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特開2022-81375胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、および製造又は試験キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022081375
(43)【公開日】2022-05-31
(54)【発明の名称】胎盤様オルガノイドの製造方法、胎盤様オルガノイド、および製造又は試験キット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20220524BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20220524BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220524BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735 ZNA
C12N5/074
C12N5/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021048452
(22)【出願日】2021-03-23
(31)【優先権主張番号】P 2020192182
(32)【優先日】2020-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】村谷 浩二
(72)【発明者】
【氏名】阿久津 英憲
(72)【発明者】
【氏名】中村 浩幸
(72)【発明者】
【氏名】川崎 友之
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BC42
4B065BD39
4B065CA05
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】長期の培養が可能である胎盤様オルガノイドの製造方法、上記の製造方法により製造される胎盤様オルガノイド、および上記胎盤様オルガノイドを含むキットを提供すること。
【解決手段】多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
【請求項2】
多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
多能性幹細胞をスフェロイド状態にした後に、スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、骨形成蛋白質ＢＭＰ４の非存在下において行う、請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
多能性幹細胞をスフェロイド状態にすること、および多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することのうちの少なくとも一つを、マイクロキャリアの存在下において行う、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
マイクロキャリアが多孔性である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項10】
胎盤様オルガノイドが、絨毛性性腺刺激ホルモン、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンからなる群から選択される少なくとも一つを産生することができる、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１から９の何れか一項に記載の方法により製造される、胎盤様オルガノイド。
【請求項12】
請求項１１に記載の胎盤様オルガノイドを含む、製造又は試験キット。
【請求項13】
生殖ホルモンの製造、被験物質の毒性又は安全性の評価、又は病原体の感染メカニズムの解析のために使用する、請求項１２に記載の製造又は試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多能性幹細胞から胎盤様オルガノイドを製造する方法に関する。本発明はさらに上記方法により製造される胎盤様オルガノイド、および製造又は試験キットに関する。
【背景技術】
【0002】
胎盤は、子宮における胎仔発生のために重要な臓器である。胎盤は、胎仔と母体環境とを、臍帯を介して連絡し、ガス、栄養、および排泄物の交換を行い、さらに妊娠関連ホルモンの産生および胎仔の免疫防御の支援を行っている。胎盤は、栄養膜系列の細胞から構成されている。
【0003】
非特許文献１には、ＢＭＰ４(Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ－４)を用いてヒトＥＳ細胞（ヒト胚性幹細胞）から合胞体栄養膜細胞（Ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ：胎盤を構成する細胞の１種で、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ともいう）を産生する）を分化誘導させる際に、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）シグナル伝達経路を阻害することにより効率的に分化が行われることが記載されている。非特許文献１においては、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコートしたプレートにおいて細胞培養を行っている。
【0004】
特許文献１には、ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰ－４等のＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、培養中の細胞とＢＭＰシグナル活性化物質を接触させ、栄養膜細胞（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）へと分化した培養物を得ることが記載されている。
【0005】
特許文献２には、霊長類幹細胞を、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＧＤＦ５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５）等の蛋白質栄養膜細胞（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）誘発因子１～１００ｎｇ／ｍＬを添加した培地において培養することにより、ヒト栄養膜細胞を得ることが記載されている。
【0006】
特許文献３には、胎盤幹細胞を胚性幹細胞の凝集塊に分散させ、ＦＧＦ、Ｗｎｔシグナル阻害物質等を含む培地中で浮遊培養し、栄養膜外胚葉様胞状構造体を得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，Ｓ．Ｓｕｄｈｅｅｒ ｅｔ．ａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ２１，Ｎｕｍｂｅｒ１６，２０１２，２９８７－３０００
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１６／１８６０７８Ａ１
【特許文献2】特表２００５－５２０５１４号公報
【特許文献3】特開２０１６－２１４１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
妊婦が摂取した物質は、胎盤を透過すると胎児に曝露される。物質が胎盤を透過するかどうかは、その物質による胎児への発生毒性の発現に大きく影響することから、物質が及ぼすヒト胎盤機能への影響やその物質の胎盤透過性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系の開発が求められている。しかし、細胞を二次元の接着培養により栄養外胚葉、さらに栄養膜細胞系へと分化誘導した場合には、２週間前後でｈＣＧ産生が停止し、長期の培養は困難であった。
【0010】
本発明は、長期の培養が可能である胎盤様オルガノイドの製造方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、上記の製造方法により製造される胎盤様オルガノイド、および上記胎盤様オルガノイドを含む製造又は試験キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することによって、長期の培養が可能である胎盤様オルガノイドを製造できることを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。本発明によれば、以下の発明が提供される。
【0012】
＜１＞ 多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、胎盤様オルガノイドの製造方法。
＜２＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にした後に、スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、＜２＞又は＜３＞に記載の方法。
＜５＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、骨形成蛋白質ＢＭＰ４の非存在下において行う、＜２＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすること、および多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することのうちの少なくとも一つを、マイクロキャリアの存在下において行う、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞ マイクロキャリアが多孔性である、＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞又は人工多能性幹細胞である、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞ 胎盤様オルガノイドが、絨毛性性腺刺激ホルモン、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンからなる群から選択される少なくとも一つを産生することができる、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ ＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法により製造される、胎盤様オルガノイド。
＜１２＞ ＜１１＞に記載の胎盤様オルガノイドを含む、製造又は試験キット。
＜１３＞ 生殖ホルモンの製造、被験物質の毒性又は安全性の評価、又は病原体の感染メカニズムの解析のために使用する、＜１２＞に記載の製造又は試験キット。
＜２＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にした後に、スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、＜２＞又は＜３＞に記載の方法。
＜５＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを、骨形成蛋白質ＢＭＰ４の非存在下において行う、＜２＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行う、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ 多能性幹細胞をスフェロイド状態にすること、および多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することのうちの少なくとも一つを、マイクロキャリアの存在下において行う、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞ マイクロキャリアが多孔性である、＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞又は人工多能性幹細胞である、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞ 胎盤様オルガノイドが、絨毛性性腺刺激ホルモン、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンからなる群から選択される少なくとも一つを産生することができる、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ ＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法により製造される、胎盤様オルガノイド。
＜１２＞ ＜１１＞に記載の胎盤様オルガノイドを含む、製造又は試験キット。
＜１３＞ 生殖ホルモンの製造、被験物質の毒性又は安全性の評価、又は病原体の感染メカニズムの解析のために使用する、＜１２＞に記載の製造又は試験キット。
【発明の効果】
【0013】
本発明の製造方法により製造される胎盤様オルガノイドは、２週間を超えてｈＣＧを産生し続けることができ、長期の培養が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本発明による胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む。
本発明による胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む。
【0016】
本発明の構成によれば、二次元の接着培養により誘導した細胞が２週間前後でｈＣＧを産生しなくなるのに対して、三次元の浮遊培養で誘導した細胞では２週間を超えてｈＣＧを産生し続ける。これまで２ケ月以上のｈＣＧ産生持続が確認されており、このｈＣＧのような胎盤ホルモン産生システムの構築が可能となる。またその長期培養可能な胎盤オルガノイドの特性を利用して、妊婦が摂取した食品・医薬品のうちどのような物質が胎盤機能に影響を及ぼすか、あるいはどのような物質が胎盤を通過し、その物質が中枢神経系やその他各組織の胚発生・胎児発達にどのような影響を及ぼすか評価することが可能となる。さらに胎盤を介して母体から胎児へ感染する感染症ウイルスのメカニズム解析も可能となる。
【0017】
本発明は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ＥＧ細胞（胚性生殖細胞）又はｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞から、胎盤を含む栄養外胚葉系の細胞、組織へと分化誘導を行う方法を提供するものである。従来においてはラミニンやＭａｔｒｉｇｅｌを表面にコートしたプレート上での二次元接着培養により分化誘導を行っていたが、その場合は胎盤特異的なホルモンであるｈＣＧの産生が２週間前後で停止する。また、従来技術の一例においては、予めラミニン(ｉＭａｔｒｉｘ-５１１：ニッピ)をコートした培養プレートを使用して分化誘導を行っている。即ち、ラミニンをコートした６ウェルプレートにｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を２ｍＬ分注し、ＢＭＰ４を添加してからｉＰＳ細胞を播種(４×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ前後)する。培養７日目前後から胎盤ホルモンｈＣＧを産生し始めるが、１４日目前後でｈＣＧ産生が停止する。場合によってはその培養段階前後から細胞がプレートから剥離し始め、培養が継続できなくなる。
【0018】
一方、本発明においては、スピナーフラスコ等による攪拌培養、又はスフェロイド調製用Ｕ字底９６ウェルプレート等を用いた静置培養により、三次元浮遊培養を行うことにより分化誘導を行う。これにより、長期に渡りｈＣＧを産生し続けることができる胎盤様オルガノイドが得られる。このオルガノイドは２ケ月以上に渡る長期培養が可能である。
【0019】
＜多能性幹細胞＞
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
【0020】
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性および自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いる。更に好ましくはｉＰＳ細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞が用いられ、最も好ましい態様では、ヒトｉＰＳ細胞が用いられる。
【0021】
ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、上記の初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１４５－１１４７（１９９８））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０（１９９７））、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６（１９９８））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素，４４，８９２（１９９９））、Ｂａｇｕｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６（１９９９））、Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７（１９９９）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４（１９９９））、Ｒｉｄｅｏｕｔ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９（２０００）、Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｙ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｃｅｌｌ（２０１３）ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１５，４８２－４８６（２００７））、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５，９８３－９８５（２００７））、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１，３４６－３５２（２００７））、Ｒｅｖａｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，９，４３２－４４９（２００７））、Ｒｅｖａｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１０，１１－２４（２００８））。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはＳｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ Ｎ．， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ．９：６２３－６２９，２００４；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４４４：４８１－４８５，２００６；Ｃｈｕｎｇ Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１１３－１１７，２００８；Ｚｈａｎｇ Ｘ．， ｅｔ ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６６９－２６７６，２００６；Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３６５，２００３等が参考になる。尚、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
【0022】
ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については国立成育医療研究センター研究所（例えば、ＳＥＥＳ１～７）、京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ ＢＩＯなどから入手可能である。
【0023】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞を、ＬＩＦ（白血病阻止因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）の存在下で培養すること等により樹立することができる（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，７０，８４１－８４７（１９９２）、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２３），１３７２６－１３７３１（１９９８）、Ｔｕｒｎｐｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２１（５），５９８－６０９，（２００３））。
【0024】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
【0025】
ｉＰＳ細胞の作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ： Ｃｅｌｌ １２６ （４），６６３－６７６， ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ １３１（５），８６１－７２，２００７）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１），１０１－１０６，２００８）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５４（７２０４），６４６－６５０，２００８）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ １３６（３），４１１－４１９，２００９）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Ｚｈｏｕ Ｈ， Ｗｕ Ｓ，Ｊｏｏ ＪＹ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，３８１－３８４，２００９； Ｋｉｍ Ｄ，Ｋｉｍ ＣＨ，Ｍｏｏｎ ＪＩ，ｅｔ ａｌ：Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，４７２－４７６，２００９）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７），７９５－７９７，２００８； Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２６９－１２７５，２００８；Ｓｉｌｖａ Ｊ， ｅｔ ａｌ： ＰＬｏＳ． Ｂｉｏｌ．６（１０），ｅ２５３，２００８）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルス（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ Ｍ， ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３），９４５－９４９，２００８）、プラスミド（Ｏｋｉｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２（５９０３），９４９－９５３，２００８）、トランスポゾンベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｋ， Ｍｉｃｈａｅｌ ＩＰ，Ｍｏｈｓｅｎｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ４５８，７６６－７７０，２００９；Ｋａｊｉ Ｋ，Ｎｏｒｒｂｙ Ｋ， Ｐａｃ ａ Ａ，ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５８，７７１－７７５，２００９；Ｙｕｓａ Ｋ， Ｒａｄ Ｒ，Ｔａｋｅｄａ Ｊ， ｅｔ ａｌ：Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３６３－３６９，２００９）、或いはエピソーマルベクター（Ｙｕ Ｊ，Ｈｕ Ｋ，Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ Ｋ，Ｔｉａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，２００９）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【0026】
ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
【0027】
ｉＰＳ細胞は、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、国立大学法人京都大学、又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター等から入手することもできる。
【0028】
＜多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養すること＞
本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む。また、ＢＭＰ４存在下において多能性幹細胞を培養する期間としては特に制限はないが、２日間から２０日間が好ましく、３日から１４日がより好ましい。また、ｈＣＧの検出が確認されたのちは、ＢＭＰ４を添加してもしなくてもよい。浮遊培養としては、攪拌培養、静置培養もしくは攪拌培養と静置培養の組み合わせが挙げられ、さらに静置培養では必要に応じてマイクロキャリアを使用することも可能である。
本発明の胎盤様オルガノイドの製造方法は、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することを含む。また、ＢＭＰ４存在下において多能性幹細胞を培養する期間としては特に制限はないが、２日間から２０日間が好ましく、３日から１４日がより好ましい。また、ｈＣＧの検出が確認されたのちは、ＢＭＰ４を添加してもしなくてもよい。浮遊培養としては、攪拌培養、静置培養もしくは攪拌培養と静置培養の組み合わせが挙げられ、さらに静置培養では必要に応じてマイクロキャリアを使用することも可能である。
【0029】
＜多能性幹細胞をスフェロイド状態にすること＞
本発明の方法は、好ましくは、多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを含む。好ましくは、多能性幹細胞を三次元浮遊培養することによりスフェロイド状態にすることができる。多能性幹細胞をスフェロイド状態にするための培養は、骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下、非存在下どちらでもよいが、ｈＣＧが長期にわたって分泌されるとの理由からＢＭＰ４非存在下が好ましい。また、多能性幹細胞をスフェロイド状態にするための培養は、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行うことができる。
ｂＦＧＦの添加量は、０．１～２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、３５～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
本発明の方法は、好ましくは、多能性幹細胞をスフェロイド状態にすることを含む。好ましくは、多能性幹細胞を三次元浮遊培養することによりスフェロイド状態にすることができる。多能性幹細胞をスフェロイド状態にするための培養は、骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下、非存在下どちらでもよいが、ｈＣＧが長期にわたって分泌されるとの理由からＢＭＰ４非存在下が好ましい。また、多能性幹細胞をスフェロイド状態にするための培養は、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行うことができる。
ｂＦＧＦの添加量は、０．１～２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、３５～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
【0030】
培地としては、多能性幹細胞の培養に適した培地を使用する。多能性幹細胞をスフェロイド状態にする工程において、多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を使用する場合には、ｉＰＳ細胞が胎盤に分化するとの観点から、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素)、ＳｔｅｍＳｕｒｅ(登録商標) ｈＰＳＣ(富士フイルム和光純薬)、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）を使用することが好ましい。またそれらの培地に、必要に応じてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ(Ｇｉｂｃｏ)等の抗生物質を添加することが可能である。さらに、αＭＥＭ、ＤＭＥＭといった一般的な細胞培養基礎培地に適宜必要なＦＧＦ等の成長因子や先に挙げた抗生物質、ＨＳＡ、ＢＳＡといった種々の蛋白質等を添加して多能性幹細胞培養用に適した自作培地も使用することができる。
培養期間は、１日から１０日、好ましくは１日から４日程度行うことができるが、特に限定されない。
培養は、浮遊培養がよく、浮遊培養とは培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。浮遊培養の手段としては特に限定されないが、攪拌培養、静置培養もしくは攪拌培養と静置培養の組み合わせが挙げられ、さらに静置培養では必要に応じてマイクロキャリアを使用することも可能である。攪拌培養とは、細胞が培養基材(容器)の表面に付着するのではなく、培地中に懸濁されている状態での培養である。攪拌培養の方法としては、攪拌子あるいは攪拌羽根等によって培養液を攪拌しながら培養する方法と、培養容器自体を駆動することによって内部の培養液を間接的に流動させて培養する方法があり、前者としてはスピナーフラスコを用いた培養方法が挙げられる。マイクロキャリアを用いた培養とは、マイクロキャリア表面に細胞を付着させた状態での培養である。一方で静置培養の方法としては、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（例えば,＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｉＰＳ細胞を播種する方法が挙げられる。この静置培養に使用するスフェロイド形成用培養基材は、細胞が接着せず、さらに底部形状がＵ字状になっていて播種された細胞がそのＵ字形状の最下部に自然に集まる構造になっていればよく、Ｖ字型、Ｍ字形、平面等の何れの形状でも使用可能であり、さらに９６ウェルに限定されるものではない。
培養期間は、１日から１０日、好ましくは１日から４日程度行うことができるが、特に限定されない。
培養は、浮遊培養がよく、浮遊培養とは培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。浮遊培養の手段としては特に限定されないが、攪拌培養、静置培養もしくは攪拌培養と静置培養の組み合わせが挙げられ、さらに静置培養では必要に応じてマイクロキャリアを使用することも可能である。攪拌培養とは、細胞が培養基材(容器)の表面に付着するのではなく、培地中に懸濁されている状態での培養である。攪拌培養の方法としては、攪拌子あるいは攪拌羽根等によって培養液を攪拌しながら培養する方法と、培養容器自体を駆動することによって内部の培養液を間接的に流動させて培養する方法があり、前者としてはスピナーフラスコを用いた培養方法が挙げられる。マイクロキャリアを用いた培養とは、マイクロキャリア表面に細胞を付着させた状態での培養である。一方で静置培養の方法としては、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（例えば,＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｉＰＳ細胞を播種する方法が挙げられる。この静置培養に使用するスフェロイド形成用培養基材は、細胞が接着せず、さらに底部形状がＵ字状になっていて播種された細胞がそのＵ字形状の最下部に自然に集まる構造になっていればよく、Ｖ字型、Ｍ字形、平面等の何れの形状でも使用可能であり、さらに９６ウェルに限定されるものではない。
【0031】
マイクロキャリアとして、合成高分子又は天然高分子からなるものを使用することができる。例えばポリスチレン(ＰＳ)、天然多糖類の誘導体であるデキストラン、天然蛋白質であるコラーゲンおよびその部分配列の遺伝子組み換え体であるヒト型リコンビナント蛋白質（遺伝子組み換えゼラチン：ＷＯ２０１０／１２８６７２Ａ１、ＷＯ２０１２／１３３６１０Ａ１／製品名ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）：富士フイルム）等の素材があげられるが、これらに限定されるものではない。このようなマイクロキャリアは自作しても市販品を購入してもよい。マイクロキャリアを共存させることにより、スフェロイドが、あるいは播種された細胞がこのマイクロキャリアを内部に包摂し、よりサイズの大きなスフェロイドを形成する。内部にマイクロキャリアを包摂することで、細胞のみからなる同じサイズのスフェロイドでは中央部の細胞に培地の栄養成分がいきわたらず壊死(セントラルネクローシス)するのに対して、中央部の細胞がマイクロキャリアに置換され、効率的に酸素や栄養分を外部から供給することが可能となり、中央部の細胞の壊死を防ぐことができる。マイクロキャリアは多孔性でも非多孔性でもよい。多孔性マイクロキャリアは、実際の組織により近い構造をとることが予想されることから、より好ましい。
マイクロキャリアは、コラーゲンやラミニンなど接着基質によって被覆されていても、被覆されていなくてもよいが、被覆されていることが好ましい。
マイクロキャリアを用いて培養する際は、静置培養が好ましい。
マイクロキャリアの直径としては、１０～２５００μｍが好ましく、５０～１０００μｍがより好ましい。また、多孔性マイクロキャリアの孔径は特に限定されないが、５～５００μｍが好ましい。
マイクロキャリアの添加量としては、基材に細胞が接着せず、その最下部に自然に集まる構造になっていればよく、Ｕ字型の他にＶ字型、Ｍ字形、平面の何れの形状でも使用可能であり、使用する培養基材の種類(プレートのウェル数、ディッシュ径)によらないため、特に限定はないが、スフェロイドが効率的にマイクロキャリアを内包するという観点からスフェロイド１個あたりマイクロキャリア１～１０００個が好ましく、１～１００個がより好ましい。
マイクロキャリアは、コラーゲンやラミニンなど接着基質によって被覆されていても、被覆されていなくてもよいが、被覆されていることが好ましい。
マイクロキャリアを用いて培養する際は、静置培養が好ましい。
マイクロキャリアの直径としては、１０～２５００μｍが好ましく、５０～１０００μｍがより好ましい。また、多孔性マイクロキャリアの孔径は特に限定されないが、５～５００μｍが好ましい。
マイクロキャリアの添加量としては、基材に細胞が接着せず、その最下部に自然に集まる構造になっていればよく、Ｕ字型の他にＶ字型、Ｍ字形、平面の何れの形状でも使用可能であり、使用する培養基材の種類(プレートのウェル数、ディッシュ径)によらないため、特に限定はないが、スフェロイドが効率的にマイクロキャリアを内包するという観点からスフェロイド１個あたりマイクロキャリア１～１０００個が好ましく、１～１００個がより好ましい。
【0032】
＜スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養すること＞
本発明においては、多能性幹細胞をスフェロイド状態にした後に、スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することが好ましい。また、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することは、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行うことがより好ましい。
ＢＭＰ４の添加量は、０．１～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
ｂＦＧＦの添加量は、０．１～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
本発明においては、多能性幹細胞をスフェロイド状態にした後に、スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することが好ましい。また、多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することは、塩基性繊維芽細胞増殖因子ｂＦＧＦの存在下において行うことがより好ましい。
ＢＭＰ４の添加量は、０．１～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
ｂＦＧＦの添加量は、０．１～１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
【0033】
培地としては、上記した通り、多能性幹細胞の培養に適した培地を使用する。
スフェロイド状態の多能性幹細胞をＢＭＰ４存在下において培養する培養期間は、特に限定されないが、２日間から２０日間が好ましく、３日から１０日がより好ましい。また、ｈＣＧの検出が確認されたのちは、ＢＭＰ４を添加してもしなくてもよい。
培養は、上記した通り、浮遊培養がよく、その手段としては攪拌培養でも静置培養でもよい。また、攪拌培養後に静置培養を行ってもよい。攪拌培養後に静置培養へ切り替える時期としては、１～１０日が好ましく、１～４日がよりが好ましいが、特に限定されない。
スフェロイド状態の多能性幹細胞をＢＭＰ４存在下において培養する培養期間は、特に限定されないが、２日間から２０日間が好ましく、３日から１０日がより好ましい。また、ｈＣＧの検出が確認されたのちは、ＢＭＰ４を添加してもしなくてもよい。
培養は、上記した通り、浮遊培養がよく、その手段としては攪拌培養でも静置培養でもよい。また、攪拌培養後に静置培養を行ってもよい。攪拌培養後に静置培養へ切り替える時期としては、１～１０日が好ましく、１～４日がよりが好ましいが、特に限定されない。
【0034】
スフェロイド状態の多能性幹細胞を骨形成蛋白質ＢＭＰ４の存在下において浮遊培養することは、マイクロキャリアの存在下において行ってもよい。マイクロキャリアは、上記したものと同様のものを使用することができる。
【0035】
＜本発明の一実施形態＞
本発明の一実施形態では、３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ＢＭＰ４を添加してからｉＰＳ細胞を播種(１×１０７ｃｅｌｌ／ｂｏｔｔｌｅ前後)する。ＢＭＰ４は、培養開始時に培地添加してもよいが、培養開始時には添加せず、培養４日目前後で培地添加してもよい。その後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行うが、ＢＭＰ４添加は培養１０～２１日目頃まで継続し、以降はＢＭＰ４無添加培地で培地交換のみ行う。培養４日目前後で細胞塊(スフェロイド)が形成され、その後胎盤を構成する栄養膜系の細胞へと分化誘導されてｈＣＧを産生するようになり、胎盤様オルガノイドが作製される。培養初期からスピナーフラスコで攪拌培養を継続してもよいが、スフェロイド形成後に浮遊培養用６ウェルプレート等に移して、静置培養に移行してもよい。ＢＭＰ４の培地への添加を停止する目安はｈＣＧを産生することであり、ｈＣＧを産生するようになってからは、任意の時期においてＢＭＰ４添加を停止することが可能である。また、ｈＣＧを産生するようになって以降、ＢＭＰ４を添加し続けることも可能である。培養容器については、細胞が接着しない浮遊培養用であれば６ウェルプレートに限定されず、１２ウェル、２４ウェル等の各プレートの他、ディッシュ,フラスコ等の細胞培養容器が使用可能である。またスフェロイド形成の別の実施形態としては、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（例えばＮｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等が使用可能である。細胞が接着しない浮遊培養容器であってスフェロイドが形成可能な形状であればＵ字底９６ウェルプレートに限定されず、１２ウェル、２４ウェル等の各プレートの他、ディッシュ,フラスコ等の細胞培養容器で、さらにＶ字底、Ｍ字底、平面等の形状のものが使用可能である。各ウェルにｉＰＳ細胞培地（例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を２００μＬ分注し、ＢＭＰ４を添加してからｉＰＳ細胞を播種(１×１０５～１０６ｃｅｌｌ／ウェル前後)する。スフェロイド形成後に、このＵ字底９６ウェルプレートから浮遊培養用６ウェルプレート等、各種培養基材に移してもよい。その後、３～４日おきに半量ずつ培地交換しながら培養を継続する。培地の交換頻度は、７日を超えない期間で任意に設定できる。
本発明の一実施形態では、３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ＢＭＰ４を添加してからｉＰＳ細胞を播種(１×１０７ｃｅｌｌ／ｂｏｔｔｌｅ前後)する。ＢＭＰ４は、培養開始時に培地添加してもよいが、培養開始時には添加せず、培養４日目前後で培地添加してもよい。その後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行うが、ＢＭＰ４添加は培養１０～２１日目頃まで継続し、以降はＢＭＰ４無添加培地で培地交換のみ行う。培養４日目前後で細胞塊(スフェロイド)が形成され、その後胎盤を構成する栄養膜系の細胞へと分化誘導されてｈＣＧを産生するようになり、胎盤様オルガノイドが作製される。培養初期からスピナーフラスコで攪拌培養を継続してもよいが、スフェロイド形成後に浮遊培養用６ウェルプレート等に移して、静置培養に移行してもよい。ＢＭＰ４の培地への添加を停止する目安はｈＣＧを産生することであり、ｈＣＧを産生するようになってからは、任意の時期においてＢＭＰ４添加を停止することが可能である。また、ｈＣＧを産生するようになって以降、ＢＭＰ４を添加し続けることも可能である。培養容器については、細胞が接着しない浮遊培養用であれば６ウェルプレートに限定されず、１２ウェル、２４ウェル等の各プレートの他、ディッシュ,フラスコ等の細胞培養容器が使用可能である。またスフェロイド形成の別の実施形態としては、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（例えばＮｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等が使用可能である。細胞が接着しない浮遊培養容器であってスフェロイドが形成可能な形状であればＵ字底９６ウェルプレートに限定されず、１２ウェル、２４ウェル等の各プレートの他、ディッシュ,フラスコ等の細胞培養容器で、さらにＶ字底、Ｍ字底、平面等の形状のものが使用可能である。各ウェルにｉＰＳ細胞培地（例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を２００μＬ分注し、ＢＭＰ４を添加してからｉＰＳ細胞を播種(１×１０５～１０６ｃｅｌｌ／ウェル前後)する。スフェロイド形成後に、このＵ字底９６ウェルプレートから浮遊培養用６ウェルプレート等、各種培養基材に移してもよい。その後、３～４日おきに半量ずつ培地交換しながら培養を継続する。培地の交換頻度は、７日を超えない期間で任意に設定できる。
【0036】
また、スピナーフラスコによる攪拌培養からスフェロイドをサンプリングしてＵ字底９６ウェルプレートに移し静置培養へ移行する際、あるいはｉＰＳ細胞を直接Ｕ字底９６ウェルプレートに播種して静置培養しながらスフェロイド形成させる際に、上記したマイクロキャリアを共存させてもよい。
【0037】
＜胎盤様オルガノイド＞
本発明によれば、上記した本発明の方法により製造される胎盤様オルガノイドが提供される。オルガノイドとは、人為的に生体外で作製された、器官又は臓器に類似した組織体である。オルガノイドは、一般に、器官形成に寄与する前駆細胞又は幹細胞等の細胞を、生体内における発生や再生過程を模倣した条件下において培養することにより作製される。胎盤様オルガノイドとは、胎盤に類似したオルガノイドで、生体内における胎盤を構成する栄養膜系の細胞、例えば合胞体栄養膜細胞(ＳＴ：Ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、細胞性栄養膜細胞(ＣＴ：Ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、絨毛外栄養膜細胞(ＥＶＴ：Ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、及びそれらの細胞の前駆細胞組織である栄養外胚葉(ＴＥ：Ｔｒｏｐｈｅｃｔｄｅｒｍ)等のうち少なくとも１つ以上の細胞から構成されている。
胎盤様オルガノイドの直径は、５０μｍ～３ｃｍが好ましく、５００μｍ～２ｃｍがより好ましい。
胎盤様オルガノイドはｈＣＧを長期間分泌することが可能であるが、ｈＣＧを分泌する期間としては１４日間以上が好ましく、２０日間以上がより好ましい。
本発明によれば、上記した本発明の方法により製造される胎盤様オルガノイドが提供される。オルガノイドとは、人為的に生体外で作製された、器官又は臓器に類似した組織体である。オルガノイドは、一般に、器官形成に寄与する前駆細胞又は幹細胞等の細胞を、生体内における発生や再生過程を模倣した条件下において培養することにより作製される。胎盤様オルガノイドとは、胎盤に類似したオルガノイドで、生体内における胎盤を構成する栄養膜系の細胞、例えば合胞体栄養膜細胞(ＳＴ：Ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、細胞性栄養膜細胞(ＣＴ：Ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、絨毛外栄養膜細胞(ＥＶＴ：Ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ)、及びそれらの細胞の前駆細胞組織である栄養外胚葉(ＴＥ：Ｔｒｏｐｈｅｃｔｄｅｒｍ)等のうち少なくとも１つ以上の細胞から構成されている。
胎盤様オルガノイドの直径は、５０μｍ～３ｃｍが好ましく、５００μｍ～２ｃｍがより好ましい。
胎盤様オルガノイドはｈＣＧを長期間分泌することが可能であるが、ｈＣＧを分泌する期間としては１４日間以上が好ましく、２０日間以上がより好ましい。
【0038】
本発明の方法により製造される胎盤様オルガノイドは、好ましくは、絨毛性性腺刺激ホルモン(ｈＣＧ)、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンからなる群から選択される少なくとも一つ（より好ましくは二つ以上、さらに好ましくは三つ以上）を産生することができる。特に好ましくは、胎盤様オルガノイドは、絨毛性性腺刺激ホルモン、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンを産生することができる。
また、胎盤様オルガノイドは、合胞栄養膜細胞(ＳＴ)、細胞性栄養膜細胞(ＣＴ)、絨毛外栄養膜細胞(ＥＶＴ)、およびそれらの細胞の前駆細胞組織である栄養外胚葉(ＴＥ)等を含んでもよい。
また、胎盤様オルガノイドは、合胞栄養膜細胞(ＳＴ)、細胞性栄養膜細胞(ＣＴ)、絨毛外栄養膜細胞(ＥＶＴ)、およびそれらの細胞の前駆細胞組織である栄養外胚葉(ＴＥ)等を含んでもよい。
【0039】
胎盤が産生するホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピンｈＣＧ(ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン)の産生確認には市販の体外診断用医薬品(妊娠検査薬)が使用可能であり、そのようなものの中に例えばイムノクロマト法の原理を応用したゴナスティックＷ(持田製薬)がある。使用する体外診断薬用医薬品は、同様のｈＣＧを検出する製品であればよく、特に限定されない。培養上清を０．５～１ｍＬ程度サンプリングし、妊娠検査薬のテストストリップに浸漬する。妊娠検査薬は本来、被験者の尿を採取し、尿添加部に採取した尿を３秒程度浸漬して検査を行うが、同様にして採取した培養上清をテストストリップの尿添加部に浸漬する。浸漬完了後、テストストリップの判定面を上に向け、培養上清が判定窓を通過して反応終了窓に達するまで静置して待つ。培養上清中にｈＣＧが存在する場合は、ｈＣＧとラテックス粒子標識抗ｈＣＧ抗体が反応(第一反応)し、培養上清とともにテストストリップのメンブレン上を移動する。次に、この反応物はメンブレンに固定化した抗ｈＣＧ抗体と反応(第二反応)し、ラテックス粒子標識抗ｈＣＧ抗体－ｈＣＧ－固定化抗ｈＣＧ抗体の複合体が形成され、青色の判定ラインが判定窓に表示される(陽性)。一方、培養上清中にｈＣＧが存在しない場合は、第一反応・第二反応ともに起こらないため、青色の判定ラインは表示されない(陰性)。また、反応終了サインはメンブレン上に塗布された無色の試薬が培養上清と接触することで反応終了窓にピンク色のラインとして表示される。本検査薬は、ｈＣＧ最小検出感度が２５ＩＵ／Ｌの定性評価試薬であるが、判定窓に予めｈＣＧ濃度１，０００ＩＵ／Ｌに相当する青色の対照ラインが印刷されており、ｈＣＧ濃度が１，０００ＩＵ／Ｌ以上の場合は判定ラインが対照ラインと同等以上の濃さの着色を示し、ｈＣＧ濃度が概ね１，０００ＩＵ／Ｌ以上であるか、それ未満であるか、目視確認が可能である。
さらに培養上清中のｈＣＧを定量する場合には、同じ体外診断用医薬品であり、酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)を応用したｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧ(アボット)を使用することができる。培養上清約１７μＬをカートリッジに注入し、そのカートリッジを専用アナライザーに差し込んで測定を開始する。約１０分後、自動的に測定結果が印字される。カートリッジ内の反応系に関与する成分としては、抗β―ｈＣＧマウスモノクローナル抗体―アルカリフォスファターゼコンジュゲート、抗β―ｈＣＧマウスモノクローナル抗体、アルカリフォスファターゼの基質であるアミノフェニルリン酸ナトリウムがある。抗原であるｈＣＧ量に応じてアルカリフォスファターゼの活性が変動し、生成物アミノフェノールを検出することでｈＣＧの定量が可能となる、
さらに培養上清中のｈＣＧを定量する場合には、同じ体外診断用医薬品であり、酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)を応用したｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧ(アボット)を使用することができる。培養上清約１７μＬをカートリッジに注入し、そのカートリッジを専用アナライザーに差し込んで測定を開始する。約１０分後、自動的に測定結果が印字される。カートリッジ内の反応系に関与する成分としては、抗β―ｈＣＧマウスモノクローナル抗体―アルカリフォスファターゼコンジュゲート、抗β―ｈＣＧマウスモノクローナル抗体、アルカリフォスファターゼの基質であるアミノフェニルリン酸ナトリウムがある。抗原であるｈＣＧ量に応じてアルカリフォスファターゼの活性が変動し、生成物アミノフェノールを検出することでｈＣＧの定量が可能となる、
【0040】
エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンの産生についても、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンｈＣＧの産生確認と同様にイムノクロマト法を利用した市販あるいは自作のテストキットで確認することができ、又は液体クロマトグラフィー質量分析(ＬＣ－ＭＳ)、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などのこれらホルモンを検出可能な一般的方法により確認することができる。あるいは、生体中に存在する微量なホルモンを検出するのに一般的に用いられる全血、血漿、血清、尿その他の検体による市販あるいは自作の体外診断薬で、高感度な酵素アッセイ法、免疫アッセイ法、化学発光法、蛍光発光法を使用してもよい。そのようなアッセイ法の例として、ＥＬＩＳＡ(酵素免疫測定法ＥＩＡの１種)、ＥＣＬ(電気化学発光法)、ＲＩＡ(放射免疫測定法)等があげられる。
【0041】
＜胎盤様オルガノイドの用途およびキット＞
本発明はさらに、本発明の胎盤様オルガノイドを含む、製造又は試験キットに関する。本発明のキットは、生殖ホルモンの製造、被験物質の毒性又は安全性の評価、又はウイルスの感染メカニズムの解析のために使用することができる。
本発明はさらに、本発明の胎盤様オルガノイドを含む、製造又は試験キットに関する。本発明のキットは、生殖ホルモンの製造、被験物質の毒性又は安全性の評価、又はウイルスの感染メカニズムの解析のために使用することができる。
【0042】
本発明の胎盤様オルガノイドは、上記した通り、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エストラジオール、デヒドロエピアンドロステロン、１１－デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、プレグネノロンおよびアロプレグナノロンからなる群から選択される少なくとも一つの生殖ホルモンを産生することができる。よって、本発明の胎盤様オルガノイドを培養することにより、上記した生殖ホルモンを製造することができる。
【0043】
本発明の胎盤様オルガノイドを用いて被験物質の毒性又は安全性を評価することができる。本発明の胎盤様オルガノイドは、妊娠期における薬剤評価モデルとして有用である。本発明の胎盤様オルガノイドは、３次元構造（立体構造）を有することから、高度組織化およびチップ化が可能である。チップ上に構成された臓器の機能を有する素子は、Ｏｒｇａｎ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ又は生体機能チップとも言う。本発明の本発明の胎盤様オルガノイドを用いてＯｒｇａｎ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ又は生体機能チップを構成することができる。さらに、本発明の胎盤様オルガノイドを、他の臓器様オルガノイドと連結することにより、ヒト発生過程、胎児発達過程における各組織に与える薬剤、アルコール、食物等の影響を評価することができる。
【0044】
本発明の胎盤様オルガノイドを用いて被験物質の毒性又は安全性を評価する場合、本発明の胎盤様オルガノイドに被験物質を接触させることができる。具体的には、本発明の胎盤様オルガノイドを含む培養培地に、被験物質を添加し、被験物質の存在下において胎盤様オルガノイドを培養することができる。培養期間は特に限定されないが、一般的には１時間～３０日間である。但し、必要に応じて培養期間は延長することができる。
【0045】
被験物質としては、様々な分子量の有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン類などを挙げることができるが、特に限定されない。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分又は候補成分でもよい。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることもできる。被験物質は天然物由来であっても、合成によるものでもよい。合成による被験物質を使用する場合には、例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
【0046】
被験物質が胎盤を透過するかどうかは、被験物質による胎児への発生毒性の発現に大きく影響することから、被験物質のヒト胎盤透過性を評価することにより、被験物質の毒性又は安全性を評価することができる。
【0047】
例えば、半透過性膜（多孔性膜）の上で胎盤様オルガノイドを培養し、胎盤様オルガノイドを透過した被験物質を定量することができる。被験物質の定量は、被験物質の種類に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等の測定方法で行うことができる。定量結果（胎盤様オルガノイドを透過した被験物質の量）と、被験物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被験物質のヒト胎盤透過性を評価することができる。さらに、被験物質のヒト胎盤透過性の有無を定性的に評価することもできる。その場合は、ｈＣＧの検出に使用したような、イムノクロマト法その他の原理により簡便に被験物質の検出が可能な市販あるいは自作の体外診断薬及びそれに類する自作テストキットが使用できる。
【0048】
ウイルスなどの病原体の母子感染においては、母体が病原体に感染した後、胎盤を介して胎児が病原体に感染することが知られている。病原体としては、ウイルス、細菌、菌類などを挙げることができるが、特に限定されない。
ウイルスなどの病原体の感染メカニズムの解析を行うためには、ヒト繊維芽細胞株等をＦＢＳ、抗生物質等を添加した培地中で培養し、その細胞に対してウイルス株等の病原体を感染させて所定量増殖させる。この病原体を胎盤オルガノイド培養液中に添加して感染実験を行う。
ウイルスなどの病原体の感染メカニズムの解析を行うためには、ヒト繊維芽細胞株等をＦＢＳ、抗生物質等を添加した培地中で培養し、その細胞に対してウイルス株等の病原体を感染させて所定量増殖させる。この病原体を胎盤オルガノイド培養液中に添加して感染実験を行う。
【0049】
その他の用途として、胎盤様オルガノイドから得られた種々の生理活性を有する抽出液を化粧品、食品、医薬品等に用いることも可能である。
【0050】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例0051】
以下の比較例および実施例において、胎盤ホルモンｈＣＧの産生は、ゴナスティックＷ (持田製薬)を用いた定性評価、及びｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧ(アボット)を用いた定量評価にて確認した。
ゴナスティックＷにおいては、培養上清を０．５～１ｍＬ程度サンプリングし、テストストリップに浸漬した。浸漬完了後、テストストリップの判定面を上に向け、培養上清が判定窓を通過して反応終了窓に達するまで静置した。なお、反応終了サインは、反応終了窓にピンク色のラインとして表示される。本検査試薬の検出感度は２５ＩＵ／Ｌであり、また判定窓には予めｈＣＧ濃度１，０００ＩＵ／Ｌに相当する青色の対照ラインが印刷されていて判定ラインとの目視比較が可能である。
判定ラインに、対照ラインの青色と同程度以上のラインが目視された場合には陽性（＋)と判定した。
判定ラインに、ラインが目視されなかった場合には陰性（－)と判定した。
判定ラインに、対照ラインの青色より薄いが、目視可能なラインが目視された場合には、（＋／－）と判定した。
また、ｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧでは、培養上清を約１７μＬサンプリングして試薬カートリッジに注入し、専用アナライザーに挿入した。約１０分後に表示された数値をｈＣＧの定量値とした。
ゴナスティックＷにおいては、培養上清を０．５～１ｍＬ程度サンプリングし、テストストリップに浸漬した。浸漬完了後、テストストリップの判定面を上に向け、培養上清が判定窓を通過して反応終了窓に達するまで静置した。なお、反応終了サインは、反応終了窓にピンク色のラインとして表示される。本検査試薬の検出感度は２５ＩＵ／Ｌであり、また判定窓には予めｈＣＧ濃度１，０００ＩＵ／Ｌに相当する青色の対照ラインが印刷されていて判定ラインとの目視比較が可能である。
判定ラインに、対照ラインの青色と同程度以上のラインが目視された場合には陽性（＋)と判定した。
判定ラインに、ラインが目視されなかった場合には陰性（－)と判定した。
判定ラインに、対照ラインの青色より薄いが、目視可能なラインが目視された場合には、（＋／－）と判定した。
また、ｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧでは、培養上清を約１７μＬサンプリングして試薬カートリッジに注入し、専用アナライザーに挿入した。約１０分後に表示された数値をｈＣＧの定量値とした。
【0052】
以下の比較例および実施例において使用したｉＰＳ細胞は、市販のヒト脂肪由来肝細胞ＡＤＳＣ(ＰＴ－５００６：Ｌｏｎｚａ)から先述のような基本的なｉＰＳ細胞の作製法に則って作製したものを使用した。 また、以下の比較例および実施例において使用したｉＰＳ細胞はＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において継代維持していたものを使用した。また、比較例および実施例で使用するにあたり、ｉＰＳ細胞の分化の観点から、ｉＰＳ細胞の培地はＳｔｅｍＦｉｔ(味の素)もしくはＳｔｅｍＳｕｒｅ(富士フイルム和光純薬)に培地を変更した。
【0053】
＜比較例１＞二次元接着培養
ラミニン(ｉＭａｔｒｉｘ-５１１：ニッピ)をＤＰＢＳ（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、６ウェルプレート(Ｆａｌｃｏｎ ＴＣ：＃３５３０４６)に１ウェルあたり１ｍＬ分注して３７℃インキュベータ内で１時間静置し、ラミニンをコートした。ラミニンコートしたプレートに５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を２μＬ添加したｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を２ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ)した。適宜培地交換しながら培養を続け、妊娠検査用体外診断薬ゴナスティックＷ(持田製薬)を用いて培養上清中に含まれるｈＣＧを検出することにより、胎盤組織への分化誘導を確認した。ネガティブコントロールとして、ＢＭＰ４を添加しない培地を用いて、同様の培養を行った。培養７日目からｈＣＧを産生し始めたが、１８日目前後でｈＣＧ産生が停止した(表１)。
ラミニン(ｉＭａｔｒｉｘ-５１１：ニッピ)をＤＰＢＳ（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、６ウェルプレート(Ｆａｌｃｏｎ ＴＣ：＃３５３０４６)に１ウェルあたり１ｍＬ分注して３７℃インキュベータ内で１時間静置し、ラミニンをコートした。ラミニンコートしたプレートに５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を２μＬ添加したｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を２ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ)した。適宜培地交換しながら培養を続け、妊娠検査用体外診断薬ゴナスティックＷ(持田製薬)を用いて培養上清中に含まれるｈＣＧを検出することにより、胎盤組織への分化誘導を確認した。ネガティブコントロールとして、ＢＭＰ４を添加しない培地を用いて、同様の培養を行った。培養７日目からｈＣＧを産生し始めたが、１８日目前後でｈＣＧ産生が停止した(表１)。
【0054】
【表1】
【0055】
＜実施例１＞三次元浮遊培養
３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(１．６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ)した。培養開始時にはＢＭＰ４を添加せず、培養４日目で５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を３０μＬ添加し、培地中のＢＭＰ４最終濃度を５０ｎｇ／ｍＬとした。実施例２以降についてもＢＭＰ４を添加する場合は同様の濃度とした。培養開始後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行いながら、ＢＭＰ４添加は培養１８日目まで継続し、以降はＢＭＰ４を添加せず、培地交換のみ行った。培養４日目までには細胞塊(スフェロイド)が形成された（図１）。培養期間を通じてスピナーフラスコで攪拌培養を継続した。培養１１日目まではｈＣＧ産生が確認されなかったが、培養１５日目以降でｈＣＧ産生が確認され、培養６０日目以降においても継続してｈＣＧ産生することを確認した（表２）。
３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(１．６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ)した。培養開始時にはＢＭＰ４を添加せず、培養４日目で５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を３０μＬ添加し、培地中のＢＭＰ４最終濃度を５０ｎｇ／ｍＬとした。実施例２以降についてもＢＭＰ４を添加する場合は同様の濃度とした。培養開始後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行いながら、ＢＭＰ４添加は培養１８日目まで継続し、以降はＢＭＰ４を添加せず、培地交換のみ行った。培養４日目までには細胞塊(スフェロイド)が形成された（図１）。培養期間を通じてスピナーフラスコで攪拌培養を継続した。培養１１日目まではｈＣＧ産生が確認されなかったが、培養１５日目以降でｈＣＧ産生が確認され、培養６０日目以降においても継続してｈＣＧ産生することを確認した（表２）。
【0056】
【表2】
【0057】
＜実施例２＞三次元浮遊培養
３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(１．１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｂｏｔｔｌｅ)した。ＢＭＰ４については、培養開始時には添加せず、培養４日目で添加した水準１、および培養開始時から添加した水準２、で比較した。ＢＭＰ４は、水準１及び２の何れの場合においても培地中の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。培養開始後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行いながら、培養１８日目以降は水準１、２ともにＢＭＰ４無添加の培地で培地交換を行った。培養４日目までには細胞塊(スフェロイド)が形成された。水準１および２について、培養初期からスピナーフラスコで攪拌培養を継続し、ｈＣＧ産生を確認した。培養開始時からＢＭＰ４を添加した場合(水準２)のほうが早くからｈＣＧ産生が開始されるが、ｈＣＧ産生停止も早い。一方で、培養４日目以降からＢＭＰ４を添加した場合(水準１)はｈＣＧ産生が若干遅れるが、長く継続された。
３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(１．１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｂｏｔｔｌｅ)した。ＢＭＰ４については、培養開始時には添加せず、培養４日目で添加した水準１、および培養開始時から添加した水準２、で比較した。ＢＭＰ４は、水準１及び２の何れの場合においても培地中の濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。培養開始後、３～４日おきに半量ずつ培地交換を行いながら、培養１８日目以降は水準１、２ともにＢＭＰ４無添加の培地で培地交換を行った。培養４日目までには細胞塊(スフェロイド)が形成された。水準１および２について、培養初期からスピナーフラスコで攪拌培養を継続し、ｈＣＧ産生を確認した。培養開始時からＢＭＰ４を添加した場合(水準２)のほうが早くからｈＣＧ産生が開始されるが、ｈＣＧ産生停止も早い。一方で、培養４日目以降からＢＭＰ４を添加した場合(水準１)はｈＣＧ産生が若干遅れるが、長く継続された。
【0058】
【表3】
【0059】
＜実施例３＞二次元接着培養及び三次元浮遊培養同時比較
以下の方法で二次元接着培養を実施した。ラミニン(ｉＭａｔｒｉｘ-５１１：ニッピ)をＤＰＢＳ（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、６ウェルプレート(Ｆａｌｃｏｎ ＴＣ：＃３５３０４６)に１ウェルあたり１ｍＬ分注して３７℃インキュベータ内で１時間静置し、ラミニンをコートした。ラミニンコートしたプレートにＢＭＰ４溶液を添加しない状態でｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を２ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ)し、適宜培地交換しながら培養を続けた、培養４日目より、培地交換時に５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を２μＬ培地添加してＢＭＰ４濃度を５０ｎｇ／ｍＬとしたｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)２ｍＬを用いた。
以下の方法で二次元接着培養を実施した。ラミニン(ｉＭａｔｒｉｘ-５１１：ニッピ)をＤＰＢＳ（ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、６ウェルプレート(Ｆａｌｃｏｎ ＴＣ：＃３５３０４６)に１ウェルあたり１ｍＬ分注して３７℃インキュベータ内で１時間静置し、ラミニンをコートした。ラミニンコートしたプレートにＢＭＰ４溶液を添加しない状態でｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を２ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ)し、適宜培地交換しながら培養を続けた、培養４日目より、培地交換時に５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を２μＬ培地添加してＢＭＰ４濃度を５０ｎｇ／ｍＬとしたｉＰＳ細胞用培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)２ｍＬを用いた。
【0060】
一方、二次元培養接着培養で用いたのと同じｉＰＳ細胞を使用して三次元浮遊培養を同時に開始した。３０ｍＬ容スピナーフラスコ(エイブル)にｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種(３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ)した。二次元接着培養と同様に、培養開始時にはＢＭＰ４を添加せず、培養４日目以降で５０μｇ／ｍＬのＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ)溶液を二次元接着培養で使用したものと同じ割合で添加した培地を用いた。培養開始後、３～４日おきに培地交換を行いながら、培地へのＢＭＰ４添加は培養１４日目まで継続し、以降はＢＭＰ４を添加しない培地を用いた。三次元浮遊培養は、培養期間を通じてスピナーフラスコで攪拌培養を継続した。二次元接着培養及び三次元浮遊培養を継続しながら、培養７日目以降で適宜培養上清をサンプリングし、生成したｈＣＧ量を、ｉ－ＳＴＡＴカートリッジＴｏｔａｌ β―ｈＣＧを用いて定量した。そのｈＣＧ定量結果を表４に示した。二次元培養と三次元培養とでは、培養開始時に播種可能な細胞量、培地添加量に違いがあるため、培養上清中のｈＣＧ濃度やｈＣＧ産生総量には差があり、単純には比較できない。そこで、胎盤への分化誘導開始後ｈＣＧ産生を始めた培養７日目のｈＣＧ定量値を１００とし、それ以降の培養測定日におけるｈＣＧ定量値と培養７日目におけるｈＣＧ定量値の比を算出した。即ち、二次元及び三次元培養の各々の培養形態における、７日目のｈＣＧ定量値を１００としたときのその後のｈＣＧ産生量変化を図２に示した。二次元培養では特に培養１５日目以降のｈＣＧ産生量低下が顕著である一方、三次元培養は１５日目以降もｈＣＧ産生し続け、培養２５日目においても培養７日目に比べ１０倍以上のｈＣＧ産生を維持していることが確認できた。
【0061】
【表4】
【0062】
＜実施例４＞三次元浮遊培養
スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｉＰＳ細胞を播種して静置培養する際に、天然高分子、あるいは合成高分子からなるマイクロキャリアを共存させた。
スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｉＰＳ細胞を播種して静置培養する際に、天然高分子、あるいは合成高分子からなるマイクロキャリアを共存させた。
【0063】
下記の水準３～５の３種類を使用した。ネガティブコントロールとして、マイクロキャリアを添加せずスフェロイドのみ播種の水準６も含めた合計４水準で実施した。
【0064】
水準３：天然蛋白質であるコラーゲンおよびその部分配列の遺伝子組換え体であるヒト型リコンビナント蛋白質（遺伝子組み換えゼラチン：ＷＯ２０１０１２８６７２ Ａ１、ＷＯ２０１２１３３６１０ Ａ１／製品名ｃｅｌｌｎｅｓｔ：富士フイルム）を材料とした多孔性マイクロスフェア；ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）
水準４：天然多糖体の誘導体である架橋デキストラン表面に化学結合させたコラーゲン層を有するマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、１７－０４８５、ＧＥ）；Ｃｙｔｏｄｅｘ３
水準５：ポリスチレン（ＰＳ）表面にコラーゲンをコートしたマイクロキャリア（３７８６、Ｃｏｒｎｉｎｇ）；ＭＣ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏａｔｅｄ ＭＣ、ＭｉｃｒｏＣａｒｒｉｅｒ）
水準６：コントロール（スフェロイドのみ）
水準４：天然多糖体の誘導体である架橋デキストラン表面に化学結合させたコラーゲン層を有するマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、１７－０４８５、ＧＥ）；Ｃｙｔｏｄｅｘ３
水準５：ポリスチレン（ＰＳ）表面にコラーゲンをコートしたマイクロキャリア（３７８６、Ｃｏｒｎｉｎｇ）；ＭＣ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏａｔｅｄ ＭＣ、ＭｉｃｒｏＣａｒｒｉｅｒ）
水準６：コントロール（スフェロイドのみ）
【0065】
スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレートの各ウェルに事前にラミニンコートすることなく、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）無添加のｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を２００μＬ分注した。そのウェルにネガティブコントロール（水準６）を含む上記の水準３～５のマイクロキャリアをウェルに３～２００個の範囲で添加し、ｉＰＳ細胞を播種（４×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル）した。マイクロキャリアを細胞と共存させることにより、播種された細胞がこのマイクロキャリアを内部に包摂してスフェロイドを形成した。スフェロイドが形成された培養４日目以降、ＢＭＰ４を添加したｉＰＳ細胞培地で培地交換を開始し、培養１０日目以降は再びＢＭＰ４を添加しないｉＰＳ培地に変更して培地交換した。培養１７日目に９６ウェルプレートから、予め２ｍＬの培地を分注しておいた浮遊培養用６ウェルプレート（＃３４７１、６ｗｅｌｌ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ、Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｕｒｆａｃｅ：Ｃｏｒｎｉｎｇ）にスフェロイドを移した。その後、３～４日おきに半量ずつ培地交換しながら培養を継続した。培養２５日目におけるｈＣＧ産生を、ゴナスティックＷを用いて確認した結果、水準３～６の何れの水準もｈＣＧ産生していたが、水準３の多孔性マイクロスフェアの発色が最も強かった。
【0066】
【表5】
【0067】
＜実施例５＞三次元浮遊培養
３０ｍＬ容スピナーフラスコ（エイブル）にＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加しないｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種（１．１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｂｏｔｔｌｅ前後）、攪拌培養を開始した。培養４日目に、Ｕ字底９６ウェルプレート（＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＢＭＰ４を添加したｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を各ウェルに２００μＬ分注し、ネガティブコントロール（水準６）を含む実施例３と同じ水準３および５のマイクロキャリアをウェルに添加後、形成されたスフェロイドをスピナーフラスコからサンプリングして２～２０個程度を分注、静置培養に移行した。マイクロキャリアを添加せずにスフェロイドのみを添加した水準６とマイクロキャリアとスフェロイドの両方を添加した上記水準３及び５を比較した。
３０ｍＬ容スピナーフラスコ（エイブル）にＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加しないｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を３０ｍＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種（１．１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｂｏｔｔｌｅ前後）、攪拌培養を開始した。培養４日目に、Ｕ字底９６ウェルプレート（＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＢＭＰ４を添加したｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を各ウェルに２００μＬ分注し、ネガティブコントロール（水準６）を含む実施例３と同じ水準３および５のマイクロキャリアをウェルに添加後、形成されたスフェロイドをスピナーフラスコからサンプリングして２～２０個程度を分注、静置培養に移行した。マイクロキャリアを添加せずにスフェロイドのみを添加した水準６とマイクロキャリアとスフェロイドの両方を添加した上記水準３及び５を比較した。
【0068】
マイクロキャリアをスフェロイドと共存させることにより、スフェロイドは培養過程においてこのマイクロキャリアを内部に包摂し、よりサイズの大きなスフェロイドを形成した。培養４日目の時点でＵ字底９６ウェルプレートに、水準３及び５は各々２個、３個に対して水準６では１３個のスフェロイドを添加したが、培養２１日目の段階で、水準６に対して水準３及び５は粒子サイズが大きくなっており、明確な差が認められた、内部にマイクロキャリアを包摂することで、細胞のみからなる同じサイズのスフェロイドでは中央部の細胞に培地の栄養成分がいきわたらず壊死(セントラルネクローシス)するのに対して、中央部の細胞がマイクロキャリアに置換され、中央部の細胞の壊死を防ぐことが可能となる。図３に示すように、ＭＳ（水準３）、ＭＣ（水準５）を添加した水準については内腔様の構造が観察される一方、水準６では細胞が密にパッキングされた状態のままであることから、マイクロキャリアを添加した場合のほうが、より高度な組織構造をとると考えることができる。さらに、マイクロキャリアは多孔性であっても多孔性でなくてもスフェロイド内部に包摂されるが、多孔性であるほうが実際の組織により近い構造をとることが予想される。
【0069】
＜実施例６＞
スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレートの各ウェルに、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０ｎｇ／ｍＬになるよう添加したｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を２００μＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）した。このようにして作製した胎盤オルガノイドを７日間培養した後の培養上清をサンプリングし、この培養上清中にｈＣＧ以外の胎盤由来ホルモンが含まれているか、即ちこのオルガノイドがｈＣＧ以外の胎盤由来ホルモンを産生しているかを、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計(ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ)により確認した。ネガティブコントロールとして、ｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)のみの場合とこの培養上清のクロマトグラムを比較し、得られたピークから定性評価を行った。
スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレートの各ウェルに、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０ｎｇ／ｍＬになるよう添加したｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素）を２００μＬ分注し、ｉＰＳ細胞を播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）した。このようにして作製した胎盤オルガノイドを７日間培養した後の培養上清をサンプリングし、この培養上清中にｈＣＧ以外の胎盤由来ホルモンが含まれているか、即ちこのオルガノイドがｈＣＧ以外の胎盤由来ホルモンを産生しているかを、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計(ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ)により確認した。ネガティブコントロールとして、ｉＰＳ細胞培地(ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ：味の素)のみの場合とこの培養上清のクロマトグラムを比較し、得られたピークから定性評価を行った。
【0070】
その結果、表６のようなホルモンが検出された。これらは、何れも胎盤が産生するステロイドホルモンとして知られているものである（図４）。
【0071】
【表6】
【0072】
＜実施例７＞胎盤オルガノイドへのウイルス感染の確認
ヒト繊維芽細胞株ＭＲＣ－５(ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１)を１０％ＦＢＳ(インビトロジェン)と１％抗生物質(ペニシリン／ストレプトマイシン、１０，０００Ｕ／ｍＬ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)を含有するＤＭＥＭ培地中で培養する。そのＭＲＣ－５細胞の培養液にヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)ＡＤ－１６９株(ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３８)を添加し、感染させた。感染させてから１０日後にＭＲＣ－５細胞がほぼ死滅したのを確認後、増殖したウイルス粒子がＭＲＣ－５細胞外へ放出された培養上清を回収し、培養上清に含まれる細胞デブリを遠心して取り除いた。残りの培養上清を０．４５μｍのフィルターに通して、これをＡＤ－１６９液とした。このＡＤ－１６９液を培養１６日目の胎盤オルガノイド培養液中へ添加して、胎盤オルガノイドへのＨＣＭＶ感染実験を行った。本実施例においてＨＣＭＶの感染に使用した胎盤オルガノイドは、実施例５と同様の方法で調製し、１６日間培養したものである。感染後の胎盤オルガノイドからＴＲＩＺＯＬ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５９６０２６)を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。まず、５～１０×１０６個の細胞あたり１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬を添加してホモジネーションを行った。次に０．２ｍＬのクロロホルムを添加し２～３分程度室温で放置後遠心分離(１２，０００回転、１５分間、４℃)した。上層(水層)を別容器に取り、０．５ｍＬのイソプロパノールを添加して５～１０分程度室温で放置した。沈殿したＲＮＡに対して１ｍＬの７５％エタノールを添加後に遠心分離(７，５００回転、５分間、４℃)して洗浄し、ｔｏｔａｌＲＮＡを得た。このＲＮＡ沈殿物を５～１０分間程度、風乾させた。(操作の詳細については、ＴＲＩＺＯＬ試薬の添付文書に従った)
ヒト繊維芽細胞株ＭＲＣ－５(ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１)を１０％ＦＢＳ(インビトロジェン)と１％抗生物質(ペニシリン／ストレプトマイシン、１０，０００Ｕ／ｍＬ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)を含有するＤＭＥＭ培地中で培養する。そのＭＲＣ－５細胞の培養液にヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)ＡＤ－１６９株(ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＶＲ－５３８)を添加し、感染させた。感染させてから１０日後にＭＲＣ－５細胞がほぼ死滅したのを確認後、増殖したウイルス粒子がＭＲＣ－５細胞外へ放出された培養上清を回収し、培養上清に含まれる細胞デブリを遠心して取り除いた。残りの培養上清を０．４５μｍのフィルターに通して、これをＡＤ－１６９液とした。このＡＤ－１６９液を培養１６日目の胎盤オルガノイド培養液中へ添加して、胎盤オルガノイドへのＨＣＭＶ感染実験を行った。本実施例においてＨＣＭＶの感染に使用した胎盤オルガノイドは、実施例５と同様の方法で調製し、１６日間培養したものである。感染後の胎盤オルガノイドからＴＲＩＺＯＬ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５５９６０２６)を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。まず、５～１０×１０６個の細胞あたり１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬を添加してホモジネーションを行った。次に０．２ｍＬのクロロホルムを添加し２～３分程度室温で放置後遠心分離(１２，０００回転、１５分間、４℃)した。上層(水層)を別容器に取り、０．５ｍＬのイソプロパノールを添加して５～１０分程度室温で放置した。沈殿したＲＮＡに対して１ｍＬの７５％エタノールを添加後に遠心分離(７，５００回転、５分間、４℃)して洗浄し、ｔｏｔａｌＲＮＡを得た。このＲＮＡ沈殿物を５～１０分間程度、風乾させた。(操作の詳細については、ＴＲＩＺＯＬ試薬の添付文書に従った)
【0073】
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ II １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ(タカラバイオ，＃６２１０Ａ)を用いてｃＤＮＡを合成した。まず、マイクロチューブ内でオリゴｄＴプライマー：１μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ；１μＬ、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ；ＲＮＡ量で５μｇ以下、ＲＮＡ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ(全液量が１０μＬになるよう添加)、を混合し、６５℃で５分間保温した後、氷上で急冷した。この液に、５×ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ II Ｂｕｆｆｅｒ：４μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：０．５μＬ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ II ＲＴａｓｅ：１μＬ、ＲＮＡ ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ(全液量が２０μＬになるよう添加)、を穏やかに攪拌した。その後、速やかに３０℃／１０分、次いで４２℃／３０～６０分で反応を行った。９５℃／５分間保温して酵素を失活させてから氷上で冷却し、ｃＤＮＡ液を調製した。
【0074】
合成したｃＤＮＡについて、ＩＥ２(ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ２)遺伝子、及びＴＢＰ(ＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＴＡＴＡボックスと呼ばれるＤＮＡ配列に結合する基本転写因子)遺伝子の各々についてＲＴ－ＰＣＲ及び電気泳動を実施した。各遺伝子のＰＣＲ反応液、反応条件、電気泳動条件は、それぞれ以下の通りとした。また、電気泳動の実験時にＭＯＣＫ細胞として、ＨＣＭＶを感染させていない胎盤オルガノイドを使用した。これは、胎盤オルガノイドで使用した培地のみで培養しＨＣＭＶ ＡＤ－１６９ウイルス粒子を含む溶液を添加していないものである。
【0075】
（１）ＩＥ２遺伝子
［ＰＣＲ反応液］
ｃＤＮＡ ： １μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｈ２Ｏ ： １０μＬ
２× Ｂｕｆｆｅｒ ：１２．５μＬ
Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： ０．５μＬ
(タカラバイオ，＃Ｒ０６０Ａ)
［ＰＣＲ反応液］
ｃＤＮＡ ： １μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｈ２Ｏ ： １０μＬ
２× Ｂｕｆｆｅｒ ：１２．５μＬ
Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： ０．５μＬ
(タカラバイオ，＃Ｒ０６０Ａ)
【0076】
［ＰＣＲプライマー配列］
Ｆｏｒｗａｒｄ：CGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGTCCTCTGCCAAGAGAAAG（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：CGCGGATCCCTGAGACTTGTTCCTCAGGTCCTG（配列番号２）
Ｆｏｒｗａｒｄ：CGCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGTCCTCTGCCAAGAGAAAG（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：CGCGGATCCCTGAGACTTGTTCCTCAGGTCCTG（配列番号２）
【0077】
［ＰＣＲ反応条件］
９４℃，１ｍｉｎ．
以下、３２ｃｙｃｌｅｓ
９８℃，１０ｓｅｃ．
５５℃、１５ｓｅｃ．
６８℃，１ｍｉｎ．
最後に
６８℃，７ｍｉｎ．
調製したＰＣＲ反応産物は、４℃で保存
９４℃，１ｍｉｎ．
以下、３２ｃｙｃｌｅｓ
９８℃，１０ｓｅｃ．
５５℃、１５ｓｅｃ．
６８℃，１ｍｉｎ．
最後に
６８℃，７ｍｉｎ．
調製したＰＣＲ反応産物は、４℃で保存
【0078】
［電気泳動条件］
１％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ
１％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ
【0079】
（２）ＴＢＰ遺伝子
［ＰＣＲ反応液］
ｃＤＮＡ ： １μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｈ２Ｏ ： １０μＬ
２× Ｂｕｆｆｅｒ ：１２．５μＬ
Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： ０．５μＬ
(タカラバイオ，＃Ｒ０６０Ａ)
［ＰＣＲ反応液］
ｃＤＮＡ ： １μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ： ０．５μＬ
Ｈ２Ｏ ： １０μＬ
２× Ｂｕｆｆｅｒ ：１２．５μＬ
Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ： ０．５μＬ
(タカラバイオ，＃Ｒ０６０Ａ)
【0080】
［ＰＣＲプライマー配列］
Ｆｏｒｗａｒｄ：TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC（配列番号４）
Ｆｏｒｗａｒｄ：TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC（配列番号４）
【0081】
［ＰＣＲ反応条件］
９４℃，１ｍｉｎ．
以下、３２ｃｙｃｌｅｓ
９８℃，１０ｓｅｃ．
５５℃、１５ｓｅｃ．
６８℃，１５ｓｅｃ．
最後に
６８℃，７ｍｉｎ．
調製したＰＣＲ反応産物は、４℃で保存
９４℃，１ｍｉｎ．
以下、３２ｃｙｃｌｅｓ
９８℃，１０ｓｅｃ．
５５℃、１５ｓｅｃ．
６８℃，１５ｓｅｃ．
最後に
６８℃，７ｍｉｎ．
調製したＰＣＲ反応産物は、４℃で保存
【0082】
［電気泳動条件］
２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ
２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ
【0083】
胎盤オルガノイドへヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)ＡＤ－１６９株を感染させた際の、感染前と感染後４日目の胎盤オルガノイド外観を比較したものを図５に示す。また、胎盤オルガノイドへヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)ＡＤ－１６９株を感染させた際の、ウイルス感染初期に発現が上昇するＩＥ２遺伝子のｍＲＮＡを、感染後１日目(１ｄｐｉ：ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ)と感染後５日目(５ｄｐｉ)とで電気泳動により確認したものを図６に示す。ＨＣＭＶは、例えば モダンメディア ５７巻３号２０１１，７９－８５ 「周産期のサイトメガロウイルス感染症」に記載されているように二本鎖ＤＮＡウイルスであり、細胞侵入後にウイルス蛋白ＶＰ１６と細胞の転写調節因子が複合体を形成し、前初期(ＩＥ：ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ)遺伝子を発現させる。ＩＥ遺伝子の中でもＩＥ１及びＩＥ２遺伝子産物がその後の初期(Ｅ：ｅａｒｌｙまたはｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ)及び後期(Ｌ：ｌａｔｅ)遺伝子の発現を調節する。本実施例において、胎盤オルガノイドに感染しなかったＡＤ－１６９株のゲノムＤＮＡは逆転写酵素ＲＴ(Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ)の有無に関わらず検出されているが、それとは別にＲＴが無い場合(ＲＴ(－))には検出されず、ＲＴがある場合(ＲＴ(＋))にのみ検出されるバンド、即ちＡＤ－１６９株が胎盤オルガノイドに感染し、そのオルガノイドの細胞内で発現したＩＥ２遺伝子のｍＲＮＡが検出された。一方でＴＢＰ遺伝子においては、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーが２つのエクソンにまたがるよう設計されている。そのため、このＴＢＰのプライマーセットは、ＴＢＰのｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡのみを検出し、ゲノムＤＮＡは検出しない。ＲＴが無い場合(ＲＴ(－))はＴＢＰのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡが合成されないため、ＰＣＲ産物のバンドが検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明の方法により胎盤様オルガノイドを製造することができる。また、妊婦が摂取した食物や医薬品等は、胎盤を通過すると胎児血中内へ取り込まれる。本発明の方法により製造される胎盤様オルガノイドを利用することにより、どのような物質が胎盤を通過するか、また通過した物質が胎児にどのような影響を及ぼすかを評価することができ、さらに胎盤を経由して感染するウイルス等の感染メカニズムを解明することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】