▶ 株式会社ダイセルの特許一覧 ▶ 国立大学法人大阪大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022085044
(43)【公開日】2022-06-08
(54)【発明の名称】融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20220601BHJP
C07K 14/32 20060101ALI20220601BHJP
C07K 14/34 20060101ALI20220601BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20220601BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220601BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220601BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220601BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220601BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220601BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220601BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220601BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220601BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220601BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20220601BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/32
C07K14/34
C07K14/435
C12N15/62 Z
C12N15/31
C12N15/12
C12M1/00 A
C12M1/34 B
C12M3/00 Z
A61P35/00
A61K48/00
A61K38/16
C12Q1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020196522
(22)【出願日】2020-11-27
(71)【出願人】
【識別番号】000002901
【氏名又は名称】株式会社ダイセル
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】二村 圭祐
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC01
4B029FA03
4B029FA04
4B029GA08
4B029GB06
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS05
4B063QS28
4B063QS32
4B063QS39
4B063QX02
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA02
4C084BA22
4C084BA23
4C084NA14
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】本開示の課題は、少なくとも、化学療法抵抗性がん細胞を標的としたがん治療に有用な技術の提供である。
【解決手段】炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、融合タンパク質。
【選択図】図６
【解決手段】炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、融合タンパク質。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、
該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、
該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、
融合タンパク質。
該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、
該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、
融合タンパク質。
【請求項2】
前記挿入が、配列番号１で表される前記炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１５３位～１７３位に相当する領域のうちの何れかの位置で行われるものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記炭疽菌防御抗原配列が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列である、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３４２位のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されている配列である、
請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
配列番号１で表されるアミノ酸配列である、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３４２位のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されている配列である、
請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記目的タンパク質配列は、第２のプロテアーゼ認識配列が挿入された配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記目的タンパク質配列が、Ｎ末端側から順に、ジフテリア毒素Ｃドメイン（ＤＴ－Ｃ）配列、前記第２のプロテアーゼ認識配列、及びジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ－Ｔ）配列を含むものである、
請求項４に記載の融合タンパク質。
請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＤＴ－Ｃ配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列であり、及び／又は
前記ＤＴ－Ｔ配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列である、
請求項５に記載の融合タンパク質。
前記ＤＴ－Ｔ配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列である、
請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記プロテアーゼ認識配列及び前記第２のプロテアーゼ認識配列は、同一の又は異なるプロテアーゼが認識するものであり、該プロテアーゼはマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）から選択される、
請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
請求項５又は６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記目的タンパク質配列が、蛍光を発するタンパク質の配列を含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記プロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）又はウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が認識するものである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記蛍光を発するタンパク質が、ｍＣｌｏｖｅｒである、請求項８又は９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を細胞死に誘導するための組成物。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を含むがんを治療するための組成物。
【請求項13】
請求項８～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を標識するための組成物。
【請求項14】
請求項１３に記載の組成物を含む、前記がん標識用キット。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、融合タンパク質に関する。詳細には、化学療法抵抗性がん細胞を標的としたがん治療に有用な融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
がんに対する初回化学療法は著効例が多いが、ほとんどの症例で化学療法に抵抗性を示すがん細胞が生じ、将来的な再発の原因となる。高悪性度漿液性腺癌は卵巣がんの中でも最も発症頻度が高く、初回の化学療法は著効するが、ほとんどの症例で再発する。初回化学療法から短期間で再発した場合、同じ薬剤は使用することができない。そのため、化学療法抵抗性がん細胞を標的とした薬剤が将来的な再発を防ぐ療法となると考えられる。
しかしながら、このような薬剤は未だ開発されていない。その理由の１つとして、実際のがん患者から化学療法後に残存するがん細胞を回収することが難しく、化学療法抵抗性を示すがん細胞の特徴がほとんど明らかになっていないことが挙げられる。
しかしながら、このような薬剤は未だ開発されていない。その理由の１つとして、実際のがん患者から化学療法後に残存するがん細胞を回収することが難しく、化学療法抵抗性を示すがん細胞の特徴がほとんど明らかになっていないことが挙げられる。
【0003】
これまでに炭疽菌防御抗原（ＰＡ）は、標的細胞の細胞膜上で７量体を形成し、７量体を形成したＰＡの致死因子結合部分に致死因子が結合することによって、炭疽菌の毒性を生ずることが分かっている。また、細胞特異性を高めるためにＰＡの致死因子結合部分に、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）又はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に認識される切断部位のいずれかを含むように作製されたＰＡ変異体は、いずれか一方のＰＡ変異体のみでは機能的な７量体を形成できないため、致死因子との結合が阻害され、がん細胞に対する傷害性が発揮できない。そのため、いずれか一方のＰＡ変異体のみを投与した場合には、抗がん効果が低いことが示されている。一方で、それら２種類のＰＡ変異体を一緒に投与すると、機能的な７量体を形成することができ、細胞特異性が高いことによりマウスへの毒性を低減しつつも、移植されたがん細胞に対して特異的に効果を生ずることが示されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Nat. Biotechnol., 2005;23(6):725-730
【非特許文献2】Biochemistry, 2014;53:2166-2171
【非特許文献3】Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2015;3:16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示の課題は、少なくとも、化学療法抵抗性がん細胞を標的としたがん治療に有用な技術の提供である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、化学療法前の卵巣がん臨床検体や化学療法後の卵巣がん臨床検体のシングルセル遺伝子発現解析やフローサイトメトリーで分離及び回収した細胞の遺伝子発現解析から、化学療法後に残存する血球系以外の細胞には間葉系マーカーＴＨＹ１を始め、間葉系細胞の性質に関わる遺伝子群が発現している間葉系がん細胞が出現することを見出した。
この細胞集団の遺伝子発現から炭疽菌毒素の受容体であるＡＮＴＸＲや、プロテアーゼＭＭＰ及びｕＰＡが特異的に発現していることを見出した。さらにこの細胞は増殖マーカーがほとんど発現しておらず、静止期にあることから、従来の抗がん剤の効果を見込めないことを見出した。
この細胞集団の遺伝子発現から炭疽菌毒素の受容体であるＡＮＴＸＲや、プロテアーゼＭＭＰ及びｕＰＡが特異的に発現していることを見出した。さらにこの細胞は増殖マーカーがほとんど発現しておらず、静止期にあることから、従来の抗がん剤の効果を見込めないことを見出した。
【0007】
ここで本発明者らは、化学療法後に残存する化学療法抵抗性がん細胞を標的とした静止期がん細胞治療用分子ＰＡ－ＤＴを開発した。ＰＡ－ＤＴは、炭疽菌防御抗原（ＰＡ）とジフテリア毒素（ＤＴ）を融合した分子である。本発明者等は、ＰＡ－ＤＴはマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）を発現するがん細胞の近くで活性化し、ＡＮＴＸＲに結合すること、さらにその後、ＡＮＴＸＲに結合したＰＡ－ＤＴは、細胞内へ送達され、がん細胞を細胞死へと誘導することを見出した。なお、ＰＡ－ＤＴのマウスへの腹腔内投与において、マウスへの有害事象は観察されなかった。
【0008】
さらに発明者等は、化学療法後に残存する化学療法抵抗性がん細胞を標識するために、静止期がん細胞検出用分子ＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒを開発した。ＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒは、炭疽菌毒素である防御抗原（ＰＡ）と蛍光色素であるｍＣｌｏｖｅｒ（Ｃｌｏｖｅｒ）を融合した分子である。本発明者等は、ＰＡ－ＣｌｏｖｅｒはＭＭＰ又はｕＰＡを発現するがん細胞の近くで活性化し、ＡＮＴＸＲに結合することにより、またはその後、ＡＮＴＸＲに結合したＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒが細胞内へ送達されることにより、がん細胞を標識できることを見出した。
【0009】
すなわち、本開示は以下のとおりである。
［１］炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、
該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、
該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、
融合タンパク質。
［２］前記挿入が、配列番号１で表される前記炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１５３位～１７３位に相当する領域のうちの何れかの位置で行われるものである、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記炭疽菌防御抗原配列が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列である、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３４２位のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されている配列である、
［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記目的タンパク質配列は、第２のプロテアーゼ認識配列が挿入された配列である、［１］～［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［５］前記目的タンパク質配列が、Ｎ末端側から順に、ジフテリア毒素Ｃドメイン（ＤＴ－Ｃ）配列、前記第２のプロテアーゼ認識配列、及びジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ－Ｔ）配列を含むものである、
［４］に記載の融合タンパク質。
［６］前記ＤＴ－Ｃ配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列であり、及び／又は
前記ＤＴ－Ｔ配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列である、
［５］に記載の融合タンパク質。
［７］前記プロテアーゼ認識配列及び前記第２のプロテアーゼ認識配列は、同一の又は異なるプロテアーゼが認識するものであり、該プロテアーゼはマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）から選択される、
［５］又は［６］に記載の融合タンパク質。
［８］前記目的タンパク質配列が、蛍光を発するタンパク質の配列を含む、
［１］～［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］前記プロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）又はウロ
キナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が認識するものである、［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］前記蛍光を発するタンパク質が、ｍＣｌｏｖｅｒである、［８］又は［９］に記載の融合タンパク質。
［１１］［１］～［７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を細胞死に誘導するための組成物。
［１２］［１］～［７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を含むがんを治療するための組成物。
［１３］［８］～［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を標識するための組成物。
［１４］［１３］に記載の組成物を含む、前記がん標識用キット。
［１５］［１］～［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１］炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、
該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、
該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、
融合タンパク質。
［２］前記挿入が、配列番号１で表される前記炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１５３位～１７３位に相当する領域のうちの何れかの位置で行われるものである、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記炭疽菌防御抗原配列が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列である、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、３４２位のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されている配列である、
［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記目的タンパク質配列は、第２のプロテアーゼ認識配列が挿入された配列である、［１］～［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［５］前記目的タンパク質配列が、Ｎ末端側から順に、ジフテリア毒素Ｃドメイン（ＤＴ－Ｃ）配列、前記第２のプロテアーゼ認識配列、及びジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ－Ｔ）配列を含むものである、
［４］に記載の融合タンパク質。
［６］前記ＤＴ－Ｃ配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列であり、及び／又は
前記ＤＴ－Ｔ配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列である、
［５］に記載の融合タンパク質。
［７］前記プロテアーゼ認識配列及び前記第２のプロテアーゼ認識配列は、同一の又は異なるプロテアーゼが認識するものであり、該プロテアーゼはマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）から選択される、
［５］又は［６］に記載の融合タンパク質。
［８］前記目的タンパク質配列が、蛍光を発するタンパク質の配列を含む、
［１］～［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］前記プロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）又はウロ
キナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が認識するものである、［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］前記蛍光を発するタンパク質が、ｍＣｌｏｖｅｒである、［８］又は［９］に記載の融合タンパク質。
［１１］［１］～［７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を細胞死に誘導するための組成物。
［１２］［１］～［７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を含むがんを治療するための組成物。
［１３］［８］～［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を標識するための組成物。
［１４］［１３］に記載の組成物を含む、前記がん標識用キット。
［１５］［１］～［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0010】
本開示により、少なくとも、化学療法抵抗性がん細胞を標的としたがん治療に有用な技術が提供できる。
【0011】
これまでに上市されている抗がん剤は、増殖しているがん細胞に作用し細胞死を誘導させるものや、がんの変異を利用した分子標的薬が主であったが、これらの抗がん剤は静止期にあるがん細胞に対して効果を示し難いものであった。本開示のＰＡ－ＤＴによって、静止期にある化学療法抵抗性がん細胞の遺伝子発現プロファイルを利用することで、特異的にこれらの細胞を傷害することが可能になる。
ＰＡ－ＤＴはプロテアーゼ非存在下では安定であるが、プロテアーゼに曝露されると切断され活性化する。活性化したＰＡ－ＤＴは速やかに分解される。そのため、ＰＡ－ＤＴは、化学療法抵抗性がん細胞の近傍に来るまでは安定であるが、近傍に来ることで、ＭＭＰやｕＰＡなどのプロテアーゼにより切断されることで活性化され、ＡＮＴＸＲに結合し、細胞内に取り込まれることによって、細胞内に毒素を放出し、細胞死を誘導するものである。ここで、活性化したＰＡ－ＤＴががん細胞に取り込まれなかった場合には、活性化ＰＡ－ＤＴの安定性が低下し、周りの正常組織に作用する前に分解されるため副作用は少ない。また、本開示の分子の毒素部分はジフテリア毒素に限られず、必要に応じて任意の毒素等に置き換えることができる。
ＰＡ－ＤＴはプロテアーゼ非存在下では安定であるが、プロテアーゼに曝露されると切断され活性化する。活性化したＰＡ－ＤＴは速やかに分解される。そのため、ＰＡ－ＤＴは、化学療法抵抗性がん細胞の近傍に来るまでは安定であるが、近傍に来ることで、ＭＭＰやｕＰＡなどのプロテアーゼにより切断されることで活性化され、ＡＮＴＸＲに結合し、細胞内に取り込まれることによって、細胞内に毒素を放出し、細胞死を誘導するものである。ここで、活性化したＰＡ－ＤＴががん細胞に取り込まれなかった場合には、活性化ＰＡ－ＤＴの安定性が低下し、周りの正常組織に作用する前に分解されるため副作用は少ない。また、本開示の分子の毒素部分はジフテリア毒素に限られず、必要に応じて任意の毒素等に置き換えることができる。
【0012】
ＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒも同様に、プロテアーゼ非存在下では安定であるが、プロテアーゼに曝露されると切断され活性化する。これにより化学療法抵抗性がん細胞を標識する検査法としても利用できるものであり。将来的な再発につながるがん細胞検出技術として利用できるものである。例えば、化学療法後の臨床検体は大量の死細胞が存在しているためその評価が極めて難しいものであるが、ＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒによって抵抗性がん細胞を標識することにより、将来的な再発リスクの評価容易に行えるようになる。また、本開示の分子のｍＣｌｏｖｅｒの部分は、必要に応じて任意の蛍光物質に置き換えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】シングルセル発現解析により、初発未治療検体２例、初発化学療法後検体１例、再発検体１例を用いて、卵巣がんを形成する細胞集団の構成の解析を行った。図中、黒色のドットは増殖マーカーであるＭＫＩ６７の遺伝子が発現していることを示す。黒色の濃淡は発現量の程度を示し、黒色が濃い程に発現量が多いことを示す。
【図2】初発未治療検体２例、初発化学療法後検体１例、再発検体１例のシングルセル発現解析結果を１つにまとめて図示したものである。図中、黒いドットは各マーカー（ＥＰＣＡＭ、ＰＴＰＲＣ、ＴＨＹ１、ＭＹＣ、ＭＫＩ６７、ＡＮＴＸＲ１、ＭＭＰ２、ＰＬＡＵ）の遺伝子が発現していることを表す。黒色の濃淡は発現量の程度を示し、黒色が濃い程に発現量が多いことを示す。
【図3】静止期がん細胞を標的とした治療用分子「ＰＡ－ＤＴ」と検出用分子「ＰＡ－Ｃｌｏｖｅｒ」の設計に関する模式図である。
【図4】ＰＡ－ＤＴの作用機序の模式図である。
【図5】Ａは、ＰＡ－ＤＴの模式図を示す。Ｂは、ＰＡ－ＤＴの性能評価を示す図であり、ＰＡ－ＤＴ、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ ｎｏ ｃｕｔと示す）のそれぞれに対してＭＭＰ２、ＭＭＰ９又はｕＰＡを反応させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動し、転写膜に転写し、ＨＲＰ標識Ｍ２抗体で検出したものである（写真図）。
【図6】ＰＡ－ＤＴの殺細胞効果の評価を示す図である。マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２及びヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２にＰＡ－ＤＴを添加して、細胞生存率を比較した。
【図7】ＰＡ－ＤＴ変異体を用いた場合のＰＡ－ＤＴの機能解析結果を示す。マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２に、ＰＡ－ＤＴ（図中ｏｒｉｇｉｎａｌ ＰＡＤＴと示す）、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ｎｏｃｕｔと示す）をそれぞれ添加して、細胞生存率を比較した。
【図8】がん細胞（ヒト卵巣癌細胞（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ）、ヒト頸癌細胞（ＨｅＬａ）、ヒト去勢抵抗性前立腺癌細胞（ＣＷＲ２２Ｒｖ１）、マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０））に対するＰＡ－ＤＴの殺細胞効果の評価を示す図である（写真図）。各細胞にＰＡ－ＤＴを添加し、所定の日数経過後の、生細胞数をコントロールと比較した。
【発明を実施するための形態】
【0014】
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
【0015】
本開示の一実施形態は、炭疽菌防御抗原配列、目的タンパク質配列、及びプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、該炭疽菌防御抗原配列は、該炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されている、融合タンパク質である。
【0016】
本実施形態の融合タンパク質は、炭疽菌防御抗原配列を有することにより、炭疽菌防御抗原受容体（ＡＮＴＸＲ）１及びＡＮＴＸＲ２の何れにも結合することができる。
炭疽菌防御抗原配列は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されることはないが、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。なお、配列番号１の炭疽菌防御抗原配列は、開始コドンのメチオニンを除いたアミノ酸配列である。以下、本実施態様において、配列番号１の炭疽菌防御抗原配列におけるアミノ酸の位置は、開始コドンを除いて定義された位置を示す。
また炭疽菌防御抗原配列は、ＡＮＴＸＲに結合することができる限り、配列番号１で表
されるアミノ酸配列の全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一の配列を含むアミノ酸配列であってもよく、また配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。「１又は数個」とは、例えば１～１１８個、好ましくは１～５４個、さらに好ましくは１～２７個であってもよい。
なお、アミノ酸配列間の同一性は当業者に既知の方法により算出することができ、例えばｂｌａｓｔｐによりデフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いることができる。
炭疽菌防御抗原配列は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されることはないが、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。なお、配列番号１の炭疽菌防御抗原配列は、開始コドンのメチオニンを除いたアミノ酸配列である。以下、本実施態様において、配列番号１の炭疽菌防御抗原配列におけるアミノ酸の位置は、開始コドンを除いて定義された位置を示す。
また炭疽菌防御抗原配列は、ＡＮＴＸＲに結合することができる限り、配列番号１で表
されるアミノ酸配列の全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一の配列を含むアミノ酸配列であってもよく、また配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。「１又は数個」とは、例えば１～１１８個、好ましくは１～５４個、さらに好ましくは１～２７個であってもよい。
なお、アミノ酸配列間の同一性は当業者に既知の方法により算出することができ、例えばｂｌａｓｔｐによりデフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いることができる。
【0017】
炭疽菌防御抗原配列は、該融合タンパク質がＡＮＴＸＲに結合できる限り任意のアミノ酸置換を有していてもよく、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基がトリプトファン、イソロイシン、バリン、ロイシン等に置換されていてもよい。該アミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基が任意のアミノ酸、例えばトリプトファン、イソロイシン、バリン、ロイシン等に置換されている配列を用いる事により、炭疽菌防御抗原のＡＮＴＸＲ２に対する結合を減少させ、一方で、ＡＮＴＸＲ１に対する特異性を高めることができる（非特許文献２）。
本実施形態におけるアミノ酸変異は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されていることにより、ＡＮＴＸＲ１に対する選択性が高まるという利点がある。これにより、炭疽菌防御抗原のＡＮＴＸＲ２に対する結合を減少させ、ＡＮＴＸＲ２を介した細胞死を減少させることができる。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されていることにより、ＡＮＴＸＲ１に対する特異性を高めることができるので、ＡＮＴＸＲ１を発現する細胞を特異的に細胞死させることができる。
すなわち、本実施形態の融合タンパク質は、ＡＮＴＸＲ１に特異的に結合させる場合は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基が任意のアミノ酸で置換されていることが好ましく、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２の何れにも結合させる場合は、該アミノ酸置換が無いものを利用するなど、その目的に応じて使い分けることができる。
本実施形態におけるアミノ酸変異は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されていることにより、ＡＮＴＸＲ１に対する選択性が高まるという利点がある。これにより、炭疽菌防御抗原のＡＮＴＸＲ２に対する結合を減少させ、ＡＮＴＸＲ２を介した細胞死を減少させることができる。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基がトリプトファン残基に置換されていることにより、ＡＮＴＸＲ１に対する特異性を高めることができるので、ＡＮＴＸＲ１を発現する細胞を特異的に細胞死させることができる。
すなわち、本実施形態の融合タンパク質は、ＡＮＴＸＲ１に特異的に結合させる場合は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３４２位又はこれに相当する位置のグリシン残基が任意のアミノ酸で置換されていることが好ましく、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２の何れにも結合させる場合は、該アミノ酸置換が無いものを利用するなど、その目的に応じて使い分けることができる。
【0018】
目的タンパク質配列は、ＡＮＴＸＲを発現する細胞に目的タンパク質を結合させることにより又は該細胞に目的タンパク質を導入させることにより、その細胞に目的タンパク質に起因する特定の作用や効果を生じさせるための配列である。
目的タンパク質配列は、その目的に応じて任意のタンパク質配列を使用することができる。目的タンパク質配列は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば、ジフテリア毒素やボツリヌス神経毒素といった毒素タンパク質配列であってもよく、Ｃ５といった補体配列であってもよく、蛍光タンパク質配列であってもよく、タグ配列を複数回繰り返した配列であってもよい。なお、タグ配列を複数回繰り返すことによって、標的細胞を鮮明に標識することができる。
目的タンパク質配列は、その目的に応じて任意のタンパク質配列を使用することができる。目的タンパク質配列は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば、ジフテリア毒素やボツリヌス神経毒素といった毒素タンパク質配列であってもよく、Ｃ５といった補体配列であってもよく、蛍光タンパク質配列であってもよく、タグ配列を複数回繰り返した配列であってもよい。なお、タグ配列を複数回繰り返すことによって、標的細胞を鮮明に標識することができる。
【0019】
プロテアーゼ認識配列は、ＡＮＴＸＲを発現する細胞に存在するプロテアーゼ及び／又は該細胞の周囲に存在するプロテアーゼにより認識される配列である。
プロテアーゼ認識配列は、ＡＮＴＸＲを発現する細胞の周囲に多く存在するプロテアーゼに認識される配列である限り特に限定されない。
該配列を認識するプロテアーゼは、ＡＮＴＸＲを発現する細胞が産生するプロテアーゼであってもよく、その周辺細胞が産生するプロテアーゼであってもよいが、ＡＮＴＸＲを発現する細胞が産生するプロテアーゼであることが好ましい。
このようなプロテアーゼとしては、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）やウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が挙げられる。ＭＭＰとしては、好ましくはＭＭＰ２やＭＭＰ９が挙げられる。
プロテアーゼ認識配列は、ＡＮＴＸＲを発現する細胞の周囲に多く存在するプロテアーゼに認識される配列である限り特に限定されない。
該配列を認識するプロテアーゼは、ＡＮＴＸＲを発現する細胞が産生するプロテアーゼであってもよく、その周辺細胞が産生するプロテアーゼであってもよいが、ＡＮＴＸＲを発現する細胞が産生するプロテアーゼであることが好ましい。
このようなプロテアーゼとしては、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）やウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が挙げられる。ＭＭＰとしては、好ましくはＭＭＰ２やＭＭＰ９が挙げられる。
【0020】
本実施形態の融合タンパク質は、炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列を含み、該ドメイン１を表す配列には、Ｎ末端側から順に、前記プロテアーゼ認識配列及び前記目的タンパク質配列が挿入されているものである。
炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列に対する、これらの配列の挿入は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば配列番号１で表される該炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１５３位～１７３位に相当する領域のうちの何れかの位置で行われるものであってもよい。好ましくは配列番号１で表される該炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１６３位に相当するアミノ酸のＣ末端側に挿入するものである。
これらの配列の炭疽菌防御抗原配列のドメイン１への挿入方法は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されず、当業者に既知の方法を用いることができる。
炭疽菌防御抗原配列のドメイン１を表す配列に対する、これらの配列の挿入は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えば配列番号１で表される該炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１５３位～１７３位に相当する領域のうちの何れかの位置で行われるものであってもよい。好ましくは配列番号１で表される該炭疽菌防御抗原のアミノ酸配列の１６３位に相当するアミノ酸のＣ末端側に挿入するものである。
これらの配列の炭疽菌防御抗原配列のドメイン１への挿入方法は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されず、当業者に既知の方法を用いることができる。
【0021】
本実施形態において、目的タンパク質配列は、第２のプロテアーゼ認識配列が挿入された配列であってもよい。例えば、目的タンパク質が、ジフテリア毒素、ボツリヌス神経毒素又は補体のように、タンパク質の一部が切断されることによって毒素活性などを生じるといった特定の作用を生じるタンパク質である場合、目的タンパク質配列は、目的タンパク質がその作用を生じるために切断される領域において、第２のプロテアーゼ認識配列が挿入されることが好ましい。
第２のプロテアーゼ認識配列は、上述のプロテアーゼ認識配列に関する記載を援用できる。
第２のプロテアーゼ認識配列は、上述のプロテアーゼ認識配列に関する記載を援用できる。
【0022】
目的タンパク質がジフテリア毒素である場合、目的タンパク質配列は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、Ｎ末端側から順に、ジフテリア毒素Ｃドメイン（ＤＴ－Ｃ）配列、前記第２のプロテアーゼ認識配列、及びジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ－Ｔ）配列を含むものであってもよい。
【0023】
目的タンパク質がジフテリア毒素である場合、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、ＤＴ－Ｃ配列は配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられ、ＤＴ－Ｔ配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
またＤＴ－Ｃ配列及びＤＴ－Ｔ配列は、細胞内に取り込まれて細胞内にジフテリア毒素を放出できる限り、それぞれ、配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列の全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一の配列を含むアミノ酸配列であってもよく、また配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列において、それぞれ１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。「１又は数個」とは、例えば１～１８個、好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個であってもよい。
またＤＴ－Ｃ配列及びＤＴ－Ｔ配列は、細胞内に取り込まれて細胞内にジフテリア毒素を放出できる限り、それぞれ、配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列の全長に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上同一の配列を含むアミノ酸配列であってもよく、また配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列において、それぞれ１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。「１又は数個」とは、例えば１～１８個、好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個であってもよい。
【0024】
プロテアーゼ認識配列と第２のプロテアーゼ認識配列は、同一のプロテアーゼが認識する配列であってもよく、異なるプロテアーゼが認識する配列であってもよい。選択性の観点からは、プロテアーゼ認識配列と第２のプロテアーゼ認識配列は異なるプロテアーゼが認識する配列であることが好ましい。
プロテアーゼ認識配列と第２のプロテアーゼ認識配列は、それぞれマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）から選択されるプロテアーゼが認識する配列であることが好ましい。
プロテアーゼ認識配列と第２のプロテアーゼ認識配列は、それぞれマトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）から選択されるプロテアーゼが認識する配列であることが好ましい。
【0025】
本実施形態において、目的タンパク質配列は、蛍光を発するタンパク質の配列を含んで
もよい。
プロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）又はウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が認識する配列であることが好ましい。
もよい。
プロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）又はウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕＰＡ）が認識する配列であることが好ましい。
【0026】
蛍光を発するタンパク質は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されないが、例えばｍＣｌｏｖｅｒや緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などが挙げられる。
【0027】
本実施形態の融合タンパク質は、本実施態様の効果を妨げない限り、Ｎ末端にIgκリーダー配列等の任意の分泌シグナル配列を付加してもよく、またＣ末端に３×ＦＬＡＧタグ等の任意のタグ配列を付加してもよい。さらに、目的タンパク質のＣ末端側に、（ＧＧＧＧＳ（配列番号４））×３リンカー等の任意のリンカー配列を含んでもよい。
【0028】
＜がん細胞を細胞死に誘導するための組成物＞
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を細胞死に誘導するための組成物である。
ポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、１又は数個の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列を有する改変ポリヌクレオチドであってもよい。またポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、ヌクレオチドに含まれる一部の糖やリン酸が置換された構造体であってもよい。
発現ベクターは、目的のポリヌクレオチドを組み込むことができ、そのタンパク質を宿主細胞において発現できる限り特に限定されず、当業者に既知の発現ベクターを用いることができる。例えば、プラスミドベクターやウイルスベクター等が挙げることができ、市販のベクターを使用することができる。
発現ベクターに目的のポリヌクレオチドを組み込む方法は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されず、当業者に既知の方法によって行うことができる。
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を細胞死に誘導するための組成物である。
ポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、１又は数個の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列を有する改変ポリヌクレオチドであってもよい。またポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、ヌクレオチドに含まれる一部の糖やリン酸が置換された構造体であってもよい。
発現ベクターは、目的のポリヌクレオチドを組み込むことができ、そのタンパク質を宿主細胞において発現できる限り特に限定されず、当業者に既知の発現ベクターを用いることができる。例えば、プラスミドベクターやウイルスベクター等が挙げることができ、市販のベクターを使用することができる。
発現ベクターに目的のポリヌクレオチドを組み込む方法は、本実施態様の効果を妨げない限り特に限定されず、当業者に既知の方法によって行うことができる。
【0029】
本実施形態の組成物に含まれる融合タンパク質又は上記発現ベクターによって発現した融合タンパク質は、がん細胞上に発現するＡＮＴＸＲと結合する。ＡＮＴＸＲに結合した該融合タンパク質は、ＭＭＰやｕＰＡ等のプロテアーゼにより、プロテアーゼ認識配列を切断され、活性化する。活性化した融合タンパク質は細胞膜上で７量体を形成して、がん細胞内にエンドサイトーシスされる。その後、がん細胞内にて、リソソームと結合してエンドソーム内のｐＨが低下することにより、融合タンパク質中の毒素が細胞質中に放出され、細胞死を誘導するものである。例えば、融合タンパク質内の毒素がジフテリア毒素である場合、細胞質中にジフテリア毒素Ｃ領域が放出され、これによりペプチド鎖伸長因子２（ＥＦ－２）の機能が抑制されることでタンパク質合成が阻害され、がん細胞の細胞死が誘導されるものである。
【0030】
本実施形態において、がん細胞は、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現する細胞である。
がん細胞は、ＡＮＴＸＲ及び融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現する限り特に限定されないが、例えば化学療法に対して抵抗性を有するがんであってもよく、上皮間葉転換を起こしたがん細胞であってもよく、ＴＨＹ１陽性のがん細胞であってもよく、及び／又は静止期のがん細胞であってもよい。
がん細胞は、ＡＮＴＸＲ及び融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現する限り特に限定されないが、例えば化学療法に対して抵抗性を有するがんであってもよく、上皮間葉転換を起こしたがん細胞であってもよく、ＴＨＹ１陽性のがん細胞であってもよく、及び／又は静止期のがん細胞であってもよい。
【0031】
がん細胞の由来組織は、本実施態様の効果を奏するものである限り特に限定されないが
、がん細胞はＡＮＴＸＲ１を発現するがん細胞であることが好ましく、例えば卵巣がん、頸がん、前立腺がん、又はメラノーマなどが挙げられる。さらにがん細胞が卵巣がんである場合は、高悪性度漿液性腺癌であることが好ましい。
、がん細胞はＡＮＴＸＲ１を発現するがん細胞であることが好ましく、例えば卵巣がん、頸がん、前立腺がん、又はメラノーマなどが挙げられる。さらにがん細胞が卵巣がんである場合は、高悪性度漿液性腺癌であることが好ましい。
【0032】
本実施形態において、融合タンパク質を単独で医薬組成物として使用することができるが、担体や添加剤と混合して使用してもよい。ここで、担体としては、薬理的に許容される溶媒、希釈剤、賦形剤、結合剤などが挙げられ、液体状の医薬組成物の調製には例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。添加剤としては、安定剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、抗酸化剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、凍害防止剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、制菌剤などが挙げられる。
【0033】
本開示の医薬の剤型は、液剤、錠剤などが例示されるが、液剤が好ましい。医薬が液剤の場合、融合タンパク質の濃度は特に制限されないが、例えば、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬである。
【0034】
本実施形態において、組成物の投与量は、がん細胞を細胞死に誘導できる限り特に限定されない。がんの種類、症状、程度、患者の年齢、性別、体重などによって適宜調整されるが、１回あたりの投与量は、例えば体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ～１００ｍｇである。単回投与であってもよく、複数回投与でもよい。複数回投与の場合は、例えば、１～６０日毎に、合計２～１０回投与する方法が挙げられる
組成物の投与方法は特に制限されず、経口投与、静脈投与、局所投与、などが挙げられるが、疾患部位に注射等で局所投与することが好ましい。注射による局所投与は、有針注射器を用いて行ってもよく、無針注射器を用いて行ってもよい。
組成物の投与対象はヒトやマウス等の哺乳動物であるが、好ましくはヒトである。
組成物の投与方法は特に制限されず、経口投与、静脈投与、局所投与、などが挙げられるが、疾患部位に注射等で局所投与することが好ましい。注射による局所投与は、有針注射器を用いて行ってもよく、無針注射器を用いて行ってもよい。
組成物の投与対象はヒトやマウス等の哺乳動物であるが、好ましくはヒトである。
【0035】
＜がんを治療するための組成物＞
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を含むがんを治療するための組成物である。
本実施形態の組成物は、ポリペプチド、発現ベクター、がん細胞、剤形、組成物中の融合タンパク質含有量、組成物の投与量、投与スケジュール、投与方法、投与対象等に関して、がんを治療できる限り特に限定されず、＜がん細胞を細胞死に誘導するための組成物＞の項に記載した事項を援用できる。
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を含むがんを治療するための組成物である。
本実施形態の組成物は、ポリペプチド、発現ベクター、がん細胞、剤形、組成物中の融合タンパク質含有量、組成物の投与量、投与スケジュール、投与方法、投与対象等に関して、がんを治療できる限り特に限定されず、＜がん細胞を細胞死に誘導するための組成物＞の項に記載した事項を援用できる。
【0036】
本実施形態において、治療とは、例えばがん細胞を細胞死に誘導することによって行われるもので達成されるものであってもよく、治療対象のがん組織に存在するがん細胞を全て消失させることのみならず、がん細胞に傷害を与えること、がん細胞の数を減少させること、がん細胞の増殖を抑制すること、がんの再発を予防することなども含む。
【0037】
＜がん細胞を標識するための組成物＞
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を標識するための組成物である。
本実施形態の組成物は、ポリペプチド、発現ベクター、がん細胞、剤形、組成物中の融合タンパク質含有量、組成物の投与量、投与スケジュール、投与方法、投与対象等に関して、がん細胞を標識できる限り特に限定されず、＜がん細胞を細胞死に誘導するための組成物＞の項に記載した事項を援用できる。
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質を含む、炭疽菌毒素受容体（ＡＮＴＸＲ）及び該融合タンパク質中のプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを発現するがん細胞を標識するための組成物である。
本実施形態の組成物は、ポリペプチド、発現ベクター、がん細胞、剤形、組成物中の融合タンパク質含有量、組成物の投与量、投与スケジュール、投与方法、投与対象等に関して、がん細胞を標識できる限り特に限定されず、＜がん細胞を細胞死に誘導するための組成物＞の項に記載した事項を援用できる。
【0038】
本実施形態において、標識とは上述の「がん細胞を細胞死に誘導するための組成物」の
場合と同様に、組成物が目的のがん細胞のＡＮＴＸＲに結合した後、細胞内に取り込まれて、細胞内部において蛍光を発するものでもよいが、組成物が目的のがん細胞のＡＮＴＸＲに結合した後、細胞内に取り込まれずに細胞膜上で蛍光を発するものであってもよい。
場合と同様に、組成物が目的のがん細胞のＡＮＴＸＲに結合した後、細胞内に取り込まれて、細胞内部において蛍光を発するものでもよいが、組成物が目的のがん細胞のＡＮＴＸＲに結合した後、細胞内に取り込まれずに細胞膜上で蛍光を発するものであってもよい。
【0039】
本実施形態のがん細胞を標識するための組成物は、がんの診断に利用することができ、また手術中においてがんを有する部位を確認及び／又は特定するために利用することができる。
【0040】
本開示の他の実施形態は、上述の「がん細胞を標識するための組成物」を含む、がん標識用キットである。
該キットは、がん細胞を標識するための組成物以外にも、陰性コントロールとなる組成物、組成物を投与又は適用するための器具、緩衝液や希釈液などを任意で含むことができる。
該キットは、がん細胞を標識するための組成物以外にも、陰性コントロールとなる組成物、組成物を投与又は適用するための器具、緩衝液や希釈液などを任意で含むことができる。
【0041】
本開示の他の実施形態は、上述のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0042】
本実施形態において、ポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、１又は数個の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加した塩基配列を有する改変ポリヌクレオチドであってもよい。
また本実施形態において、ポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、ヌクレオチドに含まれる一部の糖やリン酸が置換された構造体であってもよい。
また本実施形態において、ポリヌクレオチドは、それぞれがコードする融合タンパク質を発現できる限り、ヌクレオチドに含まれる一部の糖やリン酸が置換された構造体であってもよい。
【実施例0043】
以下実施例により、本開示をより詳細に説明するが、本開示の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【0044】
＜実施例１ 化学療法後の卵巣がん臨床検体のシングルセル解析＞
初発卵巣がん２例、再発卵巣がん１例、初発化学療法後卵巣がん１例の計４例の卵巣がん患者からのサンプルによるシングルセル発現解析を、当業者に既知の方法により行った。
具体的には、まず同意を得た卵巣がん（漿液性腺がん）患者のがん組織を回収し、コラゲナーゼ液中でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてがん組織を破砕した。単一の細胞懸濁液を作製後、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色を行い、フローサイトメーターによって、ＰＩ陰性細胞、すなわち生細胞のみを回収した。シングルセル発現解析用のライブラリーは１０Ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて作製し、Ｈｉｓｅｑ Ｘを用いて配列を解読した。得られたデータはＣｅｌｌｒａｎｇｅｒを用いて解析し、Ｌｏｕｐｅによって図を作製した。
その結果、再発がんでは、ＭＫＩ６７の発現が多いことが示され、すなわち活発に細胞増殖が起きている一方で、化学療法後のがんでは、ＭＫＩ６７の発現がほとんど無く、細胞増殖がほとんど停止していることが示された（図１）。
また、初発卵巣がん２例、再発卵巣がん１例、初発化学療法後卵巣がん１例の計４例の卵巣がん患者からのサンプルにおいてシングルセル発現解析したものを、１つにまとめて図示した（図２）。図中、丸で囲った間葉系細胞マーカーＴＨＹ１陽性細胞が卵巣がん組織中に存在することが示された。このＴＨＹ１陽性細胞は増殖マーカーであるＭＫＩ６７を発現しておらず、一方で炭疽菌毒素受容体であるＡＮＴＸＲ１とプロテアーゼであるＭＭＰ２及びｕＰＡ（図中、ＰＬＡＵとして示される）を発現していた。さらに化学療法後に上皮系細胞マーカーであるＥＰＣＡＭ陽性のがん細胞は消失するが、ＴＨＹ１陽性又は
ＴＨＹ１陽性かつＥＰＣＡＭ陽性の静止期がん細胞が残存した。このことから、このＴＨＹ１陽性の静止期がん細胞が将来的な再発の原因となる可能性が考えられた。なお、ＰＴＰＲＣは血球系細胞に発現するＣＤ４５をコードする遺伝子であるが、ＴＨＹ１陽性細胞には発現していないことが示された。
初発卵巣がん２例、再発卵巣がん１例、初発化学療法後卵巣がん１例の計４例の卵巣がん患者からのサンプルによるシングルセル発現解析を、当業者に既知の方法により行った。
具体的には、まず同意を得た卵巣がん（漿液性腺がん）患者のがん組織を回収し、コラゲナーゼ液中でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてがん組織を破砕した。単一の細胞懸濁液を作製後、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色を行い、フローサイトメーターによって、ＰＩ陰性細胞、すなわち生細胞のみを回収した。シングルセル発現解析用のライブラリーは１０Ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ社のＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いて作製し、Ｈｉｓｅｑ Ｘを用いて配列を解読した。得られたデータはＣｅｌｌｒａｎｇｅｒを用いて解析し、Ｌｏｕｐｅによって図を作製した。
その結果、再発がんでは、ＭＫＩ６７の発現が多いことが示され、すなわち活発に細胞増殖が起きている一方で、化学療法後のがんでは、ＭＫＩ６７の発現がほとんど無く、細胞増殖がほとんど停止していることが示された（図１）。
また、初発卵巣がん２例、再発卵巣がん１例、初発化学療法後卵巣がん１例の計４例の卵巣がん患者からのサンプルにおいてシングルセル発現解析したものを、１つにまとめて図示した（図２）。図中、丸で囲った間葉系細胞マーカーＴＨＹ１陽性細胞が卵巣がん組織中に存在することが示された。このＴＨＹ１陽性細胞は増殖マーカーであるＭＫＩ６７を発現しておらず、一方で炭疽菌毒素受容体であるＡＮＴＸＲ１とプロテアーゼであるＭＭＰ２及びｕＰＡ（図中、ＰＬＡＵとして示される）を発現していた。さらに化学療法後に上皮系細胞マーカーであるＥＰＣＡＭ陽性のがん細胞は消失するが、ＴＨＹ１陽性又は
ＴＨＹ１陽性かつＥＰＣＡＭ陽性の静止期がん細胞が残存した。このことから、このＴＨＹ１陽性の静止期がん細胞が将来的な再発の原因となる可能性が考えられた。なお、ＰＴＰＲＣは血球系細胞に発現するＣＤ４５をコードする遺伝子であるが、ＴＨＹ１陽性細胞には発現していないことが示された。
【0045】
＜実施例２ ＰＡ－ＤＴタンパク質の作製＞
ＰＡ－ＤＴの配列はアミノ酸配列（配列番号５）を設計後、ヒトに対してコドン最適化を行い、塩基配列を作製した。作製したＰＡ－ＤＴのＤＮＡ配列は、当業者に既知の方法によって人工合成した。合成したＰＡ－ＤＴの配列を当業者に既知の方法により哺乳類発現プラスミドに組み込んだ。ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流にＰＡ－ＤＴ配列を挿入した配列を有し、具体的にはＣＡＧプロモーター－ＰＡ－ＤＴ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏ耐性遺伝子－ｐｏｌｙＡの配列を有する。ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドを２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にリポフェクトアミン（登録商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって導入し、２９３ＦＴ細胞にタンパク質を発現させた。そして、２９３ＦＴ細胞抽出液を作製し、Ｆｌａｇタグを用いて、Ｍ２アガロースゲルによってＰＡ－ＤＴタンパク質を精製し、Ｆｌａｇペプチドによってゲルから溶出した。タンパク質の濃度はＱｕｂｉｔによって測定した。また、２９３ＦＴ細胞の代わりにＥｘｐｉ２９３細胞を用いたＰＡ－ＤＴタンパク質の作製も行った。該Ｅｘｐｉ２９３細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入後、ＤＴ耐性を有させるために、当業者に既知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてＤＰＨ１及びＤＰＨ２遺伝子を破壊し、高濃度のＤＴで選択培養したものを用いた。
作成したＰＡ－ＤＴは図３の上図に示す通りの構成である。ＰＡ－ＤＴにはシグナルペプチド（Ｉｇκ ｌｅａｄｅｒ）を結合させてあるので、遺伝子導入した細胞から分泌される。ＰＡ－ＤＴタンパク質は、ＡＮＴＸＲ１、ＭＭＰ及びｕＰＡを特異的に発現しているＴＨＹ１高発現がん細胞に結合し、細胞内に取り込まれて活性化され、がん細胞の細胞死を誘導できる。ＰＡ－ＤＴでは、ジフテリア毒素の受容体結合ドメイン以外の２つの領域：Ｃ領域（ＤＴ－Ｃ）及びＴ領域（ＤＴ－Ｔ）を、ＰＡタンパク質のドメイン１中に挿入する。ＰＡ－ＤＴにおけるこのジフテリア毒素の領域は、プロテアーゼｕＰＡによってＣ領域とＴ領域の間が切断され活性化され、がん細胞の細胞死を誘導する。さらに、ＰＡもアミノ末端側にあるドメイン１がプロテアーゼＭＭＰで切断されることによって、治療用分子はＡＮＴＸＲ１を介して細胞に取り込まれる。このようにＰＡ－ＤＴが細胞内で機能するためには、ＭＭＰ、ｕＰＡ及びＡＮＴＸＲ１の３者が揃うことが最低限必須である。この３者が同時に発現する正常組織はほとんどないため、ＰＡ－ＤＴは正常細胞を傷害することなく、従来の抗がん剤で傷害できない化学療法抵抗性のがん細胞を標的とすることが可能となる。
ＰＡ－ＣｌｏｖｅｒについてもＰＡ－ＤＴと同様に、当業者に既知の方法によってＤＮＡ配列を人工合成した後、哺乳類発現プラスミドに組み込み、ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドを２９３ＦＴ細胞に導入することで作製し、生成することによって得た。図３の下図の通り、ＡＮＴＸＲ１に結合するＰＡを有し蛍光タンパク質であるＣｌｏｖｅｒをＰＡドメイン１内に持つため、静止期がん細胞を検出することが可能である。
ＰＡ－ＤＴの配列はアミノ酸配列（配列番号５）を設計後、ヒトに対してコドン最適化を行い、塩基配列を作製した。作製したＰＡ－ＤＴのＤＮＡ配列は、当業者に既知の方法によって人工合成した。合成したＰＡ－ＤＴの配列を当業者に既知の方法により哺乳類発現プラスミドに組み込んだ。ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドは、ＣＡＧプロモーターの下流にＰＡ－ＤＴ配列を挿入した配列を有し、具体的にはＣＡＧプロモーター－ＰＡ－ＤＴ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏ耐性遺伝子－ｐｏｌｙＡの配列を有する。ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドを２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にリポフェクトアミン（登録商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって導入し、２９３ＦＴ細胞にタンパク質を発現させた。そして、２９３ＦＴ細胞抽出液を作製し、Ｆｌａｇタグを用いて、Ｍ２アガロースゲルによってＰＡ－ＤＴタンパク質を精製し、Ｆｌａｇペプチドによってゲルから溶出した。タンパク質の濃度はＱｕｂｉｔによって測定した。また、２９３ＦＴ細胞の代わりにＥｘｐｉ２９３細胞を用いたＰＡ－ＤＴタンパク質の作製も行った。該Ｅｘｐｉ２９３細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入後、ＤＴ耐性を有させるために、当業者に既知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてＤＰＨ１及びＤＰＨ２遺伝子を破壊し、高濃度のＤＴで選択培養したものを用いた。
作成したＰＡ－ＤＴは図３の上図に示す通りの構成である。ＰＡ－ＤＴにはシグナルペプチド（Ｉｇκ ｌｅａｄｅｒ）を結合させてあるので、遺伝子導入した細胞から分泌される。ＰＡ－ＤＴタンパク質は、ＡＮＴＸＲ１、ＭＭＰ及びｕＰＡを特異的に発現しているＴＨＹ１高発現がん細胞に結合し、細胞内に取り込まれて活性化され、がん細胞の細胞死を誘導できる。ＰＡ－ＤＴでは、ジフテリア毒素の受容体結合ドメイン以外の２つの領域：Ｃ領域（ＤＴ－Ｃ）及びＴ領域（ＤＴ－Ｔ）を、ＰＡタンパク質のドメイン１中に挿入する。ＰＡ－ＤＴにおけるこのジフテリア毒素の領域は、プロテアーゼｕＰＡによってＣ領域とＴ領域の間が切断され活性化され、がん細胞の細胞死を誘導する。さらに、ＰＡもアミノ末端側にあるドメイン１がプロテアーゼＭＭＰで切断されることによって、治療用分子はＡＮＴＸＲ１を介して細胞に取り込まれる。このようにＰＡ－ＤＴが細胞内で機能するためには、ＭＭＰ、ｕＰＡ及びＡＮＴＸＲ１の３者が揃うことが最低限必須である。この３者が同時に発現する正常組織はほとんどないため、ＰＡ－ＤＴは正常細胞を傷害することなく、従来の抗がん剤で傷害できない化学療法抵抗性のがん細胞を標的とすることが可能となる。
ＰＡ－ＣｌｏｖｅｒについてもＰＡ－ＤＴと同様に、当業者に既知の方法によってＤＮＡ配列を人工合成した後、哺乳類発現プラスミドに組み込み、ＰＡ－ＤＴ発現プラスミドを２９３ＦＴ細胞に導入することで作製し、生成することによって得た。図３の下図の通り、ＡＮＴＸＲ１に結合するＰＡを有し蛍光タンパク質であるＣｌｏｖｅｒをＰＡドメイン１内に持つため、静止期がん細胞を検出することが可能である。
【0046】
図４において、ＰＡ－ＤＴの作用機序を示す。ＰＡ－ＤＴは細胞膜上にあるＡＮＴＸＲ１に結合した後、ＭＭＰとｕＰＡによってそれぞれのプロテアーゼ認識部位を切断され、活性化する。活性化したＰＡ－ＤＴは７量体を形成することで、エンドサイトーシスされる。その後、細胞内にてリソソームと結合し、エンドソーム内のｐＨが低下することで、ジフテリア毒素Ｃ領域が細胞質中に放出される。ジフテリア毒素はＥＦ－２の機能を抑制することでタンパク質合成を阻害し、細胞死を引き起こすというものである。
【0047】
＜実施例３ ＰＡ－ＤＴタンパク質の性能評価＞
ＰＡ－ＤＴタンパク質の切断アッセイにより、ＰＡ－ＤＴタンパク質の性能を評価した。ＰＡ－ＤＴ、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ
Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ ｎｏ ｃｕｔと示す）をそれぞれ２９３ＦＴ細胞に発現させ、タンパク質を精製した。その精製したタンパク質に対してＭＭＰ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５５４３０６）、ＭＭＰ９（Ｂｉｏｌｅｎｇｅｎｄ、５５０５０６）又はｕＰＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７５５３０２）を２０ｎｇ／μＬ加え、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファー中において、３７℃で所定の時間（１、２、４又は６時間）インキュベートすることで切断した。その後、当業者に既知の方法によって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動し、転写膜に転写し、ＨＲＰ標識Ｍ２抗体で検出した。
その結果を図５に示す。ＰＡ－ＤＴはＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ｕＰＡで設計通り切断された。切断され活性化状態になったＰＡ－ＤＴは４時間後にはほとんど分解されることが示された。一方で、ＰＡ－ＤＴはこれらのプロテアーゼによって切断されなければ、３７℃で６時間は全く分解されず安定であることが示された（図中、ｎｏ ｅｎｚｙｍｅと示す）。このことから、ＰＡ－ＤＴはこれらのプロテアーゼを発現している間葉系がん細胞の近傍でのみ機能することが示唆された。
同様の結果が、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（ＰＡ－ＤＴ Ｇ３４２Ｗ）においても示された。
またＭＭＰ認識配列もｕＰＡ認識配列も持たないＰＡ－ＤＴ（ＰＡ－ＤＴ ｎｏ ｃｕｔ）はＭＭＰ２、ＭＭＰ９又はｕＰＡ存在化でも全く分解されなかった。このことから、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びｕＰＡは設計通り認識配列を特異的に切断することが示された。
ＰＡ－ＤＴタンパク質の切断アッセイにより、ＰＡ－ＤＴタンパク質の性能を評価した。ＰＡ－ＤＴ、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ
Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ＰＡ－ＤＴ ｎｏ ｃｕｔと示す）をそれぞれ２９３ＦＴ細胞に発現させ、タンパク質を精製した。その精製したタンパク質に対してＭＭＰ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５５４３０６）、ＭＭＰ９（Ｂｉｏｌｅｎｇｅｎｄ、５５０５０６）又はｕＰＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７５５３０２）を２０ｎｇ／μＬ加え、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファー中において、３７℃で所定の時間（１、２、４又は６時間）インキュベートすることで切断した。その後、当業者に既知の方法によって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌで泳動し、転写膜に転写し、ＨＲＰ標識Ｍ２抗体で検出した。
その結果を図５に示す。ＰＡ－ＤＴはＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ｕＰＡで設計通り切断された。切断され活性化状態になったＰＡ－ＤＴは４時間後にはほとんど分解されることが示された。一方で、ＰＡ－ＤＴはこれらのプロテアーゼによって切断されなければ、３７℃で６時間は全く分解されず安定であることが示された（図中、ｎｏ ｅｎｚｙｍｅと示す）。このことから、ＰＡ－ＤＴはこれらのプロテアーゼを発現している間葉系がん細胞の近傍でのみ機能することが示唆された。
同様の結果が、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（ＰＡ－ＤＴ Ｇ３４２Ｗ）においても示された。
またＭＭＰ認識配列もｕＰＡ認識配列も持たないＰＡ－ＤＴ（ＰＡ－ＤＴ ｎｏ ｃｕｔ）はＭＭＰ２、ＭＭＰ９又はｕＰＡ存在化でも全く分解されなかった。このことから、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びｕＰＡは設計通り認識配列を特異的に切断することが示された。
【0048】
＜実施例４ ＰＡ－ＤＴの殺細胞効果の評価＞
８０％コンフルエントのマウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２（非特許文献３に記載の方法により作製）及び陰性対照としてヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＥＣＡＣＣ）にＰＡ－ＤＴをそれぞれ、０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１５０μｇ／ｍＬ １×ｆｌａｇペプチドを含む溶媒）の濃度で投与し、２４時間培養を行った。その後、それぞれのサンプルを回収し、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を測定した（ｎ＝３で、エラーバーは標準偏差を表す）。なお、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２はＡＮＴＸＲ１を弱く発現し、かつＡＮＴＸＲ２を強く発現する細胞であり、ＭＭＰ及びｕＰＡを発現する細胞である。
その結果、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２において、ＰＡ－ＤＴの用量依存的に細胞増殖を抑制したことが示された（図６）。一方、ヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２においては、細胞増殖抑制効果は認められなかった。
なお、抗がん剤であるシスプラチン（図中、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎと示す）をそれぞれの濃度（０、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００μｇ／ｍＬ）で投与し、２４時間培養を行った場合は、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２及びヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２のいずれの細胞においても、用量依存的に細胞増殖が抑制されたことが示された。すなわち、ＰＡ－ＤＴががん細胞特異的に細胞傷害活性を持つことが示唆された。
８０％コンフルエントのマウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２（非特許文献３に記載の方法により作製）及び陰性対照としてヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＥＣＡＣＣ）にＰＡ－ＤＴをそれぞれ、０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１５０μｇ／ｍＬ １×ｆｌａｇペプチドを含む溶媒）の濃度で投与し、２４時間培養を行った。その後、それぞれのサンプルを回収し、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を測定した（ｎ＝３で、エラーバーは標準偏差を表す）。なお、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２はＡＮＴＸＲ１を弱く発現し、かつＡＮＴＸＲ２を強く発現する細胞であり、ＭＭＰ及びｕＰＡを発現する細胞である。
その結果、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２において、ＰＡ－ＤＴの用量依存的に細胞増殖を抑制したことが示された（図６）。一方、ヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２においては、細胞増殖抑制効果は認められなかった。
なお、抗がん剤であるシスプラチン（図中、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎと示す）をそれぞれの濃度（０、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００μｇ／ｍＬ）で投与し、２４時間培養を行った場合は、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２及びヒト正常前立腺細胞ＰＮＴ２のいずれの細胞においても、用量依存的に細胞増殖が抑制されたことが示された。すなわち、ＰＡ－ＤＴががん細胞特異的に細胞傷害活性を持つことが示唆された。
【0049】
＜実施例５ ＰＡ－ＤＴ変異体を用いたＰＡ－ＤＴの機能解析＞
図７にＰＡ－ＤＴ変異体を用いた場合のＰＡ－ＤＴの機能解析結果を示す。８０％コンフルエントのマウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２に、ＰＡ－ＤＴ（図中ｏｒｉｇｉｎａｌ ＰＡＤＴと示す）、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ｎｏｃｕｔと示す）をそれぞれ０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍ
Ｌ（培養液）の濃度で投与し、２４時間培養を行った。その後、それぞれのサンプルを回収し、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を測定した（ｎ＝３で、エラーバーは標準偏差を表す）。なお、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２はＡＮＴＸＲ１を弱く発現し、かつＡＮＴＸＲ２を強く発現する細胞であり、ＭＭＰ及びｕＰＡを発現する細胞である。
その結果、ＰＡ－ＤＴでは６．２５μｇ／ｍＬの濃度より高濃度の場合、用量依存的に細胞の生存率が低下した。また、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴを用いた場合、６．２５μｇ／ｍＬの濃度では細胞生存率に差は生じず、１２．５μｇ／ｍＬの濃度より高濃度の場合、用量依存的に細胞の生存率が低下した。すなわち、Ｇ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴは、ＡＮＴＸＲ２に対する結合が弱くなったことを示す。一方で、ＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴを用いた場合、いずれの濃度においても、細胞生存率の低下は示されなかった。
図７にＰＡ－ＤＴ変異体を用いた場合のＰＡ－ＤＴの機能解析結果を示す。８０％コンフルエントのマウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２に、ＰＡ－ＤＴ（図中ｏｒｉｇｉｎａｌ ＰＡＤＴと示す）、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴ（図中、Ｇ３４２Ｗと示す）、及びＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴ（図中、ｎｏｃｕｔと示す）をそれぞれ０、３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍ
Ｌ（培養液）の濃度で投与し、２４時間培養を行った。その後、それぞれのサンプルを回収し、ＭＴＳアッセイにより細胞生存率を測定した（ｎ＝３で、エラーバーは標準偏差を表す）。なお、マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８ ｌｕｃ２はＡＮＴＸＲ１を弱く発現し、かつＡＮＴＸＲ２を強く発現する細胞であり、ＭＭＰ及びｕＰＡを発現する細胞である。
その結果、ＰＡ－ＤＴでは６．２５μｇ／ｍＬの濃度より高濃度の場合、用量依存的に細胞の生存率が低下した。また、ＰＡ配列においてＧ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴを用いた場合、６．２５μｇ／ｍＬの濃度では細胞生存率に差は生じず、１２．５μｇ／ｍＬの濃度より高濃度の場合、用量依存的に細胞の生存率が低下した。すなわち、Ｇ３４２Ｗ置換を有するＰＡ－ＤＴは、ＡＮＴＸＲ２に対する結合が弱くなったことを示す。一方で、ＭＭＰ認識配列及びｕＰＡ認識配列を有しないＰＡ－ＤＴを用いた場合、いずれの濃度においても、細胞生存率の低下は示されなかった。
【0050】
＜実施例６ ＰＡ－ＤＴの殺細胞効果アッセイ＞
がん細胞（ヒト卵巣癌細胞（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ）、ヒト頸癌細胞（ＨｅＬａ）、ヒト去勢抵抗性前立腺癌細胞（ＣＷＲ２２Ｒｖ１）、マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０））をそれぞれ２４ｗｅｌｌプレートに播種し、精製した２０μｇのＰＡ－ＤＴを５００μＬの培養液中に添加して培養し、細胞毎に所定の時間経過後（それぞれ６日後、３日後、５日後、３日後）、細胞像を撮影した（図８）。なお、コントロールは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１５０μｇ／ｍＬ
１×ｆｌａｇペプチドを含む溶媒を添加したものである。
その結果、いずれの種類のがん細胞においても、ＰＡ－ＤＴは、コントロールと比較して、顕著な細胞増殖抑制効果を生じることが示された。
がん細胞（ヒト卵巣癌細胞（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ）、ヒト頸癌細胞（ＨｅＬａ）、ヒト去勢抵抗性前立腺癌細胞（ＣＷＲ２２Ｒｖ１）、マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０））をそれぞれ２４ｗｅｌｌプレートに播種し、精製した２０μｇのＰＡ－ＤＴを５００μＬの培養液中に添加して培養し、細胞毎に所定の時間経過後（それぞれ６日後、３日後、５日後、３日後）、細胞像を撮影した（図８）。なお、コントロールは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１５０μｇ／ｍＬ
１×ｆｌａｇペプチドを含む溶媒を添加したものである。
その結果、いずれの種類のがん細胞においても、ＰＡ－ＤＴは、コントロールと比較して、顕著な細胞増殖抑制効果を生じることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】