(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022006397
(43)【公開日】2022-01-13
(54)【発明の名称】バリア機能亢進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/368 20060101AFI20220105BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20220105BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220105BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220105BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220105BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
A61K8/368
A61K31/19
A61P17/00
A61P43/00 107
A61P43/00 111
A61Q19/00
A23L33/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020108596
(22)【出願日】2020-06-24
(71)【出願人】
【識別番号】591082421
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100108833
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 裕司
(74)【代理人】
【識別番号】100162156
【弁理士】
【氏名又は名称】村雨 圭介
(74)【代理人】
【識別番号】100201606
【弁理士】
【氏名又は名称】田岡 洋
(72)【発明者】
【氏名】大戸 信明
【テーマコード（参考）】
4B018
4C083
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018MD08
4B018ME14
4C083AA072
4C083AA082
4C083AA112
4C083AA122
4C083AB032
4C083AC022
4C083AC072
4C083AC102
4C083AC122
4C083AC182
4C083AC242
4C083AC311
4C083AC312
4C083AC422
4C083AC442
4C083AC482
4C083AD092
4C083AD282
4C083AD352
4C083AD392
4C083AD512
4C083AD532
4C083CC04
4C083CC05
4C083DD27
4C083DD31
4C083EE12
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA13
4C206KA17
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA89
4C206ZB22
4C206ZC41
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロソリン酸を有効成分とすることを特徴とするバリア機能亢進剤。
【請求項2】
前記コロソリン酸が、バリア機能向上用途、バリア機能低下抑制用途、クローディン－１発現促進用途、クローディン－４発現促進用途、オクルディン発現促進用途、ＺＯ－１発現促進用途およびＺＯ－２発現促進用途からなる群より選択される１または２以上の用途に用いられることを特徴とする請求項１に記載のバリア機能亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バリア機能亢進剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
生体においてその内と外とを隔てる構造の一つに、上皮細胞から構成される上皮組織がある。上皮組織は、物質透過を制御するバリア機能を有しており、これにより生体において外界とは異なる内部環境を作り上げている。このようなバリア機能は、主に細胞間の接着により形成されるが、かかる接着の一つがタイトジャンクション（以下「ＴＪ」と表記することがある。）である。ＴＪは、隣接する上皮細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞との隙間をシールすることで物質の透過を制御する細胞間接着構造である。ＴＪを構成しているのは、細胞膜タンパク質であるクローディンやオクルディン、裏打ちタンパク質であるＺＯ－１やＺＯ－２等であり、これらのタンパク質はＴＪストランドの骨格を構成し、ＴＪのバリア機能を制御すると考えられている（非特許文献１参照）。
【0003】
現在までクローディンは２０種以上のクローディン分子が報告され、クローディンファミリーを形成している。これらは組織特異的な発現パターンを示すことが分かっており、表皮においてはクローディン－１およびクローディン－４が発現している。クローディン－４は粘膜上皮においても多く発現しており、身体の内外で異物の侵入を防ぐバリアとして機能している。
【0004】
クローディンやオクルディンの発現が何らかの原因で減少した場合、ＴＪの機能低下を引き起こす。例えば、消化管においてＴＪの機能が低下すると、食物アレルゲンや病原性微生物等が体内へ侵入してしまい、炎症性腸疾患や各種感染症などの一因になると考えられる。また、従来は、皮膚のバリア機能は角質層のみが担っていると考えられていたが、近年、表皮顆粒層に存在するＴＪの構成タンパク質を遺伝子レベルで欠損させると皮膚のバリア機能が崩壊することが見いだされ、ＴＪも皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられるようになっている（非特許文献２参照）。ここで、クローディンやオクルディン等の発現が何らかの原因で減少した場合、ＴＪの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状の一因になると考えられる。
【0005】
そのため、クローディンやオクルディンの産生促進などを通じてＴＪの機能を強化することで、上皮組織におけるバリア機能を強化し、消化管においては炎症性腸疾患や食物アレルギー、各種感染症などを予防または改善することができ、一方表皮においては乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状を予防または改善することができると考えられる。クローディン産生促進作用およびオクルディン産生促進作用を有するものとして、アスパラサスリネアリス抽出物（特許文献１）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００９－２５６２４４号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】日本香粧品科学会誌，2007年，vol.31，pp.296-301
【非特許文献2】J. Cell Biol.，2002年，vol.156，pp.1099-1111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、作用効果に優れたバリア機能亢進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するために、本発明は、コロソリン酸を有効成分とすることを特徴とするバリア機能亢進剤を提供する（発明１）。
【0010】
上記発明（発明１）において、コロソリン酸は、バリア機能向上用途、バリア機能低下抑制用途、クローディン－１発現促進用途、クローディン－４発現促進用途、オクルディン発現促進用途、ＺＯ－１発現促進用途およびＺＯ－２発現促進用途からなる群より選択される１または２以上の用途に用いられることが好ましい（発明２）。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、コロソリン酸を有効成分とすることにより、作用効果に優れたバリア機能亢進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】コロソリン酸のバリア機能向上作用を、経時的な経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）値測定にて評価した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態に係るバリア機能亢進剤は、コロソリン酸を有効成分とする。
本実施形態に係るバリア機能亢進剤は、コロソリン酸を有効成分とする。
【0014】
コロソリン酸（corosolic acid）は、下記式で表される化学構造を有するトリテルペノイド類化合物の一種である。
【0015】
【化1】
【0016】
本実施形態において使用されるコロソリン酸は市販されているため、これを用いてもよい。また、コロソリン酸は、コロソリン酸を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により合成することができる（特開２００５－２９５７０号公報参照）。
【0017】
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。なお、上記植物抽出物には、コロソリン酸を含有する植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【0018】
コロソリン酸を含有する植物としては、例えば、ビワ（学名：Eriobotrya japonica）、バナバ（学名：Lagerstroemia speciosa）等が挙げられる。
【0019】
ビワ（Eriobotrya japonica）は、バラ科の常緑高木であり、果実部は食用にされ、葉部は胃腸虚弱、神経痛、下痢等の治療等に用いられている。ビワは、日本、台湾、中国等に自生しており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るビワの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。
【0020】
バナバ（Lagerstroemia speciosa）は、フィリピンやオーストラリア等の熱帯・亜熱帯地域に広く分布するミソハギ科の植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るバナバの構成部位は、特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、これらのうち葉部を用いるのが好ましい。
【0021】
コロソリン酸を含有する植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【0022】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【0023】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【0024】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１～５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２～５の多価アルコール等が挙げられる。
【0025】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を抽出溶媒として使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比が９：１～１：９（容量比）であることが好ましく、７：３～２：８（容量比）であることがさらに好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比が９：１～２：８（容量比）であることが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水と多価アルコールとの混合比が８：２～１：９（容量比）であることが好ましい。
【0026】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５～５０倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【0027】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からコロソリン酸を精製・単離する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を展開溶媒に溶解し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、コロソリン酸を含む画分を回収する方法等が挙げられる。この場合、展開溶媒は使用する固定相に応じて適宜選択すればよいが、例えば固定相としてシリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーにより抽出物を分離する場合、展開溶媒としてはクロロホルム：メタノール＝２０：１等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたコロソリン酸を含む画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液－液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【0028】
以上のようにして得られるコロソリン酸は、優れたバリア機能亢進作用を有しているため、バリア機能亢進剤の有効成分として用いることができる。本実施形態のバリア機能亢進剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品等の幅広い用途に使用することができる。
【0029】
なお、本実施形態に係るバリア機能亢進剤の有効成分として、精製・単離したコロソリン酸に替えて、コロソリン酸を含有する組成物を用いてもよい。ここで、本実施形態における「コロソリン酸を含有する組成物」には、コロソリン酸を含有する植物を抽出原料として得られる植物抽出物等が含まれる。
【0030】
本実施形態に係るバリア機能亢進剤の有効成分として、コロソリン酸を含有する組成物を用いる場合は、精製してコロソリン酸の純度を高めたものを使用することが好ましい。具体的には、当該組成物中におけるコロソリン酸の含有量が１質量％以上であることが好ましく、５質量％以上であることがさらに好ましく、１０質量％以上であることが特に好ましい。コロソリン酸の純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層作用効果に優れたバリア機能亢進剤を得ることができる。
【0031】
ここで、コロソリン酸が有するバリア機能亢進作用は、バリア機能向上作用、バリア機能低下抑制作用、クローディン－１発現促進作用、クローディン－４発現促進作用、オクルディン発現促進作用、ＺＯ－１発現促進作用およびＺＯ－２発現促進作用に基づいて発揮されることが好ましい。ただし、コロソリン酸が有するバリア機能亢進作用は、上記作用に基づいて発揮されるバリア機能亢進作用に限定されるものではない。
【0032】
また、コロソリン酸は、そのバリア機能向上作用、バリア機能低下抑制作用、クローディン－１発現促進作用、クローディン－４発現促進作用、オクルディン発現促進作用、ＺＯ－１発現促進作用およびＺＯ－２発現促進作用を利用して、それぞれバリア機能向上用途、バリア機能低下抑制用途、クローディン－１発現促進用途、クローディン－４発現促進用途、オクルディン発現促進用途、ＺＯ－１発現促進用途およびＺＯ－２発現促進用途に用いることができる。すなわち、本実施形態のバリア機能亢進剤は、コロソリン酸を有効成分とするバリア機能向上剤、バリア機能低下抑制剤、クローディン－１発現促進剤、クローディン－４発現促進剤、オクルディン発現促進剤、ＺＯ－１発現促進剤およびＺＯ－２発現促進剤として用いることもできる。
【0033】
本実施形態のバリア機能亢進剤は、コロソリン酸またはコロソリン酸を含有する組成物のみからなるものでもよいし、コロソリン酸を製剤化したものでもよい。
【0034】
本実施形態のバリア機能亢進剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。バリア機能亢進剤は、他の組成物（例えば、皮膚外用剤等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【0035】
本実施形態のバリア機能亢進剤を製剤化した場合、コロソリン酸の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【0036】
なお、本実施形態のバリア機能亢進剤は、必要に応じて、バリア機能亢進作用を有する他の天然抽出物等を、コロソリン酸とともに配合して有効成分として用いることができる。
【0037】
本実施形態のバリア機能亢進剤の患者に対する投与方法としては、経口投与、経皮投与等が挙げられ、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【0038】
また、本実施形態のバリア機能亢進剤の投与量は、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【0039】
本実施形態のバリア機能亢進剤は、有効成分であるコロソリン酸が有するバリア機能亢進作用を通じて、上皮組織におけるバリア機能を亢進することができる。例えば、消化管におけるバリア機能を亢進し、炎症性腸疾患や食物アレルギー、消化管から感染する各種感染症などを予防、治療または改善することができる。また、表皮におけるバリア機能および水分保持機能を高め、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎などの皮膚症状や各種感染症などを予防、治療または改善することができる。ただし、本実施形態のバリア機能亢進剤は、これらの用途以外にもバリア機能亢進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【0040】
本実施形態のバリア機能亢進剤は、バリア機能向上用途またはバリア機能低下抑制用途に用いる場合（バリア機能向上剤またはバリア機能低下抑制剤として用いる場合）、バリア機能向上作用、バリア機能低下抑制作用を通じて、上皮組織におけるバリア機能を亢進し、炎症性腸疾患や食物アレルギー、消化管から感染する各種感染症などの予防、治療または改善；乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎などの皮膚症状や各種感染症などの予防、治療または改善をすることができる。ただし、これらの用途以外にもバリア機能向上作用またはバリア機能低下抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【0041】
本実施形態のバリア機能亢進剤は、クローディン－１発現促進用途、クローディン－４発現促進用途、オクルディン発現促進用途、ＺＯ－１発現促進用途またはＺＯ－２発現促進用途に用いる場合（クローディン－１発現促進剤、クローディン－４発現促進剤、オクルディン発現促進剤、ＺＯ－１発現促進剤またはＺＯ－２発現促進剤として用いる場合）、クローディン－１発現促進作用、クローディン－４発現促進作用、オクルディン発現促進作用、ＺＯ－１発現促進作用およびＺＯ－２発現促進作用を通じて、上皮組織におけるタイトジャンクションの形成を促すことでバリア機能を亢進し、炎症性腸疾患や食物アレルギー、消化管から感染する各種感染症などの予防、治療または改善；乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎などの皮膚症状や各種感染症などの予防、治療または改善をすることができる。ただし、これらの用途以外にもクローディン－１発現促進作用、クローディン－４発現促進作用、オクルディン発現促進作用、ＺＯ－１発現促進作用またはＺＯ－２発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【0042】
また、本実施形態のバリア機能亢進剤は、優れたバリア機能亢進作用を有するため、例えば、皮膚外用剤または経口組成物に配合するのに好適である。この場合に、コロソリン酸またはコロソリン酸を含有する組成物をそのまま配合してもよいし、コロソリン酸またはコロソリン酸を含有する組成物から製剤化したバリア機能亢進剤を配合してもよい。
【0043】
ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【0044】
皮膚外用剤におけるコロソリン酸の配合量は、皮膚外用剤の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、０．０００１～１０質量％であり、特に好適な配合率は、０．００１～１質量％である。
【0045】
経口組成物とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品等の区分に制限されるものではない。したがって、本実施形態における「経口組成物」は、経口的に摂取される一般食品、飼料、健康食品、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品，機能性表示食品）、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。本実施形態に係る経口組成物は、当該経口組成物またはその包装に、コロソリン酸またはコロソリン酸を含有する組成物が有する好ましい作用を表示することのできる経口組成物であることが好ましく、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品，機能性表示食品）、医薬部外品または医薬品であることが特に好ましい。
【0046】
経口組成物におけるコロソリン酸の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象となる経口組成物の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりの抽出物摂取量が約１～１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。なお、添加対象経口組成物が顆粒状、錠剤状又はカプセル状の場合、コロソリン酸の添加量は、添加対象経口組成物に対して通常０．０００１～１０質量％であり、好ましくは０．００１～１質量％である。
【0047】
また、本実施形態のバリア機能亢進剤は、優れたバリア機能亢進作用を有するので、これらの作用機構に関する研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【0048】
なお、本実施形態のバリア機能亢進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例0049】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例において、使用したコロソリン酸（試料１）は市販品（富士フイルム和光純薬社製）である。
【0050】
〔試験例１〕皮膚バリア機能向上作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにして経上皮電気抵抗（transepithelial electrical resistance，ＴＥＲ）の値を測定した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにして経上皮電気抵抗（transepithelial electrical resistance，ＴＥＲ）の値を測定した。
【0051】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、１２ｗｅｌｌトランスウェル（Corning社製，直径１２ｍｍ，０．４μｍポア）の上層に１ｗｅｌｌ当たり０．５ｍＬずつ播種し、さらに下層に１．５ｍＬずつＫＧＭを加え２日間培養した。
【0052】
培養終了後（０時間）、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表１を参照）を各ｗｅｌｌの上層に０．５ｍＬずつ添加し、１５分間処理した後、上層を０．５ｍＬのＫＧＭに置換し培養を続けた。処理から２４時間後、Millicell-ERS抵抗値測定システム（ミリポア社製）を用いて、経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ）を測定した後、再度、１５分間の試料（試料１，試料濃度は表１を参照）による処理を繰り返し、さらに２４時間後（最初の処理から４８時間後）にＴＥＲを測定し経時的な皮膚バリア機能向上作用を評価した。測定したＴＥＲの値を表１および図１に示す。
【0053】
【表1】
【0054】
表１および図１に示すように、コロソリン酸（試料１）を処理することでＴＥＲ値が上昇し、皮膚のバリア機能が向上することが認められた。
【0055】
〔試験例２〕皮膚バリア機能低下抑制作用試験
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、１２ｗｅｌｌトランスウェル（Corning社製，直径１２ｍｍ，０．４μｍポア）の上層に１ｗｅｌｌ当たり０．５ｍＬずつ播種し、さらに下層に１．５ｍＬずつＫＧＭを加え培養した。２日後、ＫＧＭで溶解したＣａＣｌ2（最終濃度１．８ｍＭ）を各ｗｅｌｌの上層に０．５ｍＬ、下層にＫＧＭを１．５ｍＬずつ添加し、４日間培養してタイトジャンクション形成を誘導した。
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、１２ｗｅｌｌトランスウェル（Corning社製，直径１２ｍｍ，０．４μｍポア）の上層に１ｗｅｌｌ当たり０．５ｍＬずつ播種し、さらに下層に１．５ｍＬずつＫＧＭを加え培養した。２日後、ＫＧＭで溶解したＣａＣｌ2（最終濃度１．８ｍＭ）を各ｗｅｌｌの上層に０．５ｍＬ、下層にＫＧＭを１．５ｍＬずつ添加し、４日間培養してタイトジャンクション形成を誘導した。
【0056】
培養終了後（０時間）、高ＣａＣｌ2培地を除去し、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表２を参照）を各ｗｅｌｌの上層に０．５ｍＬずつ添加して１５分間処理した後、上層を０．５ｍＬのＫＧＭに置換し培養を続けた。２４時間後、４８時間後に同様の１５分間の試料（試料１，試料濃度は表２を参照）による処理を繰り返し、処理から７２時間後にMillicell-ERS抵抗値測定システム（ミリポア社製）を用いて、経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ）を測定し皮膚バリア機能低下抑制作用を評価した。測定したＴＥＲの値を表２に示す。
【0057】
【表2】
【0058】
表２に示すように、コロソリン酸（試料１）を処理することでＴＥＲ値の低下が抑制され、皮膚のバリア機能の低下を抑制することが認められた。
【0059】
〔試験例３〕クローディン－１発現促進作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてクローディン－１発現促進作用を試験した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてクローディン－１発現促進作用を試験した。
【0060】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。ＫＧＭを用いて６ｗｅｌｌプレートに３０×１０4ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養後、ＫＧＭ中の増殖添加剤からＢＰＥおよびＥＧＦを抜いた培地（ＫＢＭ＋）に交換した。
【0061】
２４時間後に培養液を捨て、ＫＢＭ＋に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表３を参照）を各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間処理した。処理後、再び２ｍＬのＫＢＭ＋に置換し、４時間および８時間培養した。培養後、ISOGEN II (NIPPON GENE社製)にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0062】
この総ＲＮＡを鋳型とし、クローディン－１および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System III（タカラバイオ社製）を用いて、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）およびTB Green Fast qPCR Mix（タカラバイオ社製）による２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プライマーはタカラバイオ社製のものを使用した。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。得られた値から、クローディン－１ ｍＲＮＡについて、被験試料添加による発現促進率を下記式により算出した。
【0063】
クローディン－１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
クローディン－１ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表３に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
クローディン－１ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表３に示す。
【0064】
【表3】
【0065】
表３に示すように、コロソリン酸（試料１）は優れたクローディン－１発現促進作用を有することが確認された。
【0066】
〔試験例４〕クローディン－４発現促進作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてクローディン－４発現促進作用を試験した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてクローディン－４発現促進作用を試験した。
【0067】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。ＫＧＭを用いて６ｗｅｌｌプレートに３０×１０4ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養後、ＫＧＭ中の増殖添加剤からＢＰＥおよびＥＧＦを抜いた培地（ＫＢＭ＋）に交換した。
【0068】
２４時間後に培養液を捨て、ＫＢＭ＋に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表４を参照）を各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間処理した。処理後、再び２ｍＬのＫＢＭ＋に置換し、４時間および８時間培養した。培養後、ISOGEN II (NIPPON GENE社製)にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0069】
この総ＲＮＡを鋳型とし、クローディン－４および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System III（タカラバイオ社製）を用いて、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）およびTB Green Fast qPCR Mix（タカラバイオ社製）による２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プライマーはタカラバイオ社製のものを使用した。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。得られた値から、クローディン－４ ｍＲＮＡについて、被験試料添加による発現促進率を下記式により算出した。
【0070】
クローディン－４ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
クローディン－４ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表４に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
クローディン－４ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表４に示す。
【0071】
【表4】
【0072】
表４に示すように、コロソリン酸（試料１）は優れたクローディン－４発現促進作用を有することが確認された。
【0073】
〔試験例５〕オクルディン発現促進作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてオクルディン発現促進作用を試験した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてオクルディン発現促進作用を試験した。
【0074】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。ＫＧＭを用いて６ｗｅｌｌプレートに３０×１０4ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養後、ＫＧＭ中の増殖添加剤からＢＰＥおよびＥＧＦを抜いた培地（ＫＢＭ＋）に交換した。
【0075】
２４時間後に培養液を捨て、ＫＢＭ＋に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表５を参照）を各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間処理した。処理後、再び２ｍＬのＫＢＭ＋に置換し、４時間および８時間培養した。培養後、ISOGEN II (NIPPON GENE社製)にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0076】
この総ＲＮＡを鋳型とし、オクルディンおよび内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System III（タカラバイオ社製）を用いて、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）およびTB Green Fast qPCR Mix（タカラバイオ社製）による２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プライマーはタカラバイオ社製のものを使用した。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。得られた値から、オクルディン ｍＲＮＡについて、被験試料添加による発現促進率を下記式により算出した。
【0077】
オクルディン ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
オクルディン ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表５に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
オクルディン ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表５に示す。
【0078】
【表5】
【0079】
表５に示すように、コロソリン酸（試料１）は優れたオクルディン発現促進作用を有することが確認された。
【0080】
〔試験例６〕ＺＯ－１発現促進作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてＺＯ－１発現促進作用を試験した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてＺＯ－１発現促進作用を試験した。
【0081】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。ＫＧＭを用いて６ｗｅｌｌプレートに３０×１０4ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養後、ＫＧＭ中の増殖添加剤からＢＰＥおよびＥＧＦを抜いた培地（ＫＢＭ＋）に交換した。
【0082】
２４時間後に培養液を捨て、ＫＢＭ＋に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表６を参照）を各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間処理した。処理後、再び２ｍＬのＫＢＭ＋に置換し、４時間および８時間培養した。培養後、ISOGEN II (NIPPON GENE社製)にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0083】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＺＯ－１および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System III（タカラバイオ社製）を用いて、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）およびTB Green Fast qPCR Mix（タカラバイオ社製）による２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プライマーはタカラバイオ社製のものを使用した。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。得られた値から、ＺＯ－１ ｍＲＮＡについて、被験試料添加による発現促進率を下記式により算出した。
【0084】
ＺＯ－１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
ＺＯ－１ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表６に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
ＺＯ－１ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表６に示す。
【0085】
【表6】
【0086】
表６に示すように、コロソリン酸（試料１）は優れたＺＯ－１発現促進作用を有することが確認された。
【0087】
〔試験例７〕ＺＯ－２発現促進作用試験
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてＺＯ－２発現促進作用を試験した。
コロソリン酸（試料１）について、以下のようにしてＺＯ－２発現促進作用を試験した。
【0088】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。ＫＧＭを用いて６ｗｅｌｌプレートに３０×１０4ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養後、ＫＧＭ中の増殖添加剤からＢＰＥおよびＥＧＦを抜いた培地（ＫＢＭ＋）に交換した。
【0089】
２４時間後に培養液を捨て、ＫＢＭ＋に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は表７を参照）を各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間処理した。処理後、再び２ｍＬのＫＢＭ＋に置換し、４時間培養した。培養後、ISOGEN II (NIPPON GENE社製)にて総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【0090】
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＺＯ－２および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Thermal Cycler Dice Real Time System III（タカラバイオ社製）を用いて、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製）およびTB Green Fast qPCR Mix（タカラバイオ社製）による２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応により行った。プライマーはタカラバイオ社製のものを使用した。各遺伝子ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量で補正し算出した。得られた値から、ＺＯ－２ ｍＲＮＡについて、被験試料添加による発現促進率を下記式により算出した。
【0091】
ＺＯ－２ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
ＺＯ－２ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表７に示す。
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
ＺＯ－２ ｍＲＮＡ発現促進率の結果を表７に示す。
【0092】
【表7】
【0093】
表７に示すように、コロソリン酸（試料１）は優れたＺＯ－２発現促進作用を有することが確認された。
【0094】
〔配合例１〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
コロソリン酸 ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性カンゾウエキス ０．１ｇ
１，３－ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
下記組成のクリームを常法により製造した。
コロソリン酸 ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性カンゾウエキス ０．１ｇ
１，３－ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【0095】
〔配合例２〕
下記組成に従い、乳液を常法により製造した。
コロソリン酸 ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．００ｇ
１，３－ブチレングリコール ３．００ｇ
アルブチン ３．００ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O.） ２．５０ｇ
オリーブオイル ２．００ｇ
スクワラン ２．００ｇ
セタノール ２．００ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．００ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） ２．００ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１０ｇ
黄杞エキス ０．１０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１０ｇ
イチョウ葉エキス ０．１０ｇ
コンキオリン ０．１０ｇ
オウバクエキス ０．１０ｇ
カミツレエキス ０．１０ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
下記組成に従い、乳液を常法により製造した。
コロソリン酸 ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．００ｇ
１，３－ブチレングリコール ３．００ｇ
アルブチン ３．００ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O.） ２．５０ｇ
オリーブオイル ２．００ｇ
スクワラン ２．００ｇ
セタノール ２．００ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．００ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） ２．００ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１０ｇ
黄杞エキス ０．１０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１０ｇ
イチョウ葉エキス ０．１０ｇ
コンキオリン ０．１０ｇ
オウバクエキス ０．１０ｇ
カミツレエキス ０．１０ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【0096】
〔配合例３〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
コロソリン酸 ０．１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３－ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
下記組成の美容液を常法により製造した。
コロソリン酸 ０．１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３－ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【0097】
〔配合例４〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
コロソリン酸 ５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム20％、マグネシウム10％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
コロソリン酸 ５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム20％、マグネシウム10％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ
【0098】
〔配合例５〕
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
コロソリン酸 ０．１質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
コロソリン酸 ０．１質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）
【産業上の利用可能性】
【0099】
本発明のバリア機能亢進剤は、上皮組織におけるバリア機能の亢進（炎症性腸疾患や食物アレルギー、消化管から感染する各種感染症などの予防、治療または改善；乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎などの皮膚症状や各種感染症などの予防、治療または改善など）に大きく貢献できる。
【図1】