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特開2022-91405組換え微生物および当該微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022091405
(43)【公開日】2022-06-21
(54)【発明の名称】組換え微生物および当該微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220614BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220614BHJP
C12P 7/42 20060101ALI20220614BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20220614BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12N1/19 ZNA
C12P7/42
C12N15/53
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020204225
(22)【出願日】2020-12-09
(71)【出願人】
【識別番号】000004455
【氏名又は名称】昭和電工マテリアルズ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(72)【発明者】
【氏名】中川 史子
(72)【発明者】
【氏名】蓮沼 誠久
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD29
4B064AD30
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA15X
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AA30X
4B065AA41X
4B065AA41Y
4B065AA45X
4B065AA50X
4B065AA79X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD27
4B065BD29
4B065CA10
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】組換え微生物、及び該組換え微生物を用いた、醗酵による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の工業的に効率的な製造方法を提供する。
【解決手段】プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、前記蛋白質が、特定のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物。
【選択図】なし
【解決手段】プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、前記蛋白質が、特定のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物。
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物。
【請求項2】
プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物。
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物。
【請求項3】
前記蛋白質が、Ｃｇｌ、ＲｊｏおよびＰｎａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子によってコードされる蛋白質である、請求項１または２に記載の組換え微生物。
【請求項4】
前記組換え微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え組成物。
【請求項5】
前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項7】
以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え微生物および当該微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸は、抗菌剤および抗腫瘍剤として利用される鉄錯体又は白金錯体の配位子、麻薬鎮痛剤の中間体などとして、様々な用途に用いられる。
【0003】
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を化学的に製造する方法としては、例えば、安息香酸あるいはサリチル酸から鉄（ＩＩ）と過酸化水素とを用いて、ヒドロキシ基を付加する方法がある（非特許文献１）。
【0004】
また、微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法としては、天然由来のシュードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｔ１の粗精製酵素を用いることにより、試験管内でプロトカテク酸を酸化させることにより２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成できることが報告されている（非特許文献２）。
【0005】
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を化学的に製造する上述の方法では、選択的なヒドロキシ基の付加が困難であり、収率は数％と低い。また、この方法は、将来的な枯渇が懸念される石油を原料とする点に課題がある。
【0006】
また、組換え微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の醗酵製造法は未だ確立されていない。特に、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法は現状、天然の菌体由来の粗精製酵素を用いたプロトカテク酸からの製造のみに限られることから、効率的ではなく、工業的規模の生産には適さない。なお、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸と構造の類似する、没食子酸および１，２，３，４－テトラヒドロキシベンゼンについては、組換え微生物を用いた製造方法が提案されている（特許文献１、２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２００９－６５８３９号公報
【特許文献2】特開２００９－２１３３９２号公報
【特許文献3】特表２００２－５３９７９８号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｍｅｈｍｅｔ Ａ. Ｏｔｕｒａｎ ａｎｄ Ｊｅａｎ Ｐｉｎｓｏｎ, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ９９， １３９４８－１３９５４ （１９９５）
【非特許文献2】Ｅｄｙｅ Ｅ. Ｇｒｏｓｅｃｌｏｓｅ ａｎｄ Ｄ. Ｗ. Ｒｉｂｂｏｎ, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ５５：８９７－９０３ （１９７３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
これまでシュードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の酵素のみがプロトカテク酸の６位の酸化活性を有することが知られていたが、その他の菌由来の酵素は見いだされていない。本発明の課題は、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の工業的に効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素以外の、３－ヒドロキシ安息香酸の６位を酸化させる酵素、特に、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素よりも工業的に有利なプロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する特定の酵素を見出した。すなわち、以下で示す配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素、および、これらのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素は、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素よりも優れたプロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する。
【0011】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物；
［２］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物；
［３］前記蛋白質が、Ｃｇｌ、ＲｊｏおよびＰｎａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子によってコードされる蛋白質である、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記組換え微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［５］前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する、［１］～［４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の組換え微生物を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法；
［７］以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物；
［２］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物；
［３］前記蛋白質が、Ｃｇｌ、ＲｊｏおよびＰｎａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子によってコードされる蛋白質である、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記組換え微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［５］前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する、［１］～［４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の組換え微生物を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法；
［７］以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、組換え微生物を用いた、醗酵による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の工業的に効率的な製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
本発明にかかる組換え微生物は、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現するよう改変が行われた遺伝子組換え微生物である。プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質は、以下に示すとおり、プロトカテク酸の６位を酸化することによって、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換する。本発明において、組換え微生物に関して、「プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する」とは、組換え微生物が当該蛋白質を生成する能力を有していることを意味し、本来当該蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物に対して、さらに当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合、および、本来は当該蛋白質を発現する能力を有さない宿主微生物に対して、当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合の両方を含むものとする。本明細書では、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を、「プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質」とも称し、また、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を、「プロトカテク酸６位酸化酵素活性」とも称する。
本発明にかかる組換え微生物は、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現するよう改変が行われた遺伝子組換え微生物である。プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質は、以下に示すとおり、プロトカテク酸の６位を酸化することによって、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換する。本発明において、組換え微生物に関して、「プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する」とは、組換え微生物が当該蛋白質を生成する能力を有していることを意味し、本来当該蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物に対して、さらに当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合、および、本来は当該蛋白質を発現する能力を有さない宿主微生物に対して、当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合の両方を含むものとする。本明細書では、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を、「プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質」とも称し、また、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を、「プロトカテク酸６位酸化酵素活性」とも称する。
【0014】
宿主微生物が、本来プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物である場合、組換え微生物に関して、「プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する」とは、宿主微生物と比較して、プロトカテク酸６位酸化酵素活性が少なくとも維持されているか、または、当該活性が増強されていることをいい、好ましくは、宿主微生物と比較して、プロトカテク酸６位酸化酵素活性が増強されていることをいう。すなわち、本明細書において、当該蛋白質に関して、「発現」の語には、当該蛋白質の「活性の維持」および「活性の増強」が含まれるものとする。本来プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物、および、本来は当該蛋白質を発現する能力を有さない宿主微生物については、後述する。
【0015】
【化1】
【0016】
ここで、プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質には、当該蛋白質のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質であって、当該酵素蛋白質と機能的に同等な蛋白質も含まれる。ここで「機能的に同等な蛋白質」とは、その酵素蛋白質の活性と同等の活性を備えた蛋白質であり、「機能的に同等な蛋白質」には、その酵素蛋白質のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有する蛋白質が含まれる。
【0017】
したがって、「プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質」の語には、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、プロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する蛋白質を包含する。
【0018】
ここで、プロトカテク酸６位酸化酵素活性は、当業者によって周知の方法によって評価することができ、例えば、本発明にかかる組換え微生物を培養した後、培地の上清中の２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸濃度を高速液体クロマトグラフィーで定量する方法が挙げられる。
【0019】
アミノ酸配列に関し、「配列同一性」は、公知の方法によって決定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）にて使用することのできるアライメントサーチツールを用いて得られる。ポリヌクレオチド配列の「配列同一性」についても同様に、公知の方法によって決定することができる。
【0020】
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質としては、例えば、
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および
・配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
が挙げられる。
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および
・配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
が挙げられる。
【0021】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の蛋白質Ｃｇｌである。配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来の蛋白質Ｒｊｏである。配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来の蛋白質Ｐｎａである。
【0022】
本発明にかかる組換え微生物は、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡが導入された組換え微生物であってよく、あるいは、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物であってもよい。
【0023】
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子は、
（ａ）上記で特定する配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１～１０個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個もしくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（ｆ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。
（ａ）上記で特定する配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１～１０個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個もしくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（ｆ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。
【0024】
ここで、「緊縮条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。
【0025】
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
・配列番号５、８または１１で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
・配列番号６、９または１２で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、および
・配列番号７、１０または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。配列番号５～１３の各々については後述する。
・配列番号５、８または１１で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
・配列番号６、９または１２で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、および
・配列番号７、１０または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。配列番号５～１３の各々については後述する。
【0026】
一態様において、プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＣｇｌ（配列番号８）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来のＲｊｏ（配列番号９）およびポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｎａ（配列番号１０）からなる群より選択される。
【0027】
本発明で用いられる微生物は、上記のポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ種をベクターＤＮＡに連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、当該組換え体ＤＮＡを用いて宿主の菌株を形質転換することにより取得することができる。ただし、これらのＤＮＡ種に限定されるものではなく、その目的を達成できるＤＮＡ種であればすべて使用できる。
【0028】
【表1-1】
【0029】
【表1-2】
【0030】
【表1-3】
【0031】
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現可能な組換え微生物であれば特に制限はなく、例えば、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である。本発明で用いられる微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する。本発明に係る組換え微生物は、これらの微生物株を変異処理することにより、得られる。微生物の親株はアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター等から入手することができる。
【0032】
本発明で宿主微生物として用いられる微生物は、本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物であってよい。「本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物」には、例えば、当該酵素のアミノ酸配列と配列同一性７０％以下のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する微生物が含まれる。「本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物」としては、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のラクトバシルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ならびに、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）が挙げられる。ただし、本発明に使用することのできる菌株は上記菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。
【0033】
本発明で宿主微生物として用いられる微生物は、本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物であってもよい。「本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物」としては、コリネ型細菌、ロドコッカス属、ポラロモナス型細菌等に属する微生物を挙げることができ、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、および、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属のポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）が挙げられる。
【0034】
これらの本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物を用いる場合には、当該酵素の発現強化に適切なプロモーター、エンハンサー等の発現機構を好ましく選択することができる。コリネ型細菌、ロドコッカス属、ポラロモナス型細菌の当該蛋白質の遺伝子発現を増強することが可能なプロモーターは、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【0035】
本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物において、当該酵素遺伝子の発現を強化するには、例えば、コリネ型細菌には、Ｋｍプロモーター、ｂｅｎプロモーター、ｖａｎプロモーター等を使用することができ、ロドコッカス属細菌には、ｔｉｐＡプロモーター等を使用することができ、ポラロモナス型細菌には、ｎａｇプロモーター等を用いることができる。
【0036】
以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。
【0037】
目的とするプロトカテク酸６位酸化酵素のＤＮＡは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属の細菌由来のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子（以下、「プロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子」とも称する。）、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、又はポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計する。
【0038】
目的とするプロトカテク酸６位酸化酵素のＤＮＡは、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）ＲＨＡ１、又はポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）ＣＪ２のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子の塩基配列、すなわち配列番号８、９又は１０で表される塩基配列に基づいて設計することができる。
【0039】
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子のＤＮＡを連結するベクターとしては、エスケリキア・コリＢＬ２１株等において自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能である。このようなベクターとしては、具体的には、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）等を用いることができる。
【0040】
上記のようにして、ベクターにＤＮＡを連結して得られた組換え体ＤＮＡの宿主としては、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を用いることができる。ベクターにＤＮＡを連結して得られた組換え体ＤＮＡの宿主としては、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を用いることができる。エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、例えば、エスケリキア・コリが挙げられ、エスケリキア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ５α、エスケリキア・コリＪＭ１０５、エスケリキア・コリＢＬ２１等を挙げることができる。
【0041】
エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、またはポラロモナス(Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ)属に属する微生物の中に、プロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子を導入する場合、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、当該微生物のいずれかとエスケリキア・コリＢＬ２１株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換え体ＤＮＡを宿主となる当該微生物に導入することができる。
【0042】
宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主へＤＮＡを導入することのできる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ６９, ２１１０ （１９７２）〕、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., １６, ６１２７ （１９８８）〕、市販のコンピテント・セルを用いる方法等を挙げることができる。
【0043】
上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等の既存のＤＮＡ合成装置を用いて化学合成することによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
【0044】
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主で発現させることによって得られる。
【0045】
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、当該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、当該蛋白質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製し、当該組換え体ＤＮＡを、当該発現ベクターに適合した宿主に導入することにより取得することができる。形質転換体を得るためのこれらの方法は、単独で行ってもよく、複数を組み合わせて行ってもよい。
【0046】
例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＣｇｌの塩基配列（配列番号８）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来のＲｊｏの塩基配列（配列番号９）、およびポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｎａの塩基配列（配列番号１０）について、大腸菌における発現に最適なコドンとなるよう塩基の置換を行ったものを、それぞれ、配列番号５、配列番号６および配列番号７として下記表に示す。
【0047】
【表2】
【0048】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含むものが用いられる。
【0049】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡおよび転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。当該組換え体ＤＮＡには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【0050】
ここで使用されるプロモーターは、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。プロモーターとしては、例えば以下のものが挙げられる：
（１） ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）およびｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）等の大腸菌に由来するプロモーター、
（２） ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーター等の、ファージに由来するプロモーター、
（３） ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとを融合したｔａｃプロモーター、および、ｌａｃプロモーターとＴ７プロモーターとを融合したｌａｃＴ７プロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーター、
（４） Ｋｍプロモーター（例えばｐＨＳＧ２９８のカナマイシン耐性遺伝子のプロモーター）、
（５） ｂｅｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する安息香酸代謝系のプロモーター、
（６） ｖａｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来するバニリン酸代謝系のプロモーター、
（７） ｔｉｐＡプロモーター等の、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に由来するチオストレプトン誘導型のプロモーター、ならびに、
（８） ｎａｇプロモーター等の、ポラロモナス・ナフタレニボランスに由来するナフタレン代謝系のプロモーター。
上記プロモーターは、単独でまたは２種以上組み合わせて使用可能である。
（１） ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）およびｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）等の大腸菌に由来するプロモーター、
（２） ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーター等の、ファージに由来するプロモーター、
（３） ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとを融合したｔａｃプロモーター、および、ｌａｃプロモーターとＴ７プロモーターとを融合したｌａｃＴ７プロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーター、
（４） Ｋｍプロモーター（例えばｐＨＳＧ２９８のカナマイシン耐性遺伝子のプロモーター）、
（５） ｂｅｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する安息香酸代謝系のプロモーター、
（６） ｖａｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来するバニリン酸代謝系のプロモーター、
（７） ｔｉｐＡプロモーター等の、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に由来するチオストレプトン誘導型のプロモーター、ならびに、
（８） ｎａｇプロモーター等の、ポラロモナス・ナフタレニボランスに由来するナフタレン代謝系のプロモーター。
上記プロモーターは、単独でまたは２種以上組み合わせて使用可能である。
【0051】
上記プロモーターは、「本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物」においても単独でまたは２種以上組み合わせて使用可能であり、なかでも、（４）～（８）のプロモーターは、コリネ型細菌等の発現強化に、単独でまたは２種以上を組み合わせて、更には、（１）～（３）のプロモーターと組み合わせて、好ましく使用できる。
【0052】
本発明の別の側面は、上記組換え微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。本製造方法において、本発明の組換え微生物によって発現するプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質が、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換する。
【0053】
上記のようにして得られる本発明の組換え微生物を、好ましくは１ｍＭ～１Ｍのプロトカテク酸を含む培地で培養することで、培養物中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。ここで、本発明の組換え微生物が生成するプロトカテク酸には、生成した後も当該微生物の菌体内に保持されるものと、生成した後、菌体から培地へと放出されるものとが含まれる。本発明の組換え微生物によって生成されたプロトカテク酸を「本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸」とも称する。前記菌体内に保持されるプロトカテク酸は、その一部または全部が、菌体内でプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質によって２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換されることもある。本明細書で使用される「プロトカテク酸を含む培地」の語に関し、「プロトカテク酸」には、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸（すなわち、本発明の組換え微生物によって生成されて菌体内に保持されるプロトカテク酸、および、本発明の組換え微生物によって生成されて菌体から培地へと放出されるプロトカテク酸）を含まないものとし、外部から培地に添加されたプロトカテク酸のみを意味するものとする。微生物の培養に用いられる「１ｍＭ～１Ｍのプロトカテク酸を含む培地」は、対象となる微生物に適した培地に、終濃度が１ｍＭ～１Ｍとなる量のプロトカテク酸を添加することで調製することができる。
【0054】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生産するための原料であるプロトカテク酸としては、外部から培地に添加したプロトカテク酸、および／または、上記成分を含む培地で本発明にかかる組換え微生物によって生成されたプロトカテク酸、すなわち、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸、を利用することができる。
【0055】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【0056】
本発明にかかる２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法は、その製造方法のいずれかの段階で、本発明の組換え微生物を用いるものである。上記のとおり、本発明の組換え微生物を、プロトカテク酸を含む培地で培養することで培養物中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成させることができるが、この方法に代えて、またはこの方法に加えて、本発明の組換微生物を培養した後、プロトカテク酸を含む水性媒体中に、当該微生物の培養物もしくは当該培養物の処理物を加えることにより、当該媒体中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成させることもできる。すなわち、プロトカテク酸から２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸への変換は水性媒体中で行われる。本明細書において「プロトカテク酸を含む水性媒体」の語に関し、「プロトカテク酸」は、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸を含まず、外部から水性媒体に添加されたプロトカテク酸を意味するものとする。
【0057】
当該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えばｐＨ６～１０の０．０２～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾、界面活性剤による細胞壁の溶解等の手段で破砕して得られる破砕物、当該破砕物を水等で抽出して得られるプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を含む抽出物、当該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られるプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明の２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造に使用することができる。プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を担体に固定化したものは、例えば、バイオリアクター内での反応に用いることができる。
【0058】
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
【0059】
反応に用いる水性媒体は、プロトカテク酸を含む水溶液または適当な緩衝液、例えばｐＨ３～１０の０．０２～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５～２％（ｗ/ｖ）添加することもできる。反応に用いる水性媒体は、対象となる微生物に応じて選択された培地であってもよい。水性媒体が培地の場合、水性媒体は、液体培地、リン酸緩衝液、蛋白質安定剤などを含んでもよい。
【0060】
反応原料となるプロトカテク酸の水性媒体中の濃度は、０．１ｍＭ～１Ｍ程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常１０～６０℃、好ましくは１５～５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５～１０、好ましくは６～９付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をプロトカテク酸および水の存在下、反応させるが、反応液中のプロトカテク酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くすることが有利である。反応は静置、攪拌および振盪からなる群より選択されるいずれか１以上の方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、プロトカテク酸を含む溶液を流す方法を、先述した方法に加えて、又は、単独で行ってもよい。反応温度は、通常１０～６０℃、好ましくは１５～５０℃であり、反応液中のｐＨは５～１０、好ましくは６～９付近である。
【0061】
なお、上記水性媒体に、反応時に抗酸化剤を添加すると、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生成収率が一層向上する場合がある。抗酸化剤としては、アスコルビン酸等が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常は０．１～５０ｍＭ、好ましくは０．２～１０ｍＭである。
【0062】
本発明のさらに別の側面は、以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【0063】
本発明に係る製造方法において、プロトカテク酸から２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸への変換は、先述の水性媒体中の他、バイオリアクター中で行ってもよい。この場合には、バイオリアクター内では例えば、上記蛋白質を、容器内に収容される水性媒体もしくは固形媒体に浮遊させるか、または、担体に固定し、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸へ変換する。
【0064】
上記のとおり、本発明は、組換え微生物を用いた、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の醗酵製造法を提案するものである。本発明の組換え微生物を用いることにより、当該微生物の醗酵によって２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が生産されるため、効率的に目的物質を得ることができ、さらに、工業的規模で生産への応用も期待される。
【0065】
以上、本発明を実施するための形態を例示したが、上記実施形態はあくまでも例として示されるものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。
【0066】
なお、本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。
【0067】
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例0068】
［実施例１］
プロトカテク酸を原料とする大腸菌による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生産を下記のようにして行った。
プロトカテク酸を原料とする大腸菌による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生産を下記のようにして行った。
【0069】
（１）３－ヒドロキシ安息香酸６位酸化酵素蛋白質のデータベース検索
３－ヒドロキシ安息香酸の６位を酸化させる酵素群であるＣＤ１．１４．１２．２４の酵素群の中から、シュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素の配列とアミノ酸配列同一性が７５％未満であり、大腸菌での発現実績があり、かつ、サブユニット数の異なる蛋白質として、３種類を選定した（下記表３参照）。配列同一性は、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号４に示すシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列としてＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて算出した。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素との配列同一性（％）を表３に示した。
３－ヒドロキシ安息香酸の６位を酸化させる酵素群であるＣＤ１．１４．１２．２４の酵素群の中から、シュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素の配列とアミノ酸配列同一性が７５％未満であり、大腸菌での発現実績があり、かつ、サブユニット数の異なる蛋白質として、３種類を選定した（下記表３参照）。配列同一性は、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号４に示すシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列としてＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて算出した。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素との配列同一性（％）を表３に示した。
【0070】
【表3】
【0071】
【表4】
【0072】
（２）ＤＮＡの配列デザインとＤＮＡの取得
表３記載の３種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（タカラバイオ社）によりベクターｐＥＴ－１５ｂに組み込むため、当該ベクターを制限酵素ＮｄｅＩで切断した断片の末端１５塩基の配列と同一になるように、当該ＤＮＡの両末端に配列を追加してデザインした。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアミノ酸配列は配列番号１１、ロドコッカス・ジョスティＲＨＡ１のアミノ酸配列は配列番号１２、ポラロモナス・ナフタレニボランスＣＪ２のアミノ酸配列は配列番号１３に示す通りにデザインした。上記の配列デザインを行ったＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡの状態でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社に依頼して取得した。
表３記載の３種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（タカラバイオ社）によりベクターｐＥＴ－１５ｂに組み込むため、当該ベクターを制限酵素ＮｄｅＩで切断した断片の末端１５塩基の配列と同一になるように、当該ＤＮＡの両末端に配列を追加してデザインした。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアミノ酸配列は配列番号１１、ロドコッカス・ジョスティＲＨＡ１のアミノ酸配列は配列番号１２、ポラロモナス・ナフタレニボランスＣＪ２のアミノ酸配列は配列番号１３に示す通りにデザインした。上記の配列デザインを行ったＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡの状態でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社に依頼して取得した。
【0073】
【表5】
【0074】
（３）Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法によるベクタープラスミドへの挿入
ｐＥＴ－１５ｂに対して制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理を行った後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて上記の配列デザインを行ったＤＮＡを導入し、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
ｐＥＴ－１５ｂに対して制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理を行った後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて上記の配列デザインを行ったＤＮＡを導入し、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
【0075】
（４）ＤＮＡ導入ベクターの増幅・抽出
上記（３）で作製したプラスミドをそれぞれ、増幅に適する菌株であるエスケリキア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＤＨ５α_ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。上記形質転換株を、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるように添加したＬＢ倍地で培養した後、プラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）で精製・抽出を行い、１００～１５０ｎｇ／μＬのｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを得た。
上記（３）で作製したプラスミドをそれぞれ、増幅に適する菌株であるエスケリキア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＤＨ５α_ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。上記形質転換株を、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるように添加したＬＢ倍地で培養した後、プラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）で精製・抽出を行い、１００～１５０ｎｇ／μＬのｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを得た。
【0076】
（５）醗酵生産に用いる形質転換株の作製
上記（４）で作製したプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａをそれぞれ、エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
上記（４）で作製したプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａをそれぞれ、エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
【0077】
（６）上記形質転換株を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造
上記（５）で得られた３種類の形質転換体を４ｍＬのＬＢ培地で一晩培養した。プラスミドを維持するために、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるようにＬＢ培地に添加した。一晩培養後、４ｍＬのＴＢ培地に１／１００容量接種し、３７℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度４００μＭになるように添加し、蛋白誘導を行った。ＩＰＴＧ添加と同時に終濃度１０ｍＭのプロトカテク酸を添加し、２５℃で培養した。プロトカテク酸添加後２４時間、４８時間の培養液を採取し、冷却遠心機（久保田製作所製、Ｍｏｄｅｌ ６０００）で４℃、１０分、３０００ｒｐｍで遠心分離を行い、培養上清を得た。
上記（５）で得られた３種類の形質転換体を４ｍＬのＬＢ培地で一晩培養した。プラスミドを維持するために、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるようにＬＢ培地に添加した。一晩培養後、４ｍＬのＴＢ培地に１／１００容量接種し、３７℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度４００μＭになるように添加し、蛋白誘導を行った。ＩＰＴＧ添加と同時に終濃度１０ｍＭのプロトカテク酸を添加し、２５℃で培養した。プロトカテク酸添加後２４時間、４８時間の培養液を採取し、冷却遠心機（久保田製作所製、Ｍｏｄｅｌ ６０００）で４℃、１０分、３０００ｒｐｍで遠心分離を行い、培養上清を得た。
【0078】
上記培養上清をバイアルに移し、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用い、移動相にｐＨ２．５リン酸緩衝液、カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ社製）を用いて２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を検出した。結果、培養時間２４時間の時点で、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａについてそれぞれ、０．６ｍＭ、０．１ｍＭおよび１．６ｍＭの２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が観察された。
【0079】
また培養時間４８時間の時点で、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａについてそれぞれ、０．８ｍＭ、０．２ｍＭおよび１．８ｍＭの２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が観察された。消費されたプロトカテク酸はそれぞれ、１．４ｍＭ、０．３ｍＭおよび３．４ｍＭであり、得られた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸のモル収率はそれぞれ、６１％、５０％および５３％であった。なお、シュードモナス・エアルギノーサ由来の遺伝子を導入した大腸菌をプロトカテク酸存在下で培養しても、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸は確認されなかった。
【配列表】