特開 2022-80787 アルツハイマー病様症状緩和剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022080787

(43)【公開日】2022-05-30

(54)【発明の名称】アルツハイマー病様症状緩和剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/706 20060101AFI20220523BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220523BHJP

   A23L 33/13 20160101ALI20220523BHJP

   A23K 20/153 20160101ALI20220523BHJP

【ＦＩ】

A61K31/706

A61P25/28

A23L33/13

A23K20/153

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020192083

(22)【出願日】2020-11-18

(71)【出願人】

【識別番号】000103840

【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】新井 秀夫

(72)【発明者】

【氏名】小野 孝太

(72)【発明者】

【氏名】野嶋 純

(72)【発明者】

【氏名】表 和範

【テーマコード（参考）】

2B150

4B018

4C086

【Ｆターム（参考）】

2B150AA06

2B150AB10

2B150DC23

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE03

4B018MD44

4B018ME14

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA16

(57)【要約】

【課題】安全に摂取することができ、アルツハイマー病様症状を緩和させる作用を有する素材を提供する。
【解決手段】アルツハイマー病様症状緩和剤は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド、その薬理学的に許容される塩、及びそれらの溶媒和物から選ばれる１種を有効成分とする。健康補助食品は、前記症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和するために摂取される。飼料は、前記症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和させるために摂取される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド、その薬理学的に許容される塩、及びそれらの溶媒和物から選ばれる１種を有効成分とすることを特徴とする、アルツハイマー病様症状緩和剤。

【請求項2】

経口投与される、請求項１に記載の症状緩和剤。

【請求項3】

脳内におけるアミロイドβ蓄積に起因する空間認識力障害の予防又は治療に用いられる、請求項１又は２に記載の症状緩和剤。

【請求項4】

脳内におけるアミロイドβ蓄積に起因する学習能力障害又は記憶能力障害の予防に用いられる、請求項１又は２に記載の症状緩和剤。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和するために摂取される、健康補助食品。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか一項に記載の症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和させるために摂取される、飼料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、安全に摂取することができ、アルツハイマー病の症状を緩和することができる素材、及び当該素材を有効成分とするアルツハイマー病様症状緩和剤に関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病は認知機能が少しずつ衰えていく疾患で、高齢者における認知症の中で最も患者数が多い。全世界で問題となっており、世界の患者数では２０１５年は４，６８０万人と推定されているが、２０３０年までに７，４７０万まで増加するといわれている。アルツハイマー病は、アミロイドβタンパク質やタウタンパク質等が脳内に蓄積することが原因とされており、これらの蓄積により神経細胞が死滅して、脳が委縮することで認知機能障害が生じる。

【0003】

β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「β－ＮＭＮ」と称することがある。）は、補酵素ＮＡＤ^＋の生合成中間代謝産物である。近年、β－ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献１参照）、サーカディアンリズムの制御に関与していること（例えば、特許文献２参照）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有すること等が報告されている。さらに、β－ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献３参照）。さらに、β－ＮＭＮの投与は、生体中のＮＡＤ^＋量を高め、サーチュイン遺伝子を活性化することより、生体の加齢に伴う身体機能の低下を抑制及び遅延させ、抗老化の効果が期待されている（例えば、特許文献４参照）。最近、ＮＭＮをヒトに経口投与する臨床試験が行われ、安全性に問題がないことも確認されている（例えば、非特許文献１参照）。

【0004】

β－ＮＭＮをアルツハイマー病モデル動物に投与する研究は以前からされており、β－ＮＭＮにより認知機能の改善が報告されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。ただし非特許文献２では皮下投与、非特許文献３では腹腔内投与により、β－ＮＭＮをモデル動物に与えている。どちらの投与法も非経口投与であり、「実験動物の被験物質の投与（投与経路、投与容量）及び採血に関する手引き」には、投与容量、投与前後の処方の安定性、ｐＨ、粘度、浸透圧、緩衝能、処方の無菌性や生体適合性を考慮する必要があると述べられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第７７３７１５８号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１１／１２３５１０号明細書

【特許文献3】国際公開第２０１４／１４６０４４号

【特許文献4】国際公開第２０１７／２０００５０号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Irie J et al., “Effect of oral administration of nicotinamide mononucleotide on clinical parameters and nicotinamide metabolite levels in healthy Japanese men.”, Endocr J, Vol. 67, No. 2, pp. 153-160, 2020.

【非特許文献2】Long AN et al., “Effect of nicotinamide mononucleotide on brain mitochondrial respiratory deficits in an Alzheimer’s disease-relevant murine model.”, BMC Neurol, Vol. 15, No. 19, 2015.

【非特許文献3】Wang X et al., “Nicotinamide mononucleotide protects against β-amyloid oligomer-induced cognitive impairment and neuronal death.”, Brain Res, Vol. 1643, pp. 1-9, 2016.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、安全に摂取することができ、アルツハイマー病様症状を緩和させる作用を有する素材を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、β－ＮＭＮがアルツハイマー病様症状を緩和させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明は、以下のアルツハイマー病様症状緩和剤、健康補助食品、及び飼料を提供するものである。
［１］ β－ＮＭＮ、その薬理学的に許容される塩、及びそれらの溶媒和物から選ばれる１種を有効成分とすることを特徴とする、アルツハイマー病様症状緩和剤。
［２］ 経口投与される、前記［１］の症状緩和剤。
［３］ 脳内におけるアミロイドβ蓄積に起因する空間認識力障害の予防又は治療に用いられる、前記［１］又は［２］の症状緩和剤。
［４］ 脳内におけるアミロイドβ蓄積に起因する学習能力障害又は記憶能力障害の予防に用いられる、前記［１］又は［２］の症状緩和剤。
［５］ ［１］～［４］のいずれかの症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和するために摂取される、健康補助食品。
［６］ ［１］～［４］のいずれかの症状緩和剤を含有し、アルツハイマー病様症状を緩和させるために摂取される、飼料。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係るアルツハイマー病様症状緩和剤は、元々生体内に存在するβ－ＮＭＮを有効成分とし、アルツハイマー病様認知機能障害を緩和させることができる。このため、本発明に係るアルツハイマー病様症状緩和剤は、副作用を起こすことなく安全に摂取することができ、脳内のアミロイドβの蓄積により引き起こされる疾患の予防や緩和に有効である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１において、１週間前からβ－ＮＭＮ ０．２ｍＭ含有培地で毎日培地交換した群とβ－ＮＭＮを含まない培地で毎日交換した群の各ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるアミロイドβ４２（Ａβ４２）に対する毒性について、ルシフェラーゼアッセイにより、細胞生存率を評価し、生存率（％）で示したグラフである。

【図2】実施例２において、β－ＮＭＮを１週間前から投与した群（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）とＡβ投与後にβ－ＮＭＮを投与した群（ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）と偽手術群（Ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）と水のみを投与した群（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）の各マウスについて、Ｙ迷路における行動試験により、自発的交替行動率をもとに空間認識力を評価し、自発的交替行動率（％）を示したグラフである。

【図3】実施例２において、β－ＮＭＮを１週間前から投与した群（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）とＡβ投与後にβ－ＮＭＮを投与した群（ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）と偽手術群（Ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）と水のみを投与した群（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）の各マウスについて、受動回避試験により、反応潜時をもとに学習及び記憶能力を評価し、反応潜時（ｓｅｃ）を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明に係るアルツハイマー病様症状緩和剤（以下、「本発明に係る症状緩和剤」ということがある。）は、ＮＭＮ（化学式：Ｃ_１１Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_８Ｐ）を有効成分とし、アルツハイマー病様認知機能障害を予防又は緩和させるという効果を有する。このため、本発明に係る症状緩和剤は、アルツハイマー病により引き起こされる症状に対する予防又は治療のための経口用組成物又は外用組成物の有効成分として好適である。なお、ここでいうアルツハイマー病様認知機能障害とは、例えば、記憶障害、見当識障害、判断力障害（実行機能障害）、高次機能障害（失語、失認、失行）等が挙げられる。後述する実施例に示すように、ＮＭＮは、アミロイドβ蓄積に起因する認知機能障害、特に空間認識力障害を改善することができる。また、ＮＭＮは、神経細胞におけるアミロイドβによる毒性を予防して細胞死を抑制できるため、アルツハイマー病様症状の予防剤としても有効である。具体的には、アミロイドβ蓄積前にＮＭＮを摂取することにより、アミロイドβの蓄積による認知機能障害、具体的には、空間認識力や学習及び記憶能力への障害が予防できる。このように、本発明に係る症状緩和剤は、特に、脳内へのアミロイドβ蓄積に起因する空間認識力障害の予防又は治療剤、脳内へのアミロイドβ蓄積に起因する学習能力障害の予防剤、脳内へのアミロイドβ蓄積に起因する記憶能力障害の予防剤として有用である。さらに、本発明に係る症状緩和剤は、アミロイドβによる神経細胞死の抑制剤としても有用である。

【0013】

ＮＭＮには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明に係る症状緩和剤の有効成分となるＮＭＮは、β－ＮＭＮ（ＣＡＳ番号：１０９４－６１－７）である。β－ＮＭＮの構造を下記に示す。

【0014】

【化1】

【0015】

有効成分とするβ－ＮＭＮとしては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ－ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β－ＮＭＮは広く生体に存在する成分であるため、動物、植物、微生物等の天然原料から抽出・精製することによって得られたβ－ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ－ＮＭＮを使用してもよい。

【0016】

β－ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ＮＡＭとＬ－リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ－ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ＮＡＭと５’－ホスホリボシル－１’－ピロリン酸（ＰＲＰＰ）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によりβ－ＮＭＮを製造できる。発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ＮＡＭからβ－ＮＭＮを製造できる。

【0017】

本発明に係る症状緩和剤の有効成分としては、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩であってもよい。β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。

【0018】

本発明に係る症状緩和剤の有効成分としては、遊離のβ－ＮＭＮの溶媒和物、又はβ－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。

【0019】

本発明に係る症状緩和剤は、β－ＮＭＮに加えてその他の有効成分を含有していてもよい。当該他の有効成分としては、β－ＮＭＮによるアルツハイマー病様症状の緩和効果を損なわないものであれば特に限定されるものではない。当該他の有効成分としては、例えば、β－ＮＭＮ以外の公知のアルツハイマー病様症状の緩和効果を有する機能性素材等が挙げられる。公知のアルツハイマー病様症状の緩和効果を有する機能性素材としては、例えば、イチョウ、オメガ３脂肪酸（魚油）、ビタミンＢ及びＥ、朝鮮ニンジン、ブドウ種子エキス、クルクミン等が挙げられる。

【0020】

本発明に係る症状緩和剤は、有効成分のみからなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。例えば、本発明に係る症状緩和剤は、有効成分を医薬用無毒担体と組み合わせて、製剤上の常套手段により様々な剤型に製剤化することができる。本発明に係る症状緩和剤の剤型のうち、経口投与剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤；溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤；凍結乾燥製剤等が挙げられる。非経口投与剤としては、注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤等が挙げられる。

【0021】

製剤化に使用する医薬用無毒担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、果糖、還元麦芽糖等の糖類；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストリン、β－シクロデキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の炭水化物；マンニトール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール；脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のエステル類；ポリエチレングリコール、エチレングリコール、アミノ酸、アルブミン、カゼイン、二酸化珪素、水、生理食塩水等が挙げられる。また、本発明に係る症状緩和剤の製剤化においては、製剤上の必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、矯味矯臭剤、着色剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。

【0022】

本発明に係る症状緩和剤は、ヒトやヒト以外の動物に投与されることが好ましい。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物が挙げられる。本発明に係る症状緩和剤としては、ヒト、家畜、実験動物、ペットに投与又は摂取されるものであることが好ましく、ヒトに投与又は摂取されるものであることがさらに好ましい。

【0023】

本発明に係る症状緩和剤の投与量又は摂取量は、投与される動物の生物種、年齢（月齢）、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択及び決定される。例えば、成人１人あたりの１日量を、β－ＮＭＮ量として、０．１ｍｇ～１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～７ｇ、より好ましくは１０ｍｇ～５ｇ、さらに好ましくは１００ｍｇ～２ｇを、１回又は数回に分けて投与することができる。

【0024】

β－ＮＭＮは、生体構成成分であり、かつ食品中にも含まれている成分であることから、安全性が高いと考えられる。そこで、本発明に係る症状緩和剤は、アルツハイマー病様症状を緩和するために摂取される、健康補助食品の有効成分として用いることができる。健康補助食品は、健康状態の維持又は改善を目的として栄養を補助するための飲食品であり、特定保健用食品、栄養機能食品、及び健康食品も含む。本発明に係る症状緩和剤は、安全性が高く、長期間の継続的摂取に適していることから、当該症状緩和剤を含む健康補助食品は、優れたアルツハイマー病の予防及び改善作用が期待される。

【0025】

また、本発明に係る症状緩和剤は、アルツハイマー病様症状を緩和するために動物に摂取させる飼料の有効成分として用いることができる。当該飼料を家畜、ペット、実験動物等に与えることにより、摂取させた動物の脳内のアミロイドβの蓄積による毒性が予防されて、神経細胞の細胞死が抑制される結果、アルツハイマー病の予防や病態の改善が期待できる。

【0026】

本発明に係る健康補助食品及び飼料は、β－ＮＭＮ等に適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、粉末状、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、ペースト状等に形成することによって製造できる。本発明に係る健康補助食品は、そのまま食用に供してもよく、種々の食品や飲料に混合させた状態で食用に供してもよい。例えば、粉末状の健康補助食品を、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲料に溶解又は分散させた状態で摂取させることができる。本発明に係る飼料も、そのまま動物に摂取させてもよく、他の固形飼料や飲料水に混合させた状態で動物に摂取させてもよい。

【0027】

本発明に係る健康補助食品及び飼料は、その他の食品素材や種々の添加剤を含有することができる。食品素材としては、ビタミン類、糖質、蛋白質、脂質、食物繊維、果汁等が挙げられる。具体的には、例えば、ビタミンＢ１誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸等のビタミンＢ群；ビタミンＥ、ビタミンＤ又はその誘導体、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、βカロチン等の脂溶性ビタミン；カルシウム、カリウム、鉄、亜鉛等のミネラル；酵母、Ｌ－カルニチン、クレアチン、α－リポ酸、グルタチオン、グルクロン酸、タウリン、コラーゲン、大豆イソフラボン、レシチン、ペプチド、アミノ酸、γ－アミノ酪酸、ジアシルグリセロール、ＤＨＡ、ＥＰＡ、カプサイシン、コンドロイチン硫酸、アガリクス茸エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、青汁、レシチン、ローヤルゼリー、プロポリス、オクタコサノール、フラバンジェノール、ピクノジェノール、マカ、キトサン、ガルシニアエキス、コンドロイチン、グルコサミン等が挙げられる。添加剤としては、甘味料、有機酸等の酸味料、安定剤、香料、着色料等が挙げられる。

【実施例0028】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0029】

［マウス］
以降の実験で用いたＳｌｃ：ｄｄＹ マウスは、全実験期間中を通して、ＳＰＦ環境下で飼育した。全実験期間中、固型飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業株式会社）と飲料水は、自由摂取させた。

【0030】

［経口投与］
経口投与は、β－ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）を注射用水（大塚製薬工場社製）に溶解させた溶液を、ラット用ディスポーザブル経口ゾンデ（有限会社フチガミ器械）を取り付けたポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒（テルモ株式会社）を用いて強制的に投与した。

【0031】

［Ａβ脳室内注入アルツハイマー病モデルマウスの作製］
ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社）４０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与（投与液量：１０ｍＬ／ｋｇ）し、麻酔した。麻酔後、頭皮にレボブピバカイン塩酸塩（ポプスカイン（登録商標）０．２５％注、丸石製薬株式会社）を皮下投与（０．１ｍＬ）した。動物の頭頂部の毛を刈り、頭部を脳定位固定装置に固定した。頭頂部をイソジンで消毒後に切開して、頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨上の結合組織を綿棒で取り除いた後、ブロワーで乾燥させてｂｒｅｇｍａの位置を見やすくした。歯科用ドリルを用いてｂｒｅｇｍａより側方１ｍｍ（右側）、後方０．２ｍｍの頭蓋骨にステンレス製パイプ刺入用の穴を開けた。外径０．５ｍｍのシリコンチューブ及びマイクロシリンジに接続されたステンレス製パイプを骨表面から２．５ｍｍの深さまで垂直に刺入する。脳室内にアミロイドβ溶液３μＬ（６ｎｍｏｌ／３μＬ）をマイクロシリンジポンプで３分間かけて注入した（偽手術群は注射用水を３μＬ注入）。注入後は、ステンレス製パイプを挿入したまま３分間静置し、ステンレス製パイプをゆっくりと抜去した。頭蓋穴を非吸収性骨髄止血剤（ネストップ（登録商標）、アルフレッサファーマ株式会社）で塞ぎ、頭皮を縫合した。動物を脳定位固定装置から外し、飼育ケージに戻した。なお、ステンレス製パイプ及びシリコンチューブは滅菌済みのものを使用した。

【0032】

［Ｙ迷路試験（自発的交替行動試験）］
試験には、１本のアームの長さが３９．５ｃｍ、床の幅が４．５ｃｍ、壁の高さが１２ｃｍで、３アームがそれぞれ１２０度に分岐しているプラスチック製のＹ字型迷路（有限会社ユニコム）を用いた。
測定前に、装置の床面の照度が１０～４０ｌｘになるように調節した。測定は、投与約１時間（＋１０分）後に行った。動物をＹ字型迷路のいずれかのアームに置き、８分間迷路内を自由に探索させた。動物が測定時間内に移動したアームの番号（Ａ～Ｃ）を記録し、アームに移動した回数を数え、総エントリー数とした。次に、この中で連続して異なる３つのアームを選択した組み合わせを調べ、この数を自発的交替行動数とした。さらに以下の式を用いて自発的交替行動率を算出した。

【0033】

自発的交替行動率（％）＝［自発的交替行動数／（総エントリー数－２）］×１００

【0034】

［受託回避試験］
試験には、中央のギロチンドアに仕切られた明室（Ｗ：１００ｍｍ×Ｄ：１００ｍｍ×Ｈ：３００ｍｍ）と床のグリッドから電気刺激を与える暗室（Ｗ：２４０ｍｍ×Ｄ：２４５ｍｍ×Ｈ：３００ｍｍ）を備えたｓｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ型受動的回避反応装置（明暗箱：自社製、ＳＨＯＣＫ ＳＣＲＡＭＢＬＥＲ：有限会社ユニコム）を用いた。
測定は、投与約１時間（＋１０分）後に行った。動物を明室に入れて１０秒後にギロチンドアを静かに開け、動物が暗室に入るまでの時間（反応潜時）を測定した。
獲得試行（投与１０日）は、動物が暗室に入ると同時にギロチンドアを閉め電気刺激（０．２ｍＡ、２秒間、スクランブル方式）を与え、電気刺激負荷時の動物の鳴き声の有無を確認した。反応潜時の測定は最長３００秒までとした。
保持試行（投与１１日）は、動物が暗室に入るか、明室で３００秒経過したら終了とした。

【0035】

［実施例１］
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、Ａβ４２を添加する１週間前から、０.２ｍＭ ＮＭＮ含有培地で培養した。その間、培地交換は毎日行った。アッセイする前日にＮＭＮを含まない培地に交換し、１×１０／ｗｅｌｌで細胞を播種した。次の日に、各ウェルに濃度が異なるＡβ４２をそれぞれ添加し、２日後にルシフェラーゼアッセイによって細胞死を測定した。測定結果は図１に示す。ＮＭＮを事前に添加した細胞群では、ＮＭＮを添加していない群よりも、細胞死が抑制された。この結果から、Ａβの投与前にＮＭＮを投与することは、Ａβによる毒性を予防する効果があることが示唆された。

【0036】

［実施例２］
アルツハイマー病モデルマウスは、β－ＮＭＮをＡβ投与の１週間前から投与した群（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）と、Ａβ投与後にβ－ＮＭＮを投与した群（ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐ）と、偽手術群（Ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）と、水のみを投与した媒体対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）の４群に分け、各１０匹ずつとした（表１）。ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐは、β－ＮＭＮを１６日間投与した。ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐは、投与１～７日（Ａβ投与前）は媒体（注射用水）を投与し、投与８～１６日（Ａβ投与後）はβ－ＮＭＮを投与した。

【0037】

【表1】

【0038】

（Ｙ迷路試験の測定結果）
被験物質の投与開始日を投与１日とし、投与８日にアミロイドβを注入した。その後、投与１４日にＹ迷路試験を行った。測定結果は図１に示す。β－ＮＭＮを投与したｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐとｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐの両群で自発的交替行動率が改善する傾向が見られた。この結果から、β－ＮＭＮには、Ａβによる空間認識力障害を予防する効果と、Ａβによる空間認識力障害を治療する効果の両方があることが示唆された。

【0039】

（受動回避試験の測定結果）
被験物質の投与開始日を投与１日とし、投与８日にアミロイドβを注入した。その後、投与１５～１６日に受動回避試験を行った。測定結果は図２に示す。ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐでは反応潜時は改善しなかったが、β－ＮＭＮを事前に投与したｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｇｒｏｕｐでは改善する傾向が見られた。これらの結果から、β－ＮＭＮを事前に摂取しておくことにより、アミロイドβによる学習及び記憶能力に対する障害を予防できる可能が示唆された。

【図1】

【図2】

【図3】