではアミノ酸ＸはＡであることが好ましいが、特にＮ末端から５番目のアミノ酸ＬがＰに置換したタンパクでは、Ｎ末端から３０番目のアミノ酸ＸはＡ，Ｄ，Ｎの何れかであり、３４番目のアミノ酸ＸはＡ，Ｑ，Ｇ，Ｓの何れかであり、３７番目のアミノ酸ＸはＡ，Ｅ，Ｐ，Ｈの何れかであり、３８番目のアミノ酸はＡ又はＶであり、４１番目のアミノ酸ＸはＡ，Ｄ，Ｎであり得る。

【0018】

本願発明に係るＨＬＨタンパクは、Ａ鎖のＮ末端とＣ鎖のＣ末端にはそれぞれスルフィド基を有する場合には、Ａ鎖のＮ末端とＣ鎖のＣ末端がジスルフィド結合して環状構造を形成させることが好ましい。

【0019】

本願発明に係るＨＬＨタンパクはＨＳＡに対する結合性を有し、動物、特にヒトにおける血中滞留性を延ばすことができる。対象となる薬物は限られるものではないが、これまで血中滞留性が短いとされてきたインスリン、グルカゴン様ペプチド、ヒト成長ホルモン、インターロイキン２、Ｇ－ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor 顆粒球コロニー刺激因子）が例示される。

【0020】

本願発明に係るＨＳＡ結合性タンパクの製造方法は、配列番号３６で示されるタンパク鎖ＡのＣ末端と配列番号３７で示されるタンパク鎖ＣのＮ末端の間に、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク鎖Ｂ（但し、タンパク鎖ＢのＮ末端及び／又はＣ末端のＧが欠損してもよい）がペプチド結合したタンパク、つまり配列番号１１に示すタンパク（ただし、Ｎ末端から１７番目のＧ及び／又は２７番目のＧが欠損してもよい）を構成するアミノ酸の少なくとも１つをその他の天然に存在するタンパク中に通常見いだされる任意のＬ－アミノ酸に置換する工程と、置換されたアミノ酸配列を有するタンパクとＨＳＡと接触させる工程と、ＨＳＡと結合したタンパクのアミノ酸配列を決定する工程と、決定したアミノ酸配列からタンパクを合成する工程を有する。

【0021】

置換前のタンパクはＨＳＡに対して結合性が認められたＨＬＨタンパクであって、これから改変したＨＳＡ結合性のタンパクを探索する方法である。特にループ部のアミノ酸配列を保持したＨＬＨタンパクはＨＳＡ結合性を示すと考えられる。

【0022】

置換されるアミノ酸は、Ａ鎖－Ｂ鎖－Ｃ鎖からなるタンパクのうち任意のアミノ酸の少なくとも１つ以上であり、好ましくはＮ末端から２，３，６，７，１０，１３，１４，３０，３１，３４，３７，３８，４１，４２番目のアミノ酸、すなわち、α－ヘリックスであるＡ鎖、Ｃ鎖の外側を向いたアミノ酸Ａの少なくとも１つのアミノ酸である。また、ループ部であるＢ鎖を構成するアミノ酸であっても差し支えないが、ループ部であるＢ鎖のアミノ酸配列を保持するように置換するのが好ましい。

【0023】

ＨＬＨタンパクとＨＳＡの接触はＨＳＡへの結合性を確認する工程である。接触方法も特段制限されることはなく、その後、ＨＳＡへの結合性が認められたＨＬＨタンパクはその他のＨＬＨタンパクなどと分離される。ＨＳＡへの結合性への判別は接触に用いられるＨＳＡの濃度などにより適宜決定し得る。結合性が確認されたＨＳＡ結合性タンパクは、例えば磁気ビーズが結合された抗ビオチン抗体と結合させた後、磁気を用いて分離される。そして、分離されたＨＳＡ結合性タンパクのアミノ酸配列が種々の方法により決定され得る。

【0024】

ＨＬＨタンパクの作製は公知である種々の化学的方法、例えば固相合成法を用いてもよく、酵母やファージに当該置換後のタンパクを発現するように構成されたプラスミドなどのベクターを用いて形質転換させることでもよい。

【0025】

アミノ酸を置換する方法は、ターゲットとするアミノ酸又は当該アミノ酸に対応する塩基を特定して置換する方法やランダムに置換する方法の何れでもよい。前者では、タンパクの化学的合成時に該当するアミノ酸や塩基を用いればよい。後者では、任意のアミノ酸が導入されるようにランダム化のための塩基配列を導入したプラスミドを用いることで、多様なアミノ酸配列を有するタンパクを同時に作製（発現）することができる。後者の方法では、いわゆるＨＳＡ結合性タンパクのライブラリーが得られる。この際、酵母又はファージの表層に当該タンパクを提示するプラスミドが好ましく用いられる。多種のタンパク合成が簡便にでき、それらとＨＳＡとの結合性を容易に確認できるからである。

【0026】

また、置換前のタンパクを決定する塩基配列を鋳型としてエラープローンＰＣＲ法（error prone PCR）によりアミノ酸が置換されたタンパクを製造してもよい。エラープローンＰＣＲも公知であり、配列番号４～８のアミノ酸配列を有するＨＳＡタンパク、例えば配列番号１１や３４などに示すＨＳＡ結合性アミノ酸配列を有するタンパクをコードする遺伝子をＰＣＲ（polymerase chain reaction）により増幅する際、複製の厳密性を低下して増幅する方法である。この方法により変異が導入された遺伝子を元に合成し、あるいは当該遺伝子が導入されたベクターにより酵母などを形質転換して、前記した方法と同様にしてＨＳＡ結合性タンパクを得ることができる。このようにして種々のアミノ酸配列を有するＨＳＡ結合性タンパクを製造できる。

【0027】

以下、本願発明について下記の実施例に基づいて説明する。

【実施例0028】

〔ＨＳＡ結合性タンパクのスクリーニング１〕
Ramanayakeらの報告（Ramanayake Mudiyanselage T.M.R. et al. An Immune-Stimulatory Helix-Loop-Helix Peptide: Selective Inhibition of CTLA-4-B7 interaction. ACS Chem. Biol. 15, 360-368 (2020)）を参考にして、酵母の細胞表層に存在するアグルチニンを利用してＨＬＨタンパクを酵母の細胞表層に発現したタンパクライブラリーを作製した。ライブラリーを構成するＨＬＨタンパクは配列番号３８に示すアミノ酸配列（CAAELAALEAELAALEGXXXXXXXXXGKLAALKAKLAALKAAC）を有し、ループ部分の９個アミノ酸がランダム化されている。また、ＨＬＨタンパクのＣ末端側にはリンカーを介してＦＬＡＧタグを発現するように酵母に導入するベクターを構成した。

【0029】

酵母を培養することでライブラリーを提示した酵母細胞液に、ビオチン化したＨＳＡと抗ビオチン抗体が結合した磁気ビーズを加えて、ライブラリーを反応させた。反応後、磁石が外側に備えられたカラムを用いて当該酵母細胞液中から、ＨＳＡと結合したタンパク発現酵母を分離し、分離して得られた酵母をさらに培養し同様なスクリーニングを数回繰り返して、ＨＳＡ結合性タンパクを発現した酵母を濃縮した。

【0030】

濃縮された酵母と、抗ＦＬＡＧタグマウス抗体及びビオチン化ＨＳＡを反応させ、その後にストレプトアビジンが結合した蛍光標識であるＡＰＣ（Allophycocyanin）と抗マウスＩｇＧヤギ抗体が結合された蛍光標識であるAlexa488を反応させることで、標識化されたＨＳＡ結合性タンパクライブラリーを得た。このライブラリーの蛍光強度をフローサイトメーターで検出した。ＡＰＣの蛍光強度はＨＬＨタンパクが結合したＨＳＡ量を示し、Alexa488は酵母表層のＨＬＨタンパク発現量を示すことから、両者の蛍光強度が強い領域の酵母集団をソーティングした。そして、ソーティングした酵母を再度培養し、同様の操作を行い強い蛍光強度を示した細胞集団から８つのクローンを選び、ＤＮＡ配列を解析したところ、配列番号１１に示されたアミノ酸配列（CAAELAALEAELAALEGVNFGVELFRGKLAALKAKLAALKAAC）を有するタンパク（ＡＹ０１）が発現されていることが示された。

【0031】

なお、当該タンパクを提示している単一の酵母を使って、フローサイトメトリーを用いたＨＳＡ及びＭＳＡ（マウス血清アルブミン）に対する結合性の評価を行ったところ、当該タンパク（ＡＹ０１）はＨＳＡ及びＭＳＡの双方に結合性を有することが確認された。

【0032】

また、Ｆｍｏｃ固相合成法によりペプチド合成機を用いてタンパクＡＹ０１を合成したところ、このものもＨＳＡ及びＭＳＡの双方に結合性を有し、ＣＤスペクトルによって立体性を保持することも確認された。

【実施例0033】

〔ＨＳＡ結合性タンパクのスクリーニング２〕
次に、藤井らの論文（Fujii, I. et al. Evolving catalytic antibodies in a phage-displayed combinatorial library. Nat. Biotechnol. 16, 463 (1998)）を参考にファージ発現用プラスミド(pComb3d)を用いて、ファージ表層提示タンパクライブラリーを作製した（図１参照）。当該ライブラリーを構成するタンパクは配列番号３９に示すアミノ酸配列（CAAELAALEAELAALEGXXXXXXXXXGKLXXLKXKLXXLKXAC）を有し、ループ部のアミノ酸以外にもＣ末端側のヘリックス部位を構成するアミノ酸も一部ランダム化されている。なお、ヘリックス部位には立体構造が不安定化させるプロリン残基、その他アラニン残基やトレオニン残基が含まれないようにした。ライブラリーのためのベクターマップを図１に示す。

【0034】

得られたライブライリーについてバイオパンニングを繰り返すことで、ＨＳＡに結合するタンパクを発現しているファージをスクリーニングした。得られたファージからタンパクのアミノ酸配列を決定したところ、実施例１で得られたタンパクＡＹ０１と類似する配列番号３４で示すアミノ酸配列（CAAELAALEAELAALEGVNFGRSLFVGKLNFLKSKLHFKANAC）を有するタンパク（ＡＹ０３）が得られた。