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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022068978
(43)【公開日】2022-05-11
(54)【発明の名称】高コレステロール血症／動脈硬化症モデルミニブタ
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20220428BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220428BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20220428BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220428BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220428BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20220428BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220428BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027
C12Q1/02
C12N5/071
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/92 A
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020177849
(22)【出願日】2020-10-23
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 第１１１回日本養豚学会大会、令和１年１０月２４日、発表資料、開催通知、プログラム 第１１１回日本養豚学会大会講演要旨、表紙、目次、第６頁、裏付、令和１年１０月２４日 第４５回豚の繁殖衛生セミナー、令和１年１１月２６日、発表資料、講演論文集の表紙、目次、裏付 豚の繁殖衛生セミナー通信 Ｎｏ．４５／２０１９ 第４５回豚の繁殖衛生セミナー講演論文集、表紙、目次、第８－９頁、裏付 山梨大学医学部分子病理学講演会、令和２年２月３日、発表資料、開催通知 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｓｓｉｏｎｓ ２０１９ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、令和１年１１月１８日、発表資料（英文）、発表資料（和文翻訳）、プログラム、要旨 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１９；１４０：Ａ１６３１９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｈａｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１１６１／ｃｉｒｃ．１４０．ｓｕｐｐｌ＿１．１６３１９）、令和１年１１月１１日、和文翻訳 ＪＡＣＣ Ｍａｒｃｈ ２４，２０２０，Ｖｏｌｕｍｅ ７５，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐ．１４６、令和２年３月１６日、和文翻訳、ウェブサイト ８８ｔｈ ＥＡＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｅａｓ２０２０．ｃｏｍ／）、令和２年１０月５日、発表資料、発表資料（和文翻訳）、ウェブページ ８８ｔｈ ＥＡＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｅａｓ２０２０．ｃｏｍ／）、令和２年１０月４日、要旨、要旨（和文翻訳）、ウェブページ ８８ｔｈ ＥＡＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｅａｓ２０２０．ｃｏｍ／）、令和２年１０月７日、発表資料、発表資料（和文翻訳）、ウェブページ ８８ｔｈ ＥＡＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｅａｓ２０２０．ｃｏｍ／）、令和２年１０月４日、要旨、要旨（和文翻訳）、ウェブページ
(71)【出願人】
【識別番号】591267855
【氏名又は名称】埼玉県
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】中村 嘉之
(72)【発明者】
【氏名】瀧沢 慶太
(72)【発明者】
【氏名】淵本 大一郎
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 俊一
(72)【発明者】
【氏名】奥村 恭男
(72)【発明者】
【氏名】李 ヨキン
(72)【発明者】
【氏名】北野 大輔
(72)【発明者】
【氏名】右田 卓
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA29
2G045AA40
2G045CB01
2G045CB17
2G045DA69
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ09
4B063QQ70
4B063QQ76
4B063QS10
4B063QS11
4B065AA90X
4B065AB10
4B065AC20
4B065BA24
4B065CA05
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】
本発明の目的は、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として有用ながらも、小型であり、クローンミニブタと比べて安定して生産及び生育できる、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）であるミニブタを提供することにある。
【解決手段】
上記目的は、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり；複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、非クローンミニブタなどにより解決される。
【選択図】図３
本発明の目的は、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として有用ながらも、小型であり、クローンミニブタと比べて安定して生産及び生育できる、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）であるミニブタを提供することにある。
【解決手段】
上記目的は、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり；複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、非クローンミニブタなどにより解決される。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり；
複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び
２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、
非クローンミニブタ。
複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び
２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、
非クローンミニブタ。
【請求項2】
前記非クローンミニブタは、受胎率が８０％以上であり、分娩率が８０％以上であり、平均産子数が８頭以上であり、及び／又は平均離乳前へい死率が２０％以下である、請求項１に記載の非クローンミニブタ。
【請求項3】
前記非クローンミニブタは、平均乳頭高が１５ｍｍ以下であり、及び／又は平均乳頭径が１２ｍｍ以下である、請求項１～２のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
【請求項4】
前記非クローンミニブタは、高コレステロール血症及び動脈硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患のモデル動物として使用される、請求項１～３のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
【請求項5】
前記高コレステロール血症は、ＩＩｂ型遺伝性高脂血症である、請求項４に記載の非クローンミニブタ。
【請求項6】
前記非クローンミニブタは、脂肪含有量が２質量％～５質量％の飼料を２ヵ月摂取した場合において、静脈血漿中の総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄｌ以上であり、及び／又は静脈血漿中のＬＤＬコレステロール濃度が１４０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
【請求項7】
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタとＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る工程と、
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程と
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の非クローンミニブタの作製方法。
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程と
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の非クローンミニブタの作製方法。
【請求項8】
被験対象として請求項１～６のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ又は該非クローンミニブタに由来する細胞に、被験物質を投与して、該被験対象における、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のコレステロールの濃度又は動脈硬化の程度を測定する工程と、
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程と
を含む、高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程と
を含む、高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
【請求項9】
前記コントロールが、前記被験物質を投与する前の濃度及び程度、並びに前記被験対象を野生型のブタ及び野生型のブタに由来する細胞とした濃度及び程度からなる群から選ばれる少なくとも１種のコントロールである、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか１項に記載の非クローンミニブタに由来する、臓器又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子をノックアウトした高コレステロール血症及び動脈硬化症のモデルとなる非クローンミニブタ及びその作製方法、並びに該非クローンミニブタの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
生活習慣が欧米化したことに伴って、日本人の三大死因の１つとして心血管系の疾患が増加している。その中でも、狭心症、心筋梗塞といった虚血性心疾患患者が年々増加している。現在、虚血性心疾患患者の患者数は全国に約８０万人存在し、その医療費は７千億円を超える規模にまでになっている。虚血性心疾患は、高コレステロール血症が長期間続くことで引き起こされる動脈硬化症が進むことによって起こると報告されている。したがって、虚血性心疾患を治療するためには、高コレステロール血症及び動脈硬化症の予防法、診断法及び治療法に関する研究開発が求められている。そして、これらの研究開発には、高コレステロール血症及び動脈硬化症（以下、これらを合わせて「高コレステロール・動脈硬化症」ともよぶ。）を発症するモデル動物が利用されている。
【0003】
例えば、高コレステロール・動脈硬化症モデル動物として、血中コレステロール値の調節に作用する遺伝子である、ＬＤＬＲ遺伝子、アポリポ遺伝子（ＡｐｏＥ）、ニューロメジンＵ遺伝子（ＮＭＵ）などをノックアウトしたマウス；ＬＤＬＲ機能低下突然変異の遺伝子型を有する育種選抜によって得られたＷＨＨＬウサギなどが知られている。しかし、マウス及びウサギは、通常時のヒトの血中低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロール及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロールの組成と大きく異なり、脈管系が小さく、寿命の短い小動物であり、これらを用いた試験は、長期間の治療実験、外科的治療試験、治療器具の開発などへの利用が困難であるという問題がある。
【0004】
そこで、近年、解剖学的、生理学的及び生化学的な特徴がヒトと類似していることから、ブタが医療研究用に用いられるようになっている。例えば、特許文献１及び非特許文献１～２には、ブタの大型種であるランドレース種から作製した高コレステロール・動脈硬化症モデルクローンブタが記載されている。しかし、特許文献１及び非特許文献１～２に記載のクローンブタは、生後６ヵ月齢で１００ｋｇ以上になり、１２ヵ月齢で１５０ｋｇ以上となることから、通常の実験施設での飼養管理が困難であること、ヒト用の治療器具などをサイズが適していないために利用できないこと、これらの結果として長期間の経過観察が難しいために治療後の慢性期におこる副作用変化の観察ができないことといった問題がある。
【0005】
それに対して、体格の小さいミニブタを用いた、ノックアウトミニブタもまた知られている。血中コレステロール値の調節に作用する遺伝子のうち、ＬＤＬＲ遺伝子の欠損は、ヒトにおいて、家族性高コレステロール血症を引き起こし、冠動脈疾患のリスクを高め、遂には心筋梗塞をもたらし得る。このようなＬＤＬＲ遺伝子をノックアウトしたミニブタの例が、非特許文献３～６に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第６１７２６９９号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Yuxin Li.et al., J Am Heart Assoc., 5, 1-13 (2016)
【非特許文献2】Manabu Ogita et al., 2016 PLoS One., 11, e0163055 (2016)
【非特許文献3】Lei Huang et al. Oncotarget., 8, 37751-37760 (2017)
【非特許文献4】Bryan T. Davis et al., PLoS One., 9(4), e93457 (2014)
【非特許文献5】Chidozie Amuzie et al., Toxicol Pathol., 44(3), 442-449 (2016)
【非特許文献6】Amy C. Burke et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 38, 1178-1190 (2018)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
非特許文献３～６に記載のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトミニブタは、クローンミニブタ又はその後代である。一般的に、体細胞クローン動物及びその後代は、受胎率及び分娩率が低く、誕生前後又は離乳前のへい死率が高いことから、非特許文献３～６に記載のクローンミニブタは安定に生産及び生育できない蓋然性がある。また、仮に生産できたとしても、ミニブタは平均産子数が約５頭と少なく、へい死率の高さも相俟って、繁殖できるようになるまでに生育するクローンミニブタの数は１頭から数頭程度である可能性がある。
【0009】
そこで、本発明は、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として有用ながらも、小型であり、クローンミニブタと比べて安定して生産及び生育できる、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）であるミニブタを提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために、特許文献１に記載されている、食肉用として広く流通している品種のランドレース種（Ｌ）及び３元交雑豚であるＬＷＤ種（ランドレース種×大ヨークシャー種（Ｗ）×デュロック種（Ｄ））を用いて作製した、ＬＤＬＲ遺伝子をヘテロノックアウトした核移植体細胞クローンブタ（ＬＤＬＲ＋／－）と、家畜改良センターで開発されたミニブタ（ＬＤＬＲ＋／＋）であるサクラコユキとを交配して、小型化を目指した。
【0011】
しかし、クローンブタとミニブタとの体格差は３倍程度あり、自然交配できなかった。そこで、人工授精による交配をしようとしたところ、ミニブタから精液を採取するための手法が確立されておらず、困難を極めた。
【0012】
そこで、本発明者らは、試行錯誤を繰り返して、ミニブタの体格に適した小型擬牝台を作製し、調教後に擬牝台を用いた手圧法による精液採取法を確立して、クローンブタとミニブタとの人工授精による交配をして、子ブタ（Ｓ系統Ｆ１世代）を生産することに成功した。しかし、生産したＳ系統Ｆ１世代は、生後直死率が高く、離乳時までの育成率が低いなど、発育できない個体が頻発した。
【0013】
上記のような問題がありつつも、生産したＳ系統Ｆ１世代の中から遺伝子型をヘテロ（ＬＤＬＲ＋／－）にもつブタを選抜し、Ｓ系統Ｆ１世代どうしの交配により、体型及び遺伝子選抜を行い、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）である個体を得ることを試みた。その結果、Ｆ３世代において、遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）である個体を得ることに成功した。作出されたホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、体重が９ヵ月齢で５０ｋｇ程度と小型であり、ヒトと類似性の高い高コレステロール・動脈硬化症の病態を発現した。しかし、産子数が少なく、分娩後の生後直死が多く、生後３５日目の離乳率が非常に低く、さらに抗病性が低く育成ブタにおいても突然死及び皮膚病が多発していた。また、乳頭の肥大化により、子ブタが哺乳できなかった。このような問題が発生していたために、Ｓ系統Ｆ３世代のホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ群を維持管理することは困難を極めた。また、Ｓ系統全世代にわたって、生後３ヵ月齢～６ヵ月齢までの突然死、全身性の皮膚病の発症、高脂肪食給与直後の元気消失、食欲不振の多発、へい死などの問題を有し、目的とする実験の用に供することが不可能な個体が多く、ブタ群の維持及び継続的な供給には不適であった。この遠因としては、クローンブタは同一個体の組換え細胞から作出され、対するミニブタも１品種であったことから、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）である個体を得るために、クローンブタとミニブタとの間に産まれたブタどうしを交配することにより、近親交配が早期に進み、繁殖性の低下及び抗病性の低下に繋がった可能性がある。
【0014】
そこで、本発明者らは、さらなる研究開発に励み、鋭意検討した結果、Ｓ系統Ｆ３世代のホモ（ＬＤＬＲ－／－）ブタと、英国系バークシャー種とを交配するという考えに至った。バークシャー種のブタは、ランドレース種、大ヨークシャー種といった大型種のブタとミニブタとの中間の大きさである。また、バークシャー種は、系統樹からランドレース種、大ヨークシャー種、ミニブタとは血縁関係が遠く、それでいて系統内における血縁が高度に保持されており、継続的に血縁更新に利用することで長期的な維持及び供給が可能である。さらに、別の品種を交配させることで、雑種強勢効果（ヘテローシス効果）が働き、得られる後代ミニブタに対して強健性及び産子数の増大を付与することなどが期待できる。
【0015】
上記考えのもと、大型種とミニブタとの交配で作出したＳ系統Ｆ３世代ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ブタとバークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋）とを交配したところ、得られたＳＢ系統Ｆ１世代は体型が大きくなり、ばらつき、遺伝子型がヘテロとなったことから、体形によりＳＢ系統Ｆ１世代を選抜して、ＳＢ系統Ｆ１世代ブタどうし、又はＳＢ系統Ｆ１世代ブタとミニブタとを交配することで、ＳＢ系統Ｆ２世代を得た。
【0016】
ＳＢ系統Ｆ２世代の中にはホモ型（ＬＤＬＲ－／－）もいたが、さらに遺伝子型及び体形によりＳＢ系統Ｆ２世代を選抜して、ＳＢ系統Ｆ２世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）どうし、又はホモ型とヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）とを交配してＳＢ系統Ｆ３世代を得た。
【0017】
さらに遺伝子型及び体形をもとに、小型のＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）どうしを交配することにより、全てホモ型であるＳＢ系統Ｆ４世代ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ブタを得ることに成功した。
【0018】
驚くべきことに、得られたＳＢ系統Ｆ４世代ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ブタは、小型であり、産子数が多く、出生直後の生存率及び離乳率が高く、強健性に優れていることから、安定して生産及び生育でき、さらに高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として優れたものであった。また、上記のとおり、ＳＢ系統Ｆ１世代～Ｆ４世代を得るにあたり、核移植などの体細胞クローン技術は用いておらず、得られたＳＢ系統Ｆ４世代ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ブタは、非クローンミニブタである。
【0019】
上記のような知見及び成功例を基に、本発明者らは遂に、本発明の課題を解決し得るものとして、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として利用可能な非クローンミニブタ、非クローンミニブタの作製方法及び非クローンミニブタの利用方法などを創作することに成功した。本発明は、本発明者らによって初めて見出された知見及び成功例に基づいて完成されたものである。
【0020】
したがって、本発明によれば、以下の各態様の非クローンミニブタ、非クローンミニブタの作製方法、候補物質のスクリーニング方法、並びに臓器及び細胞が提供される。
［１］ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり；
複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び
２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、
非クローンミニブタ。
［２］前記非クローンミニブタは、受胎率が８０％以上であり、分娩率が８０％以上であり、平均産子数が８頭以上であり、及び／又は平均離乳前へい死率が２０％以下である、［１］に記載の非クローンミニブタ。
［３］前記非クローンミニブタは、平均乳頭高が１５ｍｍ以下であり、及び／又は平均乳頭径が１２ｍｍ以下である、［１］～［２］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［４］前記非クローンミニブタは、高コレステロール血症及び動脈硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患のモデル動物として使用される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［５］前記高コレステロール血症は、ＩＩｂ型遺伝性高脂血症である、［４］に記載の非クローンミニブタ。
［６］前記非クローンミニブタは、脂肪含有量が２質量％～５質量％の飼料を２ヵ月摂取した場合において、静脈血漿中の総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄｌ以上であり、及び／又は静脈血漿中のＬＤＬコレステロール濃度が１４０ｍｇ／ｄｌ以上である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［７］ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタとＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る工程と、
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程と
を含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタの作製方法。
［８］被験対象として［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ又は該非クローンミニブタに由来する細胞に、被験物質を投与して、該被験対象における、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のコレステロールの濃度又は動脈硬化の程度を測定する工程と、
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程と
を含む、高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
［９］前記コントロールが、前記被験物質を投与する前の濃度及び程度、並びに前記被験対象を野生型のブタ及び野生型のブタに由来する細胞とした濃度及び程度からなる群から選ばれる少なくとも１種のコントロールである、［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタに由来する、臓器又は細胞。
［１］ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり；
複数の品種のブタに由来し、かつ、該品種の１種が野生型のバークシャー種であり；及び
２７０日齢の平均体重が雄である場合は６５ｋｇ以下であり、かつ雌である場合は８０ｋｇ以下である、
非クローンミニブタ。
［２］前記非クローンミニブタは、受胎率が８０％以上であり、分娩率が８０％以上であり、平均産子数が８頭以上であり、及び／又は平均離乳前へい死率が２０％以下である、［１］に記載の非クローンミニブタ。
［３］前記非クローンミニブタは、平均乳頭高が１５ｍｍ以下であり、及び／又は平均乳頭径が１２ｍｍ以下である、［１］～［２］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［４］前記非クローンミニブタは、高コレステロール血症及び動脈硬化症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患のモデル動物として使用される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［５］前記高コレステロール血症は、ＩＩｂ型遺伝性高脂血症である、［４］に記載の非クローンミニブタ。
［６］前記非クローンミニブタは、脂肪含有量が２質量％～５質量％の飼料を２ヵ月摂取した場合において、静脈血漿中の総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄｌ以上であり、及び／又は静脈血漿中のＬＤＬコレステロール濃度が１４０ｍｇ／ｄｌ以上である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ。
［７］ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタとＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る工程と、
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程と
を含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタの作製方法。
［８］被験対象として［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタ又は該非クローンミニブタに由来する細胞に、被験物質を投与して、該被験対象における、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のコレステロールの濃度又は動脈硬化の程度を測定する工程と、
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程と
を含む、高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
［９］前記コントロールが、前記被験物質を投与する前の濃度及び程度、並びに前記被験対象を野生型のブタ及び野生型のブタに由来する細胞とした濃度及び程度からなる群から選ばれる少なくとも１種のコントロールである、［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］［１］～［６］のいずれか１項に記載の非クローンミニブタに由来する、臓器又は細胞。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として有用ながらも、小型である、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（ＬＤＬＲ－／－）である非クローンミニブタを提供することができる。本発明の一態様の非クローンミニブタは、小型でありながらも受胎率及び分娩率が高く、ミニブタと比べて平均産子数が多く、乳頭のサイズが小さいことから子ブタの哺乳が容易であり、安定して生産及び生育することができる。また、本発明の一態様の非クローンミニブタは、比較的強健であることから、長期の薬物投与試験などに利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明の一態様である非クローンミニブタ、非クローンミニブタの作製方法及び候補物質のスクリーニング方法について詳細に説明するが、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【0024】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。
【0025】
「野生型」のブタは、遺伝子工学的に遺伝子操作されていないブタを意味する。なお、「野生型」のブタのＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型は、ワイルド（＋／＋）である。野生型のブタと体格、生育能力、生殖能力などの表現型が変わらなければ、ＬＤＬＲ遺伝子座以外の遺伝子座を遺伝子工学的又はゲノム編集技術で遺伝子操作されたブタを野生型のブタとして使用してもよい。
「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。
「及び／又は」は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。
【0026】
［１．非クローンミニブタ］
本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり、バークシャー種を含む複数の品種に由来する、サイズが小さなミニブタである。
本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり、バークシャー種を含む複数の品種に由来する、サイズが小さなミニブタである。
【0027】
本発明の一態様の非クローンミニブタの具体的態様は、後述する実施例に記載のＳＢ系統ミニブタである。このＳＢ系統ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタの概要について、以下に説明する。
【0028】
本発明者らが作成した、後述する実施例に記載のＳＢ系統ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、特許文献１に記載の高脂血症モデルブタを応用して作出された、高コレステロール・動脈硬化症のモデルミニブタである。特許文献１に記載の高脂血症モデルブタは、生後６ヵ月齢で体重１００ｋｇ以上となり、さらに９ヵ月齢では１５０ｋｇ以上になるため、実験での長期間の取り扱いが難しくなる。そこで、特許文献１に記載の高脂血症モデルブタと家畜改良センターで開発されたミニブタ（サクラコユキ）とを交配することで小型化を試みて、高脂血症モデルミニブタ系統Ｓを作出した。しかし、Ｓ系統ミニブタは、小型化を達成したものの、作出過程における体格の不一致、作出されたブタの近交退化に伴う繁殖性の低下、育成率の低下、通常ブタに比べて強健性が劣るなどの問題から、効率的な生産及び維持管理が難しく、実験動物として不向きであった。そこで、Ｓ系統ミニブタを、中型種である英国系バークシャー種と交配して、遺伝子選抜及び体形選抜を繰り返すことにより、遺伝子のホモ化と、６ヵ月齢で体重５０ｋｇ以下、９ヵ月齢で８０ｋｇ以下の高コレステロール・動脈硬化症モデルホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ系統ＳＢを作出することに成功した。
【0029】
ＳＢ系統ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、遺伝子のホモ化、体形の小型化、繁殖性の向上、育成率の向上及び通常ブタに比べても劣らない強健性という特徴を有する。さらに、ＳＢ系統ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、通常食においても、高コレステロール血症の症状を呈し、血漿中コレステロールの組成（超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ：ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＬＤＬ及びＨＤＬの各コレステロール）において、ヒト家族性高脂血症を十分に再現した。また、ヒトと類似した冠動脈に不安定粥腫などの動脈硬化病変を呈し、その治療法及び治療後の慢性期の副作用もヒトと同様の経過を示した。したがって、ＳＢ系統ホモ（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、特許文献１に記載の高脂血症モデルブタよりさらにヒトの高コレステロール・動脈硬化症の診断、治療薬、予防薬、治療後の慢性期の副作用及びその発生機序の解明などのスクリーニングに優れたモデル動物である。
【0030】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、クローンミニブタではないことに特徴を有する。すなわち、本発明の一態様の非クローンミニブタは、核移植による体細胞クローン技術によって作出されたクローンミニブタそのものではない。本発明の一態様の非クローンミニブタは、由来する品種の一種が、体細胞クローン化技術によって作出されていない、野生型のバークシャー種であり、それをもって非クローンミニブタであり得る。
【0031】
本発明の一態様の非クローンミニブタの由来品種は、野生型バークシャー種が含まれていれば特に限定されないが、継代的に小型化を維持するために、サクラコユキなどのミニブタをさらに含むことが好ましく、継代的に頑健性を維持するために、ランドレース種、大ヨークシャー種及びデュロック種をさらに含むことがより好ましい。なお、野生型バークシャー種などの品種は、交雑種の中に含まれる一品種であってもよい。後述する実施例に記載のＳＢ系統は、由来品種がランドレース種、大ヨークシャー種、デュロック種、サクラコユキ及びバークシャー種である。また、後述する実施例に記載のＳ系統は、由来品種がランドレース種、大ヨークシャー種、デュロック種及びサクラコユキである。
【0032】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、食肉用途で畜産されるランドレース種のブタ及び交配に用いる野生型バークシャー種のブタよりも身体が小さく、体重も小さい。本発明の一態様の非クローンミニブタは、雄である場合は、２７０日齢の平均体重が６５ｋｇ以下であり、身体が小さいほど飼育及び各種試験に用いることが容易であるという観点から、好ましくは６０ｋｇ以下であり、より好ましくは５０ｋｇ以下である。また、本発明の一態様の非クローンミニブタは、雌である場合は、２７０日齢の平均体重が８０ｋｇ以下であり、身体が小さいほど飼育及び各種試験に用いることが容易であるという観点から、好ましくは７８ｋｇ以下であり、より好ましくは７０ｋｇ以下である。
【0033】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、各種試験の用に供される日齢の体重に加えて、分娩及び飼養の容易性の観点から、生時及び離乳時（３５日齢）の体重が小さいことが好ましい。本発明の一態様の非クローンミニブタは、平均生時体重が１ｋｇ未満であることが好ましく、０．７ｋｇ以下であることがより好ましく、０．６ｋｇ以下であることがさらに好ましい。また、本発明の一態様の非クローンミニブタは、平均離乳時体重が７．５ｋｇ以下であることが好ましく、６．０ｋｇ以下であることがより好ましく、５．５ｋｇ以下であることがさらに好ましい。
【0034】
本発明者らが調べたところ、ランドレース種ブタ及び３元交雑ブタ（ランドレース種×大ヨークシャー種×デュロック種）を用いて作製したクローンブタ及びその後代のブタ（以下、これらをまとめて「クローンブタ」ともいう。）、並びにこれらとミニブタであるサクラコユキとを人工授精により交配して生産した第１の非クローンミニブタ及びその後代のブタ（以下、これらをまとめて「第１のクローンミニブタ」ともいう。）は、受胎率及び分娩率が低く、平均産子数も少なかった。しかし、第１の非クローンミニブタとバークシャー種ブタとを人工授精により交配して第２の非クローンミニブタを生産し、さらに第２の非クローンミニブタどうし、又は第２の非クローンミニブタとミニブタであるサクラコユキとを人工授精し、さらにその後代のブタどうしを人工授精することを続けることにより、受胎率及び分娩率が高く、平均産子数の多い、第２の非クローンミニブタの後代のブタが得られた。
【0035】
上記の知見を鑑みれば、本発明の一態様の非クローンミニブタは、由来する品種に野生型バークシャー種が含まれることによって、クローンブタ及び第１のクローンミニブタよりも、受胎率が高く、分娩率が高く、及び平均産子数が多いことが好ましい。そこで、本発明の一態様の非クローンミニブタは、受胎率が好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり；分娩率が好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり；及び／又は平均産子数が好ましくは８頭以上であり、より好ましくは９頭以上であり、さらに好ましくは９．５頭以上である。
【0036】
後述する実施例に記載があるとおり、第１の非クローンミニブタに相当するＳ系統Ｆ１世代～Ｆ３世代のミニブタは、離乳時前のへい死率が４０％以上と高かった。それに対して、第２の非クローンミニブタの後代のブタに相当するＳＢ系統Ｆ１世代～Ｆ４世代のミニブタは、離乳時前のへい死率が４０％未満であった。かかる事情を勘案すれば、本発明の一態様の非クローンミニブタは、離乳時前のへい死率が４０％未満であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましく、２０％以下であることがさらに好ましい。
【0037】
後述する実施例に記載があるとおり、Ｓ系統Ｆ３世代のミニブタは乳頭の肥大化が認められたが、ＳＢ系統Ｆ３世代のミニブタには認められなかった。そこで、本発明の一態様の非クローンミニブタは、平均乳頭高が第１の非クローンミニブタよりも小さいことが好ましく、１５ｍｍ以下であることがより好ましく；平均乳頭径が第１の非クローンミニブタよりも小さいことが好ましく、１２ｍｍ以下であることがより好ましい。
【0038】
本発明の一態様の非クローンミニブタについて、２７０日齢の平均体重、受胎率、分娩率、平均産子数、平均離乳前へい死率、平均乳頭高及び平均乳頭径は、後述する実施例に記載の方法によって測定すればよい。
【0039】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である。理論的には、生体個体におけるＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である場合、正常に機能するＬＤＬＲ遺伝子発現産物が得られず、ＬＤＬＲ遺伝子の発現の欠損に伴う症状又は異常が個体において表出する。そこで、本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である場合に表出する症状又は異常のモデル動物として使用されることが好ましく、高コレステロール血症、動脈硬化症又はその両方の疾患のモデル動物として使用されることがより好ましい。
【0040】
本明細書における「高コレステロール血症」は、医学界において通常用いられている疾患を意味する。例えば、高コレステロール血症は、血液中のコレステロール値が異常な値になることを意味し、具体的には空腹時に採血した際の血漿中の総コレステロールの濃度が２２０ｍｇ／ｄｌ以上になることを意味する。本明細書において、高コレステロール血症は、脂質異常症及び高脂血症と本質的に同一乃至包含し、これらを区別しない。すなわち、本発明の一態様の非クローンミニブタは、脂質異常症及び高脂血症のモデル動物として使用してもよい。
【0041】
ヒト高脂血症は血中の脂質成分量からＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ型に分類することができる。このうち、ＩＩｂ型は、ＶＬＤＬコレステロール濃度及びＬＤＬコレステロール濃度が健常者よりも高く、ＨＤＬコレステロール濃度が健常者と同程度の高脂血症である。本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（ＬＤＬＲ＋／＋）であるブタ（コントロール）と比べて、ＶＬＤＬコレステロール濃度及びＬＤＬコレステロール濃度が高く、ＨＤＬコレステロール濃度が同程度である傾向にあり、ＩＩｂ遺伝性高脂血症と同様の血中脂肪成分組成を示し得る。そこで、本発明の一態様の非クローンミニブタは、ＩＩｂ型遺伝性高脂血症のモデル動物として利用されることが好ましい。
【0042】
本明細書における「動脈硬化症」は、医学界において通常用いられている疾患を意味する。例えば、動脈硬化症は、動脈内に粥種が形成される疾患であることを意味する。
【0043】
ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度は、血漿、血清などの血液由来サンプルのコレステロール区分におけるＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ濃度として測定することができる。同様に、ＨＤＬトリグリセライド、ＬＤＬトリグリセライド及びＶＬＤＬトリグリセライドの濃度は、血漿、血清などの血液由来サンプルのトリグリセライド（中性脂肪）区分におけるＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ濃度として測定することができる。
【0044】
例えば、ＶＬＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールを定量する方法としては、例えば、血清サンプルをまず各コレステロールに分画し、それぞれの画分について「デタミナーＬ ＴＣＩＩ」、「デタミナーＴＣ－５５５」（協和メデックス社製）、「アクアオートカイノスＴ－ＣＨＯ試薬」（カイノス社製）などの酵素法用キットを使用して酵素法による定量を行う方法を挙げることができる。また、各コレステロールの分画方法としては、血清中のリポタンパク質を分析可能なゲル濾過カラム、例えば、「ＴＳＫｇｅｌ ＬｉｐｏｐｒｏｐａｋＸＬ、ＴＳＫｇｅｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ」（東ソー社製）などを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により解析する方法を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0045】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、血中の総コレステロール、総中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールなどの血中脂質成分濃度については、年齢、飼育環境、餌の種類などにより変化することから特に限定されないが、例えば、高コレステロール血症及び／又は動脈硬化症のモデル実験動物として使用されるためには、脂肪含有量が２質量％～５質量％の飼料を２ヵ月摂取した場合において、静脈血漿中の総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄｌ以上であることが好ましく、３００ｍｇ／ｄｌ以上であることがより好ましく；静脈血漿中のＬＤＬコレステロール濃度が１４０ｍｇ／ｄｌ以上であることが好ましく、２００ｍｇ／ｄｌ以上であることがより好ましい。
【0046】
本明細書では、脂肪含有量が２質量％～５質量％の飼料を通常食ともよぶ。通常食は、後述する実施例に記載の市販品を挙げることができる。通常食に対して、脂肪含有量が大きい飼料を高脂肪食ともよぶ。高脂肪食は、通常食に、ラード、高脂肪食油、油脂などの脂肪含有物を混入して作製することができる。高脂肪食における脂肪含有量は１０質量％～５０質量％に設定すればよい。なお、一般的に、通常食を与えられた野生型のブタ（ＬＤＬＲ＋／＋）は、血中の総コレステロール値が５０ｍｇ／ｄｌ～１００ｍｇ／ｄｌであるのに対し、高脂肪食を与えられた野生型のブタ（ＬＤＬＲ＋／＋）は血中の総コレステロール値が５００ｍｇ／ｄｌ～８００ｍｇ／ｄｌになり、高脂血症を発症する。
【0047】
［２．非クローンミニブタの作製方法］
本発明の一態様の非クローンミニブタを作製する方法は、少なくとも野生型バークシャー種を用い、得られる非クローンミニブタのＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり、２７０日齢の平均体重が所定の体重になる方法であれば、特に限定されない。
本発明の一態様の非クローンミニブタを作製する方法は、少なくとも野生型バークシャー種を用い、得られる非クローンミニブタのＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であり、２７０日齢の平均体重が所定の体重になる方法であれば、特に限定されない。
【0048】
理論的には、遺伝子工学及び核移植による体細胞クローン技術を駆使すれば、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であるミニブタを作製することができる。しかし、ミニブタが近縁交配によって産み出されたものであることなどの理由により、クローンミニブタは、繁殖能力及び頑健性が極端に劣り、出産及び生育することが極めて困難であり、後代のミニブタを作製することに至ってはほとんど不可能である。
【0049】
上記事情を鑑みれば、本発明の一態様の非クローンミニブタを得るためには、クローンミニブタを利用しないことが好ましい。そのためには、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であるブタと野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタが得られる。しかし、このようにして得られた第１のミニブタは、やはり繁殖能力及び頑健性が劣り、高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として長期間の試験の用に供することが困難である。また、第１のミニブタは、乳頭が肥大化するなどの体型的な異常が認められ、発育が困難である。
【0050】
ところが、第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である上に、第１のミニブタとサイズが同程度でありつつも、繁殖能力及び頑健性が優れており、産子数が多く、乳頭の肥大化が認められないミニブタが得られる。
【0051】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、上記知見に基づいて作製されることが好ましい。すなわち、本発明の別の一態様として、本発明の一態様の非クローンミニブタの作製方法は、以下の工程を含む：
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタとＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る工程；及び
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程。
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタとＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る工程；及び
前記第１のミニブタとバークシャー種ブタとを、人工授精により交配し、さらに得られたブタを用いて継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得る工程。
【0052】
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタは特に限定されないが、例えば、特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ２世代のＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（ＬＤＬＲ＋／－）又はホモ（－／－）であるブタなどが挙げられ、このうち比較的頑健性があることからヘテロ（ＬＤＬＲ＋／－）のブタが好ましい。
【0053】
特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ２世代のＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）であるブタは、特許文献１に記載の核移植による体細胞クローン技術を利用した方法によって得ることができる。例えば、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ＬＤＬＲ遺伝子の一部若しくは全部を改変又は欠失させたゲノムＤＮＡを有するブタ体細胞核を注入し、得られた核移植卵を親雌ブタの子宮に着床し、妊娠及び分娩をすることで、体細胞核移植クローンブタとして作製することができる。なお、特許文献１にも記載しているとおり、ブタのＬＤＬＲ遺伝子としては、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等のデータベースにおいてＧｅｎｅ ＩＤ：３９６８０１として登録されており、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＣ＿０１０４４４．３、バージョンＧＩ：３４７６１８７９２としてＤＮＡ配列を取得することが可能である。
【0054】
ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタとしては、例えば、独立行政法人家畜改良センターから購入可能なミニブタであるサクラコユキなどが挙げられるが、これに限定されない。
【0055】
ランドレース種を含む品種に由来するブタは大型であり、野生型のミニブタは小型であることから、分娩の容易性を考慮して、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がヘテロ（＋／－）又はホモ（－／－）であり、かつランドレース種を含む品種に由来するブタを種雌ブタとし、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がワイルド（＋／＋）である野生型のミニブタを種雄ブタとすることが好ましい。
【0056】
種雌ブタと種雄ブタとを人工授精により交配する方法は特に限定されず、通常のブタの人工授精による交配を採用することができる。ただし、種雄ブタとする小型のミニブタから精液を採取することは困難であることから、後述する実施例に記載の小型擬牝台を用いて精液を採取することが好ましい。
【0057】
複数の種雌ブタと複数の種雄ブタとを人工授精により交配して得られたブタ（Ｆ１世代）どうしをかけ合わせることによりＦ２世代のブタを得る。また、Ｆ２世代のブタどうし、又はＦ２世代のブタとＦ１世代のブタとをかけ合わせることによりＦ３世代のブタを得る。このようにして継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタを得る。継代に使用するミニブタは、比較的サイズの小さいブタを選ぶことが好ましい。ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である第１のミニブタは、Ｆ３世代のミニブタであることが好ましい。
【0058】
第１のミニブタは、野生型のバークシャー種ブタと人工授精により交配する。野生型のバークシャー種ブタを得る方法は特に限定されないが、例えば、埼玉県農業技術研究センターから入手が可能である。野生型のバークシャー種ブタは、サイズとしては、ランドレース種などの大型種とミニブタとの中間のサイズを有する。第１のミニブタ及び野生型のバークシャー種ブタの雌雄は特に限定されないが、小型擬牝台を用いて精液を採取することができることから、第１のミニブタを種雄ミニブタとし、バークシャー種ブタを種雌ブタとすることが好ましい。
【0059】
複数の種雌ブタと複数の種雄ミニブタとを人工授精により交配して得られたミニブタ（Ｆ１世代）どうし、又はＦ１世代のミニブタと野生型のミニブタとをかけ合わせてＦ２世代のミニブタを得て、次いでＦ２世代のミニブタどうしをかけ合わせてＦ３世代のミニブタを得て、次いでＦ３世代のミニブタどうしをかけ合わせることによりＦ４世代のミニブタを得る。このようにして継代することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタを得ることができる。継代に使用するミニブタは、サイズが比較的小さいミニブタを選ぶことが好ましい。例えば、Ｆ４世代のミニブタを得るためのＦ３世代のミニブタとして、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であるミニブタを用いた場合、Ｆ４世代のミニブタは全てＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）である非クローンミニブタとなる。
【0060】
このようにして得られる非クローンミニブタは、中型のバークシャー種に由来するにもかかわらず、サイズの小さいミニブタである。さらに、非クローンミニブタは、第１のミニブタ又は野生型のミニブタと比べると、受胎率及び分娩率は高く、平均産子数が多く、及び平均離乳前へい死率が低くなる傾向にある。また、非クローンミニブタにおいて、原則として、第１のミニブタでみられるような乳頭の肥大化は見られない。それでいて、非クローンミニブタは、ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であることにより、特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ２世代のＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型がホモ（－／－）であるブタと同様に、通常食を用いて飼養したとしても、高コレステロール・動脈硬化症の症状を発出し、該疾患のモデル動物として利用することができる。
【0061】
［３．非クローンミニブタの使用方法］
本発明の一態様の非クローンミニブタの使用方法は特に限定されず、例えば、高コレステロール血症及び動脈硬化症、並びにこれらの疾患により引き起こされる心筋梗塞、脳梗塞などの二次的な疾患のモデル動物として使用することが好ましい。具体的には、本発明の一態様の非クローンミニブタは、通常食による飼養下における高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として、高コレステロール血症、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞などの疾患（以下、これらを総称して「高コレステロール・動脈硬化症等疾患」ともよぶ。）の判定、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療技術及び器具の開発、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療技術の習得に使用する練習台などとして使用することができる。
本発明の一態様の非クローンミニブタの使用方法は特に限定されず、例えば、高コレステロール血症及び動脈硬化症、並びにこれらの疾患により引き起こされる心筋梗塞、脳梗塞などの二次的な疾患のモデル動物として使用することが好ましい。具体的には、本発明の一態様の非クローンミニブタは、通常食による飼養下における高コレステロール・動脈硬化症のモデル動物として、高コレステロール血症、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞などの疾患（以下、これらを総称して「高コレステロール・動脈硬化症等疾患」ともよぶ。）の判定、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療技術及び器具の開発、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療技術の習得に使用する練習台などとして使用することができる。
【0062】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、普通食による飼養下においても高コレステロール血症及び動脈硬化症を発症する傾向にあるが、これらの疾患の症状を強めること、又は心筋梗塞、脳梗塞などの二次的な疾患を誘発するために、高脂肪食を与えること、飼養を維持して加齢させるようにして使用することができる。
【0063】
高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療技術としては、例えば、ステント留置術、バイパス手術、カテーテル手術、頸動脈内膜切除術（ＣＥＡ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療器具としては、例えば、ステント、カテーテルなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0064】
非クローンミニブタの個体、並びにその血液、血管及び組織を用いて、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の有無の判定の練習を行うことができる。例えば、非クローンミニブタについて、心拍数、脈拍数、血圧などの測定結果；血糖値、赤血球値、白血球値、血中ＬＤＬコレステロール値、血中ＨＤＬコレステロール値、及び血中ＶＬＤＬコレステロール値などの血液検査結果；超音波検査法（エコー）、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）などの検査結果などから、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の有無を判定する練習を行うことができる。
【0065】
非クローンミニブタから採取された、血液などの体液、血管、心臓などの組織については、血液検査、解剖、組織化学染色などを行い、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の判定の練習を行うことができる。例えば、動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞などの疾患を発症した非クローンミニブタは、ブタ個体、並びに粥種が形成した血管及び該血管を有する組織、心筋梗塞を起こした心臓などを用いて、ヒトにおいてこれらの疾患の判定を行う練習に利用することができる。
【0066】
また、本発明の一態様の非クローンミニブタは、薬効評価動物として使用することができる。普通食又は高脂肪食を与えられた非クローンミニブタに、高コレステロール・動脈硬化症等疾患の治療薬候補薬剤を投与し、血中コレステロール値、症状又は異常の改善、又はそれらが悪化しないことを指標として、治療薬候補薬剤の薬効及び副作用を調べることができる。
【0067】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、通常食で飼養しても、野生型のブタと比べて、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度が高く、ＨＤＬコレステロールの濃度が同程度である傾向にあり、高コレステロール・動脈硬化症を示し得る。そして、このような本発明の一態様の非クローンミニブタの性質を利用して、該非クローンミニブタに由来する臓器又は細胞を高コレステロール・動脈硬化症を予防及び治療するための候補物質のスクリーニングなどに利用できる。本発明の別の一態様は、本発明の一態様の非クローンミニブタに由来する臓器及び細胞である。
【0068】
本発明の一態様の臓器及び細胞としては、本発明の一態様の非クローンミニブタに由来する生体試料であればよく、頭部、頸部、胸部、腹部、脚などにおける生体組織、例えば、臓器、骨、体液、細胞などを挙げることができ、かかる細胞としては上皮細胞や肝細胞、線維芽細胞、腎臓細胞などの体細胞、神経細胞、免疫細胞、ＥＳ細胞、原始生殖細胞、精子、卵子などを挙げることができ、これらの細胞の初代培養細胞及びこれらの細胞に由来する細胞株、すなわちこれらの細胞から増殖した細胞を含む。
【0069】
本発明の別の一態様は、本発明の一態様の非クローンミニブタ及び細胞を利用した高コレステロール・動脈硬化症の予防及び治療のための候補物質のスクリーニング方法である。本発明の一態様のスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
被験対象として本発明の一態様の非クローンミニブタ又は該非クローンミニブタに由来する細胞に、被験物質を投与して、該被験対象における、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のコレステロールの濃度又は動脈硬化の程度を測定する工程；及び
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、前記被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程。
被験対象として本発明の一態様の非クローンミニブタ又は該非クローンミニブタに由来する細胞に、被験物質を投与して、該被験対象における、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のコレステロールの濃度又は動脈硬化の程度を測定する工程；及び
前記コレステロールの濃度又は動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、前記被験物質を高コレステロール血症又は動脈硬化症の予防又は治療のための候補物質としてスクリーニングする工程。
【0070】
本発明の一態様のスクリーニング方法では、コントロールは、被験物質を投与する前の濃度及び程度、並びに被験対象として非クローンミニブタ及び該非クローンミニブタに由来する細胞に代えて野生型のブタ及び野生型のブタに由来する細胞として得られた濃度及び程度からなる群から選ばれる少なくとも１種のコントロールであることが好ましい。
【0071】
被験物質は特に限定されないが、例えば、化学物質、タンパク質、ペプチド、ステロイドなどを挙げることができ、これらは新規なものでも公知のものでもよく、さらに合成、抽出などの方法により製造したものでも市販品でもよい。被験対象に被験物質を投与する方法は特に限定されず、例えば、被験対象がブタである場合は経口、注射、点滴、塗布などの方法を挙げることができ；被験対象が細胞である場合は、細胞培養液への添加、トランスフェクション試薬及びエレクトロポレーション法を用いた細胞内への投与などの方法を挙げることができる。
【0072】
被験物質の投与期間、投与回数及び投与量は、被験対象の大きさ、年齢、性別、症状などによって適宜選択することができ、特に限定されない。被験対象のブタの飼育環境及び年齢、並びに被験対象の細胞の培養方法などの条件は、所望の試験系に合わせて適宜設定すればよい。例えば、被験対象のブタに、高脂肪食を給餌してもよいが、過度の総コレステロール濃度の上昇を抑えるために、通常食を給餌することが好ましい。
【0073】
被験対象におけるコレステロールの濃度及び動脈硬化の程度を測定する方法は、本明細書の他の項目を参照して実施すればよい。例えば、血漿中コレステロール区分におけるＬＤＬコレステロール又はＶＬＤＬコレステロールの濃度、動脈硬化症の有無を測定することなどを挙げることができる。また、これらの測定と合わせて、血漿中の総コレステロール濃度及びコレステロール区分におけるＨＤＬコレステロールなどの濃度、総中性脂肪濃度、中性脂肪区分におけるＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬの濃度などを測定してもよく、他の検査項目、例えば、血糖値、赤血球量、白血球量などを測定して、候補物質のスクリーニングの判断指標の一つとしてもよい。
【0074】
また、動脈硬化の程度は、超音波検査法（エコー）、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）などによって測定してもよく、被験対象から血管組織サンプルなどを採取して組織化学的に測定してもよい。
【0075】
被験対象が細胞である場合には、その増殖速度及び代謝速度、細胞内のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度などを生化学的及び細胞生物学的に一般的な手法により測定することができる。
【0076】
本発明の一態様のスクリーニング方法では、コレステロールの濃度及び動脈硬化の程度が、コントロールと比べて、同程度又は低いことを指標に、被験物質の高コレステロール・動脈硬化症の予防可能性及び治療可能性を判断する。すなわち、非クローンミニブタ及び細胞において、比較的高いＬＤＬコレステロール濃度及び／又はＶＬＤＬコレステロール濃度が維持又は低下された場合、又は非クローンミニブタにおいて認められた動脈硬化が維持又は改善された場合、候補物質は、高コレステロール・動脈硬化症の予防剤又は治療剤として有用であるといえる。コントロールとの比較の際に、被験対象の健康状態及び他の検査項目の結果などを考慮してもよい。
【0077】
また、本発明の別の様態として、本発明の一態様の非クローンミニブタに由来する臓器、組織及び細胞を、適宜目的に応じたスクリーニングに利用する方法が挙げられる。これら細胞等は、ＬＤＬＲ遺伝子の発現が欠失していることから、ＬＤＬＲ遺伝子に着目したスクリーニング、ＬＤＬＲ及びこれに関連する細胞機能の解析などの医学的及び生物学的研究などにおいて有用である。例えば、本発明の一態様の細胞を用いて、解析対象のシグナル因子の変動を指標としてスクリーニングを行うことができ、具体的には、被験対象として本発明の一態様の細胞に、被験物質を投与して、被験対象におけるシグナル因子の変化を調べ、次いでシグナル因子の変化がコントロールと異なる被験物質を候補物質としてスクリーニングすることを含む方法などが挙げられる。ＬＤＬＲ及びリポタンパク質代謝の関与する生命現象に関わる因子、シグナル因子の制御物質をスクリーニングにより同定することができる。
【0078】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、傾向として、ヒト高コレステロール・動脈硬化症の病態を十分に再現し、長期間の実験においても通常のブタと異なり取り扱いが容易なミニブタであることから、高コレステロール・動脈硬化症の診断、治療及び予防のための医薬のスクリーニング、治療後の慢性期の副作用及びその発生機序の解明などに広く利用することが期待される。
【0079】
また、本発明者らによるこれまでの知見より、本発明の一態様の非クローンミニブタについて、以下のことがいえる。
実施例において作出したＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、通常食においても他の高脂血症モデルブタと同様に高脂血症を示し、高脂肪食給餌により、血中総コレステロール濃度は２倍以上に増加し、４か月後には血管内超音波画像診断により、冠動脈内にプラークが形成された。冠動脈プラーク確認後、プラーク病変部に多種類の薬剤溶出型ステントを留置し、留置後３ヵ月目のステント留置部の血管反応を観察した結果、新生内膜が形成され、新生内膜中に炎症細胞の浸潤、ステントのストラット周囲のフィブリン蓄積、断片化された石灰化、泡沫状マクロファージなど、遅発性血管反応が観察された。さらに、ヒト型高コレステロール・動脈硬化症患者における、ステント留置による治療後変化と同様の結果を示した。さらに、これまで通常家畜から作出された高脂血症ブタにおいて観察が困難乃至不可能であった、ステント治療後６ヵ月から２年～３年以降の変化を観察できることから、第２世代及び第３世代の薬剤溶出型ステント留置、生体吸収型のポリラクチド素材のステント構造の消失変化、長期的な生体反応、留置後１年以降に問題となる、ステント内新規動脈硬化による慢性期血栓症発症に関するメカニズム及びこれらの慢性期合併症予防のための新規治療法の検討が可能であることが明らかとなった。さらに、病理解析により、大動脈や冠動脈の動脈硬化粥腫、その部位にコレステリン結晶の散在を認めたことから、世界初のコレステロール栓塞症の大動物モデルが開発され、その発症のメカニズム及び治療ストラテージを明らかにすることが可能になる。
実施例において作出したＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、通常食においても他の高脂血症モデルブタと同様に高脂血症を示し、高脂肪食給餌により、血中総コレステロール濃度は２倍以上に増加し、４か月後には血管内超音波画像診断により、冠動脈内にプラークが形成された。冠動脈プラーク確認後、プラーク病変部に多種類の薬剤溶出型ステントを留置し、留置後３ヵ月目のステント留置部の血管反応を観察した結果、新生内膜が形成され、新生内膜中に炎症細胞の浸潤、ステントのストラット周囲のフィブリン蓄積、断片化された石灰化、泡沫状マクロファージなど、遅発性血管反応が観察された。さらに、ヒト型高コレステロール・動脈硬化症患者における、ステント留置による治療後変化と同様の結果を示した。さらに、これまで通常家畜から作出された高脂血症ブタにおいて観察が困難乃至不可能であった、ステント治療後６ヵ月から２年～３年以降の変化を観察できることから、第２世代及び第３世代の薬剤溶出型ステント留置、生体吸収型のポリラクチド素材のステント構造の消失変化、長期的な生体反応、留置後１年以降に問題となる、ステント内新規動脈硬化による慢性期血栓症発症に関するメカニズム及びこれらの慢性期合併症予防のための新規治療法の検討が可能であることが明らかとなった。さらに、病理解析により、大動脈や冠動脈の動脈硬化粥腫、その部位にコレステリン結晶の散在を認めたことから、世界初のコレステロール栓塞症の大動物モデルが開発され、その発症のメカニズム及び治療ストラテージを明らかにすることが可能になる。
【0080】
また、実施例において作出したＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、大動脈及び冠動脈以外にも眼底動脈にも動脈硬化の所見が認められ、眼底カメラを用いて眼底動脈病変及び冠動脈病変の相関性を検討するとともに、頚動脈内膜肥厚及び壁内栄養血管の増生が認められたので、造影頚動脈エコーを用いて、総頚動脈内膜中膜複合体厚の増加を伴う動脈硬化病変進展による輝度変化及び同部の組織学的な壁内栄養血管の増生の相関性について、定量評価が可能である。
【0081】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例0082】
［１．評価方法］
（１）受胎率調査
受胎率調査は、人工受精２１日後に発情兆候が再び現れないことを目視により確認し（ノンリターン法）、かつ人工受精２８日後に超音波画像診断装置（富士平工業社製：「ＨＳ－１０１Ｖ豚用」）を用いて胎胞を確認して、妊娠の有無を判断した。受胎率は、人工授精した雌ブタに対する妊娠が認められた雌ブタの割合により求めた。分娩率は、妊娠が認められた雌ブタのうち、１頭でも出産した雌ブタの割合により求めた。
（１）受胎率調査
受胎率調査は、人工受精２１日後に発情兆候が再び現れないことを目視により確認し（ノンリターン法）、かつ人工受精２８日後に超音波画像診断装置（富士平工業社製：「ＨＳ－１０１Ｖ豚用」）を用いて胎胞を確認して、妊娠の有無を判断した。受胎率は、人工授精した雌ブタに対する妊娠が認められた雌ブタの割合により求めた。分娩率は、妊娠が認められた雌ブタのうち、１頭でも出産した雌ブタの割合により求めた。
【0083】
（２）産子のホモ型又はヘテロ型の判定
ＰＣＲ法による判定は、変異アレル及び野生型アレルを、それぞれ特異的に検出することにより行った。具体的には、ゲノムＤＮＡの抽出は、ブタ耳片から「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｔｉｓｓｕｅ」（タカラバイオ社製）を用いて行った。ＰＣＲ分析は、２０μｌ容量の反応液中に精製したゲノムＤＮＡサンプル ４０ｎｇを鋳型として、「ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲサイクルは、最初に９８℃を３分間後、９８℃を１０秒、６０℃を３０秒、７２℃を１分１５秒の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃で１０分間との条件で実施した。変異アレルを検出するプライマーとしては、特許文献１に記載のＦＰ２及びＬＤＬＲＲｅｘ３Ｆ４を用いた。このプライマーセットにより、１．１ｋｂの変異アレル特異的な産物が増幅された。
ＰＣＲ法による判定は、変異アレル及び野生型アレルを、それぞれ特異的に検出することにより行った。具体的には、ゲノムＤＮＡの抽出は、ブタ耳片から「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｔｉｓｓｕｅ」（タカラバイオ社製）を用いて行った。ＰＣＲ分析は、２０μｌ容量の反応液中に精製したゲノムＤＮＡサンプル ４０ｎｇを鋳型として、「ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲサイクルは、最初に９８℃を３分間後、９８℃を１０秒、６０℃を３０秒、７２℃を１分１５秒の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃で１０分間との条件で実施した。変異アレルを検出するプライマーとしては、特許文献１に記載のＦＰ２及びＬＤＬＲＲｅｘ３Ｆ４を用いた。このプライマーセットにより、１．１ｋｂの変異アレル特異的な産物が増幅された。
【0084】
野生型アレルを検出するのに際して、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用し、かつ野生型アレルを検出するプライマーとして特許文献１に記載のＬＤＬＲＲｅｘ３Ｆ４及びＬＤＬＲｅｘ４Ｒ１を用いたこと以外は、上記と同様の方法で行った。
【0085】
各プライマーセットを用いて検出されたアレルの組み合わせにより、ホモ型及びヘテロ型を判定した。
【0086】
（３）血液検査
ヘパリン採血管により、ブタ静脈より血液を採取し、血液学検査を実施した。検査後の血液を２，０００ｒｐｍ、１５分間にて遠心分離に供して、血漿を分離及び回収した。回収した血漿について、血液生化学検査をするとともに、Ｏｋａｚａｋｉらの文献（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５，２５：５７８－５８４）に記載のＨＰＬＣ法により、コレステロール及び中性脂肪の４分画を解析した。
ヘパリン採血管により、ブタ静脈より血液を採取し、血液学検査を実施した。検査後の血液を２，０００ｒｐｍ、１５分間にて遠心分離に供して、血漿を分離及び回収した。回収した血漿について、血液生化学検査をするとともに、Ｏｋａｚａｋｉらの文献（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２００５，２５：５７８－５８４）に記載のＨＰＬＣ法により、コレステロール及び中性脂肪の４分画を解析した。
【0087】
（４）凍結精液の品質評価
凍結精液について、凍結融解後に改良モデナ液で再希釈し、３．５ｃｍシャーレ内に１００μｌの精子懸濁液としてドロップを作成し、流動パラフィン（軽質）で覆った。このシャーレを、５％Ｏ２、５％ＣＯ２気相、３８．５℃のインキュベーター内で１５分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後のシャーレにおける精子について、コンピューター精子運動解析装置ＣＡＳＡシステム（エアブラウン社製；「ＣＥＲＯＳＩＩ」）を用いて運動精子率を測定した。
凍結精液について、凍結融解後に改良モデナ液で再希釈し、３．５ｃｍシャーレ内に１００μｌの精子懸濁液としてドロップを作成し、流動パラフィン（軽質）で覆った。このシャーレを、５％Ｏ２、５％ＣＯ２気相、３８．５℃のインキュベーター内で１５分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後のシャーレにおける精子について、コンピューター精子運動解析装置ＣＡＳＡシステム（エアブラウン社製；「ＣＥＲＯＳＩＩ」）を用いて運動精子率を測定した。
【0088】
（５）冠動脈内の血管内超音波画像（ＩＶＵＳ）のイメージング及びステント留置
ブタを全身麻酔した後に、頸部におけるシース挿入部について剃毛及び消毒を行い、局所麻酔下（１％リドカイン１０ｍｌを皮下投与）で、シースにて動脈穿刺を行い、動脈ラインを確保した。動脈圧ライン及び心電図による血行動態監視下で、シースから挿入したカテーテルと血管内イメージデバイスとにより、冠動脈の観察を行った。冠動脈におけるプラーク病変の特徴及び部位を確認した後、ＩＶＵＳにて病変部の血管内径を測定し、留置ステントのサイズを決定した。冠動脈に、ステント拡張後の外径及び病変部血管内径を１．２：１とし、ステントを留置した。冠動脈カテーテルの操作後に、デバイス及びシースを抜去し、用手的に圧迫及び止血を確認した後、麻酔を終了した。
ブタを全身麻酔した後に、頸部におけるシース挿入部について剃毛及び消毒を行い、局所麻酔下（１％リドカイン１０ｍｌを皮下投与）で、シースにて動脈穿刺を行い、動脈ラインを確保した。動脈圧ライン及び心電図による血行動態監視下で、シースから挿入したカテーテルと血管内イメージデバイスとにより、冠動脈の観察を行った。冠動脈におけるプラーク病変の特徴及び部位を確認した後、ＩＶＵＳにて病変部の血管内径を測定し、留置ステントのサイズを決定した。冠動脈に、ステント拡張後の外径及び病変部血管内径を１．２：１とし、ステントを留置した。冠動脈カテーテルの操作後に、デバイス及びシースを抜去し、用手的に圧迫及び止血を確認した後、麻酔を終了した。
【0089】
（６）ステント留置後のＩＶＵＳのイメージング
ブタについて、全身麻酔下で、冠動脈カテーテル及び血管内イメージングを以下の方法で行った。
冠動脈造影は東芝メディカルシステムズ社のＸ線アンギオグラフィーシステムを用いて撮影し、ＣＤに記録した。ＩＶＵＳはボストン社のＩＶＵＳプローブカテーテルを毎秒０．５ｍｍで機械式プルバックシステムを用いて自動的に引き抜いて撮像し、ＣＤに記録した。光干渉断層（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）は、セント・ジュード・メディカル社のカテーテルを用いて、造影剤で血管内腔をフラッシュしながら、毎秒１ｍｍの速度で引き抜き、画像をハードディスクに記録した。ＯＣＴ及びＩＶＵＳを用いて、ステント内の血栓及び血栓内膜変化を定性的又は定量的に観察した。
ブタについて、全身麻酔下で、冠動脈カテーテル及び血管内イメージングを以下の方法で行った。
冠動脈造影は東芝メディカルシステムズ社のＸ線アンギオグラフィーシステムを用いて撮影し、ＣＤに記録した。ＩＶＵＳはボストン社のＩＶＵＳプローブカテーテルを毎秒０．５ｍｍで機械式プルバックシステムを用いて自動的に引き抜いて撮像し、ＣＤに記録した。光干渉断層（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）は、セント・ジュード・メディカル社のカテーテルを用いて、造影剤で血管内腔をフラッシュしながら、毎秒１ｍｍの速度で引き抜き、画像をハードディスクに記録した。ＯＣＴ及びＩＶＵＳを用いて、ステント内の血栓及び血栓内膜変化を定性的又は定量的に観察した。
【0090】
（７）ステント留置後の組織学的解析
ブタを安楽死させた後、生理食塩水を用いて灌流を行い、１０％ホルマリン液による灌流固定後に組織を採取して（心臓、上行～下行大動脈及び頚動脈）、病理組織学的に調査した。心臓は摘出後、冠動脈を剥離し、樹脂包埋又はパラフィン切片で組織病理学的に解析した。
ブタを安楽死させた後、生理食塩水を用いて灌流を行い、１０％ホルマリン液による灌流固定後に組織を採取して（心臓、上行～下行大動脈及び頚動脈）、病理組織学的に調査した。心臓は摘出後、冠動脈を剥離し、樹脂包埋又はパラフィン切片で組織病理学的に解析した。
【0091】
［２．高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタの作出］
（１）Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の作出
本願出願人である国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構が保有する特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－；６ヵ月齢平均体重 約１１０ｋｇ；平均産子数 １０頭～１２頭）及び独立行政法人家畜改良センターから購入したミニブタである「サクラコユキ」（ＬＤＬＲ＋／＋；９ヵ月齢平均体重 約４０ｋｇ；平均産子数 約５頭）を人工授精により交配してＳ系統Ｆ１世代を作出した。
（１）Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の作出
本願出願人である国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構が保有する特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－；６ヵ月齢平均体重 約１１０ｋｇ；平均産子数 １０頭～１２頭）及び独立行政法人家畜改良センターから購入したミニブタである「サクラコユキ」（ＬＤＬＲ＋／＋；９ヵ月齢平均体重 約４０ｋｇ；平均産子数 約５頭）を人工授精により交配してＳ系統Ｆ１世代を作出した。
【0092】
具体的には、ＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型の雌４頭を生後約６ヶ月齢で埼玉県農業技術研究センター養豚エリア内の隔離豚舎に導入し、ミニブタにおいては２頭の雄を２回に分けて該隔離豚舎に導入した。なお、隔離豚舎は遺伝子組換え実験施設としての要件を満たしている。導入したブタの全ては、約１ヶ月間隔離管理するとともに、導入直後及び隔離１ヶ月後に頚静脈より採血し、ブタのオーエスキー病及びＰＲＲＳ病抗体検査を実施した。検査の結果として抗体陰性が確認され、かつ健康状態が良好であったブタを遺伝子改変動物管理基準を満たした豚舎に移動した。
【0093】
ＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型は、１日のうち朝及び夕の２回にて発情兆候を観察し、発情日を判定した。次いで、２回～３回の発情周期を確認した後、３回目～４回目の発情に合わせて、ミニブタから採取した新鮮精液を用いて人工授精を実施した。受胎したＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型から自然分娩によりＳ系統Ｆ１世代を生産した。Ｓ系統Ｆ１世代について、生後１週間以内に耳ナンバリング時に採取した耳小片からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法でＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型（ＬＤＬＲ＋／－、ＬＤＬＲ＋／＋）を確認した。遺伝子型の確認後、Ｓ系統Ｆ１世代のうちヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）の個体（Ｓ系統Ｆ１世代ヘテロ型）を選抜した。
【0094】
選抜したＳ系統Ｆ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）どうしを交配することで、Ｓ系統Ｆ２世代を得た。次いで、Ｓ系統Ｆ２世代のうちヘテロ型の個体（Ｓ系統Ｆ２世代ヘテロ型）を選抜し、Ｓ系統Ｆ２世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）どうし、又はＳ系統Ｆ２世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）とＳ系統Ｆ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）を交配することでＳ系統Ｆ３世代を得て、その中からホモ型であるＳ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の個体の生産に成功した。得られたＳ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）をＳ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）とした。
【0095】
しかしながら、後述するとおりに、作出したＳ系統は、Ｆ１世代～Ｆ３世代に関係なく、個体の生産及び維持管理が難しいこと、産子数が少ないこと、分娩後の生後直死が多いこと、生後３５日目の離乳率が非常に低いこと、抗病性が低く育成豚においても突然死又は皮膚病が多発することなどの問題を有していた。また、Ｓ系統は、乳頭の肥大化により、子ブタが哺乳出来ず、安定供給を継続できないという問題が発生した。
【0096】
（２）高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタ（ＳＢ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－））の作出
Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）及び英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋；８ヵ月齢平均体重 約１００ｋｇ；平均産子数 約８頭）を人工授精により交配してＳＢ系統Ｆ１世代を作出した。
Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）及び英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋；８ヵ月齢平均体重 約１００ｋｇ；平均産子数 約８頭）を人工授精により交配してＳＢ系統Ｆ１世代を作出した。
【0097】
具体的には、Ｓ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の雄２頭を用いて、バークシャー種の雌２頭に人工授精を行い、受胎したバークシャー種の雌から自然分娩によりＳＢ系統Ｆ１世代を生産した。得られたＳＢ系統Ｆ１世代から生後１週間以内に耳のナンバリング時に採取した耳小片からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法でＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型を確認した。遺伝子型の確認後、ＳＢ系統Ｆ１世代のうち、比較的サイズの小さいヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）の個体（ＳＢ系統Ｆ１世代ヘテロ型）を選抜した。
【0098】
選抜したＳＢ系統Ｆ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）どうし、又はＳＢ系統Ｆ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）に上記１で使用したミニブタ（ＬＤＬＲ＋／＋）を交配することで、ＳＢ系統Ｆ２世代を得た。次いで、ＳＢ系統Ｆ２世代について比較的サイズが小さいホモ型の個体（ＳＢ系統Ｆ２世代ホモ型）及びヘテロ型の個体（ＳＢ系統Ｆ２世代ヘテロ型）に分けて、ＳＢ系統Ｆ２世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）どうし、又はＳＢ系統Ｆ２世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）及びヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）を交配することでＳＢ系統Ｆ３世代を得た。さらにＳＢ系統Ｆ３世代について比較的サイズが小さいホモ型の個体（ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型）を選抜し、ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）どうしを交配することで全てがホモ型であるＳＢ系統Ｆ４世代を得た。ＳＢ系統Ｆ２世代及びＳＢ系統Ｆ４世代において、遺伝子のホモ化（ＬＤＬＲ－／－）及び体型の小型化がみられた個体として、高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタの生産に成功した。
【0099】
（３）具体的な作出手順
（３－１）精液採取及び人工授精を用いた繁殖
大型種であるランドレース種から作出した特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）とミニブタであるサクラコユキ（ＬＤＬＲ＋／＋）とは、体格差があることから、自然交配によるいわゆる直接交配ができなかった。そこで、発情期の中型品種及び小型品種を用いた横取り法又はミニブタ用に開発して作製した小型擬牝台を用いた手圧法により精液を採取し、人工授精により、ＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ２世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）を受胎及び分娩させた。また、Ｓ系統Ｆ１世代以降の交配、Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）及び英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋）の交配を通じた高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタＳＢ系統の作出においても、体型選抜により小型化してくるために、雌の体型が小型化しても、膣内が狭く雄ブタの陰茎が挿入されにくいこと、膣内に精液が入らないことなどの問題が生じたことから、継続的に人工授精による繁殖を実施した。
（３－１）精液採取及び人工授精を用いた繁殖
大型種であるランドレース種から作出した特許文献１に記載のＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ１世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）とミニブタであるサクラコユキ（ＬＤＬＲ＋／＋）とは、体格差があることから、自然交配によるいわゆる直接交配ができなかった。そこで、発情期の中型品種及び小型品種を用いた横取り法又はミニブタ用に開発して作製した小型擬牝台を用いた手圧法により精液を採取し、人工授精により、ＬＤＬＲ－ＫＯブタＦ２世代ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）を受胎及び分娩させた。また、Ｓ系統Ｆ１世代以降の交配、Ｓ系統ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）及び英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋）の交配を通じた高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタＳＢ系統の作出においても、体型選抜により小型化してくるために、雌の体型が小型化しても、膣内が狭く雄ブタの陰茎が挿入されにくいこと、膣内に精液が入らないことなどの問題が生じたことから、継続的に人工授精による繁殖を実施した。
【0100】
横取り法は、発情期の雌ブタを鼻保定後、鎮痛鎮静剤として体重に対して０．０８ｍｇ／ｋｇのミタゾラムを筋肉内注射し、雄ブタを雌ブタに乗駕させた後、採取者が横から手圧法により精液を４０ｍｌ～２００ｍｌ程度の容量で広口保存瓶に採取した。
【0101】
小型擬牝台を用いた手圧法は、雄ブタを小型擬牝台に乗せた後、横取り法と同様に採取者が横から手圧法により精液を４０ｍｌ～２００ｍｌ程度の容量で広口保存瓶に採取した。
【0102】
採取した直後の精液を、３５℃程度の温湯に保存瓶のまま湯煎し、精液検査室に運び、モデナ液で必要量まで希釈した。希釈後の精液を、１５℃にて温度管理した精液保管庫に人工授精直前まで保管した。１部の精液は３８℃に加熱した加温板上にセットした精液性状検査盤上に戴置して、光学顕微鏡を用いて２００倍で観察し、常法に従って運動精子率及び精子活力を測定した。発情を確認した個体に対し、発情当日及び翌日の２回にわたり、採取した精液５０ｍｌ～７０ｍｌずつをシリンジ内に装填し、ブタに通常用いられている人工授精用カテーテル（富士平工業社製）を用いて常法により人工授精を実施した。
【0103】
（３－２）小型擬牝台の作製
小型擬牝台は、通常市販されている擬牝台をもとにそのサイズの全てを小型化して作製した。鉄骨フレームで躯体を作成後、乗駕面を作成した。鉄骨フレームの高さを６０ｃｍ以下とし、長さを７０ｃｍとし、幅を７０ｃｍ以下とした。乗駕面の高さを１２ｃｍとし、長さを６０ｃｍとし、幅を２５ｃｍ以下とした。また、乗駕面の素材は無垢材で作成し、そのまま使用し、又は弾性スポンジを骨組みに巻いた後、ホロ布により覆い使用した。
小型擬牝台は、通常市販されている擬牝台をもとにそのサイズの全てを小型化して作製した。鉄骨フレームで躯体を作成後、乗駕面を作成した。鉄骨フレームの高さを６０ｃｍ以下とし、長さを７０ｃｍとし、幅を７０ｃｍ以下とした。乗駕面の高さを１２ｃｍとし、長さを６０ｃｍとし、幅を２５ｃｍ以下とした。また、乗駕面の素材は無垢材で作成し、そのまま使用し、又は弾性スポンジを骨組みに巻いた後、ホロ布により覆い使用した。
【0104】
（３－３）哺乳方法
分娩後１日目から翌日まで、生まれた子ブタの哺乳状態に応じて、哺乳できない個体に対して子ブタ用代用乳を温湯で融解した。融解した子ブタ用代用乳を、５ｍｌのシリンジを用いてそれぞれの子ブタに５ｍｌずつ強制的に経口哺乳を行った。３日目以降からは、同腹ブタの全てに子ブタ用代用乳を給餌バットに入れて分娩後２週間目まで不断給餌した。
分娩後１日目から翌日まで、生まれた子ブタの哺乳状態に応じて、哺乳できない個体に対して子ブタ用代用乳を温湯で融解した。融解した子ブタ用代用乳を、５ｍｌのシリンジを用いてそれぞれの子ブタに５ｍｌずつ強制的に経口哺乳を行った。３日目以降からは、同腹ブタの全てに子ブタ用代用乳を給餌バットに入れて分娩後２週間目まで不断給餌した。
【0105】
（３－４）飼料
ブタの飼料としては、維持群においては以下脂肪含量（日本標準飼料成分表に基づく）の通常飼料（普通食）を使用し、実験群は導入後、高脂肪飼料を４週間給与し、実験に供した。
１）維持群
分娩翌日～２週齢：脂肪含量 ４．０％以上
（飼料名：日清丸紅印子豚用代用乳 サニッコ２号）
３週齢～５週齢：脂肪含量 ４．０％以上
（飼料名：ノーサン印子豚人工乳前期用配合飼料 ウイニーＡ）
５週齢～２ヶ月：脂肪含量 ３．５％以上
（飼料名：ノーサン印子豚人工乳後期用配合飼料 ウイニーＢ）
２ヶ月～６ヶ月：脂肪含量 ２．５％以上
（飼料名：ノーサン印肉豚飼育用配合飼料 クリア肉豚）
６ヶ月以上：脂肪含量 ２．０％以上
（飼料名：ノーサン印種豚飼育用配合飼料 ネクセルブリード）
２）実験群
導入後～実験終了まで：脂肪含量１５％牛脂、１．５％コレステロール
（飼料名：フィードワン（株）高脂肪特殊飼料 ）
ブタの飼料としては、維持群においては以下脂肪含量（日本標準飼料成分表に基づく）の通常飼料（普通食）を使用し、実験群は導入後、高脂肪飼料を４週間給与し、実験に供した。
１）維持群
分娩翌日～２週齢：脂肪含量 ４．０％以上
（飼料名：日清丸紅印子豚用代用乳 サニッコ２号）
３週齢～５週齢：脂肪含量 ４．０％以上
（飼料名：ノーサン印子豚人工乳前期用配合飼料 ウイニーＡ）
５週齢～２ヶ月：脂肪含量 ３．５％以上
（飼料名：ノーサン印子豚人工乳後期用配合飼料 ウイニーＢ）
２ヶ月～６ヶ月：脂肪含量 ２．５％以上
（飼料名：ノーサン印肉豚飼育用配合飼料 クリア肉豚）
６ヶ月以上：脂肪含量 ２．０％以上
（飼料名：ノーサン印種豚飼育用配合飼料 ネクセルブリード）
２）実験群
導入後～実験終了まで：脂肪含量１５％牛脂、１．５％コレステロール
（飼料名：フィードワン（株）高脂肪特殊飼料 ）
【0106】
（３－５）凍結精液の作製
ＳＢ系統の遺伝子型ホモの種雄豚より、小型擬牝台を用いて手圧法により精液を採取し、丹羽らの方法に順じて凍結精液を作製した。採取した膠様豚を除いた精液はすぐさま３８℃の保温状態で実験室に持ち帰り、採取量の２／３量の改良モデナ液を添加し、精液低温処理室内で３８℃から１５℃まで約２時間かけて冷却後、５０ｍｌのガラス製遠心管に分注後、冷却したまま７００Ｇで１５分間遠心分離した後、アスピレーターで精漿を除去し、ＮＳＦ－１液と混合した後、５℃まで９０分間かけて冷却した。冷却した精子懸濁液にＮＳＦ－１液と同量のＮＳＦ－２液を添加し、最終グリセリン濃度３％、最終精子濃度を１０億個／ｍｌに調節したのち、０．２５ｍｌのプラスチックストローに一本型ストロー管充填・閉封機（富士平工業社製；「ＳＦＭ－１」）を用いて充填した。ストローは液体窒素液面上４ｃｍで約２０分間予備冷却した後、液体窒素内に浸漬した。全てのストローは、液体窒素充填ボンベ内で使用まで保存した。
ＳＢ系統の遺伝子型ホモの種雄豚より、小型擬牝台を用いて手圧法により精液を採取し、丹羽らの方法に順じて凍結精液を作製した。採取した膠様豚を除いた精液はすぐさま３８℃の保温状態で実験室に持ち帰り、採取量の２／３量の改良モデナ液を添加し、精液低温処理室内で３８℃から１５℃まで約２時間かけて冷却後、５０ｍｌのガラス製遠心管に分注後、冷却したまま７００Ｇで１５分間遠心分離した後、アスピレーターで精漿を除去し、ＮＳＦ－１液と混合した後、５℃まで９０分間かけて冷却した。冷却した精子懸濁液にＮＳＦ－１液と同量のＮＳＦ－２液を添加し、最終グリセリン濃度３％、最終精子濃度を１０億個／ｍｌに調節したのち、０．２５ｍｌのプラスチックストローに一本型ストロー管充填・閉封機（富士平工業社製；「ＳＦＭ－１」）を用いて充填した。ストローは液体窒素液面上４ｃｍで約２０分間予備冷却した後、液体窒素内に浸漬した。全てのストローは、液体窒素充填ボンベ内で使用まで保存した。
【0107】
（３－６）凍結精液の融解及び人工授精
発情ブタを朝発見した場合には、当日の夕方及び翌日の朝方に凍結精液による人工授精を２回実施した。液体窒素充填ボンベから保存した凍結精液４本を取り出した直後に、３８℃の温湯に約１０秒間浸漬し融解した。融解後の精液を、保温した改良モデナ液１．２５ｍｌと混合し、１ｍｌのシリンジ２本に充填して、精子懸濁液を調製した。発情ブタにおいては、陰部を良く洗浄した後、子宮深部注入用カテーテルセット（富士平工業社製；「匠」）を用いて、子宮角深部及び子宮体部にそれぞれ１ｍｌずつ精子懸濁液を注入し、最後に空気 ３ｍｌを注入し、１回の人工授精とした。
発情ブタを朝発見した場合には、当日の夕方及び翌日の朝方に凍結精液による人工授精を２回実施した。液体窒素充填ボンベから保存した凍結精液４本を取り出した直後に、３８℃の温湯に約１０秒間浸漬し融解した。融解後の精液を、保温した改良モデナ液１．２５ｍｌと混合し、１ｍｌのシリンジ２本に充填して、精子懸濁液を調製した。発情ブタにおいては、陰部を良く洗浄した後、子宮深部注入用カテーテルセット（富士平工業社製；「匠」）を用いて、子宮角深部及び子宮体部にそれぞれ１ｍｌずつ精子懸濁液を注入し、最後に空気 ３ｍｌを注入し、１回の人工授精とした。
【0108】
（３－７）全身麻酔方法
ケタミンを５ｍｇ／ｋｇにてブタに筋注して麻酔鎮静した。筋注後のブタを、静脈ルートを確保し、カテーテル台に仰臥位に固定した。固定したブタに、気管挿管を行い、１回換気量１０ｍｌ／ｋｇ～１５ｍｌ／ｋｇ、２０回／分にて呼吸管理しながら、酸素５０％及びセボフルラン１％～４％を吸入させて全身麻酔とした。
ケタミンを５ｍｇ／ｋｇにてブタに筋注して麻酔鎮静した。筋注後のブタを、静脈ルートを確保し、カテーテル台に仰臥位に固定した。固定したブタに、気管挿管を行い、１回換気量１０ｍｌ／ｋｇ～１５ｍｌ／ｋｇ、２０回／分にて呼吸管理しながら、酸素５０％及びセボフルラン１％～４％を吸入させて全身麻酔とした。
【0109】
［３．高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタの繁殖成績］
（１）ＳＢ系統とＳ系統との比較評価
平成２５年度～令和１年度の７年間、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）及びコントロールの雄ブタから精液を横取り法又は小型擬牝台を用いた手圧法により採取した。それぞれの精液 ５０ｍｌ～７０ｍｌを、精液の由来に対応させて、自然発情した種雌ブタである、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）２２頭、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）４０頭及びコントロール（ランドレース種）１７頭の計７９頭に、発情当日及び翌日の２回人工授精した。各種雌ブタの受胎頭数及び分娩頭数はまとめたものを表１とした。
（１）ＳＢ系統とＳ系統との比較評価
平成２５年度～令和１年度の７年間、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）及びコントロールの雄ブタから精液を横取り法又は小型擬牝台を用いた手圧法により採取した。それぞれの精液 ５０ｍｌ～７０ｍｌを、精液の由来に対応させて、自然発情した種雌ブタである、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）２２頭、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）４０頭及びコントロール（ランドレース種）１７頭の計７９頭に、発情当日及び翌日の２回人工授精した。各種雌ブタの受胎頭数及び分娩頭数はまとめたものを表１とした。
【0110】
【表1】
【0111】
表１に示すとおり、Ｓ系統の受胎率及び分娩率は、ＳＢ系統及びコントロールのものと比較して有意に低かった。
【0112】
また、表１に示すとおり、分娩した各種雌ブタの頭数は。Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）は１６頭、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）は３６頭、コントロールは１５頭であった。これらの種雌ブタが分娩した子ブタの総産子数は、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）は１１７頭、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）は３５０頭、コントロールは１３０頭であった。これらの結果から、１頭の雌ブタが１回に出産した産子数の平均（平均産子数）を算出するとともに、生後直後及び生後３５日目に子ブタの体重を測定して平均生時体重及び平均離乳時体重を得た。これらの結果を表２に示す。
【0113】
【表2】
【0114】
表２に示すとおり、ＳＢ系統は、Ｓ系統と比べて、平均産子数が有意に高かった。また、ＳＢ系統は、平均生時体重はＳ系統と遜色なく、コントロールと比較すると有意に低かった。また、ＳＢ系統の平均離乳時体重は、Ｓ系統、コントロールと比べて有意に低かった。
【0115】
Ｓ系統Ｆ３世代及びＳＢ系統Ｆ３世代のうち、２産以上を経験した経産ブタについて、それぞれ５頭、計１０頭の左右の全乳頭の高さ及び直径をデジタルスケール（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社製；「デジマチックキャリパ」）を用いて測定し、系統ごとに平均を算出した。結果を、表３に示す。
【0116】
【表3】
【0117】
表３に示すとおり、ＳＢ系統の平均乳頭高及び平均乳頭径は、Ｓ系統のものに比べて、有意に小さいことがわかった。このことから、ＳＢ系統の乳頭は全体的に小さく、子ブタに対して哺乳し易いことがわかった。
【0118】
表１～表３の結果を合わせると、ＳＢ系統は、受胎率及び分娩率が高く、平均産子数が多く、体重が小さく、かつ子ブタの哺乳が容易であるという特徴を有することがわかった。
【0119】
（２）ＳＢ系統各世代の産子数及び体重の評価
ＳＢ系統の各世代の平均産子数及び平均２７０日齢体重を表４及び表５に示す。
ＳＢ系統の各世代の平均産子数及び平均２７０日齢体重を表４及び表５に示す。
【0120】
【表4】
【0121】
【表5】
【0122】
表４が示すとおり、ＳＢ系統Ｆ２世代以降の平均産子数は、ＳＢ系統Ｆ１世代及びＳ系統に比べて高い傾向を示した。Ｓ系統Ｆ１世代と比較してＳＢ系統Ｆ４世代の産子数が有意に高かった。また、表５に示すとおり、ＳＢ系統Ｆ４世代の雄ブタ及び雌ブタの平均２７０日齢体重は、Ｓ系統Ｆ３世代のものと比べて同程度の体重であった。雄雌合算の各世代間において、Ｓ系統Ｆ１世代とＳＢ系統Ｆ２世代及びＳＢ系統Ｆ３世代において増大傾向を示した（Ｐ＜０．０６）がＳＢ系統Ｆ４世代において再び減少した。なお、平均２７０日齢体重は、ＳＢ系統の各世代において、雄ブタの方が雌ブタと比較して小さかった。
【0123】
【0124】
図１に示すとおり、死産・生後直死率は、各世代間の変動が激しく、各群間において有意差は認められなかった。しかし、図２に示すとおり、離乳前のへい死率は、Ｓ系統よりもＳＢ系統が明らかに低く、Ｓ系統Ｆ１世代（へい死率５４．５％）と比較して、ＳＢ系統Ｆ２世代（へい死率２０．０％）、ＳＢ系統Ｆ３世代（へい死率１０．２％）及びＳＢ系統Ｆ４世代（へい死率８．６％）が有意に低いことが解った（Ｐ＜０．０１）。
【0125】
以上の結果より、ＳＢ系統は、後代になるほど、へい死率が下がり、離乳後に良好に生育することがわかった。
【0126】
（４）ＳＢ系統各世代の遺伝子型評価
ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）子ブタについて、ワイルド型（ＬＤＬＲ＋／＋）、ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）及びホモ型（ＬＤＬＲ－／－）といった遺伝子型を判定した結果を、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）の結果とともに図３に示す。
ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）子ブタについて、ワイルド型（ＬＤＬＲ＋／＋）、ヘテロ型（ＬＤＬＲ＋／－）及びホモ型（ＬＤＬＲ－／－）といった遺伝子型を判定した結果を、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）の結果とともに図３に示す。
【0127】
図３に示すとおり、ＳＢ系統は、継代するごとにワイルド型が減り、ホモ型が増え、遂にはＳＢ系統Ｆ４世代において、全てのブタにおいて遺伝子型をホモ化することに成功した。
【0128】
また、ＳＢ系統（Ｆ１世代～Ｆ４世代）の各世代の平均血縁係数及び平均近交係数を算出ソフト「ＣｏｅＦＲ ｖｅｒ．３．７」（Ｓａｔｏｈ， Ｍ．，Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｄａｔａ ｓｅｔｓ．Ｊａｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｓ系統（Ｆ１世代～Ｆ３世代）とともに算出した。結果を表６に示す。
【0129】
【表6】
【0130】
表６に示すとおり、平均近交係数は、Ｓ系統Ｆ３世代において新たなミニブタの導入により低下したが、遺伝子のホモ化に伴いＳＢ系統Ｆ３世代により上昇した。ＳＢ系統Ｆ４世代に新たな英国系バークシャー種の導入により再度低下した。平均血縁係数は、Ｓ系統Ｆ２世代で急激に上昇し、ＳＢ系統において比較的安定した値を示した。
【0131】
（５）ＳＢ系統の精液品質評価
ＳＢ系統の凍結精液の融解後の品質及び受精能について測定した。凍結前及び凍結・融解後の精子の運動性についてＣＡＳＡシステムを用いて評価した。結果を表７に示す。また、凍結・融解した、ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の精液懸濁液を子宮深部注入用カテーテル（富士平工業社製；「匠カテーテル」）を用いて英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋）の種雌ブタに人工授精した際の受胎率、分娩率及び産子数の結果を表８に示す。
ＳＢ系統の凍結精液の融解後の品質及び受精能について測定した。凍結前及び凍結・融解後の精子の運動性についてＣＡＳＡシステムを用いて評価した。結果を表７に示す。また、凍結・融解した、ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）の精液懸濁液を子宮深部注入用カテーテル（富士平工業社製；「匠カテーテル」）を用いて英国系バークシャー種（ＬＤＬＲ＋／＋）の種雌ブタに人工授精した際の受胎率、分娩率及び産子数の結果を表８に示す。
【0132】
【表7】
【0133】
【表8】
【0134】
表７に示すとおり、凍結前の新鮮精液における運動精子率（「Ｍｏｔｉｌｅ Ｃｅｌｌｓ」）は７９．５％であったのに対し、凍結・融解後の運動精子率は１９．１％であった。また、表８に示すとおり、人工授精した雌ブタ５頭のうち、４頭が受胎し、そのうち３頭が計３０頭の子ブタを産生した。また、図４に示すとおり、誕生した、子ブタすべての遺伝子型はＬＤＬＲ＋／－のヘテロ型であった。
【0135】
［４．高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタの評価］
（１）血中脂質評価
通常食又は高脂肪食による飼養試験は、次のスケジュールにより実施した。すなわち、生産したＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタを生後約２ヵ月齢～８ヵ月齢まで通常飼料により育てた。次いで、ブタを日本大学医学部実験動物施設へ搬送後、静脈から採血検査を行った。次いで、１．５％コレステロール及び１５％牛脂を含む高脂肪食を１日１ｋｇの量で４ヶ月間給餌した。
（１）血中脂質評価
通常食又は高脂肪食による飼養試験は、次のスケジュールにより実施した。すなわち、生産したＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタを生後約２ヵ月齢～８ヵ月齢まで通常飼料により育てた。次いで、ブタを日本大学医学部実験動物施設へ搬送後、静脈から採血検査を行った。次いで、１．５％コレステロール及び１５％牛脂を含む高脂肪食を１日１ｋｇの量で４ヶ月間給餌した。
【0136】
ＳＢ系統ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタと特許文献１に記載のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ブタとＳＢ系統の血中コレステロール及び中性脂肪の４分画を測定した結果を図５に示す。図５に示すとおり、ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタは、通常食の給餌下での血算、生化学及び血中脂質プロファイルについて、特許文献１に記載のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ブタと同様であった。また、今回作出した高コレステロール／動脈硬化症モデルミニブタＳＢ系統は、特許文献１に記載のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ブタと同様に、トータルコレステロールは６２０ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬコレステロールは４３０ｍｇ／ｄｌと高かった。
【0137】
ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ７頭について、高脂肪食給与後の血中脂質濃度の平均値の推移を測定した結果を図６に示す。図６に示すとおり、高脂肪食を１ヶ月間食べさせると、血中ＶＬＤＬ濃度は２倍以上増加した。なお、ＳＢ系統Ｆ３世代ホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ９頭の高脂肪食給与前、高脂肪食給与１ヵ月～４ヵ月目及びステント留置後１２ヶ月時の血算及び生化学検査結果の平均値を表９及び表１０に示す。
【0138】
【表9】
【0139】
【表10】
【0140】
（２）動脈内粥種形成評価
ＳＢ系統Ｆ２世代～Ｆ４世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタに高脂肪食を４ヶ月間給与し、血管内イメージングによる冠動脈粥種形成の確認を行った。結果を図７に示す。図７中の冠動脈造影（図７中のＢ）では狭窄は認められなかったが、ＩＶＵＳ（図７中のＣ～Ｅ）では弱い狭窄及びプラーク形成が認められた。
ＳＢ系統Ｆ２世代～Ｆ４世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタに高脂肪食を４ヶ月間給与し、血管内イメージングによる冠動脈粥種形成の確認を行った。結果を図７に示す。図７中の冠動脈造影（図７中のＢ）では狭窄は認められなかったが、ＩＶＵＳ（図７中のＣ～Ｅ）では弱い狭窄及びプラーク形成が認められた。
【0141】
【0142】
（３）ステント留置後の動脈内粥種形成評価
ＳＢ系統Ｆ２世代～Ｆ４世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ雄に高脂肪食を４ヶ月間給与し、冠動脈へ、第１世代ＢＶＳ（１ｓｔＢＶＳ、アボット社、「Ａｂｓｏｒｂ ＧＴ１ 生体吸収性スキャホールドシステム」）及び第２世代ステント（２ｎｄＤＥＳ、アボット社、「ＸＩＥＮＣＥ Ａｌｐｉｎｅ」）の２種類のステント留置を行なった。
ＳＢ系統Ｆ２世代～Ｆ４世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ雄に高脂肪食を４ヶ月間給与し、冠動脈へ、第１世代ＢＶＳ（１ｓｔＢＶＳ、アボット社、「Ａｂｓｏｒｂ ＧＴ１ 生体吸収性スキャホールドシステム」）及び第２世代ステント（２ｎｄＤＥＳ、アボット社、「ＸＩＥＮＣＥ Ａｌｐｉｎｅ」）の２種類のステント留置を行なった。
【0143】
留置から３ヶ月後及び１２ヶ月後まで継続して高脂肪食を給与したブタの血管内イメージング及び病理学的評価を実施した。１２ヵ月後の観察結果を図９に示す。３ヵ月後の１ｓｔＢＶＳ及び２ｎｄＤＥＳの両区における冠動脈造影では、ステント留置部位に経度狭窄が認められた。また、ＩＶＵＳで観察したところ、ステントの内側に新生内膜が観察された。
【0144】
さらに、冠動脈の病理切片において両区ともに新生内膜中に炎症細胞の浸潤、ステントのストラット周囲のフィブリン蓄積、断片化された石灰化、泡沫状マクロファージなどが観察された。図９が示すとおり、１２ヵ月後の観察では、１ｓｔＢＶＳ及び２ｎｄＤＥＳの両区において、冠動脈造影では軽度狭窄が認められ、病理学的評価においては、両区ともにステント内に新規動脈硬化が認められた。２ｎｄＤＥＳ区には壊死コア層と血栓が認められた。
【0145】
ステント留置から３ヶ月後に血管反応を調査した後、安楽死後に心臓、上行～下行大動脈及び頚動脈を病理組織学的に調査した。ステント内側に平滑筋細胞を主成分とした新生内膜が形成され、新生内膜の中に炎症性細胞浸潤、ステントのストラット周囲のフィブリン蓄積、断片化された石灰化、泡沫状マクロファージなどが観察され、ステント内血栓は認められなかった。
【0146】
（４）ステント留置後の冠動脈内粥種形成評価
ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ及びＬＷＤ３元交雑豚（ランドレース種×大ヨークシャー種×デュロック種）のそれぞれ６頭ずつの計１２頭に高脂肪食を４ヶ月間給与し、薬剤溶出性の第２世代薬剤溶出型ステント（２ｎｄＤＥＳ，Ｐｒｏｍｕｓ－ＰＲＥＭＩＥＲ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を冠動脈に留置し、留置１ヵ月後に血管内反応を病理組織学的に調査した。結果を図１０に示す。
ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ及びＬＷＤ３元交雑豚（ランドレース種×大ヨークシャー種×デュロック種）のそれぞれ６頭ずつの計１２頭に高脂肪食を４ヶ月間給与し、薬剤溶出性の第２世代薬剤溶出型ステント（２ｎｄＤＥＳ，Ｐｒｏｍｕｓ－ＰＲＥＭＩＥＲ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を冠動脈に留置し、留置１ヵ月後に血管内反応を病理組織学的に調査した。結果を図１０に示す。
【0147】
図１０に示すとおり、ＬＷＤ３元交雑豚においては、ステントストラットの周囲に多くのマクロファージの浸潤が認められ、ヒトと類似した反応は認められなかった。しかし、ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタにおいては、ヒトのステント留置後に認められる早期組織反応と同様に、炎症が少なく、新生内膜中に未成熟な細胞外基質が認められた。
【0148】
ＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ雄に高脂肪食を４ヶ月間給与し、冠動脈プラーク確認後に第２世代薬剤溶出型ステント（２ｎｄＤＥＳ，Ｐｒｏｍｕｓ－ＰＲＥＭＩＥＲ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）及び第３世代薬剤溶出型ステント（３ｒｄＤＥＳ，ＳＹＮＥＧＲＹ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を冠動脈に留置し、留置１ヵ月後にＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）によりその血管内変化をヒトの標本と比較した。
【0149】
その結果、ミニブタにおいて、第２世代及び第３世代薬剤溶出型ステント留置後に均質の新生内膜が観察され、新生内膜の厚さ及び面積は、第３世代が有意に薄く、面積も第３世代では１．９０±０．０３ｍｍ２、第２世代では２．０５±０．０７ｍｍ２であり、有意に第３世代の面積が小さかった（Ｐ＜０．０５）。ステントのストラット周囲のフィブリン堆積量は、ミニブタ及びヒトともに、第３世代薬剤溶出型ステントが小さかった。
【0150】
３ヵ月齢のＳＢ系統Ｆ３世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタ雄１２頭に高脂肪食を４ヶ月間給与し、ステント留置前に、ＩＶＵＳで動脈硬化による冠動脈の中程度の狭窄及び離心性繊維脂肪プラーク形成を確認した。２ｎｄＤＥＳ及び３ｒｄＤＥＳそれぞれ６頭ずつ冠動脈内に留置し、留置後２週間及び４週間目に、ＯＣＴ及び組織切片を作成し評価した。第２世代及び第３世代のＤＥＳ留置４週間後の血管内反応結果を表１１に示す。
【0151】
【表11】
【0152】
表１１に示すとおり、４週間後の血管内反応は、３ｒｄＤＥＳと比較して、２ｎｄＤＥＳは炎症性反応が強く、新生内膜の厚さ及びフィブリン堆積面積は留置２週間後、４週間後ともに有意に３ｒｄＤＥＳの方が２ｎｄＤＥＳより低かった。３ｒｄＤＥＳにおいて成熟した細胞外マトリクス及び高密度の平滑筋細胞を伴う新生内膜が観察された。
【0153】
また、ＳＢ系統Ｆ２世代～Ｆ４世代のホモ型（ＬＤＬＲ－／－）ミニブタに高脂肪食を４ヶ月間給与し、眼底動脈及び頚動脈の血管内変化を観察したところ、眼底動脈及び頚動脈に動脈硬化の所見か認められた。そこで、眼底カメラを用いて眼底動脈病変及び冠動脈病変の相関性を検討したところ、網膜のミクログロリアはアメーバー状の形状を示した。また、ミクログロリアのＧＦＡＰの活性が観察された。造影頚動脈エコーを用いて、総頚動脈内膜中膜複合体厚の増加を伴う動脈硬化病変進展による輝度変化と同部の組織学的な壁内栄養血管の増生の相関性について、定量評価を行った。また、外膜側頚動脈栄養血管（ｖｖ）の増殖が動脈硬化発展早期に発現した。
【産業上の利用可能性】
【0154】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、強健性の高いブタの安定的な生産が可能であり、多くの世代交代を経てもＬＤＬＲ遺伝子の遺伝子型をホモ（ＬＤＬＲ－／－）に保持し、系統維持が容易である。また、ウイルスベクターを介さずに遺伝子改変が行われており、２重扉、逃亡防止策などのＰ３Ａ施設での飼育管理が可能であるため、これまでに開発された遺伝子改変ブタと比較して、飼養におけるハードルが低く、通常の養豚農家、ベンチャー企業での飼育管理や増殖管理が可能である。
【0155】
本発明の一態様の非クローンミニブタは、ヒト用に開発された治療器具及び診断機器をそのまま利用できるなどの外挿性が高く、治療後の短期間から長期間の生体変化及び血管内変化をスクリーニングが可能であり、その汎用性は高い。高コレステロール血症及び動脈硬化症の研究分野、疾患モデル動物の分野、高コレステロール血症及び動脈硬化症の新たな診断方法、治療薬及び予防薬、治療方法及び治療後の副作用の解明、治療器具の素材の検討、さらに再治療方法の開発などの多岐に渡る分野に好適に利用することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
