特開 2022-82045 生体分子の回収方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022082045

(43)【公開日】2022-06-01

(54)【発明の名称】生体分子の回収方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/14 20060101AFI20220525BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20220525BHJP

【ＦＩ】

C07K1/14

C12N15/10 100Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020193364

(22)【出願日】2020-11-20

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 第１０回イオン液体討論会実行委員会発行の第１０回イオン液体討論会 要旨集、令和１年１１月２１日発行 イオン液体研究会開催の第１０回イオン液体討論会、令和１年１１月２１日～２２日開催

(71)【出願人】

【識別番号】592068200

【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学

(71)【出願人】

【識別番号】504132881

【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】藤田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】大野 弘幸

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA50

4H045EA61

4H045GA15

4H045GA45

(57)【要約】

【課題】簡便な処理によって、かつ生体分子の活性の低下を抑制できる、生体分子を回収する手段を提供する。
【解決手段】生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と、を混合することを有する、生体分子の回収方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と、を混合することを有する、生体分子の回収方法。

【請求項2】

前記生体分子がタンパク質および核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の回収方法。

【請求項3】

前記水溶液の塩の濃度が０．４Ｍ以下である、請求項１または２に記載の回収方法。

【請求項4】

前記水和イオン液体が下記一般式（１）または下記一般式（２）：

【化1】

式中、
Ｘは、窒素原子またはリン原子を表し、
ｎは、７～１１の整数を表し、
ｐおよびｑは、それぞれ独立して２～１４の整数を表し、かつ｜ｐ－ｑ｜≧６を満足し、
Ａ^Ｘ－は、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸イオン、硫酸水素イオンおよびカルボン酸イオンからなる群から選択される対アニオンを表し、ｘは、前記対アニオンの価数を表す、
で表されるイオン液体の水和物であり、
この際、前記水和物における前記イオン液体と水和水とのモル比が１：１～１：２０である、請求項１～３のいずれか１項に記載の回収方法。

【請求項5】

疎水性のイオン液体をさらに混合することを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の回収方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体分子の回収方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質、核酸などの生体分子は、生体外での安定性が低いことが知られている。そのため、例えばタンパク質は、短期間の保管の場合、４℃以下、緩衝液中で保管される。長期間の保管の場合、凍結乾燥したタンパク質を－２０～－８０℃で保管することは汎用法の一つである。しかし、これらの方法では、凍結乾燥の過程で変性が生じタンパク質の安定性を十分に確保できないことがある。

【0003】

非特許文献１および２には、タンパク質を水和イオン液体中で保管することにより、経時安定性、熱安定性などを向上させる技術が開示されている。

【0004】

また、タンパク質は、容易に変性し、凝集体を形成する。このような凝集タンパク質から活性を有するタンパク質へと再生する方法として、特許文献１には、水和イオン液体として所定の化学構造を有するイオン液体の水和物を使用することにより、強力な変性剤を使用しなくとも凝集タンパク質を可溶化することができ、かつ、その他の添加剤を使用しなくともネイティブ類似の構造へと巻き戻し（リフォールディング）することが一貫して実施可能な技術が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１９／１０３１０６号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Biomacromolecules (2007), 8, 2080-2086

【非特許文献2】Chemical Communications (2015), 51, 10883-10886

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

このように、水和イオン液体は、生体分子の保管だけではなく、様々な用途で使用することができる。しかし、水和イオン液体中で反応、保管後の生体分子を水溶液中で利用する場合、イオン液体中の生体分子を水溶液（例えば、緩衝液）中へと移行させる必要がある。そのためには、希釈、脱塩、透析などの煩雑な操作を行う必要がある。また、操作途中での生体分子の活性低下、収率低下などの問題がある。

【0008】

そこで本発明は、簡便な処理によって、かつ生体分子の活性の低下を抑制できる、生体分子を回収する手段を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液とを混合することを有する、生体分子の回収方法によって上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、簡便な処理によって生体分子を水溶液中に移行でき、かつ生体分子の活性の低下を抑制できる、生体分子を回収する手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】二相系形成後の水相に含まれるＣｏｎＡ濃度と添加したリン酸緩衝液の塩濃度との関係を示すグラフである。

【図2】二相系形成後のイオン液体相の含水率と添加したリン酸緩衝液の塩濃度との関係を示すグラフである。

【図3】二相系形成後の水相に含まれるＣｏｎＡについて、結合活性の評価を行った結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

【0013】

本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。

【0014】

本発明の一形態は、生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と、を混合することを有する、生体分子の回収方法に関する。本形態の生体分子の回収方法によれば、簡便な処理によって、かつ生体分子の活性を低下させることなく、生体分子を回収することができる。

【0015】

＜生体分子を含む水和イオン液体＞
本形態において、水和イオン液体に含まれる生体分子は、特に制限されず、タンパク質、核酸、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、補酵素、ホルモン、これらの複合体または代謝産物などが挙げられる。

【0016】

一実施形態では、生体分子は、タンパク質および核酸からなる群から選択される。

【0017】

本形態に係るタンパク質には、天然または人造（化学合成法、発酵法、遺伝子組み換え法）などの由来や製造方法の別にかかわらず、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびこれらの複合体（例えば、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質と化合物との複合体、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質と糖類との複合体、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質と金属との複合体、（ポリ）ペプチドまたはタンパク質と補酵素との複合体など）が含まれる。なお、タンパク質の種類は問わず、例えば細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、および核内タンパク質がいずれも含まれる。

【0018】

後述のとおり、水和イオン液体として、下記一般式（１）または下記一般式（２）で表されるイオン液体の水和物（水和イオン液体）を使用すると、凝集タンパク質を再生することができる。そのため、本形態に係るタンパク質は、大腸菌などの原核生物や酵母などの真核生物や無細胞抽出系などの異種発現系を用いて遺伝子工学的に生産された組み換え体であってもよい。このような組み換え体は、しばしば不溶性で不活性の凝集体（いわゆる封入体）として得られることが多い。本形態に係る水和イオン液体で凝集タンパク質を処理することにより、凝集タンパク質を溶解およびリフォールディングすることで凝集タンパク質を再生することができ、再生した（正常な）タンパク質を含む水和イオン液体を得ることができる。

【0019】

本形態に係るタンパク質の分子量の上限は、特に制限はないが、通常約１０，０００，０００以下である。また、タンパク質の分子量の下限は、特に制限はないが、通常１，０００程度である。もちろん、分子量１，０００未満のタンパク質であってもよい。タンパク質の分子量は、一般的なゲル電気泳動法などで測定することができる。

【0020】

本形態に係る核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）などが含まれる。核酸は、生物試料由来のものであっても、合成したものであってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ、セルフリ－ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが含まれる。ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、それらの前駆体または合成ＲＮＡなどが含まれる。生物試料からの核酸の回収は、従来公知の知見を参照し、または組み合わせることによって行うことができる。合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列または非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製できる。

【0021】

水和イオン液体中の生体分子の含有量は、生体分子が溶解する限り、特に制限されない。

【0022】

本形態に係る水和イオン液体は、疎水性のイオン液体の水和物であり、後述の水または低濃度の塩の水溶液と混合することによりイオン液体／水二相系を形成できるものであれば、特に制限されない。本形態に係るイオン液体は、１００℃以下、好ましくは８０℃以下に融点を有し、室温で液体状態を呈するものである。

【0023】

一実施形態では、水和イオン液体は、下記一般式（１）または下記一般式（２）で表されるイオン液体の水和物である。

【0024】

下記一般式（１）または下記一般式（２）で表されるイオン液体は、水和物を調製するとほぼ全て液体状態となる。

【0025】

また、下記一般式（１）または下記一般式（２）で表されるイオン液体は、後述の水または低濃度の塩の水溶液と混合してイオン液体／水二相系を形成した場合、他のイオン液体と比べて、イオン液体相の含水率を低くすることができる。よって、生体分子の回収率を高くすることができる。

【0026】

【化1】

【0027】

一般式（１）および（２）において、Ｘは、窒素原子またはリン原子を表す。すなわち、水和イオン液体を構成するイオン液体のカチオンは、アンモニウムカチオンまたはホスホニウムカチオンである。

【0028】

一般式（１）で表されるイオン液体のカチオンは、中心元素（窒素原子またはリン原子）に対して４本の同一のアルキル鎖（－Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１）が共有結合した構造を有している。ここで、ｎは、７～１１の整数を表す。一般式（１）においてｎが７以上であると、カチオンの疎水性が高くなるにより、二相系形成後のイオン液体相の含水率が低くなる。低含水率のイオン液体では、タンパク質の溶解度が低下するため、イオン液体相から水相へタンパク質を移行させることができる。また、カチオンの疎水性が高くなるにより、溶解した凝集タンパク質を溶解させることができる。一般式（１）においてｎが１１以下であると、水和物の形態とした場合に、タンパク質（特に凝集タンパク質）を十分に可溶化（溶解）させることができる。なお、一般式（１）で表されるイオン液体において、ｎは、好ましくは８～１０の整数を表し、より好ましくは８である。また、一般式（１）で表されるイオン液体において、Ｘは、好ましくは窒素原子である（後述する実施例を参照）。

【0029】

また、一般式（２）で表されるイオン液体のカチオンは、中心元素（窒素原子またはリン原子）に対して４本のアルキル鎖が結合しているが、４本のうち１本のアルキル鎖（－Ｃ_ｑＨ_２ｑ＋１）の炭素数（ｑ）は他の３本のアルキル鎖（－Ｃ_ｐＨ_２ｐ＋１）の炭素数（ｐ）とは異なっている。さらに、これらの炭素数の差は６以上異なっている必要がある（つまり、｜ｐ－ｑ｜≧６を満足する）。非対称構造を有する一般式（２）で表されるイオン液体の場合には、このような構造を有することにより、界面活性剤に類似した性質を示すようになり、タンパク質が凝集体である場合、凝集タンパク質の再生剤として優れた性能を発揮することが可能となる。また、上記一般式（１）と同様にある程度の疎水性を示すという観点から、一般式（２）におけるｐおよびｑは、それぞれ独立して２～１４の整数を表すことが好ましい。他の好ましい実施形態では、一般式（２）で表されるイオン液体において、ｐ＜ｑをさらに満足する（つまり、１本のみ異なるアルキル鎖が他の３本のアルキル鎖よりも長い）。さらに他の好ましい実施形態では、一般式（２）で表されるイオン液体において、Ｘがリン原子であり、ｐが３～５の整数であり、ｑが９～１３の整数である。より好ましい実施形態では、一般式（２）で表されるイオン液体において、Ｘがリン原子であり、ｐが４であり、ｑが１２である。

【0030】

一般式（１）および（２）において、Ａ^ｘ－は、対アニオンを表す（ｘは当該対アニオンの価数を表す）。そして、本形態において、当該対アニオンは、３価のアニオン（ｘ＝３）であるリン酸イオン、２価のアニオン（ｘ＝２）であるリン酸水素イオンおよび硫酸イオン、並びに１価のアニオン（ｘ＝１）であるリン酸二水素イオンおよび硫酸水素イオンからなる群から選択される。つまり、ｘは１～３の整数である。なお、カルボン酸イオンとしては、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、酪酸イオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオンなどが挙げられる。また、対アニオンとしては、生体分子の構造保持、活性をより向上できるとの観点から、好ましくはリン酸二水素イオンである。

【0031】

上記一般式（１）または上記一般式（２）で表されるイオン液体の具体的な構造について特に制限はなく、上述した各構造の組み合わせによって得られる任意のイオン液体が用いられうる。イオン液体の一例としては、下記一般式（３）または下記一般式（４）で表されるものが挙げられる。

【0032】

【化2】

【0033】

好ましい実施形態では、イオン液体は、生体分子の回収率をより向上できるとの観点から、一般式（３）で表される。

【0034】

本形態の水和イオン液体は、上記イオン液体が水に水和したものであり、水和水を含む。

【0035】

水和イオン液体におけるイオン液体と水和水とのモル比は、水和に関与しない水（自由水）が生じない範囲で、適宜調整することができる。当該モル比（イオン液体：水）は、例えば１：１～１：２０であり、自由水の発生を防止するという観点から、好ましくは１：２～１：１７であり、より好ましくは１：３～１：１５であり、さらに好ましくは１：３～１：７であり、特に好ましくは１：３～１：５であり、最も好ましくは１：３～１：４である。

【0036】

本形態において、水和イオン液体は、１種のみが単独で用いられてもよいし、イオン液体のカチオンおよびアニオンの構造の組み合わせや水和水の含有量の異なる２種以上のものが併用されてもよい。好ましい実施形態では、イオン液体は、二相系形成後の水相に含まれる塩の種類を減らすとの観点から、１種のみが単独で用いられる。

【0037】

本形態に係る水和イオン液体は、市販品が存在する場合には当該市販品を購入して用いてもよい。また、市販品が存在しない場合であっても、従来公知の手法により製造可能である（後述する実施例を参照）。

【0038】

イオン液体を水和イオン液体とする手法についてもそれ自体は公知であり、イオン液体に所定量の水を添加した後、必要に応じて混合、撹拌等の処理を施すことで、水和イオン液体を得ることができる。

【0039】

生体分子を含む水和イオン液体の調製方法についてもそれ自体は公知であり、生体分子と水和イオン液体とを混合する方法、生体分子を含む水溶液とイオン液体とを混合する方法などが挙げられる。混合時間、混合する際の温度条件などは、特に制限されず、生体分子が水和イオン液体に溶解するように適宜調整できる。

【0040】

生体分子として凝集タンパク質を使用する場合、凝集タンパク質をリフォールディングさせるためにタンパク質を含む水和イオン液体を一定時間静置してもよい。静置時間は例えば１～５０時間でありうる。また、静置する際の温度条件としては、０～１００℃の範囲で、対象とするタンパク質の熱耐性に応じて適宜選択することができるが、通常は４～３０℃の範囲である。

【0041】

＜水または低濃度の塩の水溶液＞
本形態に係る水としては、特に制限されず、純水、蒸留水、脱イオン水、ＲＯ水、ミリＱ水などを適宜使用することができる。なお、ミリＱ水は、メルク社製の超純水装置ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）（商品名）により精製された超純水である。

【0042】

本形態に係る低濃度の塩の水溶液としては、緩衝作用のある従来公知の水溶液を使用することができる。本形態に係る低濃度の塩の水溶液としては、例えばリン酸、硫酸、炭酸などの無機酸の塩、および酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸の塩を含む水溶液が挙げられる。具体例としては、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。低濃度の塩の水溶液は、従来公知の方法により調製してもよく、市販品を使用してもよい。

【0043】

水溶液に含まれる塩の濃度としては、生体分子の回収率をより高めるとの観点から、好ましくは０．４Ｍ以下であり、より好ましくは０．２Ｍ以下であり、さらに好ましくは０．１Ｍ以下であり、特に好ましくは０．０５Ｍ以下である。塩の濃度の下限は、特に制限されず、０Ｍ超であればよい。

【0044】

低濃度の塩の水溶液のｐＨは、特に制限されず、回収する生体分子の種類に応じて適宜選択することができる。低濃度の塩の水溶液のｐＨは、例えば７前後であればよい。

【0045】

＜混合工程＞
本形態に係る生体分子の回収方法は、上記生体分子を含む水和イオン液体と上記水または低濃度の塩の水溶液とを混合することを有する。

【0046】

生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液との混合方法は、生体分子を含む水和イオン液体に対して水または低濃度の塩の水溶液を添加して混合してもよく、水または低濃度の塩の水溶液に対して生体分子を含む水和イオン液体を添加して混合してもよい。混合後、必要に応じて、撹拌を行ってもよい。

【0047】

また、混合において、生体分子を含む水和イオン液体および水または低濃度の塩の水溶液とは別に、疎水性のイオン液体をさらに混合してもよい。これにより、水相への生体分子の回収率をさらに高めることができる。疎水性のイオン液体としては、特に制限されず、例えば上記一般式（１）または上記一般式（２）で表されるイオン液体であって、生体分子を含む水和イオン液体を構成するイオン液体とは異なるものを使用できる。

【0048】

生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と混合比（体積比）（生体分子を含む水和イオン液体：水または低濃度の塩の水溶液）は、特に制限されず、例えば１：０．５～３である。

【0049】

疎水性のイオン液体をさらに混合する場合、生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と疎水性のイオン液体との混合比（体積比）（生体分子を含む水和イオン液体：水または低濃度の塩の水溶液：疎水性のイオン液体）は、特に制限されず、例えば１：０．１～１である。また、混合のタイミングにも特に制限はなく、各成分の混合順序は任意である。混合のタイミングは、疎水性を上げるとの観点から、好ましくは生体分子を含む水和イオン液体および水または低濃度の塩の水溶液を混合した後である。

【0050】

混合する際の温度は、特に制限されず、通常４～３０℃の範囲である。また、混合時間も特に制限されない。

【0051】

生体分子を含む水和イオン液体と水または低濃度の塩の水溶液と（必要に応じて疎水性イオン液体と）を混合した後、静置することにより、イオン液体／水二相系を形成することができる。二相系を形成することで、生体分子をイオン液体相から水相へと移行させる、すなわち生体分子を水相に回収することができる。

【0052】

生体分子のイオン液体相から水相へ移行するメカニズムは、以下のように推定される。

【0053】

二相系形成後のイオン液体相の含水率を評価すると、後述の実施例に示すように、本形態に係るイオン液体相の含水率が低くなる。低含水率の疎水性のイオン液体は、生体分子（例えば、天然状態のタンパク質）の溶解度が低下することが知られている。そのため、生体分子をイオン液体相から水相へと移行させることができる、すなわち生体分子を水相に回収することができると考えられる。

【0054】

水相に回収した生体分子は、様々な用途で使用することができる。例えば、生体分子の精製、評価などに用いることができる。

【実施例0055】

以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。

【0056】

［製造例１］テトラ－ｎ－オクチルアンモニウムリン酸二水素（［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］）の調製
テトラ－ｎ－オクチルアンモニウムブロミド（Ｎ８８８８・Ｂｒ）を水に溶解し、陰イオン交換カラム樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ ７８）に通液してアニオンをＯＨ^－に交換した。次いで、等モル量のリン酸を加え、中和反応後、エバポレーターで脱水することで、テトラ－ｎ－オクチルアンモニウムリン酸二水素（［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］）を調製した。

【0057】

［製造例２］テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムリン酸二水素（［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］の調製
テトラ－ｎ－オクチルアンモニウムブロミド（Ｎ８８８８・Ｂｒ）の代わりにテトラ－ｎ－オクチルホスホニウムブロミド（Ｐ８８８８・Ｂｒ）を使用したこと以外は、製造例１と同様の操作を行い、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムリン酸二水素（［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］）を調製した。

【0058】

［製造例３］テトラブチルホスホニウムテトラメチルベンゼンスルホン酸（［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］）（比較例）の調製
氷浴下で、４０質量％のテトラブチルホスホニウムホドリキシド水溶液に対して小過剰モル量となるように３５質量％の塩酸水溶液を滴下した。得られた溶液を濃縮し、ジクロロメタンに溶解させた。この溶液に僅かに純水を添加し分液操作を行った。上層のｐＨが中性となるまでこの操作を繰り返した。得られた溶液の溶媒を除去し、真空乾燥することでテトラブチルホスホニウムクロリド（Ｐ４４４４・Ｃｌ）を得た。

【0059】

Ｐ４４４４・Ｃｌおよびトリメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムをそれぞれ任意の割合で水に溶解させた。トリメチルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液に対して、１．１倍モル量となるようにＰ４４４４・Ｃｌ水溶液を氷浴下、撹拌しながら滴下した。得られた溶液を濃縮しジクロロメタンに溶解させた。ジクロロメタンに対して等体積の純水を添加し、激しく混合し静置、下層を回収した。下層にハロゲンの存在が確認できなくなるまでこの作業を繰り返した。下層のハロゲンは、硝酸／硝酸銀混合溶液に下層とメタノールを添加し、ＡｇＣｌの沈澱による白濁の有無から存在を確認した。得られた下層から溶媒除去し、常温で１２時間および４５℃で１２時間真空乾燥し、白色固体として［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］を得た。得られた生成物は１Ｈ－ＮＭＲにより構造を確認した。

【0060】

［水和イオン液体の調製］
さらに、上記で調製した［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］、［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］および［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］について、水を添加することにより水和物の形態とした。具体的には、イオン液体の１イオンペアに対して水分子の数が３分子の割合となるように水を添加して、水和イオン液体を得た。

【0061】

［タンパク質の調製］
タンパク質として、糖鎖認識タンパク質であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の凝集体を調製した。具体的には、ＣｏｎＡを１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにミリＱ水と混合し、７０℃にて１０分間インキュベートすることにより、ＣｏｎＡの凝集体を得た。

【0062】

［タンパク質を含む水和イオン液体の調製］
上記で調製した水和イオン液体にＣｏｎＡの凝集体を１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した後、一晩撹拌を行い、タンパク質を含む水和イオン液体（Ｈｙ［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］、Ｈｙ［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］およびＨｙ［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］）を調製した。

【0063】

［タンパク質の回収および評価］
上記で調製したタンパク質を含む水和イオン液体に等体積のリン酸緩衝液（塩濃度：５０ｍＭ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍまたは１Ｍ）を添加し、撹拌混合して、イオン液体／水二相系を形成した。遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、２５℃）後、各相を分取して、以下の評価を行った。

【0064】

（水相に含まれるＣｏｎＡ濃度の測定）
水相に含まれるＣｏｎＡの濃度をＢＣＡ法（ビシンコシン酸法）により定量した。結果を図１に示す。

【0065】

図１に示すように、ＣｏｎＡが水相へ移行しており、ＣｏｎＡを回収できていることが分かる。また、［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系および［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系では、塩濃度の低いリン酸緩衝液（０．２Ｍ以下の塩濃度）を使用することで、［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］／水二相系よりも多くのＣｏｎＡが水相へ移行したことが分かる。また、［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］／水二相系とは異なり、［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系および［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系では、リン酸緩衝液の塩濃度が低いほど、ＣｏｎＡの回収量が多くなることが分かる。

【0066】

（イオン液体相の含水率の測定）
イオン液体相の含水率をカールフィッシャー法で測定した。結果を図２に示す。

【0067】

図２に示すように、［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系および［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系では、リン酸緩衝液の塩濃度が高くなると、イオン液体相の含水率が高くなることが分かる。一方、［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］／水二相系では、リン酸緩衝液の塩濃度が高くなると、イオン液体相の含水率が低くなることが分かる。図１および２から、イオン液体相の含水率が低くなると、ＣｏｎＡの水相への移行が促進されることが分かる。

【0068】

（ＣｏｎＡのフォールディング状態の評価）
調製したタンパク質を含む水和イオン液体について、蛍光スペクトル測定を行い、極大蛍光波長からＣｏｎＡのフォールディング状態を評価した。蛍光測定では、タンパク質中のトリプトファン残基を測定対象とする励起波長２８０ｎｍで励起を行った。結果を表１に示す。

【0069】

【表1】

【0070】

表１に示す結果について考察する。まず、ネイティブのＣｏｎＡはバッファー中に溶解すると３３６ｎｍに極大蛍光波長が観測される。Ｈｙ［Ｐ４４４４］［ＴＭＢＳ］では、３０７ｎｍに極大蛍光波長を示し、大幅な短波長側へのシフトから、ＣｏｎＡが凝集していることが示唆される。一方、Ｈｙ［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］およびＨｙ［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］に溶解したＣｏｎＡの極大蛍光波長は、それぞれ３３９ｎｍおよび３４０ｎｍである。わずかに長波長側にシフトしているものの、ＣｏｎＡがネイティブに比較的類似した構造を形成していることが示唆される。図１の結果を考慮すると、ＣｏｎＡのイオン液体相から水相への移行は、水和イオン液体中のＣｏｎＡのフォールディング状態に影響を受けることが分かる。

【0071】

（水相に含まれるＣｏｎＡの活性の確認）
水相に含まれるＣｏｎＡについて、バイオレイヤー干渉法を用いて糖鎖結合能の確認を行った。異なる濃度のネイティブのＣｏｎＡの結合速度から作成した検量線を用いて、水相に移行した活性をもつＣｏｎＡの濃度を算出し、ＢＣＡ法で得られた濃度と比較することで、相対活性を算出した。結果を図３に示す。

【0072】

図３に示すように、［Ｎ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系および［Ｐ８８８８］［ｄｈｐ］／水二相系において、水相に移行したＣｏｎＡは、十分な糖鎖結合活性を示すことが分かる。したがって、水相への移行の過程で、結合活性の低下を抑制できることが分かる。

【0073】

以上の結果および考察に基づき、タンパク質を含む水和イオン液体と低濃度の塩の水溶液とを混合することで、イオン液体／水二相系を形成し、イオン液体相に含まれるタンパク質を水相へと移行できることが分かる。操作としては、２つの液を混合するだけであり、簡便かつ短時間でタンパク質を回収することが可能である。また、従来の希釈、脱塩などの操作とは異なり、操作途中でのタンパク質の活性低下を抑制することも可能である。

【図1】

【図2】

【図3】