特開 2022-79240 魚類の冷水病菌の増殖抑制微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022079240

(43)【公開日】2022-05-26

(54)【発明の名称】魚類の冷水病菌の増殖抑制微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220519BHJP

   A01K 61/13 20170101ALI20220519BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

A01K61/13

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020190314

(22)【出願日】2020-11-16

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(71)【出願人】

【識別番号】507157045

【氏名又は名称】公立大学法人福井県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】竹内 美緒

(72)【発明者】

【氏名】永田 恵里奈

(72)【発明者】

【氏名】末武 弘章

【テーマコード（参考）】

2B104

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B104AA27

2B104BA13

4B065AA01X

4B065AA27X

4B065AC14

4B065CA43

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】ヒトや魚類に対して安全性の高い冷水病菌の増殖抑制剤、および冷水病の予防剤を提供する。
【解決手段】独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２９０を付与されたBosea sp. OX14株、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３２８９を付与されたFlavobacterium sp. GL7株、または上記菌株の近縁細菌であって冷水病菌に対する増殖抑制作用を有する細菌、これらの細菌の培養上清、ならびにこれらの細菌または培養上清を含む冷水病菌の増殖抑制剤および冷水病の予防剤。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

冷水病菌（Flavobacterium psychrophilum）に対する増殖抑制作用を有するBosea属またはFlavobacterium属の細菌。

【請求項2】

冷水病菌に対する増殖抑制作用を有する細菌であって、その１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列が、
（ａ）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２９０を付与されたBosea sp. OX14株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列、または
（ｂ）独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２８９を付与されたFlavobacterium sp. GL7株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列
に対して９８％以上の同一性を有する、細菌。

【請求項3】

独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２９０を付与されたBosea sp. OX14株。

【請求項4】

独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２８９を付与されたFlavobacterium sp. GL7株。

【請求項5】

冷水病菌に対して抗菌活性を有する請求項１～４のいずれか１項記載の細菌の培養上清。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか１項記載の細菌または請求項５記載の培養上清を冷水病菌に適用することを含む、冷水病菌の増殖抑制方法。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか１項記載の細菌または請求項５記載の培養上清を含む、冷水病菌の増殖抑制剤。

【請求項8】

請求項１～４のいずれか１項記載の細菌または請求項５記載の培養上清を魚類に適用することを含む、冷水病の予防方法。

【請求項9】

請求項１～４のいずれか１項記載の細菌または請求項５記載の培養上清を有効成分として含む、冷水病の予防剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、魚類の冷水病の抑制に関する。詳細には、冷水病菌の増殖を抑制する細菌およびその培養上清、ならびにそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

世界の養殖産業は増加の一途をたどっている。淡水養殖においては、ニジマスやギンザケなどのサケ科魚類、アユなどが主要であるが、冷水病菌などによる魚病被害による経済損失が大きい。

【0003】

冷水病は、冷水病菌（Flavobacterium psychrophilum）によって引き起こされ、鰓蓋下部の出血や体表の潰瘍等穴あき症状を特徴とする。もともとは北米の病気であったが、日本でも昭和６０年代からサケ、ニジマス、アユでの感染が確認されている（非特許文献１）。

【0004】

発生する冷水病菌に対しては、主に抗生物質が用いられているが、近年世界的に抗生物質耐性菌の拡大が懸念され、抗生物質を用いない方法が求められている。

【0005】

様々な魚病に対して、ワクチンが有効である。冷水病菌に対しても盛んにワクチン開発が行われているものの（特許文献１、２、３、４、５）、冷水病菌に対しては、商業的に利用されているワクチンは未だ存在しないのが現状である（非特許文献２）。

【0006】

抗生物質の利用が制限されるようになってきたこと、利用できるワクチンがないことなどから、代替法として冷水病菌に抗菌活性を持つ微生物の利用が期待され、多くの抗菌微生物が探索されてきた。例えば、Carnobacterium sp. （非特許文献３）、Pseudomonas sp.（非特許文献４、５、６、７）、Enterobacter sp. （非特許文献８）、Luteimonas sp., Rhodococcus sp., Microbacterium sp., Sphingopyxis sp., Dietzia sp. (非特許文献９）などが知られている。

【0007】

上記の抗菌活性を持つ微生物のうち、Pseudomonas sp., Enterobacter sp.は餌として投与した際、冷水病菌による致死率が低下することが実験レベルで示されている（非特許文献４、８）。しかし、いずれも商業的利用には至っていない。

【0008】

餌として投与する方法では、投与した微生物がなかなか腸内に定着しないことが課題である（非特許文献１０）。

【0009】

近年、魚類の腸内細菌と上皮細胞は、ほ乳類と異なりキチン質膜で隔てられていることが明らかになり（非特許文献１１）、従来行われてきた腸内細菌を対象にしたプロバイオティクスの餌としての利用は、ほ乳類ほど効果がない可能性も生じてきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開2017-088532

【特許文献2】特開2008-220262

【特許文献3】特開2008-137933

【特許文献4】特開2004-352690

【特許文献5】特開2004-210769

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Wakabayashi et al., 1994. Fish Pathology 29: 101-104

【非特許文献2】Gomez et al., 2014. Microbial Biotechnology 7: 414-423.

【非特許文献3】Robertson et al., 2000. Aquaculture 185: 235-243.

【非特許文献4】Korkea-aho et al., 2011. Journal of Applied Microbiology 111: 266-277.

【非特許文献5】Strom-Bestor and Wiklund, 2011. Journal of Fish Diseases 34: 255-264.

【非特許文献6】De la Fuente et al., 2013. SpringerPlus 2: 176.

【非特許文献7】非特許文献7 De la Fuente et al., 2015. J Aquat Anim Health 27: 112-122.

【非特許文献8】Schubiger et al., 2015. Applied and Environmental Microbiology 81: 658-665.

【非特許文献9】Boutin et al., 2012. Veterinary Microbiology 155: 355-361.

【非特許文献10】Aubin et al., 2005. Aquaculture Research 36: 758-767.

【非特許文献11】Nakashima et al., 2018. Nature Communications 9: 3402.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

冷水病発生時には、治療薬としてスルフィソゾールが使用されているが、治療効果も十分ではなく、また上記のように、現在までに冷水病菌に有効な予防剤は開発されていない。

【0013】

プロバイオティクス菌の餌としての投与も実験レベルで行われてきたものの、実用化されておらず、上記のように腸内細菌相の改善によるプロバイオティクス菌の効果は、魚類ではほ乳類ほど期待できない可能性も明らかになってきた。

【0014】

以上のように、抗生物質やワクチンに頼らない新規な感染予防手段が強く求められている。本発明は、腸内ではなく感染門戸となる皮膚からの作用に着目し、冷水病菌の増殖抑制効果を持つ皮膚細菌およびその培養上清、ならびに該細菌が生産する抗冷水病菌物質を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

上記のような課題を解決するため、本発明者らは冷水病を予防するための有用細菌の探索を行った。探索にあたり、魚類の皮膚常在菌であること、ヒトに対する病原菌でないこと、冷水病菌の増殖抑制作用を示すこと、を条件とした。

【0016】

以上の観点から本発明者らは、本発明者らが所有するニジマスの皮膚粘液から１７４株の皮膚常在菌を得た。これらの培養上清を用いた冷水病菌の増殖抑制効果を調べたところ、Bosea sp. OX14株（以下、「ＯＸ１４株」ということがある）ならびにFlavobacterium sp. GL7株（以下、「ＧＬ７株」ということがある）に増殖抑制作用があることを見出し、本発明を完成した。なお、Bosea属細菌は、日本細菌学会による病原細菌のＢＳＬレベルリストに含まれておらず、これまでにヒトに対する病原性も確認されていないことから病原菌ではないと考えられる。Flavobacterium属については、F. branchiophilum、F. columnare、F. devorans、F. johnsoniae、F. mizutaii、F. psychrophilumなどが日和見病原体とされているが、ＧＬ７株はこれらの種とは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の同一性が９８％未満であり、別種と考えられることからヒトに対する病原菌でない可能性が高い。加えて、ＧＬ７株は３６℃では増殖できないことからヒトに対する病原性はないと判断される。

【0017】

すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）冷水病菌に対する増殖抑制作用を有するBosea属またはFlavobacterium属の細菌。
（２）冷水病菌に対する増殖抑制作用を有する細菌であって、その１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列が、
（ａ）ＯＸ１４株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列、または
（ｂ）ＧＬ７株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列
に対して９８％以上の同一性を有する、細菌。
（３）ＯＸ１４株。
（４）ＧＬ７株。
（５）冷水病菌に対して抗菌活性を有する（１）～（４）のいずれか記載の細菌の培養上清。
（６）（１）～（４）のいずれか記載の細菌または（５）記載の培養上清を冷水病菌に適用することを含む、冷水病菌の増殖抑制方法。
（７）（１）～（４）のいずれか記載の細菌または（５）記載の培養上清を含む、冷水病菌の増殖抑制剤。
（８）（１）～（４）のいずれか記載の細菌または（５）記載の培養上清を魚類に適用することを含む、冷水病の予防方法。
（９）（１）～（４）のいずれか記載の細菌または（５）記載の培養上清を有効成分として含む、冷水病の予防剤。

【発明の効果】

【0018】

本発明は、世界各国でサケ科魚類、アユの養殖において問題となっている冷水病菌に対する増殖抑制作用を有する新規なＯＸ１４株およびＧＬ７株、ならびにそれらの近縁種、それらの培養上清、それらが生成する増殖抑制物質等を提供するものである。これらを用いることにより、従来の抗生物質、ワクチンなどを用いることなく冷水病菌の予防に用いることができる。しかも、本発明によるＯＸ１４株ならびにＧＬ７株は少なくとも魚類の皮膚常在菌であることから、魚類にとっても、それを食するヒトにとっても安全性が高いという利点がある。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、予め寒天培地に増殖させたＯＸ１４株に対して、垂直に冷水病菌ＫＵ１９０６２８－７８株を接種し、５日間培養したものを示す。コントロールは、ＯＸ１４株を増殖させていない寒天培地に同様に冷水病菌ＫＵ１９０６２８－７８株を接種し、５日間培養したものを示す。

【図2】図２は、ＯＸ１４株の対数増殖期中期、後期、ならびに定常期の培養上清による冷水病菌ＫＵ１９０６２８－７８株に対する増殖抑制効果を示すグラフである。コントロールは同量の培地を添加した場合の増殖である。この際の濁度測定値を１００％とした。＊は統計的に有意な減少を示す（ｐ＜０．０５）。

【図3】図３は、ＯＸ１４株の培養上清の、熱処理、３ｋＤａ以下、３ｋＤａ以上の画分、陰イオン交換カラムの通過画分、高塩濃度バッファーによって溶出するタンパク質画分、および１％のギ酸を含むメタノールによって溶出する低分子画分による冷水病菌ＫＵ１９０６２８－７８株に対する増殖抑制効果を示すグラフである。コントロールは同量の培地を添加した場合の増殖である。この際の濁度測定値を１００％とした。＊は統計的に有意な減少を示す（ｐ＜０．０５）。

【図4】図４は、予め寒天培地に増殖させたＧＬ７株に対して、垂直に冷水病菌ＮＣＩＭＢ １９４７株を接種し、２日間培養したものを示す。コントロールは、ＧＬ７株を増殖させていない寒天培地に同様に冷水病菌ＮＣＩＭＢ １９４７株を接種し、２日間培養したものを示す。

【図5】図５は、ＧＬ７株の対数増殖期中期、後期、ならびに定常期の培養上清による冷水病菌ＮＣＩＭＢ １９４７株に対する増殖抑制効果を示すグラフである。コントロールは同量の培地を添加した場合の増殖である。この際の濁度測定値を１００％とした。＊は統計的に有意な減少を示す（ｐ＜０．０５）。

【図6】図６は、ＧＬ７株の培養上清の、３ｋＤａ以下、３ｋＤａ以上の画分、陰イオン交換カラムの通過画分、高塩濃度バッファーによって溶出するタンパク質画分、および１％のギ酸を含むメタノールによって溶出する低分子画分による冷水病菌ＮＣＩＭＢ １９４７株に対する増殖抑制効果を示すグラフである。コントロールは同量の培地を添加した場合の増殖である。この際の濁度測定値を１００％とした。＊は統計的に有意な減少を示す（ｐ＜０．０５）。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明は、１の態様において、冷水病菌に対する増殖抑制作用を有するBosea属の細菌またはFlavobacterium属の細菌を提供する。

【0021】

本発明はさらなる態様において、冷水病菌に対する増殖抑制作用を有する細菌であって、その１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列が、
（ａ）ＯＸ１４株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列、または
（ｂ）ＧＬ７株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列
に対して９８％以上の同一性を有する、細菌を提供する。

【0022】

すなわち、上記態様において、ＯＸ１４株の近縁種およびＧＬ７株の近縁種が提供される。上述のごとく、本発明者らは冷水病を予防するための有用細菌の探索を行い、冷水病菌の増殖抑制作用を有するＯＸ１４株およびＧＬ７株を得た。これらの細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、それぞれ、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２９０およびＮＩＴＥ ＡＰ－０３２８９を付与された。これらの細菌の近縁種も同様に冷水病菌の増殖抑制作用を有すると考えられる。近縁種であるかどうかについては、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の同一性によって判断するのが一般的である。本発明の上記態様の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡは、ＯＸ１４株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列、またはＧＬ７株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に対して９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有する。１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の同一性は、ＤＮＡ抽出、バクテリア用に汎用されているプライマーを用いたＰＣＲ (Polymerase Chain Reaction)、ＰＣＲによって増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンス解析、国立遺伝学研究所の提供する相同性検索サービス、ＢＬＡＳＴを用いた塩基配列の相同性検索などの公知の手段を用いて調べることができる。

【0023】

実施例に記載するように、ＯＸ１４株およびＧＬ７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、それぞれ、Bosea lupini、Flavobacterium tructaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対して９９．６％、９８．９％の同一性を示した。したがって、ＯＸ１４株およびＧＬ７株の近縁種の例としては、それぞれ、Bosea属の細菌およびFlavobacterium属の細菌が挙げられ、好ましくは、Bosea lupini種の細菌およびFlavobacterium tructae種の細菌が挙げられる。

【0024】

本発明は、特別な態様において、ＯＸ１４株を提供する。本発明は、もう１つの特別な態様において、ＧＬ７株を提供する。

【0025】

本発明の冷水病菌の増殖抑制作用を有する細菌は公知の方法にて培養することができる。

【0026】

本発明の細菌は、通常は、約１０℃～約３０℃の温度範囲にて培養することができる。例えば、ＯＸ１４株は約１０℃～約３０℃で増殖し、至適温度は約２５℃である。ＧＬ７株は約１０℃～約２５℃で増殖し、至適温度は約２５℃である。当業者は、培養すべき細菌に応じて適切な培養温度を選択することができる。

【0027】

本発明の細菌の培養に用いる培地は公知のものであってよい。例えば、ＯＸ１４株およびＧＬ７株を、ＦＬＰ培地（Cepeda et al., 2004. Aquaculture 238: 75-82）にて培養してもよい。ＦＬＰ培地の組成は以下の通りである。１０００ｍｌの脱イオン水中、トリプトン ４．０ｇ、グルコース ０．５ｇ、イーストエキス ０．４ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ｐＨ７．２。Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地またはＯＸＯＩＤ ＣＭ３培地をこれらの菌株の培養に用いてもよい。当業者は、培養すべき細菌に応じて適宜培地を選択することができ、培地組成を変更することができる。

【0028】

冷水病菌に対する所望の増殖抑制作用が見られるまで本発明の細菌を培養することができる。冷水病菌の増殖抑制作用は、例えば以下のようにして調べることができる。冷水病菌を含む液に本発明の細菌の培養上清を添加して、適当温度にて適当時間培養した後（経時的に培養液をサンプリングしてもよい）、目視により、あるいは６００ｎｍにおける濁度を測定することにより冷水病菌の増殖を判定することができる。

【0029】

本発明は、もう１つの態様において、ＯＸ１４株、ＯＸ１４株の近縁種、ＧＬ７株、またはＧＬ７株の近縁種の培養上清であって、冷水病菌に対して抗菌活性を有する培養上清を提供する。

【0030】

培養上清が冷水病菌に対して抗菌活性を有するかどうかは、例えば上で説明したようにして冷水病菌の増殖を調べることにより判定することができる。増殖抑制作用が強いほど、抗菌活性が高いと判断することができる。

【0031】

本発明の細菌を使用するに際し、本発明の細菌を含む培養液を使用してもよく、遠心分離や膜濾過等の手段により分離した本発明の細菌を用いてもよい。本発明の細菌を含む培養液を遠心分離や膜濾過等の手段に供することにより、培養上清を得ることができる。培養上清をそのまま使用してもよく、培養上清を限外濾過、エバポレーション、クロマトグラフィー、有機溶媒による沈殿等の手段により分画および／または濃縮して使用してもよい。あるいは凍結乾燥等の処理をした培養上清を使用してもよい。

【0032】

本発明は、さらなる態様において、本発明の細菌またはその培養上清を冷水病菌に適用することを含む、冷水病菌の増殖抑制方法を提供する。

【0033】

本発明の細菌またはその培養上清を冷水病菌に適用する方法の具体例としては、例えば、魚類の養殖槽に本発明の細菌またはその培養上清を投入することが挙げられる。また例えば、本発明の細菌またはその培養上清を投入したプールにて魚類を一定時間飼育することが挙げられる。このようなプールでの飼育を複数回繰り返してもよい。本発明の細菌が魚類の皮膚に定着するまで飼育することが好ましい。本発明の細菌またはその上清を冷水病菌に適用する方法のさらなる具体例としては、養殖槽からの排水処理が挙げられる。例えば、排水をプールに貯留し、本発明の細菌またはその培養上清を添加して処理した後、河川や海に流してもよい。また例えば、本発明の細菌を固定化した担体を含む層に排水を通過させ、連続的に処理してもよい。このような処理により、河川や海が冷水病菌に汚染されるのを防止することができる。

【0034】

本発明の細菌またはその上清の使用量は、望まれる冷水病菌増殖抑制効果の程度、魚類の種類、魚類の数、養殖槽のサイズ、適用時間または排水の量などに応じて、当業者が適宜決定することができる。

【0035】

本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の細菌またはその培養上清を含む、冷水病菌の増殖抑制剤を提供する。

【0036】

本発明の剤は公知の方法にて製造できる。例えば、本発明の細菌またはその培養上清を適当な担体と混合し、所望により濃縮、乾燥、打錠、粉砕等の工程を経て所望の剤形に成形することができる。本発明の剤の剤形は特に限定されず、例えば液剤、ペースト、粉末、顆粒、ペレット、ブロック等であってもよい。

【0037】

例えば、本発明の剤を養殖槽に投入してもよい。また例えば、本発明の剤を投入したプールにて魚類を一定時間飼育してもよい。また例えば、プールに貯留された養殖槽からの排水に本発明の剤を投入してもよい。また例えば、本発明の剤が顆粒、ペレット、ブロック等の場合は、上述のごとく連続的に処理してもよい。

【0038】

本発明の剤の使用量は、望まれる冷水病菌増殖抑制効果の程度、魚類の種類、魚類の数、養殖槽のサイズ、適用時間または排水の量などに応じて、当業者が適宜決定することができる。

【0039】

本発明は、さらなる態様において、本発明の細菌またはその培養上清を魚類に適用することを含む、冷水病の予防方法を提供する。

【0040】

本発明の細菌またはその培養上清の魚類への適用方法は上述した方法と同様であってよい。

【0041】

対象となる魚類は、冷水病菌に感染する可能性のある魚類、ならびに冷水病菌に感染した魚類である。かかる魚類の種類は特に限定されず、例えば、サケ、マスなどのサケ科魚類、アユ、コイ科魚類、ウナギ等が挙げられる。対象となる魚類の典型例としては、サケ、ギンザケ、ベニザケ、マスノスケ、ブラウントラウト、カワマス、サクラマス、ニジマス、アユ等が挙げられる。

【0042】

本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の細菌またはその培養上清を有効成分として含む、冷水病の予防剤を提供する。

【0043】

本発明の予防剤の製造、剤形、魚類への投与については、冷水病菌の増殖抑制剤に関する上記説明をあてはめることができる。本発明の予防剤の投与量については、冷水病罹病率が低下し、好ましくはゼロになること、河川や海に放出される排水からの冷水病菌の消失、あるいは本発明の細菌の魚類の皮膚への定着等を目安に決定することができる。

【0044】

本明細書中の用語は、特に断らないかぎり、水産学、生物学、生化学、化学、薬学、獣医学等の分野において通常に理解されている意味に解される。

【0045】

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例0046】

実施例１：ニジマス皮膚粘液からの冷水病菌増殖抑制効果を有する細菌の分離および同定
本発明者らは、魚類の皮膚常在菌であること、ヒトに対する病原菌でないこと、冷水病菌の増殖抑制作用を示すことを条件として、ニジマスの皮膚粘液から有用細菌の探索を行った。本発明者らが所有するニジマスの皮膚粘液から１７４株の皮膚常在菌を得た。これらの培養上清を用いた冷水病菌の増殖抑制効果を調べたところ、ＯＸ１４株ならびにＧＬ７株に増殖抑制作用があることを見出した。

【0047】

ＯＸ１４株およびＧＬ７株は次のような菌学的性質を有していた。
ＯＸ１４株およびＧＬ７株について１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析したところ、それぞれBosea lupini、Flavobacterium tructaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対して９９．６％、９８．９％の同一性を示したことから、それぞれBosea sp. OX14、Flavobacterium sp. GL7と同定した。

【0048】

ＯＸ１４株およびＧＬ７株はＦＬＰ培地、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地、およびＯＸＯＩＤ ＣＭ３培地にてよく増殖した。ＯＸ１４株は約１０～約３０℃で増殖し、至適温度は約２５℃であった。ＧＬ７株は約１０～約２５℃で増殖し、至適温度は約２５℃であった。

【0049】

ニジマスの皮膚粘液、鰓、腸からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子のＶ３－Ｖ４領域をＰＣＲ増幅、Ｍｉｓｅｑシーケンサーを用いて解析し、それぞれの微生物相を明らかにした。微生物相の情報を基にＯＸ１４株ならびにＧＬ７株についてその存在量を調べた。その結果、ＯＸ１４株は、皮膚粘液、鰓、腸で１．６，６１．４，０．０％を占めており、ＧＬ７株は皮膚粘液、鰓、腸で０．２，０．０，０．０％であり、共に皮膚（ＯＸ１４株においては鰓においても）常在菌の主要構成員であった。

【0050】

また、アメリカのニジマスの皮膚粘液の微生物相データ（Lowrey et al., 2015. Applied and Environmental Microbiology 81: 6915-6925.）を用いて解析したところ、ＯＸ１４株ならびにＧＬ７株について０．０３，０．０５％で存在していることから、両株はニジマス皮膚細菌のコア微生物であることが示唆された。

【0051】

ＯＸ１４株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室にある独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２９０を付与された。ＧＬ７株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室にある独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３２８９を付与された。

【実施例0052】

実施例２：ＯＸ１４株による冷水病菌増殖抑制効果
ＯＸ１４株をＦＬＰ寒天培地上に直線状に接種し、７日間培養した。ＦＬＰ培地で培養した冷水病菌を増殖したＯＸ１４株に対して垂直方向かつ直線状に接種し、５日間培養した。

【0053】

その結果、ＯＸ１４株はアユで問題となっているＫＵ１９０６２８－７８株の増殖を抑制することが示された。ＫＵ１９０６２８－７８株は、近畿大学でアユの腎臓より分離された菌株である。試験結果を図１に示す。