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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022099279
(43)【公開日】2022-07-04
(54)【発明の名称】複合脂質結合性担体
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220627BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20220627BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20220627BHJP
C12N 11/02 20060101ALI20220627BHJP
C07K 17/08 20060101ALI20220627BHJP
C07K 17/06 20060101ALI20220627BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220627BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 S ZNA
G01N33/92
G01N33/531 A
C12N11/02
C07K17/08
C07K17/06
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021202508
(22)【出願日】2021-12-14
(31)【優先権主張番号】P 2020212667
(32)【優先日】2020-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】000173762
【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所
(72)【発明者】
【氏名】相原 秀典
(72)【発明者】
【氏名】畑山 耕太
(72)【発明者】
【氏名】穂谷 恵
(72)【発明者】
【氏名】荒木 怜子
(72)【発明者】
【氏名】河合 康俊
(72)【発明者】
【氏名】大竹 則久
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 博之
(72)【発明者】
【氏名】兜坂 健太
(72)【発明者】
【氏名】松永 太一
(72)【発明者】
【氏名】森本 篤史
【テーマコード（参考）】
2G045
4B033
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045DA60
2G045DA61
2G045FA37
2G045FB01
2G045FB03
4B033NA25
4B033NB33
4B033NC05
4B033ND03
4B033NE08
4B033NF02
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ67
4B063QQ70
4B063QR48
4B063QR83
4B063QS15
4B063QS24
4B063QS33
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA57
4H045DA89
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】
細胞外小胞を高感度に検出する技術、および、高純度の細胞外小胞を簡便な操作で大量
に単離する技術を提供すること。
【解決手段】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が固定化され
てなる不溶性担体を含むことを特徴とする複合脂質結合性担体と、細胞外小胞を含む試料
液を接触させ、複合脂質結合性担体と細胞外小胞が結合した複合体を得る方法、および、
当該複合体をキレート剤で処理して細胞外小胞を脱着させて回収する方法により、前記課
題を解決する。
【選択図】 図１１
細胞外小胞を高感度に検出する技術、および、高純度の細胞外小胞を簡便な操作で大量
に単離する技術を提供すること。
【解決手段】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が固定化され
てなる不溶性担体を含むことを特徴とする複合脂質結合性担体と、細胞外小胞を含む試料
液を接触させ、複合脂質結合性担体と細胞外小胞が結合した複合体を得る方法、および、
当該複合体をキレート剤で処理して細胞外小胞を脱着させて回収する方法により、前記課
題を解決する。
【選択図】 図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が固定化されてなる不溶性担体を含むことを特徴とする複合脂質結合性担体。
【請求項2】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の
（ａ）から（ｄ）の何れかに記載のタンパク質である、請求項１に記載の複合脂質結合性
担体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外
小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ
末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｄ）前記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ａ）から（ｄ）の何れかに記載のタンパク質である、請求項１に記載の複合脂質結合性
担体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外
小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ
末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｄ）前記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【請求項3】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の（ｅ）から（ｈ）の何れかに記載のタンパク質である、請求項１に記載の複合脂質結合性担体。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外
小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｆ）前記（ｅ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ
末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｇ）前記（ｅ）または（ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リ
ン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｈ）前記（ｅ）から（ｇ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外
小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｆ）前記（ｅ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ
末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｇ）前記（ｅ）または（ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数
個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リ
ン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｈ）前記（ｅ）から（ｇ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【請求項4】
タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の（ｉ）から（ｌ）の何れかに記載のタンパク質である、請求項１に記載の複合脂質結合性担体。
（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｊ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｋ）前記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｌ）前記（ｉ）から（ｋ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｊ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｋ）前記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｌ）前記（ｉ）から（ｋ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【請求項5】
複合脂質がリン脂質である、請求項１から４のいずれかに記載の複合脂質結合性担体。
【請求項6】
リン脂質がホスファチジルセリンを成分として含むリン脂質であることを特徴とする、請求項５に記載の複合脂質結合性担体。
【請求項7】
細胞外小胞がヒト細胞由来の細胞外小胞である、請求項２から６のいずれかに記載の複合脂質結合性担体。
【請求項8】
請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体を含む検出試薬。
【請求項9】
細胞外小胞の検出に使用するキットであって、請求項８に記載の検出試薬を含むことを特徴とする、細胞外小胞検出用キット。
【請求項10】
請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体を充填してなるカラム。
【請求項11】
細胞外小胞の単離に使用するキットであって、請求項１０に記載のカラムを含むことを特徴とする、細胞外小胞単離用キット。
【請求項12】
以下の（Ａ１）と（Ａ２）の工程を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれかに
記載の複合脂質結合性担体の製造方法：
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、請求項１から請求項４のいず
れかに記載のタンパク質を固定化する工程。
記載の複合脂質結合性担体の製造方法：
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、請求項１から請求項４のいず
れかに記載のタンパク質を固定化する工程。
【請求項13】
不溶性担体に、前記（ａ）から（ｌ）のいずれかに記載のタンパク質を物理的吸着によって固定化する工程を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体の製造方法。
【請求項14】
以下の（Ｘ１）から（Ｘ３）の工程を含むことを特徴とするリン脂質および／または細
胞外小胞の検出方法：
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
胞外小胞の検出方法：
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項15】
検出方法として、ＥＬＩＳＡ法またはフローサイトメトリー法を用いることを特徴とする、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項16】
以下の（Ｙ１）から（Ｙ３）の工程を含むことを特徴とするリン脂質および／または細
胞外小胞の単離方法：
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
胞外小胞の単離方法：
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、請求項１から７のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
【請求項17】
工程（Ｙ３）がカルシウムイオンキレート剤を用いて行なわれることを特徴とする、請求項１６に記載の単離方法。
【請求項18】
複合脂質結合性担体を含む検出試薬を用いることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の検出方法。
【請求項19】
複合脂質結合性担体を充填してなるカラムを用いることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複合脂質に結合性を有するタンパク質を不溶性担体に固定化した複合脂質結合性担体、ならびに、当該担体を用いた複合脂質および細胞外小胞の、検出方法および単離方法に関する。
【背景技術】
【0002】
複合脂質は細胞膜や細胞外小胞の脂質二重層の主な構成要素であり、リン酸エステル結合を有するリン脂質と糖が結合した糖脂質に大別される。リン脂質の一つであるホスファチジルセリンは、正常な細胞では細胞膜の細胞質側に存在しているが、細胞外小胞ではホスファチジルセリンがその膜表面に存在することが知られている（特許文献１、非特許文献１）。細胞外小胞は内部にマイクロＲＮＡやメッセンジャーＲＮＡなどの核酸やタンパク質などの物質を含み、細胞間の情報伝達を担っていると考えられていることから、がんなどの各種疾患のバイオマーカーとして注目されるだけでなく、新規治療薬やドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）としての応用も期待されている（非特許文献２）。
【0003】
細胞外小胞の検出技術として、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０）やテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）を細胞外小胞のマーカーとして利用する方法が知られているが、細胞外小胞を放出する細胞の種類によりこれらのマーカーの発現量は異なり、感度および定量性に欠けることが課題である（例えば非特許文献１）。また、細胞外小胞を単離する技術として、超遠心法、限外ろ過法、密度勾配遠心法、ポリマー沈殿法、免疫沈降法などの方法が知られているが、（１）高純度の細胞外小胞が得られること、（２）細胞外小胞が大量かつ安価に得られること、（３）操作が短時間且つ簡便であること、の３点すべてを満たす方法がないことが課題である。これらの方法以外に、ホスファチジルセリンに結合性を持つアネキシンＶやＴｉｍ４タンパク質を利用した細胞外小胞の検出方法および単離方法が知られているが（特許文献２、非特許文献１）、アネキシンＶやＴｉｍ４タンパク質は細胞外小胞の検出率や回収率に改善の必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１９－１６４１４５号公報
【特許文献2】ＷＯ２０１６／０８８６８９
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】日本薬理学雑誌 １４９巻３号、１１９－１２２頁、２０１７年
【非特許文献2】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３巻、１６３７－１６５３頁、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、細胞外小胞の産業的利用を発展させるにあたり、細胞外小胞を高感度且つ高精度に検出する技術や、高純度の細胞外小胞を簡便な操作で大量に単離する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、複合脂質に結合性を有するタンパク質が不溶性担体に固定化されてなる複合脂質結合性担体を作製し、細胞外小胞を含む生体物質含有試料液を接触させて、複合脂質結合性担体と細胞外小胞が結合した複合体を得ることで、細胞外小胞を高感度かつ高精度に検出できることを見出した。さらに、前記複合体にキレート剤を含む緩衝液を添加して複合脂質結合性担体から細胞外小胞を脱着させることにより、簡便な操作で大量の高純度な細胞外小胞を単離できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち本発明は、以下の［１］から［１９］に記載した発明を提供するものである。
【0009】
［１］タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が固定化されてなる不溶性担体を含むことを特徴とする複合脂質結合性担体。
【0010】
［２］タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の（ａ）から（ｄ）の何れかに記載のタンパク質である、前記［１］に記載の複合脂質結合性担体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｄ）前記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｄ）前記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【0011】
［３］タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の（ｅ）から（ｈ）の何れかに記載のタンパク質である、前記［１］に記載の複合脂質結合性担体。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｆ）前記（ｅ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｇ）前記（ｅ）または（ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｈ）前記（ｅ）から（ｇ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｆ）前記（ｅ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｇ）前記（ｅ）または（ｆ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｈ）前記（ｅ）から（ｇ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【0012】
［４］タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が、以下の（ｉ）から（ｌ）の何れかに記載のタンパク質である、前記［１］に記載の複合脂質結合性担体。
（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｊ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｋ）前記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｌ）前記（ｉ）から（ｋ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｊ）前記（ｉ）のタンパク質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｋ）前記（ｉ）または（ｊ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
（ｌ）前記（ｉ）から（ｋ）の何れかに記載のタンパク質と不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質との複合体であり、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有するタンパク質。
【0013】
［５］複合脂質がリン脂質である、前記［１］から［４］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体。
【0014】
［６］リン脂質がホスファチジルセリンを成分として含むリン脂質であることを特徴とする、前記［５］に記載の複合脂質結合性担体。
【0015】
［７］細胞外小胞がヒト細胞由来の細胞外小胞である、前記［２］から［６］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体。
【0016】
［８］前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体を含む検出試薬。
【0017】
［９］細胞外小胞の検出に使用するキットであって、前記［８］に記載の検出試薬を含むことを特徴とする、細胞外小胞検出用キット。
【0018】
［１０］前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体を充填してなるカラム。
【0019】
［１１］細胞外小胞の単離に使用するキットであって、前記［１０］に記載のカラムを含むことを特徴とする、細胞外小胞単離用キット。
【0020】
［１２］以下の（Ａ１）と（Ａ２）の工程を含むことを特徴とする前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体の製造方法：
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、前記［１］から［４］のいず
れかに記載のタンパク質を固定化する工程。
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、前記［１］から［４］のいず
れかに記載のタンパク質を固定化する工程。
【0021】
［１３］不溶性担体に、前記（ａ）から（ｌ）のいずれかに記載のタンパク質を物理的吸着によって固定化する工程を含むことを特徴とする、前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体の製造方法。
【0022】
［１４］以下の（Ｘ１）から（Ｘ３）の工程を含むことを特徴とするリン脂質および／または細胞外小胞の検出方法：
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
【0023】
［１５］検出方法として、ＥＬＩＳＡ法またはフローサイトメトリー法を用いることを特徴とする、前記［１４］に記載の検出方法。
【0024】
［１６］以下の（Ｙ１）から（Ｙ３）の工程を含むことを特徴とするリン脂質および／または細胞外小胞の単離方法：
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、前記［１］から［７］のいずれかに記載の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
【0025】
［１７］工程（Ｙ３）がカルシウムイオンキレート剤を用いて行なわれることを特徴とする、前記［１６］に記載の単離方法。
【0026】
［１８］複合脂質結合性担体を含む検出試薬を用いることを特徴とする、前記［１４］または［１５］に記載の検出方法。
【0027】
［１９］複合脂質結合性担体を充填してなるカラムを用いることを特徴とする、前記［１６］または［１７］に記載の単離方法。
【0028】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【0029】
本発明の複合脂質結合性担体は、不溶性担体に、タンパク質リン酸化酵素（以降、ＰＫＣと略する場合もある）のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が固定化されてなることを特徴とする。
【0030】
本発明の複合脂質結合性担体に使用するタンパク質（以降、複合脂質結合性タンパク質と略する場合もある）はＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質であり、より詳しくは、当該タンパク質を形質転換大腸菌で発現させたものである。ＰＫＣのＣ２ドメインは、複合脂質、特にリン脂質の主な成分であるホスファチジルセリンに結合性を有することが知られており（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． ４２巻、１４７１－１４７６頁、２０１４年）、ホスファチジルセリンは細胞外小胞の外側に存在することが知られている。また、後述する参考例で示すとおり、ＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質を形質転換大腸菌で発現させた組換えタンパク質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール４－リン酸、ホスファチジルイノシトール４、５－ビスリン酸、スルファチドなどの複合脂質に結合することが明らかになっている。従って、本発明の複合脂質結合性担体は、複合脂質への結合性を損なうことなく複合脂質結合性タンパク質を不溶性担体に固定化することで、リン脂質および／または細胞外小胞に結合することができる。
【0031】
なお、本明細書における複合脂質は、真核細胞およびそれから分泌された細胞外小胞に由来する脂質二重膜であり、細胞外小胞は、脂質二重膜で構成される２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、好ましくは５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の粒径を有する膜小胞であり、具体的には、エクソソーム、微小胞、エクトソーム、エクソソーム様小胞、アポトーシス性小胞、アジポソームを例示することができる。エクソソームは後期エンドソームに由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、ＣＤ６３やＣＤ９などのテトラスパニンなどのタンパク質を含む５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の粒径を有する。微小胞は細胞膜に由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０リガンドなどのタンパク質を含む１００ｎｍ以上ら８００ｎｍ以下の粒径を有する。エクトソームは細胞膜に由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、ＣＲ１、タンパク質分解酵素を含むがエクソソームに含まれるＣＤ６３を含まない、５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下の粒径を有する。エクソソーム様小胞は初期エンドソームに由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、ＴＮＦＲ１（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）を含む２０ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒径を有する。アポトーシス性小胞はアポトーシス細胞に由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、ヒストンを含む５０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の粒径を有する。アジポソームは脂肪細胞に由来する脂質二重膜で構成され、膜表面にホスファチジルセリンを有し、ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ Ｆａｔ Ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ－ｆａｃｔｏｒ ８）を含む１００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の粒径を有する。文献（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３巻、１６３７－１６５３頁、２０１３年）に開示されているように、これらの細胞外小胞はがんなどの各種疾患のバイオマーカーとして注目されていることから、細胞外小胞がヒト細胞由来である場合には、本発明の複合脂質結合性担体を各種疾患の診断に好適に用いることができる。
【0032】
前記ＰＫＣのＣ２ドメインとしては、カルシウムイオン依存的な複合脂質への結合性を有するＰＫＣαのＣ２ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号１で示されるＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｐ１７２５２の１５５番目から２９３番目の領域のアミノ酸配列。以降、ＰＫＣαＣ２と略する場合もある。）、ＰＫＣβのＣ２ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号２で示されるＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｐ０５７７１の１５３番目から２９３番目の領域のアミノ酸配列。以降、ＰＫＣβＣ２と略する場合もある。）、ＰＫＣγのＣ２ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号３で示されるＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｐ０５１２９の１５３番目から２９３番目の領域のアミノ酸配列。以降、ＰＫＣγＣ２と略する場合もある。）や、カルシウムイオン非依存的な複合脂質への結合性を有するＰＫＣεのＣ２ドメイン、ＰＫＣηのＣ２ドメイン、ＰＫＣδのＣ２ドメインおよびＰＫＣθのＣ２ドメインを例示することができる。これらＰＫＣのＣ２ドメインの中では、カルシウムイオンの添加および捕捉によりリン脂質および／または細胞外小胞の本発明の複合脂質結合性担体への吸脱着が制御可能な点で、ＰＫＣαＣ２、ＰＫＣβＣ２およびＰＫＣγＣ２が好ましい。
【0033】
複合脂質結合性タンパク質は、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、配列番号１から３で示されるＰＫＣα、βおよびγのＣ２ドメインの各アミノ酸配列を２箇所以上の複数箇所含んでいても良い。前記Ｃ２ドメインを複数箇所含む場合、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、同じ種類のＰＫＣのＣ２ドメインであってもよく、異なる種類のＰＫＣのＣ２ドメインであってもよい。前記複数箇所に特に制限はなく、複合脂質や細胞外小胞への結合性が向上する場合は２箇所以上が好ましいが、形質転換大腸菌での発現性を低下させない点では１０箇所以下が好ましい。
【0034】
複合脂質結合性タンパク質は、配列番号１から３で示されるＰＫＣα、βおよびγのＣ２ドメインの各アミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、ＰＫＣのＣ２ドメイン以外のタンパク質のアミノ酸配列、具体的には、配列番号４（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｐ０８５１５の３番目から２１８番目の領域のアミノ酸配列）で示されるグルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ（以降、ＧＳＴと略する場合もある。）のアミノ酸配列を付加することで、リン脂質および／または細胞外小胞への結合性を向上させることができる。リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、ＰＫＣのＣ２ドメインとＧＳＴのアミノ酸配列上の位置関係に特に制限はなく、例えば、Ｎ末端側がＰＫＣのＣ２ドメインでＣ末端側がＧＳＴであってもよく、Ｎ末端側がＧＳＴでＣ末端側がＰＫＣのＣ２ドメインであってもよいが、リン脂質および／または細胞外小胞への結合性が高い点で、Ｎ末端側がＰＫＣのＣ２ドメインでＣ末端側がＧＳＴであることが好ましい。また、複合脂質結合性タンパク質は、配列番号４で示されるＧＳＴのアミノ酸配列を複数箇所含んでいてもよく、複合脂質や細胞外小胞への結合性および形質転換大腸菌での発現性の点で、１から３箇所が好ましく、より好ましくは１箇所である。また、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、ＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸配列とＧＳＴのアミノ酸配列の間は直結されていても良く、１個から複数個のリンカーとなるアミノ酸配列が含まれていても良い。リンカーとなるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基数に特に制限はないが、アミノ酸残基数が多いとＧＳＴのアミノ酸配列の付加によるリン脂質および／または細胞外小胞への結合性向上の効果が低くなり、また、複合脂質結合性タンパク質の形質転換大腸菌での発現性が低下することから、リンカーとなるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基数は１個から５０個が好ましく、１０個から３０個がより好ましい。
【0035】
複合脂質結合性タンパク質は、配列番号１から３で示されるＰＫＣα、βおよびγのＣ２ドメインの各アミノ酸配列を含むアミノ酸配列、および、配列番号１から３で示されるＰＫＣα、βおよびγのＣ２ドメインの各アミノ酸配列を含むアミノ酸配列と配列番号４で示されるＧＳＴのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列において、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加してもよい。前記複数個に特に制限はないが、複合脂質や細胞外小胞への結合性が消失しない点で、２０個以下が好ましく、１０個以下がより好ましく、５個以下がことさらに好ましい。このアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行なうことができる。
【0036】
複合脂質結合性タンパク質は、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、複合脂質非結合性タンパク質との複合体であってもよく、そのタンパク質の結合数や種類に制限はなく、２種類以上の複合脂質非結合性タンパク質との複合体であってもよい。
【0037】
前記複合体を構成する複合脂質非結合性タンパク質としては、ＰＫＣのＣ２ドメインの密度や配向を制御しＰＫＣのＣ２ドメインの細胞外小胞への結合性を最適化する点で、固定化補助タンパク質が好ましく、３量体構造または９量体構造を有した固定化補助タンパク質が、ＰＫＣのＣ２ドメインの多価効果による親和性向上が得られ、かつ作製も容易な点から、さらに好ましい。固定化補助タンパク質の具体例として、配列番号３３および配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
【0038】
また、複合脂質結合性タンパク質は、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性を有する限り、配列番号１から３で示されるＰＫＣα、βおよびγのＣ２ドメインの各アミノ酸配列に、前述のＧＳＴのアミノ酸配列以外の付加的なアミノ酸配列を含んでいても良い。具体的には、前記Ｃ２ドメインのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、複合脂質結合性タンパク質の製造時に有用な分離精製用タグのアミノ酸配列や、複合脂質結合性担体を作製する際に有用な担体固定化用タグのアミノ酸配列または担体固定化に有用なポリペプチドが付加されていてもよい。
【0039】
これらの分離精製用タグおよび担体固定化用タグとしては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド（ポリヒスチジンタグ）、システイン残基を含むオリゴペプチド、リジン残基を含むオリゴペプチド、ポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドを例示することができる。これら付加的なアミノ酸配列の中では、分離精製が容易になる点でポリヒスチジンタグやポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドが、複合脂質への結合性を損なうことなく複合脂質結合性タンパク質を不溶性担体に固定化できる点で、システインを含むオリゴペプチドやポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドが好ましく、ポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドがより好ましい。ポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易になる点で、ヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から１０個からなる繰返し配列であることがより好ましい。
【0040】
また、システイン残基の数は、不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に行なえる点で、システイン残基を１残基以上５残基以下含むことが好ましく、１残基または２残基を含むことがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドの長さは、前記ヒスチジンの繰返し配列およびシステイン残基が含まれており、かつ、リン脂質および／または細胞外小胞に結合性が消失されなければ特に制限はなく、具体的には、配列番号３９および配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを例示することができる。また、前記ポリヒスチジン配列とシステイン残基の双方を含むオリゴペプチドが複合脂質結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側またはＣ末端側のいずれかであってもよいが、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製と不溶性担体への固定化が効率的に行なえる点で、Ｃ末端側に付加されていることが好ましい。
【0041】
担体固定化に有用なポリペプチドとしては、タンパク質分子表面に露出したシステイン残基やリジン残基、共有結合を形成するタンパク質タグのＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを例示することができる。中でも、配向制御固定に適し細胞外小胞への結合性を最適化する点で、一般にタンパク質のアミノ酸配列中での出現頻度が低く、かつ結合部位の制御が容易なシステイン残基や、天然のタンパク質には存在しない配列であるＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが好ましく、前述の固定化補助タンパク質と結合することにより、多量体構造を作製し細胞外小胞への結合性を最適化する点で、ＳｐｙＴａｇがより好ましい。
【0042】
さらに、本発明の吸着剤に使用するタンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【0043】
複合脂質結合性タンパク質の複合脂質への結合性は、例えば、固相酵素免疫測定法（以降、ＥＬＩＳＡ法と略する場合もある。）、フローサイトメトリー法などの当業者に周知の方法を用いることで評価することができる。他にも、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７巻、９２７－９４０頁、２００７年）に記載の膜脂質ストリップ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、Ｐ－６００２）を用いることにより、複合脂質結合性タンパク質について、多数の複合脂質への結合性を一度に評価することができる。
【0044】
複合脂質結合性タンパク質の具体例としては、
配列番号５（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に相当し、その１５５番目から１６０番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１５３番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５５番目から３７０番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７３番目から３７８番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号９（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１７９番目はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの下流のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ１７２５２の２９４番目から３３１番目の領域のアミノ酸配列）に、１９３番目から４０８番目は配列番号４のアミノ酸配列に、４１１番目から４１６番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６６番目から３８１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８４番目から３８９番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１３（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１５２番目から１６５番目はαヘリックスリンカー（配列番号４２）に、１７１番目から３８６番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８９番目から３９４番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１５（その４番目から２１９番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２２番目から２３５番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、２４１番目から３７９番目は配列番号１のアミノ酸配列に、３８２番目から３８７番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１７（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１９（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に、１４７番目から１６０番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６７番目から３８２番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８５番目から３９０番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号２１（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号２３（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に、１４３番目から１５４番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５６番目から３７１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７４番目から３７９番目はポリヒスチジン配列に相当）、
および配列番号３１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６４番目から２７９番目はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢの１１６アミノ酸残基）に、その２８２番目から２８７番目はポリヒスチジン配列に相当）のいずれかで示される複合脂質結合性タンパク質を挙げることができる。
配列番号５（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に相当し、その１５５番目から１６０番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１５３番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５５番目から３７０番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７３番目から３７８番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号９（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１７９番目はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの下流のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ１７２５２の２９４番目から３３１番目の領域のアミノ酸配列）に、１９３番目から４０８番目は配列番号４のアミノ酸配列に、４１１番目から４１６番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６６番目から３８１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８４番目から３８９番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１３（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１５２番目から１６５番目はαヘリックスリンカー（配列番号４２）に、１７１番目から３８６番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８９番目から３９４番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１５（その４番目から２１９番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２２番目から２３５番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、２４１番目から３７９番目は配列番号１のアミノ酸配列に、３８２番目から３８７番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１７（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号１９（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に、１４７番目から１６０番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６７番目から３８２番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８５番目から３９０番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号２１（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）、
配列番号２３（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に、１４３番目から１５４番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５６番目から３７１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７４番目から３７９番目はポリヒスチジン配列に相当）、
および配列番号３１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６４番目から２７９番目はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢの１１６アミノ酸残基）に、その２８２番目から２８７番目はポリヒスチジン配列に相当）のいずれかで示される複合脂質結合性タンパク質を挙げることができる。
【0045】
これらの複合脂質結合性タンパク質のうち、後述する実施例で示すように、細胞外小胞検出性能が高い点で、配列番号１１および配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる複合脂質結合性タンパク質が好ましく、細胞培養上清に含まれる細胞外小胞を濃縮できる点で、配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなる複合脂質結合性タンパク質が好ましい。
【0046】
複合脂質結合性タンパク質の製造法に特に制限はなく、例えば、特開２０１８－００００３８号公報などで開示されている当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、複合脂質結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主細胞を培養して培養物（培養された形質転換体自体や分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる）を得る工程、得られた培養物を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し、超音波による物理的破砕や界面活性剤などの薬剤による破砕によって細胞を破砕したのち、遠心分離により破砕残渣を除去することで、複合脂質結合性タンパク質を含む可溶性タンパク質抽出液を得る工程、得られた可溶性タンパク質抽出液をイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィーにより精製する工程により、目的とする複合脂質結合性タンパク質を製造すればよい。の複合脂質結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主とは、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に代表される動物細胞、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に代表される細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に代表される酵母、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。また、界面活性剤などの薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、特開２０１３－２５２０９９号公報に開示した方法や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕してもよい。
【0047】
本発明の複合脂質結合性担体に使用する不溶性担体（以降、本発明の不溶性担体と略する場合もある。）は、後述する本発明のリン脂質および／または細胞外小胞の検出方法および単離方法（以降、本発明の検出方法および本発明の単離方法と略する場合もある。）に応じて適宜選択すればよく、シリカゲル、多孔性ガラス、金薄膜を蒸着させた無孔性ガラス、アルミナ、鉄、コバルト、ニッケル、マグネタイト、クロマイト等の磁性体、金属酸化物などの無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナンなどの多糖系担体、多糖系担体を架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレンやポリプロピレンを含むポリオレフィン類、ポリエチレンテレフタレートを含むポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリイミド、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリ塩化ビニール、ポリカーボネートなどの合成高分子系担体、合成高分子系担体を架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体、およびこれらをデキストランやプルラン、ポリビニルアルコールなどの親水性高分子で表面を修飾した親水性表面修飾合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した親水性表面修飾架橋合成高分子系担体を例示することができる。後述する物理的吸着によって複合脂質結合性タンパク質を担体に固定化する場合には、効率的に複合脂質結合性タンパク質の固定化が行なえる点で、合成高分子系担体や架橋合成高分子系担体であることが好ましい。また、疎水性相互作用による担体への複合脂質や細胞外小胞の非特異的吸着が、リン脂質および／または細胞外小胞の検出および単離に悪影響を与える場合には、多糖系担体、架橋多糖系担体、親水性表面修飾合成高分子系担体および親水性表面修飾架橋合成高分子系担体であることが好ましい。
【0048】
本発明の複合脂質結合性担体の形状も、後述する本発明のリン脂質および／または細胞外小胞の検出方法および単離方法に応じて、粒子状、平板状、スポンジ状、平膜状、中空状、繊維状のいずれかから適宜選択すればよい。本発明の複合脂質結合性担体を、本発明の検出方法に使用する場合には、通常の免疫学的測定法で用いられる磁気を有する粒子状担体（以降、磁性微粒子と記載する場合もある。）または平板状担体を用いればよい。磁性微粒子の粒径は０．０１μｍ以上５００μｍ以下の範囲で適宜選択すればよく、入手容易な点で０．１μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。また、平板状担体中の穴（ウェル）の数は６ウェル以上１５３６ウェル以下の範囲で適宜選択すればよく、入手容易な点で２４ウェル以上３８４ウェル以下であることが好ましい。本発明の複合脂質結合性担体を、本発明の単離方法に使用する場合には、簡便な操作で効率的に単離が行なえる点で、通常の脂質やタンパク質などの生体由来試料の分離精製で用いられる粒子状担体を用いることが好ましく、粒径は１μｍ以上１０００μｍ以下の範囲で適宜選択すればよい。なお、細胞外小胞の単離に使用する場合には、細胞外小胞が担体と十分接触し、かつ担体に結合しない細胞外小胞が担体の隙間を目詰まりすることなく通過できる点で、１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましい。
【0049】
本発明の複合脂質結合性担体の製造方法は、以下の（Ａ１）と（Ａ２）の工程を含むことを特徴とする。
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、前記［１］から［４］のいずれかに記載のタンパク質を固定化する工程。
（Ａ１）不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程。
（Ａ２）前記工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、前記［１］から［４］のいずれかに記載のタンパク質を固定化する工程。
【0050】
以下に工程（Ａ１）と工程（Ａ２）を説明する。
【0051】
工程（Ａ１）は、不溶性担体に複合脂質結合性タンパク質を固定化するための反応性官能基を導入する工程である。前記反応性官能基は、一般的なタンパク質固定化用の官能基であれば特に制限されず、エポキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、活性エステル基、アミノ基、マレイミド基、ハロアセチル基、メルカプト基を例示することができる。また、担体に前記反応性官能基を導入する方法は、一般的な官能基導入方法であれば特に制限はされない。
【0052】
担体にエポキシ基を導入する方法としては、担体表面のヒドロキシ基とエピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１、４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、１、６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラエチレングリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル類、グリセロールトリグリシジルエーテル、エリスリトールトリグリシジルエーテル、ジグリセロールトリグリシジルエーテルなどのトリグリシジルエーテル類、エリスリトールテトラグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテルなどのテトラグリシジルエーテル類などのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させることで担体にエポキシ基を導入したのち、エポキシ基と親水性高分子のヒドロキシ基を塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。
【0053】
担体にホルミル基を導入する方法としては、担体のヒドロキシ基をグルタルアルデヒドなどの２官能性アルデヒド類を反応させる方法や、担体を過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。また、前述の方法によりエポキシ基を導入した担体と、Ｄ－グルカミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、α－チオグリセロールなどの化合物を反応させて反応点の隣接炭素上にヒドロキシ基を導入した担体を、過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤と反応させる方法を例示することができる。
【0054】
担体にカルボキシ基を導入する方法としては、担体のヒドロキシ基とモノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸などのハロ酢酸と塩基性条件下で反応させる方法の他に、前述の方法によりエポキシ基を導入した担体を、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸類、β－アラニン、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸などのアミノ基含有カルボン酸類、チオグリコール酸やチオリンゴ酸などの含硫黄カルボン酸類と塩基性条件下で反応させる方法を例示することができる。さらに、担体に導入したカルボキシ基を１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの縮合剤存在下でＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、活性エステル基であるＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルへ誘導する方法を例示することができる。
【0055】
担体にアミノ基を導入する方法としては、前述の方法によりエポキシ基を導入した担体を、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２－アミノエチル）アミンなどの少なくとも２つ以上のアミノ基を有する化合物と反応させる方法を例示することができる。担体にマレイミド基を導入する方法としては、ヒドロキシ基および／またはアミノ基を有する担体と、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸などのマレイミド基を有するカルボン酸類をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法を例示することができる。さらに、前述のマレイミド基を有するカルボン酸類のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を例示することができる。
【0056】
担体にハロアセチル基を導入する方法としては、例えば、ヒドロキシ基を有する担体や、前述の方法によりアミノ基を導入した担体と、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミドなどの酸ハロゲン化物を反応させる方法や、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸などのハロゲン化酢酸をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法をあげることができる。さらに、前述のハロゲン化酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法をあげることができる。
【0057】
担体にメルカプト基を導入する方法としては、例えば、前述の方法によりアミノ基を導入した担体と、アミノ基を保護したシステインやチオグリコール酸をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法をあげることができる。
【0058】
前述した不溶性担体に反応性官能基を導入する工程で使用する溶媒、反応温度や時間は、目的とする反応性官能基が導入できれば特に制限はなく、当業者が通常用いる溶媒や条件の中から、適宜選択すればよい。
【0059】
工程（Ａ２）は、工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体に、複合脂質結合性タンパク質を固定化し、本発明の複合脂質結合性担体を得る工程である。具体的には、担体に導入したエポキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、担体に導入したアミノ基とタンパク質のカルボキシ基を反応させる方法、担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、ハロアルキル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【0060】
これらの固定化方法の中では、短時間に高収率で担体へのタンパク質固定化が行なえる点で、担体に導入したホルミル基、活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させる方法、および、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法が好ましく、固定化反応をｐＨが中性付近で行なうことが可能であり、複合脂質結合性タンパク質の変性を抑制できることが可能である点で、担体に導入したマレイミド基、ハロアセチル基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法がより好ましく、官能基の安定性が高い点で、担体に導入したマレイミド基とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法がことさらに好ましい。
【0061】
また、工程（Ａ２）では、複合脂質結合性タンパク質に導入した反応性官能基と、工程（Ａ１）で得られた反応性不溶性担体とを反応させ、複合脂質結合性タンパク質を固定化してもよい。具体的には、複合脂質結合性タンパク質と４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩などのマレイミド基と活性エステル基の双方を有する化合物の活性エステル基とタンパク質のアミノ基を反応させてタンパク質にマレイミド基または活性エステル基を導入したのち、工程（Ａ１）で得られたメルカプト基またはアミノ基が導入された担体と反応させる方法を例示することができる。
【0062】
さらに、工程（Ａ２）では、抗原－抗体反応や、アビジン－ビオチン結合などのアフィニティー結合を利用して、複合脂質結合性タンパク質を担体に固定化してもよい。具体的には、工程（Ａ１）で得られたエポキシ基、ホルミル基、カルボキシ基および活性エステル基、アミノ基などの反応性不溶性担体と、抗ＭＢＰ抗体、抗ＣＢＤ抗体、抗ｍｙｃタグ抗体、抗ＦＬＡＧタグ抗体、抗Ｈｉｓタグ抗体などの抗体またはストレプトアビジンを反応させて抗体またはストレプトアビジン固定化担体を製造したのち、ＭＢＰ、ＣＢＤ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグを導入した複合脂質結合性タンパク質、または、ビオチン化した複合脂質結合性タンパク質を接触させる方法を例示することができる。タンパク質へのビオチンの導入方法は当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよく、具体的には、９－（ビオチンアミド）－４、７－ジオキサノナン酸－Ｎ－スクシンイミジルなどの活性エステル基を有するビオチン化試薬とタンパク質のアミノ基を反応させる方法や、Ｎ－ビオチニル－Ｎ’－［２－（Ｎ－マレイミド）エチル］ピペラジン塩酸塩などのマレイミド基を有するビオチン化試薬とタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【0063】
加えて、本発明の複合脂質結合性担体の製造方法は、不溶性担体と複合脂質結合性タンパク質を接触させて、前記タンパク質を物理的吸着によって不溶性担体に固定化する工程を含む方法であってもよい。物理的吸着によってタンパク質を不溶性担体に固定化する方法は当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよく、具体的には、特公平５－４１９４６号公報に記載の方法を例示することができる。
【0064】
本発明の複合脂質結合性担体の製造方法は、後述する本発明のリン脂質および／または細胞外小胞の検出方法および単離方法に応じて適宜選択すればよいが、簡便である点で前記担体を本発明の検出方法に使用する場合には物理的吸着による製造方法が好ましく、本発明の単離方法に用いる場合には、反応性不溶性担体と複合脂質結合性タンパク質を反応させる製造方法、または、前述の抗原－抗体反応やアビジン－ビオチン結合などのアフィニティー結合を利用した製造方法が好ましい。
【0065】
前述した担体と、緩衝液に溶解した複合脂質結合性タンパク質とを反応または接触させることで、本発明の複合脂質結合性担体を製造することができる。前記タンパク質を溶解する緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬製）などの市販の緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。本発明の複合脂質結合性担体の製造方法における反応または接触温度およびｐＨは、反応性官能基の反応性や複合脂質結合性タンパク質の安定性を考慮し、反応温度については０℃以上５０℃以下、ｐＨについてはｐＨ４以上ｐＨ１０以下の範囲の中から適宜設定すればよく、タンパク質の失活を抑制する点で、反応温度については１５℃以上４０℃以下、ｐＨについてはｐＨ５以上ｐＨ９以下の範囲が好ましい。
【0066】
本発明の複合脂質結合性担体における複合脂質結合性タンパク質の固定化量は、本発明の検出方法および本発明の単離方法によって適宜選択すればよい。例えば、本発明の検出方法においては、磁性微粒子の場合は、担体１ｍｇに対して０．１μｇ以上５０μｇ以下が好ましく、０．５μｇ以上３０μｇ以下がより好ましく、１．０μｇ以上２０μｇ以下がことさらに好ましい。平板状担体の場合は、１ウェル（２．７ｃｍ２）に対して０．０５μｇ以上５μｇ以下が好ましく、０．１μｇ以上２μｇ以下がより好ましく、０．２μｇ以上１μｇ以下がことさらに好ましい。また、本発明の単離方法においては、水または緩衝液などの水溶液で膨潤させた担体１ｍＬに対して０．０１ｍｇ以上３０ｍｇ以下が好ましく、０．０５ｍｇ以上１０ｍｇ以下がより好ましい。前記タンパク質の固定化量は、本発明の複合脂質結合性担体を製造する際のタンパク質の使用量や不溶性担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。また、前記タンパク質の担体への固定化量は、固定化反応後のタンパク質溶液を回収して未反応の前記タンパク質を求めたのち、固定化反応に使用した前記タンパク質量から未反応の前記タンパク質量を差し引くことで算出することができる。
【0067】
本発明のリン脂質および／または細胞外小胞の検出方法は、以下の（Ｘ１）から（Ｘ３）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
（Ｘ１）カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｘ２）前記工程（Ｘ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｘ３）前記工程（Ｘ２）の終了後、前記工程（Ｘ１）で得られた複合体を検出する工程。
【0068】
以下に工程（Ｘ１）から工程（Ｘ３）を説明する。
【0069】
本発明の検出方法では、簡便な操作で効率的にリン脂質および／または細胞外小胞の検出が行なえる点で、磁性微粒子および／または平板上担体を用いることが好ましい。また、本発明の検出方法は、後述する工程（Ｘ１）から工程（Ｘ３）の操作を簡便に行なえる点で、後述する複合脂質結合性担体を含む検出試薬、および、当該検出試薬を含む細胞外小胞検出用キットを用いることが好ましく、当該検出用キットを用いて、通常の免疫学的測定法において、当業者が用いる方法を適宜選択して行なえばよい。
【0070】
本発明の検出方法における試料液は、複合脂質や細胞外小胞を含むものであれば特に制限はなく、生体組織、培養した細胞などの生体に由来するものや、培地や緩衝液等の溶液に複合脂質や細胞外小胞を溶解又は懸濁させたものであってもよい。
【0071】
複合脂質を含む試料液としては、具体的には、細胞および／または細胞外小胞の抽出物や破砕物を含む溶液を、また、細胞外小胞を含む試料液としては、例えば、血液、唾液、尿などの体液や、細胞培養上清を例示することができる。前記リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を調製するための溶液としては、カルシウムと結合して沈殿を生成する成分が含まれておらず、複合脂質や細胞外小胞を安定な状態で保持可能であり、かつ複合脂質結合性担体と複合脂質や細胞外小胞の結合を阻害しなければ特に制限はなく、具体的には、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．０以下の範囲で緩衝能を持つトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）や、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）を例示することができる。
【0072】
前記生理食塩水中の緩衝剤濃度に特に制限はなく、１ｍＭ以上２００ｍＭ以下の範囲で適宜選択すればよい。また、生理食塩水中に含まれる塩化ナトリウムなどの塩濃度にも特に制限はなく、１００ｍＭ以上２００ｍＭ以下の範囲で適宜選択すればよい。さらに、前記生理食塩水中には複合脂質や細胞外小胞の安定性を維持するための界面活性剤が含まれていてもよく、具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下の非イオン性界面活性剤、より具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００やＴｗｅｅｎ ２０（いずれも商品名）を例示することができる。
【0073】
本発明の検出方法における工程（Ｘ１）は、カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体と細胞外小胞が結合した複合体を得る工程である。検出感度が良い点で工程（Ｘ１）におけるカルシウムイオン濃度は０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることがより好ましい。また、工程（Ｘ１）で使用する試料液の量としては、複合脂質結合性担体として磁性微粒子を用いる場合は、前記担体１ｍｇに対して０．１ｍＬ以上１０００ｍＬ以下が好ましく、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下であることがより好ましい。複合脂質結合性担体として平板上担体を用いる場合は、１ウェルに対して２５μＬ以上３００μＬ以下が好ましく、５０μＬ以上１００μＬ以下であることがより好ましい。工程（Ｘ１）において、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させる温度は２℃以上３７℃以下が好ましく、２℃以上３０℃以下がより好ましい。また、接触時間は０．１時間以上２４時間以下が好ましく、１時間以上１２時間以下がより好ましい。
【0074】
本発明の検出方法における工程（Ｘ２）は、具体的には、工程（Ｘ１）で得られた複合体と試料液とを分離する分離工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含む工程である。工程（Ｘ２）における分離工程は、通常の免疫学的測定法におけるＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離方法であれば特に制限はなく、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。具体的には、複合脂質結合性担体として磁性微粒子を用いる場合は、工程（Ｘ１）で複合体形成工程を行なったのち、磁力を用いて複合体を集積させて試料液を除く方法を例示することができる。また、複合脂質結合性担体として平板上担体を用いる場合は、工程（Ｘ１）で複合体形成工程を行なった平板上担体から、ピペットまたはプレートウォッシャーを用いて試料液を除く方法を例示することができる。
【0075】
工程（Ｘ２）における洗浄工程は、前記分離工程で得られた複合体を、カルシウムイオンを含有する洗浄液を用いて洗浄する工程である。洗浄工程を行なうことにより、複合脂質結合性担体に結合した試料液中の夾雑物を除去することができる。工程（Ｘ２）における洗浄工程は、カルシウムイオンを含有する洗浄液を用いる以外は、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。具体的には、複合脂質結合性担体として磁性微粒子を用いる場合は、磁力を用いて複合体を集積させて洗浄する方法を例示することができる。また、複合脂質結合性担体として平板上担体を用いる場合は、ピペットまたはプレートウォッシャーを用いて洗浄する方法を例示することができる。
【0076】
工程（Ｘ２）における洗浄工程で使用するカルシウムイオンを含有する洗浄液は、前記分離工程で得られた複合体が安定であれば特に制限はなく、具体的には、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．０以下の範囲で緩衝能を持つＴＢＳやＨＢＳを例示することができる。前記洗浄液中のカルシウムイオン濃度は、前記分離工程で得られた複合体の安定性の点で０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることがより好ましい。また、前記洗浄液中には複合体の安定性を維持するための界面活性剤が含まれていてもよく、具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下の非イオン性界面活性剤、より具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００やＴｗｅｅｎ ２０（いずれも商品名）を例示することができる。
【0077】
本発明の検出方法における工程（Ｘ３）は、本発明の複合脂質結合性担体と試料液中のリン脂質および／または細胞外小胞との複合体を検出する工程である。工程（Ｘ３）における操作は、カルシウムイオンを含有し、且つ、カルシウムと結合して沈殿を生成する成分が含まれていない試薬類および測定溶液を用いる以外は、工程（Ｘ１）で得られた複合体の有無および／または複合体の量を検出できれば特に制限はなく、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。具体的には、エンザイムイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光・発光免疫測定法、フローサイトメトリー法を例示することができる。これらの中では、精度および感度の点で、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、であることがより好ましい。
【0078】
工程（Ｘ３）をＥＬＩＳＡ法またはフローサイトメトリー法により行なう場合も当業者が通常用いる方法で行なえばよく、具体的には、複合脂質または細胞外小胞に対して結合性を有する抗体を用いて、１次抗体を標識した標識１次抗体、当該１次抗体と当該１次抗体に対して結合する標識２次抗体、または当該１次抗体のビオチン標識物と当該１次抗体ビオチン標識物に対して結合する標識ストレプトアビジンを用いる方法を例示することができる。当該標識１次抗体、標識２次抗体及び標識ストレプトアビジンとしては、通常、ＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法の標識抗体／ストレプトアビジンに用いられるものであれば特に制限はなく、具体的には、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質で標識した蛍光標識抗体／ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した酵素標識抗体／ストレプトアビジンを例示することができる。これらの標識抗体／ストレプトアビジンに係る蛍光等は、当該標識抗体／ストレプトアビジンの標識方法に対応する公知の方法により測定すればよい。
【0079】
工程（Ｘ２）における検出工程で使用する標識１次抗体、１次抗体および標識２次抗体、または１次抗体ビオチン標識物および標識ストレプトアビジンの希釈倍率は、抗体の活性や濃度によって適宜選択すればよく、１０倍以上１０６倍以下に希釈することが好ましく、１０００倍以上１０５倍以下に希釈することがより好ましい。前記洗浄工程で得られた複合体と反応させる標識１次抗体、１次抗体および標識２次抗体、または１次抗体ビオチン標識物および標識ストレプトアビジン溶液の希釈溶液量は、複合脂質結合性担体として磁性微粒子を用いる場合は、前記担体１ｍｇに対して０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下であることが好ましく、０．１ｍＬ以上５０ｍＬ以下がより好ましい。
【0080】
また、複合脂質結合性担体として平板上担体を用いる場合は、１ウェルに対して１０μＬ以上３００μＬ以下が好ましく、３０μＬ以上１００μＬ以下がより好ましい。また、反応温度は２℃以上４０℃以下が好ましく、より好ましくは１０℃以上４０℃以下である。反応時間は０．５時間以上１２時間以下が好ましく、より好ましくは１時間以上４時間以下である。
【0081】
本発明のリン脂質および／または細胞外小胞の単離方法は、以下の（Ｙ１）から（Ｙ３）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
（Ｙ１）カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体とリン脂質および／または細胞外小胞が結合した複合体を得る工程。
（Ｙ２）前記工程（Ｙ１）で得られた複合体から、複合脂質結合性担体に結合しなかった物質を分離除去する工程。
（Ｙ３）前記工程（Ｙ２）の終了後、前記工程（Ｙ１）で得られた複合体からリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させ、リン脂質および／または細胞外小胞を回収する工程。
【0082】
以下に工程（Ｙ１）から工程（Ｙ３）を説明する。
【0083】
本発明の単離方法で用いる試料液は、前述した本発明の検出方法における試料液と同じである。また、本発明の単離方法では、簡便な操作で効率的にリン脂質および／または細胞外小胞の単離が行なえる点で、粒子状の複合脂質結合性担体を用いることが好ましく、その粒径は１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましい。また、後述する工程（Ｙ１）から工程（Ｙ３）の操作を簡便に行なえる点で、本発明の単離方法は、後述する複合脂質結合性担体を充填してなるカラム、および当該カラムを含む細胞外小胞単離キットを用いることが好ましく、当該単離用キットを用いて、通常のクロマトグラフィー法による生体由来物質の単離方法を適宜選択して行なえばよい。
【0084】
本発明の単離方法における工程（Ｙ１）は、カルシウムイオン存在下、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させ、該担体と細胞外小胞が結合した複合体を得る工程である。本発明の検出方法における工程（Ｘ１）と同様、工程（Ｙ１）におけるカルシウムイオン濃度は０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることがより好ましい。
【0085】
また、工程（Ｙ１）で使用する試料液の量としては、水で膨潤させた担体１ｍＬに対して１ｍＬ以上１０００ｍＬ以下が好ましく、１ｍＬ以上１００ｍＬ以下であることがより好ましい。工程（Ｙ１）において、本発明の複合脂質結合性担体と、リン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を接触させる温度は２℃以上３７℃以下が好ましく、２℃以上３０℃以下がより好ましい。また、接触時間は０．５時間以上２４時間以下が好ましく、１時間以上１２時間以下がより好ましい。
【0086】
本発明の単離方法における工程（Ｙ２）は、本発明の検出方法における工程（Ｘ２）と同様、工程（Ｙ１）で得られた複合体と試料液とを分離する分離工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含む工程である。工程（Ｙ２）における分離工程は、通常のタンパク質や脂質などの生体由来物質の分離精製操作における分離方法であれば特に制限はなく、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。
【0087】
工程（Ｙ２）における洗浄工程は、前記分離工程で得られた複合体を、カルシウムイオンを含有する洗浄液を用いて洗浄する工程である。洗浄工程を行なうことにより、複合脂質結合性担体に結合した試料液中の夾雑物を除去することができる。工程（Ｙ２）における洗浄工程は、カルシウムイオンを含有する洗浄液を用いる以外は、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。具体的には、工程（Ｙ１）で得られた複合体が充填されたカラムに、カルシウムイオンを含有する洗浄液を添加する方法を例示することができる。
【0088】
工程（Ｙ２）における洗浄工程で使用するカルシウムイオンを含有する洗浄液は、前記分離工程で得られた複合体が安定であれば特に制限はなく、具体的には、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．０以下の範囲で緩衝能を持つＴＢＳやＨＢＳを例示することができる。前記洗浄液中のカルシウムイオン濃度は、前記分離工程で得られた複合体の安定性の点で０．１ｍＭ以上１００ｍＭであることが好ましく、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることがより好ましい。また、前記洗浄液中には複合体の安定性を維持するための界面活性剤が含まれていてもよく、具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下の非イオン性界面活性剤、より具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００やＴｗｅｅｎ ２０（いずれも商品名）を例示することができる。
【0089】
本発明の単離方法における工程（Ｙ３）は、具体的には、前述した工程（Ｙ１）および工程（Ｙ２）で得られた複合体に対して、複合体を解離させる操作を行なうことによりリン脂質および／または細胞外小胞を脱着させて回収する工程である。前記複合体を解離させる操作は、細胞外小胞の構造を壊すことなく担体から解離できればよく、具体的には、複合体とタンパク質を変性することができる界面活性剤とを接触させる方法や、複合体中のカルシウムイオン濃度を低下させる方法を例示することができる。
【0090】
前記複合体と界面活性剤を接触させる方法では、工程（Ｙ２）で洗浄した複合体と、前述したＴＢＳやＨＢＳなどの緩衝生理食塩水に界面活性剤を添加した溶液を接触させ、複合脂質結合性タンパク質を変性させることにより、リン脂質および／または細胞外小胞を回収することができる。前記界面活性剤は、当業者がタンパク質を変性させるために通常用いる界面活性剤であればよく、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００やＴｗｅｅｎ ２０（いずれも商品名）などの非イオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）などの両イオン性界面活性剤を例示することができる。
【0091】
これらの中では、低濃度でタンパク質を変性させることができる点で、ＳＤＳが好ましい。前記緩衝生理食塩水中の界面活性剤の濃度は、複合脂質結合性タンパク質の安定性を考慮して、０．０１％（ｗ／ｖ）以上１０％（ｗ／ｖ）以下の範囲で適宜選択すればよい。また、前記界面活性剤を含む緩衝生理食塩水と複合体とを接触させる温度や時間に特に制限はない。温度は２℃以上４０℃以下が好ましく、より好ましくは１０℃以上４０℃以下である。時間は１分間以上６０分間以下が好ましく、より好ましくは５分間以上３０分間以下である。
【0092】
前記複合体中のカルシウムイオン濃度を低下させる方法では、工程（Ｙ２）で洗浄した複合体と、複合体中のカルシウムイオン濃度を低下させることができる溶液を接触させ、複合体を解離させることにより、リン脂質および／または細胞外小胞を脱着させて回収することができる。前記複合体中のカルシウムイオン濃度を低下させることができる溶液としては、前述したＴＢＳやＨＢＳなどのカルシウムイオンを含まない緩衝液や、ＴＢＳやＨＢＳにカルシウムイオンキレート剤を添加した緩衝液を例示することができるが、これらの中では高効率に複合体中のカルシウムイオンを低下させることができる点で、カルシウムイオンキレート剤を添加した緩衝液であることが好ましい。
【0093】
前記カルシウムイオンキレート剤としては、カルシウムイオンとキレート結合を形成することができれば特に制限はなく、具体的には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）を例示することができる。これらの中では、カルシウムイオンとの結合性の点で、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡが好ましい。
【0094】
前記緩衝生理食塩水中のカルシウムイオンキレート剤の濃度は、前記複合体の安定性を考慮して、０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下の範囲で適宜選択すればよい。また、前記カルシウムイオンキレート剤を含む緩衝生理食塩水と複合体とを接触させる温度や時間に特に制限はないが、温度は２℃以上４０℃以下が好ましく、より好ましくは１０℃以上４０℃以下である。時間は１分間以上６０分間以下が好ましく、より好ましくは５分間以上３０分間以下である。
【0095】
本発明の単離方法における工程（Ｙ３）で回収されたリン脂質および／または細胞外小胞が目的物であるかどうかの確認は、本発明の検出方法やウェスタンブロッティングなどの当業者が通常用いる方法により、必要に応じて行なえばよい。本発明の単離方法によって得られた細胞外小胞は、試料液がヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養液であった場合、例えば、文献（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２９巻、１４０－１５１頁、２０１４年）に記載されているような、治療薬としてのＭＳＣ－エクソソームの原料として、好適に使用されることが期待できる。
【0096】
次に、本発明の複合脂質結合性担体を含む検出試薬（以降、本発明の検出試薬とする。）、および、当該検出試薬を含む細胞外小胞検出用キット（以降、本発明の細胞外小胞検出用キットとする。）について説明する。本発明の検出試薬は、本発明の複合脂質結合性担体の他に、前述した複合脂質結合性担体と試料液中のリン脂質および／または細胞外小胞との複合体を検出するための標識１次抗体、標識２次抗体、標識ストレプトアビジン、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、アルブミンや界面活性剤などの安定化剤などが含まれていてもよい。
【0097】
また、本発明の細胞外小胞検出用キットには、前述した検出試薬以外に、通常、当該技術分野で使用される一般的な試薬類が含まれていても良く、具体的には、前述したリン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を調製するための緩衝生理食塩水およびカルシウムイオン水溶液、カルシウムイオン含有洗浄液、界面活性剤を含む緩衝生理食塩水などの水溶液、カルシウムイオンキレート剤を含む緩衝生理食塩水などの水溶液、酵素標識抗体／ストレプトアビジンを検出するための基質液および反応停止液、測定対象物質に対して検量線を作成するために使用される標準品を例示することができる。加えて、本発明の検出方法および試薬類の取扱い方法などを記載した説明書が含まれていてもよい。
【0098】
次に、本発明の複合脂質結合性担体を充填してなるカラム（以降、本発明のカラムとする。）、および、当該カラムを含む細胞外小胞単離用キット（以降、本発明の細胞外小胞単離用キットとする。）について説明する。本発明のカラムは、前述した細胞外小胞の単離方法を実施することができれば、その容量や形状に特に制限はなく、容量については、細胞外小胞を含む試料液の添加量や、複合脂質結合性担体の細胞外小胞結合量などによって決定した量の担体を、処理時間などを考慮して決定した大きさや形状のカラムに充填して行なえばよい。
【0099】
また、カラムの形状は、細胞外小胞を含む試料液の添加量や処理時間に応じて、カラム上端部が開放されている開放系カラムや、カラム両端部が閉鎖されている閉鎖系カラムなどを適宜選択すればよく、試料液の添加量が少ない場合は開放系カラムを、試料液の添加量が多く、短時間で処理したい場合はＨＰＬＣ装置と接続することが可能な、両端部が閉鎖されている閉鎖系カラムが好ましい。
【0100】
また、本発明の細胞外小胞単離用キットには、前述したカラム以外に、通常、当該技術分野で使用される一般的な試薬類が含まれていても良く、具体的には、前述したリン脂質および／または細胞外小胞を含む試料液を調製するための緩衝生理食塩水およびカルシウムイオン水溶液、カルシウムイオン含有洗浄液、界面活性剤を含む緩衝生理食塩水などの水溶液、カルシウムイオンキレート剤を含む緩衝生理食塩水を例示することができる。さらに、通常、当該技術分野で使用される一般的な器具類が含まれていても良く、具体的には、試料液をカラムに注入するためのシリンジおよびアダプター、カラムから脱着した細胞外小胞を回収するためのマイクロチューブを例示することができる。加えて、本発明の単離方法および試薬類や器具類の取扱い方法などを記載した説明書が含まれていてもよい。
【発明の効果】
【0101】
本発明の複合脂質結合性担体は、リン脂質などの複合脂質、および／または、リン脂質などの複合脂質が表面に存在する細胞外小胞に結合性を有するタンパク質を不溶性担体に固定化したものであり、当該担体を用いることにより、細胞外小胞を含む生体物質含有試料液から細胞外小胞を選択的に高感度かつ高精度に検出することができる。また、本発明の複合脂質結合性担体を充填したカラムに細胞外小胞を含む生体物質含有試料液を通液して細胞外小胞を担体に吸着させたのち、キレート剤で処理することにより、簡便な操作で大量の高純度な細胞外小胞を単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【0102】
【図1】参考例３において、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出性能のカルシウムイオン濃度依存性を示す図。
【図2】参考例３において、組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出性能のカルシウムイオン濃度依存性を示す図。
【図3】参考例４において、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出サンドイッチＥＬＩＳＡの検量線を示す図。
【図4】参考例４において、組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出サンドイッチＥＬＩＳＡの検量線を示す図。
【図5】実施例１５において、組換えタンパク質を固定化していない担体と、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）を固定化した担体からの回収液のウェスタンブロッティングを示す図。
【図6】実施例１５において、組換えタンパク質を固定化していない担体と、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）を固定化した担体からの回収液のウェスタンブロッティングを示す図。
【図7】参考例５において、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）、ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）およびｒＰＫＣｇＣ２（配列番号２１）のＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ ＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【図8】参考例５において、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１９）およびｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）のＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ ＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【図9】参考例６において、膜脂質ストリップを用いた組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）の複合脂質結合性を示す図。
【図10】参考例６において、膜脂質ストリップを用いた組換えタンパク質ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）の複合脂質結合性を示す図。
【図11】実施例１７において、本発明の複合脂質結合性担体を用いた培養上清中の細胞外小胞の分離結果を示す図。
【図12】実施例１８において、本発明の複合脂質結合性担体を用いた培養上清中の細胞外小胞の分離結果を示す図。
【実施例0103】
以下、作製例、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターおよびそれらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の作製
タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表１に示した６種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、特開２０１８－００００３８号公報などで開示されている一般的な方法により各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（１）タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターおよびそれらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の作製
タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表１に示した６種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、特開２０１８－００００３８号公報などで開示されている一般的な方法により各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
【0104】
［実施例１］
実施例１はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２のアミノ酸配列は配列番号５（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に相当し、その１５５番目から１６０番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号６）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２を作製した。
実施例１はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２のアミノ酸配列は配列番号５（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に相当し、その１５５番目から１６０番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号６）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２を作製した。
【0105】
［実施例２］
実施例２はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴ（グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ）タンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１５３番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５５番目から３７０番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７３番目から３７８番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを作製した。
実施例２はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴ（グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ）タンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１５３番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５５番目から３７０番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７３番目から３７８番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＧＳＴを作製した。
【0106】
［実施例３］
実施例３はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴとの融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号９（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１７９番目はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの下流のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ１７２５２の２９４番目から３３１番目の領域のアミノ酸配列）に、１９３番目から４０８番目は配列番号４のアミノ酸配列に、４１１番目から４１６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１０）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを作製した。
実施例３はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴとの融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号９（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４２番目から１７９番目はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインの下流のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ１７２５２の２９４番目から３３１番目の領域のアミノ酸配列）に、１９３番目から４０８番目は配列番号４のアミノ酸配列に、４１１番目から４１６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１０）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－Ｌ－ＧＳＴを作製した。
【0107】
［実施例４］
実施例４はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６６番目から３８１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８４番目から３８９番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１２）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを作製した。
実施例４はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６６番目から３８１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８４番目から３８９番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１２）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを作製した。
【0108】
［実施例５］
実施例５はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１３（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１５２番目から１６５番目はαヘリックスリンカー（配列番号４２）に、１７１番目から３８６番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８９番目から３９４番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１４）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを作製した。
実施例５はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１３（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１５２番目から１６５番目はαヘリックスリンカー（配列番号４２）に、１７１番目から３８６番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８９番目から３９４番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１４）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｈ－ＧＳＴを作製した。
【0109】
［実施例６］
実施例６はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２のアミノ酸配列は配列番号１５（その４番目から２１９番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２２番目から２３５番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、２４１番目から３７９番目は配列番号１のアミノ酸配列に、３８２番目から３８７番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１６）を含む発現ベクターをｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を作製した。
実施例６はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２のアミノ酸配列は配列番号１５（その４番目から２１９番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２２番目から２３５番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、２４１番目から３７９番目は配列番号１のアミノ酸配列に、３８２番目から３８７番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１６）を含む発現ベクターをｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＧＳＴ－ｇｓ－ＰＫＣａＣ２を作製した。
【0110】
【表1】
【0111】
（２）タンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターおよびそれらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の作製
タンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表２に示した２種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
タンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表２に示した２種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
【0112】
［実施例７］
実施例７はタンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣｂＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｂＣ２のアミノ酸配列は配列番号１７（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｂＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｂＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｂＣ２を作製した。
実施例７はタンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣｂＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｂＣ２のアミノ酸配列は配列番号１７（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号１８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｂＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｂＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｂＣ２を作製した。
【0113】
［実施例８］
実施例８はタンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１９（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に、１４７番目から１６０番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６７番目から３８２番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８５番目から３９０番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２０）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｂ２－ｇｓ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを作製した。
実施例８はタンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号１９（その２番目から１４２番目までは配列番号２のアミノ酸配列に、１４７番目から１６０番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６７番目から３８２番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３８５番目から３９０番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２０）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｂ２－ｇｓ－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを作製した。
【0114】
【表2】
【0115】
（３）タンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターおよびそれらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の作製
タンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表３に示した２種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
タンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質発現ベクターは、タンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターであり、具体的には、表３に示した２種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
【0116】
［実施例９］
実施例９はタンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｇＣ２のアミノ酸配列は配列番号２１（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２２）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｇＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｇＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｇＣ２を作製した。
実施例９はタンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインの組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２を発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｇＣ２のアミノ酸配列は配列番号２１（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に相当し、その１５６番目から１６１番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２２）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｇＣ２とした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｇＣ２を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｇＣ２を作製した。
【0117】
［実施例１０］
実施例１０はタンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号２３（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に、１４３番目から１５４番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５６番目から３７１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７４番目から３７９番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２４）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを作製した。
実施例１０はタンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質との融合タンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号２３（その２番目から１４２番目までは配列番号３のアミノ酸配列に、１４３番目から１５４番目は発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト由来の配列に、１５６番目から３７１番目は配列番号４のアミノ酸配列に、３７４番目から３７９番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２４）を含む発現ベクターをｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴを作製した。
【0118】
【表3】
【0119】
［実施例１１］ 組換えタンパク質の製造
前記（１）から（３）で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（表１から３）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．５ｍＭ添加したのち、５時間培養することで各組換えタンパク質（表１から表３に記載した１０種類の組換えタンパク質）を発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。
前記（１）から（３）で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（表１から３）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．５ｍＭ添加したのち、５時間培養することで各組換えタンパク質（表１から表３に記載した１０種類の組換えタンパク質）を発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。
【0120】
（４）種々のタンパク質発現ベクターおよびそれらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の作製
タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質（比較例２）発現ベクターおよびタンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインを含まないタンパク質（比較例１および３）発現ベクターを作製した。具体的には、表４に示した比較例１から３とする、３種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質（比較例２）発現ベクターおよびタンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインを含まないタンパク質（比較例１および３）発現ベクターを作製した。具体的には、表４に示した比較例１から３とする、３種類の発現ベクターである。発現ベクターはｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）を用い、（１）と同様にして各発現ベクターを作製し、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
【0121】
［比較例１］
比較例１はＧＳＴの組換えタンパク質ｒＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号２５（その３番目から２１８番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２１番目から２２６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２６）を含む発現ベクターをｐＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＧＳＴを作製した。
比較例１はＧＳＴの組換えタンパク質ｒＧＳＴを発現させるための発現ベクターであり、ｒＧＳＴのアミノ酸配列は配列番号２５（その３番目から２１８番目までは配列番号４のアミノ酸配列に、２２１番目から２２６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２６）を含む発現ベクターをｐＧＳＴとした。さらに、発現ベクターｐＧＳＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＧＳＴを作製した。
【0122】
［比較例２］
比較例２はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとマルトース結合タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）を構成するアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＥＥＲ８２４５０６３の２７番目から３９２番目の配列）との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰのアミノ酸配列は配列番号２７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６５番目から５３０番目はＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列に、５３３番目から５３８番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを作製した。
比較例２はタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとマルトース結合タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）を構成するアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＥＥＲ８２４５０６３の２７番目から３９２番目の配列）との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを発現させるための発現ベクターであり、ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰのアミノ酸配列は配列番号２７（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６５番目から５３０番目はＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列に、５３３番目から５３８番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号２８）を含む発現ベクターをｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰとした。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＭＢＰを作製した。
【0123】
［比較例３］
比較例３はＭＢＰの組換えタンパク質ｒＭＢＰを発現させるための発現ベクターであり、ｒＭＢＰのアミノ酸配列は配列番号２９（その３番目から３６８番目まではＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列に、３７１番目から３７６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３０）を含む発現ベクターをｐＭＢＰとした。さらに、発現ベクターｐＭＢＰを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＭＢＰを作製した。
比較例３はＭＢＰの組換えタンパク質ｒＭＢＰを発現させるための発現ベクターであり、ｒＭＢＰのアミノ酸配列は配列番号２９（その３番目から３６８番目まではＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列に、３７１番目から３７６番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３０）を含む発現ベクターをｐＭＢＰとした。さらに、発現ベクターｐＭＢＰを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体ＥＣ／ｐＭＢＰを作製した。
【0124】
【表4】
【0125】
［比較例４］ 組換えタンパク質の製造
前記（４）で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（表４）について、前記実施例１１に記載の方法により発現培養を行ない、組換えタンパク質を調製した。
前記（４）で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（表４）について、前記実施例１１に記載の方法により発現培養を行ない、組換えタンパク質を調製した。
【0126】
［参考例１］ 各種細胞培養上清由来の細胞外小胞の調製
表５の条件ａ～ｇに示した細胞株を、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５、１００ＫＤａ （Ｍｅｒｃｋ製）で限外ろ過したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％（ｖ／ｖ）添加した表５に記載された培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下にて４８時間培養した後に、以下の方法で細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ、およびｓｍａｌｌ ＥＶ）を回収した。
表５の条件ａ～ｇに示した細胞株を、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５、１００ＫＤａ （Ｍｅｒｃｋ製）で限外ろ過したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％（ｖ／ｖ）添加した表５に記載された培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下にて４８時間培養した後に、以下の方法で細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ、およびｓｍａｌｌ ＥＶ）を回収した。
【0127】
［１］培養液６０ｍＬを、４℃、２０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。
【0128】
［２］上記の遠心上清を、４℃、１６０００×ｇで３０分間遠心し、上清と沈殿を分離した。
【0129】
［３］上記［２］で得られた沈殿にＰＢＳを６０ｍＬ添加し、４℃、１６０００×ｇで３０分間遠心し、上清を除去して沈殿を回収した。
【0130】
［４］上記［３］で得られた沈殿にＰＢＳを２００μＬ添加し、ピペッティングにより懸濁し、１６０００×ｇ画分の細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ）を回収した。
【0131】
［５］上記［２］で得られた遠心上清を、４℃、１０００００×ｇで１６時間超遠心を行ない、上清を除去して沈殿を回収した。
【0132】
［６］上記［５］で得られた超遠心沈殿にＰＢＳを６０ｍＬ添加し、４℃、１０００００×ｇで３時間超遠心を行ない、上清を除去して沈殿を回収した。
【0133】
［７］上記［６］で得られた超遠心沈殿にＰＢＳを２００μＬ添加し、ピペッティングにより懸濁し、１０００００×ｇ画分の細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を回収した。
【0134】
【表5】
【0135】
［参考例２］ 細胞外小胞のタンパク質濃度定量
参考例１で調製した細胞外小胞のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、以下の方法で測定した。
参考例１で調製した細胞外小胞のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、以下の方法で測定した。
【0136】
［１］ＢＣＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ＡとＢＣＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂを５０：１で混合してＷｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＷＲ）を調製した。
【0137】
［２］濃度既知のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準液をＰＢＳで希釈し、終濃度が１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、および０μｇ／ｍＬとなるように希釈系列を作製した。
【0138】
［３］９６ウェルマイクロプレートに、上記［２］で調製したＢＳＡ標準液の希釈系列および細胞外小胞溶液を、１ウェルあたり２５μＬずつ、各サンプルについて２ウェルに分注した。
【0139】
［４］上記［１］で調製したＷＲを２００μＬ／ウェル添加して、直ちに３０秒間振盪撹拌した後、プレートに蓋をして３７℃で３０分間インキュベートした。
【0140】
［５］プレートを室温に戻した後、吸光プレートリーダーにて５６２ｎｍの吸光度を測定した。
【0141】
［６］吸光度からブランク（０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ標準液の吸光度）を差し引いた補正値を用いて、ＢＳＡ標準液の希釈系列の値から検量線を作成した。この検量線を用いて、細胞外小胞溶液に含まれるタンパク質濃度を算出した。
【0142】
［実施例１２］ タンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を固定化したＥＬＩＳＡプレートによる細胞外小胞検出性能の評価
実施例１１で製造した組換えタンパク質を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの具体的な操作方法を以下に示す。
実施例１１で製造した組換えタンパク質を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの具体的な操作方法を以下に示す。
【0143】
［１］Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）で希釈したタンパク質を、１ウェルあたり５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して固定化した。
【0144】
［２］ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、ブロッキング溶液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。
【0145】
［３］ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、各リガンドタンパク質を固定化したウェルに対して、希釈液（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈した測定試料を、それぞれ５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置した。
【0146】
［４］洗浄液（２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４）により３回洗浄を行ない、希釈液で希釈したビオチン標識検出抗体を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。
【0147】
［５］洗浄液により３回洗浄を行ない、希釈液で５００００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。
【0148】
［６］洗浄液により３回洗浄を行ない、基質液（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ、ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１０分間静置した。
【0149】
［７］１Ｍリン酸水溶液を５０μＬ／ウェル添加して反応を停止した。
【0150】
［８］吸光プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0151】
［比較例５］ 比較例４で製造した種々の組換えタンパク質を固定化したＥＬＩＳＡプレートによる細胞外小胞検出性能の評価
比較例４で製造した組換えタンパク質を固定化したマイクロプレート若しくはタンパク質を固定化しないマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。
比較例４で製造した組換えタンパク質を固定化したマイクロプレート若しくはタンパク質を固定化しないマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。
【0152】
実施例１２および比較例５の評価条件と結果を表６に示す。
【0153】
【表6】
【0154】
マイクロプレートに固定化された組換えタンパク質がタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む条件ａ～ｆのうち、Ｃ２ドメインのＮ末端側またはＣ末端側にＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列を融合した組換えタンパク質を用いた条件ｂ～ｆにおいて細胞外小胞が存在する場合に吸光度が増大し、これらの組換えタンパク質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって細胞外小胞を検出可能であることが示された。これらのうち条件ｂ～ｅで使用した組換えタンパク質は、Ｎ末端側に存在するタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメイン（配列番号１のアミノ酸配列に相当）とＣ末端側に存在するＧＳＴタンパク質（配列番号４のアミノ酸配列に相当）の間にはさまれたアミノ酸配列が異なるものであるが、これらを比較すると、タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインとＧＳＴタンパク質の間をＧＳリンカー（配列番号４１）で連結した場合（条件ｄ、配列番号１１）に最も高い細胞外小胞検出性能が得られた。また条件ｄおよびｆは、ＧＳＴタンパク質をタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのＣ末端側に融合した組換えタンパク質（条件ｄ、配列番号１１）とＮ末端側に融合した組換えタンパク質（条件ｆ、配列番号１５）を比較したものであるが、どちらも同程度の感度で細胞外小胞を検出可能であった。
【0155】
組換えタンパク質がタンパク質リン酸化酵素βのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む条件ｇおよびｈのうち、Ｃ２ドメインのＣ末端側にＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列を融合した組換えタンパク質を用いた条件ｈ（配列番号１９）において細胞外小胞が存在する場合に吸光度が増大し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって細胞外小胞を検出可能であることが示された。
【0156】
組換えタンパク質がタンパク質リン酸化酵素γのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む条件ｉおよびｊのうち、Ｃ２ドメインのＣ末端側にＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列を融合した組換えタンパク質を用いた条件ｊ（配列番号２３）において細胞外小胞が存在する場合に吸光度が増大し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって細胞外小胞を検出可能であることが示された。
【0157】
一方で、マイクロプレートに固定化された組換えタンパク質がタンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインを含まない場合（条件ｋ（配列番号２５）およびｍ（配列番号２９））およびタンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのＣ末端側にＭＢＰタンパク質のアミノ酸配列を融合した場合（条件ｌ、配列番号２７）、ならびにマイクロプレートにタンパク質を固定化しない場合（条件ｎ）においてはいずれも、細胞外小胞が存在しても吸光度が増大しなかった。
【0158】
［実施例１３］ 各種細胞株から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）検出性能の評価
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１１）を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体３種類（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、いずれもフロンティア研究所製）を用いて、参考例１において各種細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表７に示す。
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１１）を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体３種類（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、いずれもフロンティア研究所製）を用いて、参考例１において各種細胞の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表７に示す。
【0159】
【表7】
【0160】
組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを固定化したプレートは、ビオチン標識検出抗体としてＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１いずれかの抗テトラスパニン抗体を用いることによって、本実施例で使用した細胞株が異なるｓｍａｌｌ ＥＶのいずれも検出可能であることが示された。
【0161】
［実施例１４］ 細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ）検出性能の評価
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１１）を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体３種類（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、いずれもフロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞（表５の条件ａ）およびＡＧＳ細胞（表５の条件ｄ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表８に示す。
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１１）を固定化したマイクロプレートおよびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体３種類（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、いずれもフロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞（表５の条件ａ）およびＡＧＳ細胞（表５の条件ｄ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｌａｒｇｅ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表８に示す。
【0162】
【表8】
【0163】
組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ｇｓ－ＧＳＴを固定化したプレートは、ビオチン標識検出抗体としてＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１いずれかの抗テトラスパニン抗体を用いることによって、２９３Ｔ細胞およびＡＧＳ細胞の培養上清から精製したｌａｒｇｅ ＥＶを検出可能であることが示された。
【0164】
［参考例３］ 組換えタンパク質を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出性能のカルシウムイオン濃度依存性
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）若しくはｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１においてＡＧＳ細胞（表５の条件ｄ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様であるが、希釈液および洗浄液に含まれるＣａＣｌ２の濃度を表９に記載の通りとした。評価条件と結果を表９に示す。
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）若しくはｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１においてＡＧＳ細胞（表５の条件ｄ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様であるが、希釈液および洗浄液に含まれるＣａＣｌ２の濃度を表９に記載の通りとした。評価条件と結果を表９に示す。
【0165】
【表9】
【0166】
組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴおよびｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴのそれぞれについて、吸光度を最小値が０、最大値が１となるように正規化してＣａＣｌ２濃度に対してプロットしたものを図１および図２にそれぞれ示す。
【0167】
条件ａ～ｈにおいて、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）を固定化したプレートは、図１に示す通り、希釈液および洗浄液に含まれるＣａＣｌ２濃度が１×１０－５Ｍ、すなわち０．０１ｍＭ以上の場合に細胞外小胞の検出が可能となり、２×１０－３Ｍ、すなわち２ｍＭ以上の場合に検出性能が最大となることが示された。
【0168】
また条件ｉ～ｐにおいて、ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したプレートは、図２に示す通り、希釈液および洗浄液に含まれるＣａＣｌ２濃度が１×１０－５Ｍ、すなわち０．０１ｍＭ以上の場合に細胞外小胞の検出が可能となり、１×１０－４Ｍ、すなわち０．１ｍＭ以上の場合に検出性能が最大となることが示された。
【0169】
［参考例４］ 組換えタンパク質を固定化したマイクロプレートによる細胞外小胞検出サンドイッチＥＬＩＳＡの検量線
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）若しくはｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞（表５の条件ａ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表１０に示す。
実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）若しくはｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）を固定化したマイクロプレート、およびビオチン標識した市販の抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、フロンティア研究所製）を用いて、参考例１において２９３Ｔ細胞（表５の条件ａ）の培養上清から調製した細胞外小胞（ｓｍａｌｌ ＥＶ）を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。サンドイッチＥＬＩＳＡの操作方法は実施例１２と同様である。評価条件と結果を表１０に示す。
【0170】
【表10】
【0171】
組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴおよびｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴのそれぞれについて作成した検量線を図３および図４にそれぞれ示す。本参考例におけるサンドイッチＥＬＩＳＡの条件において、１ｎｇ以上１０００ｎｇ以下の範囲で細胞外小胞を定量的に検出可能であることが示された。
【0172】
［実施例１５］ ポリエチレングリコール固定化担体を用いた複合脂質結合性担体による細胞外小胞の単離
（１）組換えタンパク質の製造
実施例１および実施例１１と同様の方法により、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２のＣ末端に、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列と１個のシステイン残基からなるアミノ酸配列（配列番号３９）を付加した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣを製造した。同様に、実施例２および実施例１１と同様の方法により、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴのＣ末端に、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列と１個のシステイン残基からなるアミノ酸配列（配列番号３９）を付加した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣを製造した。製造した２種類のタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５、１０ＫＤａ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いた限外ろ過によりＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製）に置換した。
（１）組換えタンパク質の製造
実施例１および実施例１１と同様の方法により、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２のＣ末端に、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列と１個のシステイン残基からなるアミノ酸配列（配列番号３９）を付加した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣを製造した。同様に、実施例２および実施例１１と同様の方法により、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴのＣ末端に、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列と１個のシステイン残基からなるアミノ酸配列（配列番号３９）を付加した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣを製造した。製造した２種類のタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５、１０ＫＤａ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いた限外ろ過によりＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製）に置換した。
【0173】
（２）ポリエチレングリコール固定化反応性不溶性担体の製造
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（Ｃｙｔｉｖａ製、粒径２０μｍ～８０μｍ）は、水で膨潤させたのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。１００ｍＬ容のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製容器に２．５ｇ（ろ過後の含水重量）のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）、５．０ｍＬの水、０．５ｍＬのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル（デナコールＥＸ－８２１、ナガセケムテックス製）、５２μＬの４８％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ水溶液を添加（最終濃度：０．５％（ｗ／ｖ））したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で６時間振盪することによりエポキシ化を行なった。
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（Ｃｙｔｉｖａ製、粒径２０μｍ～８０μｍ）は、水で膨潤させたのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。１００ｍＬ容のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製容器に２．５ｇ（ろ過後の含水重量）のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）、５．０ｍＬの水、０．５ｍＬのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル（デナコールＥＸ－８２１、ナガセケムテックス製）、５２μＬの４８％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ水溶液を添加（最終濃度：０．５％（ｗ／ｖ））したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で６時間振盪することによりエポキシ化を行なった。
【0174】
反応終了後、担体をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、エポキシ化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ全量を１００ｍＬ容のＰＴＦＥ製容器に添加した。次に、反応容器に５．０ｍＬの水と１６６．５μＬのエチレンジアミン（濃度：０．５Ｍ、東京化成製無水エチレンジアミンから調製）を添加したのち、振盪機内で４０℃、１２０ｒｐｍの条件で１５時間振盪することによりアミノ化を行なった。反応終了後、担体をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、アミノ化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ全量を１００ｍＬ容のＰＴＦＥ製容器に添加した。
【0175】
次に、反応容器に５．０ｍＬの３－マレイミドプロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（富士フイルム和光純薬製）のＤＭＳＯ溶液（濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したのち、振盪機内で３５℃、１２０ｒｐｍの条件で４時間振盪することによりマレイミド化を行なった。反応終了後、担体をグラスフィルター上で２０ｍＬのＤＭＳＯで３回、３０ｍＬの水で５回洗浄することにより、目的のポリエチレングリコール固定化反応性不溶性担体である。マレイミド化Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅを作製した。
【0176】
（３）複合脂質結合担体の製造
複合脂質結合担体の製造に使用する組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣおよび組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣのＤ－ＰＢＳ（－）溶液に、最終濃度が０．５ｍＭとなるようトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）水溶液（濃度：０．１Ｍ）を添加して室温で１時間放置して還元処理を行ない、複合脂質結合担体製造用の組換えタンパク質溶液を調製した。
複合脂質結合担体の製造に使用する組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣおよび組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣのＤ－ＰＢＳ（－）溶液に、最終濃度が０．５ｍＭとなるようトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）水溶液（濃度：０．１Ｍ）を添加して室温で１時間放置して還元処理を行ない、複合脂質結合担体製造用の組換えタンパク質溶液を調製した。
【0177】
マレイミド化Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅの５０％（ｗ／ｖ）スラリー（１００μＬ）を反応容器（ミニバイオスピンクロマトグラフィー用カラム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）に添加した（ゲル体積：５０μＬ）。１５０μＬの固定化用緩衝液（０．２Ｍ Ｎａ３ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加し、遠心分離により反応性不溶性担体を緩衝液で置換した（同様の操作を４回繰り返し）。
【0178】
次に、マレイミド化Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅが入った反応容器に、予め調製した複合脂質結合担体製造用の組換えタンパク質溶液５０μＬ（濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ－担体）を添加し、４℃で終夜撹拌振盪することにより組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣを固定化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（以降、ｒＰＫＣａＣ２－Ｓｅｐｈａｄｅｘとする。）および組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣを固定化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ（以降、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘとする。）を製造した。
【0179】
固定化反応終了後、反応容器をスピンダウンして反応液を回収し、続いて、反応容器にＤ－ＰＢＳ（－）を１５０μＬ添加し、５分間撹拌振盪した後、スピンダウンして洗浄する作業を３回繰り返すことにより、合計０．５ｍＬの反応液と洗浄液を回収した。回収した洗浄液中の組換えタンパク質の濃度をＭｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて測定し、担体製造時に仕込んだ組換えタンパク質量から回収した組換えタンパク質量を差し引くことにより担体１ｍＬ当りの組換えタンパク質固定化量を算出した結果、表１１に示す通り、ｒＰＫＣａＣ２－ＳｅｐｈａｄｅｘにおけるｒＰＫＣａＣ２－６ＨＣの固定化量は０．３４ｍｇ／ｍＬ、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－ＳｅｐｈａｄｅｘにおけるｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－６ＨＣの固定化量は０．２４ｍｇ／ｍＬであり、目的とする複合脂質結合担体が製造できていることが明らかとなった。
【0180】
【表11】
【0181】
（４）複合脂質結合性担体による細胞外小胞の単離
［４－１］複合脂質結合性担体の洗浄
前記（３）で製造したｒＰＫＣａＣ２－ＳｅｐｈａｄｅｘおよびｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘの５０％（ｗ／ｖ）スラリー（４０μＬ）を１．５ｍＬチューブに添加した（担体の体積：２０μＬ）。１５０μＬの２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ溶液（ＴＢＳ溶液の組成：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、タッピング、スピンダウンによる分離、上清廃棄の操作を４回繰り返すことによって、担体を洗浄した。比較対照として、組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅも同様の操作を行なった。
［４－１］複合脂質結合性担体の洗浄
前記（３）で製造したｒＰＫＣａＣ２－ＳｅｐｈａｄｅｘおよびｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘの５０％（ｗ／ｖ）スラリー（４０μＬ）を１．５ｍＬチューブに添加した（担体の体積：２０μＬ）。１５０μＬの２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ溶液（ＴＢＳ溶液の組成：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、タッピング、スピンダウンによる分離、上清廃棄の操作を４回繰り返すことによって、担体を洗浄した。比較対照として、組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅも同様の操作を行なった。
【0182】
［４－２］複合脂質結合性担体への細胞外小胞の吸着
次に、洗浄したｒＰＫＣａＣ２－ＳｅｐｈａｄｅｘおよびｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘに、２０μＬのヒト由来精製細胞外小胞（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ、ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ製）を含む懸濁液（前記エクソソーム２μＬと、２ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ溶液１８μＬの混合物）を添加し、４℃の冷蔵庫内に設置したチューブローテーター（アズワン製、型番ＴＲ－３５０）を利用して、３時間反応させた。また、比較対照として、組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅについても同様の操作を行なった。
次に、洗浄したｒＰＫＣａＣ２－ＳｅｐｈａｄｅｘおよびｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘに、２０μＬのヒト由来精製細胞外小胞（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ、ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ製）を含む懸濁液（前記エクソソーム２μＬと、２ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ溶液１８μＬの混合物）を添加し、４℃の冷蔵庫内に設置したチューブローテーター（アズワン製、型番ＴＲ－３５０）を利用して、３時間反応させた。また、比較対照として、組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅについても同様の操作を行なった。
【0183】
反応終了後、スピンダウンにより担体（ｒＰＫＣａＣ２－Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ｒＰＫＣ
ａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘおよび組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ）を沈殿させ、上清を回収した（回収液１）。
ａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘおよび組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅ）を沈殿させ、上清を回収した（回収液１）。
【0184】
［４－３］キレート剤処理による複合脂質結合性担体に吸着した細胞外小胞の回収
次に、１５０μＬの２ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ－Ｔ溶液（ＴＢＳ－Ｔ溶液の組成：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、ｐＨ８．０）を添加し、タッピング、スピンダウンによる分離、上清廃棄の操作を４回繰り返すことによって、担体を洗浄した。
次に、１５０μＬの２ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ－Ｔ溶液（ＴＢＳ－Ｔ溶液の組成：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、ｐＨ８．０）を添加し、タッピング、スピンダウンによる分離、上清廃棄の操作を４回繰り返すことによって、担体を洗浄した。
【0185】
次に、洗浄した担体に、溶出液として５ｍＭのＥＤＴＡを含むＴＢＳ溶液を２０μＬ添加後、ボルテックスミキサーで懸濁、卓上遠心機でスピンダウンし、室温で１５分間静置した。１５分後、ボルテックスミキサーで再度懸濁し、スピンダウンにより担体を沈殿させ、上清を回収した（回収液２）。回収液２を回収したのち、さらに、担体への５ｍＭのＥＤＴＡを含むＴＢＳ溶液２０μＬの添加、ボルテックスミキサーによる懸濁、卓上遠心機によるスピンダウン、室温での１５分間静置、ボルテックスミキサーによる再度懸濁、スピンダウンによる担体の沈殿までの一連の操作を繰り返し、上清を回収した（回収液３）。
【0186】
次に、担体に、溶出液として２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液を２０μＬ添加後、ボルテックスミキサーで懸濁、スピンダウン後、室温で１５分間静置した。１５分後、ボルテックスミキサーで再度懸濁し、スピンダウンにより担体を沈殿させ、上清を回収した（回収液４）。
【0187】
［４－４］回収液のウェスタンブロッティング
次に、回収液１から回収液４を９５℃で５分間処理することにより変性させたのち、市販の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（ｅ－ＰＡＧＥＬ Ｅ－Ｒ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ製）を用い、３０ｍＡ、５５分間の条件で電気泳動した。なお、電気泳動の分子量マーカーとして、ＥｚＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（ＷＳＥ－７０２０、ＡＴＴＯ製）を用いた。
次に、回収液１から回収液４を９５℃で５分間処理することにより変性させたのち、市販の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（ｅ－ＰＡＧＥＬ Ｅ－Ｒ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ製）を用い、３０ｍＡ、５５分間の条件で電気泳動した。なお、電気泳動の分子量マーカーとして、ＥｚＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（ＷＳＥ－７０２０、ＡＴＴＯ製）を用いた。
【0188】
電気泳動終了後、転写バッファー（ＥｚＦａｓｔＢｌｏｔ、ＡＴＴＯ製）を用いてゲルを洗浄し、転写バッファーに浸したろ紙をブロッティング装置（ＰｏｗｅｒｅｄＢｌｏｔ Ａｃｅ、ＷＳＥ－４１１５、ＡＴＴＯ製）に置き、その上にＰＶＤＦ膜（クリアブロット・Ｐプラス膜、ＷＳＥ－４０５１、ＡＴＴＯ製）、ゲル、転写バッファーに浸したろ紙の順番で重ね、Ｆａｓｔモードにて１０分間、ゲルからＰＶＤＦ膜への転写を行なった。転写後のＰＶＤＦ膜はＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄し、３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔによって４℃で１晩ブロッキングした。
【0189】
その後、３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液を用いて調製した、抗ＣＤ８１抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製、商品コード：ＮＢ１００－６５８０５Ｈ、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識）溶液と、ブロッキング後のＰＶＤＦ膜をポリプロピレン製容器に入れ、室温で１時間振盪することにより抗体と結合させた。抗体との反応後、未反応の抗体を洗浄除去するためにＴＢＳ－Ｔ溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で５分間振盪する操作を３回行なった。
【0190】
洗浄後、高解像度化学発光専用機ＧｅｎｅＧｎｏｍｅ（ＧＧＮＯＭＥ－ＸＲＱ－ＮＰＣ、ＳＹＮＧＥＮＥ製）を用いて、ＨＲＰ用検出試薬（ＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉＯｎｅ、ＷＳＥ－７１１０、ＡＴＴＯ製）の発光により細胞外小胞を示すバンドを検出した（図５および図６）。
【0191】
図５および図６からも明らかなように、組換えタンパク質を固定化していないＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５ Ｆｉｎｅでは、細胞外小胞と接触させた直後に回収した回収液１（図５および図６におけるレーン番号２）に細胞外小胞に由来するバンドが検出されたため、細胞外小胞は当該担体に非特異的な吸着をしないことが明らかとなった。
【0192】
一方、ｒＰＫＣａＣ２－Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｄｅｘでは、細胞外小胞と接触させた直後に回収した回収液１（図５および図６におけるレーン番号７）に細胞外小胞に由来するバンドがほとんど検出されておらず、キレート剤であるＥＤＴＡを含む緩衝液を添加して回収した回収液２（図５および図６におけるレーン番号８）では細胞外小胞に由来するバンドが確認されたことから、キレート剤で処理することにより、複合脂質結合性担体に吸着した細胞外小胞を回収できることが明らかとなった。
【0193】
［参考例５］ 組換えタンパク質のホスファチジルセリン結合性評価
文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻、９２７－９４０頁、２００７年）に記載の方法に従い、実施例１１で製造した６種類の組換えタンパク質（ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）、ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）、ｒＰＫＣｇＣ２（配列番号２１）、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１９）および組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３））の、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳとする。）に対する結合性をＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ ＥＬＩＳＡにより評価した。
文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻、９２７－９４０頁、２００７年）に記載の方法に従い、実施例１１で製造した６種類の組換えタンパク質（ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）、ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）、ｒＰＫＣｇＣ２（配列番号２１）、ｒＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１９）および組換えタンパク質ｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３））の、ホスファチジルセリン（以下、ＰＳとする。）に対する結合性をＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ ＥＬＩＳＡにより評価した。
【0194】
２５μｇ／ｍＬのＰＳ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製１，２－Ｄｉａｃｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅをクロロホルムで５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解後、メタノールで２００倍希釈）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつＥＬＩＳＡ用プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に添加し、風乾することによりプレートへＰＳを固相化した。
【0195】
次に、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３０℃で２時間放置することでブロッキングした後、バッファーＷ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して合計３回洗浄した。
【0196】
次に、バッファーＡ（２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で希釈した前記６種類の組換えタンパク質を添加し、３０℃で９０分間、加温したのち、バッファーＷＣ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して合計３回洗浄した。
【0197】
次に、ＨＲＰ標識抗６－Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有バッファーＷＣで５０００倍希釈した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３０℃で１．５時間、加温したのち、バッファーＷＣを３５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して合計３回洗浄した。
【0198】
ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して発色させた後、１Ｍリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加することにより反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0199】
図７に組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）、ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）およびｒＰＫＣｇＣ２（配列番号２１）の、図８に組換えタンパク質ＰＫＣａＣ２－ＧＳＴ（配列番号７）、ｒＰＫＣｂＣ２－ｇｓ－ＧＳＴ（配列番号１９）およびｒＰＫＣｇＣ２－ＧＳＴ（配列番号２３）のＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ ＥＬＩＳＡの結果を示すが、いずれの組換えタンパク質でも濃度依存的に吸光度が上昇しており、評価した６種類の組換えタンパク質全てがＰＳに結合することが明らかとなった。
【0200】
［参考例６］ 組換えタンパク質の脂質結合性評価
文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻、９２７－９４０頁、２００７年）に記載の方法に従い、市販の膜脂質ストリップ（Ｐ－６００２、Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）およびｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）の複合脂質への結合性を評価した。
文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２７巻、９２７－９４０頁、２００７年）に記載の方法に従い、市販の膜脂質ストリップ（Ｐ－６００２、Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、実施例１１で製造した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）およびｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）の複合脂質への結合性を評価した。
【0201】
容器に前記膜脂質ストリップと１０ｍＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を入れて室温で１時間振盪し、膜脂質ストリップのブロッキングを行なった。
【0202】
次に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを廃棄後、９ｍＬの組換えタンパク質溶液（０．５μｇ／ｍＬ組換えタンパク質と２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加し室温で１時間振盪することにより、組換えタンパク質を膜脂質ストリップに結合させた。
【0203】
次に、組換えタンパク質溶液を廃棄後、１０ｍＬのＷａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、２ｍＭ ＣａＣｌ２）を添加し、室温で１０分間振盪することにより洗浄し、この洗浄操作を３回繰り返した。
【0204】
３回の洗浄後、Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを廃棄後、１０ｍＬの抗ポリヒスチジンタグ抗体溶液（Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（以降、「抗６－Ｈｉｓ抗体」とも表記）、カタログ番号Ａ１９０－１１４Ｐ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）と２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加して室温で１時間振盪し、膜脂質ストリップに結合した組換えタンパク質に抗６－Ｈｉｓ抗体を結合させた。
【0205】
１時間振盪後、過剰の抗６－Ｈｉｓ抗体を廃棄し、１０ｍＬの前記Ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、室温で１０分間振盪することを３回繰り返して、膜脂質ストリップを洗浄した。
【0206】
洗浄後の膜脂質ストリップは高解像度化学発光専用機（ＧｅｎｅＧｎｏｍｅ、ＳＹＮＧＥＮＥ製）を用い、膜脂質ストリップに結合した組換えタンパク質をＨＲＰ用検出試薬（ＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉＯｎｅ、型番ＷＳＥ－７１１０、ＡＴＴＯ製）の発光により検出した。
【0207】
組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２（配列番号５）の脂質結合性評価の結果を図９に、ｒＰＫＣｂＣ２（配列番号１７）の脂質結合性評価の結果を図１０に示す。図９および図１０において、濃く発色されているスポットに組換えタンパク質が結合していることを示唆している。図９からも明らかなように、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール４－リン酸、ホスファチジルイノシトール４、５－ビスリン酸、スルファチド、カルジオリピンにも結合することが明らかとなった。また、図１０からも明らかなように、組換えタンパク質ｒＰＫＣｂＣ２はホスファチジルセリン（ＰＳ）に強く結合し、ホスファチジルイノシトール４－リン酸、カルジオリピンにも結合することが明らかとなった。
【0208】
［実施例１６］ タンパク質リン酸化酵素αのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの融合タンパク質の発現ベクター、そのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体、および前記融合タンパク質の製造
［１］発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣとその形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの作製
まずＰＫＣαのＣ２ドメインとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを製造するための発現ベクターを作製した。ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣのアミノ酸配列は配列番号３１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６４番目から２７９番目はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢの１１６アミノ酸残基）に、その２８２番目から２８７番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３２）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを大腸菌で発現可能なベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを作製した。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを製造可能な形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを作製した。
［１］発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣとその形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの作製
まずＰＫＣαのＣ２ドメインとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）との融合タンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを製造するための発現ベクターを作製した。ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣのアミノ酸配列は配列番号３１（その３番目から１４１番目までは配列番号１のアミノ酸配列に、１４６番目から１５９番目はＧＳリンカー（配列番号４１）に、１６４番目から２７９番目はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢの１１６アミノ酸残基）に、その２８２番目から２８７番目はポリヒスチジン配列に相当）であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３２）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを大腸菌で発現可能なベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを作製した。さらに、発現ベクターｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを製造可能な形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを作製した。
【0209】
［２］組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの製造
前記［１］で作製した形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣについて、前記実施例１１に記載の方法により発現培養を行ない、組換えタンパク質を調製した。調製したタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５、１０ＫＤａ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いた限外ろ過によりＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２６．８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）に置換した。
前記［１］で作製した形質転換体ＥＣ／ｐＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣについて、前記実施例１１に記載の方法により発現培養を行ない、組換えタンパク質を調製した。調製したタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５、１０ＫＤａ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いた限外ろ過によりＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２６．８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）に置換した。
【0210】
［作製例１］固定化補助タンパク質の作製
［１］Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴの作製
［１－１］発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴとその形質転換体ＥＣ／ｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴの作製
発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴは、Ｎ末端側にビオチン標識用システイン残基（Ｃｙｓ）を付加したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺドメイン（ＳｐＡ－Ｚ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ登録番号：ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）とＳｐｙＴａｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ Ｂ［１３残基］、ＳｐｙＴ）がタンデムに３コピーならんだポリペプチドとの融合タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを製造するための発現ベクターであり、そのアミノ酸配列は配列番号３３であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３４）を、ｐＢＲ３２２系プラスミドのｐＧＥＸ（Ｃｙｔｉｖａ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを大腸菌で発現可能なベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを作製した。
［１］Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴの作製
［１－１］発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴとその形質転換体ＥＣ／ｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴの作製
発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－１ＳｐｙＴは、Ｎ末端側にビオチン標識用システイン残基（Ｃｙｓ）を付加したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺドメイン（ＳｐＡ－Ｚ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ登録番号：ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）とＳｐｙＴａｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ登録番号：４ＭＬＩのＣｈａｉｎ Ｂ［１３残基］、ＳｐｙＴ）がタンデムに３コピーならんだポリペプチドとの融合タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを製造するための発現ベクターであり、そのアミノ酸配列は配列番号３３であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３４）を、ｐＢＲ３２２系プラスミドのｐＧＥＸ（Ｃｙｔｉｖａ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを大腸菌で発現可能なベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを作製した。
【0211】
なおｐＧＥＸは、マルチクローニングサイトの上流側にＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ登録番号：ＱＬＶ９５７７８の１番目から２１８番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドおよびプロテアーゼ認識部位を有しており、前記挿入により作製した発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴは、ＧＳＴとＣｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴとの融合タンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号３５）を大腸菌で発現可能なベクターである。ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴをコードする塩基配列を配列番号３６に示す。
【0212】
発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１を形質転換し、組換えタンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを製造可能な形質転換体ＥＣ／ｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを作製した。
【0213】
［１－２］組換えタンパク質の製造
［１－１］で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体ＥＣ／ｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを、６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、それぞれ６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加したのち、５時間培養することで組換えタンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。
［１－１］で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体ＥＣ／ｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを、６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、それぞれ６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加したのち、５時間培養することで組換えタンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。
【0214】
可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、グルタチオン固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行ない、固定化担体に結合したＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを、ＧＳＴ融合ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いてメーカープロトコルに従い消化し、上清を回収することで、Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号３３）溶液を得た。得られたタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５、１０ＫＤａ（Ｍｅｒｃｋ製）を用いた限外ろ過によりＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬製）に置換した。
【0215】
［２］（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴの作製
［２－１］発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴとその形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴの作製
発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴは、変異型ＢＣ２ＬＣＮレクチンＢＣ２ＬＣＮｍ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドのホモ３量体を形成するタンパク質、ただし当該アミノ酸残基において４０番目のグルタミンがロイシンに、８２番目のグルタミン酸がシステイン（ビオチン標識用）に、それぞれ置換したポリペプチド）とタンデムに並んだ３コピーのＳｐｙＴａｇとの融合タンパク質（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを製造するための発現ベクターであり、そのアミノ酸配列は配列番号３７であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３８）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）を大腸菌で発現可能なベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを作製した。発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えタンパク質（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを製造可能な形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを、作製した。
［２－１］発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴとその形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴの作製
発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴは、変異型ＢＣ２ＬＣＮレクチンＢＣ２ＬＣＮｍ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドのホモ３量体を形成するタンパク質、ただし当該アミノ酸残基において４０番目のグルタミンがロイシンに、８２番目のグルタミン酸がシステイン（ビオチン標識用）に、それぞれ置換したポリペプチド）とタンデムに並んだ３コピーのＳｐｙＴａｇとの融合タンパク質（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを製造するための発現ベクターであり、そのアミノ酸配列は配列番号３７であり、そのアミノ酸をコードする塩基配列（配列番号３８）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｍｅｒｃｋ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）を大腸菌で発現可能なベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを作製した。発現ベクターｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えタンパク質（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを製造可能な形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを、作製した。
【0216】
［２－２］組換えタンパク質の製造
［２－１］で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを、３０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。
［２－１］で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体ＥＣ／ｐ（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを、３０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液は、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。
【0217】
培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加したのち、一晩培養することで組換えタンパク質（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを発現させた。回収した菌体から実施例１１と同様にして組換えタンパク質（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴを調製し、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）溶液を得た。
【0218】
［実施例１７］ 固定化補助タンパク質を用いた複合脂質結合性担体による細胞外小胞を含む溶液からの細胞外小胞の単離
［１］固定化補助タンパク質とＰＫＣαのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質の構造体の作製
作製例１で作製した固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号３３）および（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）を、それぞれ限外ろ過フィルターを用いてＤ－ＰＢＳ（＋）緩衝液に置換後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、メーカープロトコルに従って、前記固定化補助タンパク質中に存在するシステイン残基のスルフヒドリル基にビオチンを標識した。
［１］固定化補助タンパク質とＰＫＣαのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質の構造体の作製
作製例１で作製した固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号３３）および（ＢＣ２ＬＣＮ－ｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）を、それぞれ限外ろ過フィルターを用いてＤ－ＰＢＳ（＋）緩衝液に置換後、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、メーカープロトコルに従って、前記固定化補助タンパク質中に存在するシステイン残基のスルフヒドリル基にビオチンを標識した。
【0219】
作製したビオチン標識固定化補助タンパク質と、実施例１６で作製したＰＫＣαのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣ（配列番号３１）とを、以下に示す方法で結合させることで、不溶性担体に固定化させる、固定化補助タンパク質とｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣとが結合した構造体（以下、「ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体」とする。）を作製した。なおＰＫＣαＣ２ドメイン構造体の作製に用いた、ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣと固定化補助タンパク質との組み合わせと、得られるＰＫＣαＣ２ドメイン構造体を表１２にまとめる。
【0220】
【表12】
【0221】
表１２に記載の組み合わせに基づき、前記のビオチン標識固定化補助タンパク質と実施例１６で作製した組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣとを結合させた。具体的には、ビオチン標識固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号３３）および（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴ（配列番号３７）と、組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣ（配列番号３１）とを、それぞれ濃度０．３ｍｇ／ｍＬ以上となるよう、Ｄ－ＰＢＳ（＋）またはｐＨ７．０以上８．０以下のＴＢＳ－Ｔ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２））に懸濁し、表１２の実施例１７の条件ａまたはｂに記載の組み合わせでビオチン標識固定化補助タンパク質とｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの溶液を混合後、４℃で一昼夜以上放置することでタンパク質タグＳｐｙＴとＳｐｙＣの結合反応によりＰＫＣαＣ２ドメイン構造体を作製した。
【0222】
なお混合時のモル比は、ビオチン標識固定化補助タンパク質１に対し、ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを９とした。混合時のモル比は、タンパク質タグＳｐｙＴとＳｐｙＣの結合反応が十分に進むように、ＳｐｙＣ配列をもつ組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣを過剰量添加した。固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴおよび（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴは１分子あたり３コピーのＳｐｙＴａｇ配列をもつため、分子内の全ＳｐｙＴａｇ配列にＳｐｙＣを結合させるためには、モル比として固定化補助タンパク質１に対し、ＳｐｙＣ配列をもつ組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣが３必要であり、結合反応を円滑に行なうため、必要量の３倍のモル比として９倍量添加した。
【0223】
ＳｐｙＴとＳｐｙＣとの結合反応により、ビオチン標識固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴと組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの結合によるＰＫＣαＣ２ドメイン構造体（表１２の実施例１７の条件ａ、ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎ）は、固定化補助タンパク質１分子当たりに３分子のＰＫＣαのＣ２ドメインが結合した３量体型ＰＫＣαＣ２ドメイン構造となる。また、ビオチン標識固定化補助タンパク質（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴと組換えタンパク質ｒＰＫＣａＣ２－ＳｐｙＣの結合によるＰＫＣαＣ２ドメイン構造体（表１２の実施例１７の条件ｂ、ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎ）は、固定化補助タンパク質１分子当たりに３分子のＰＫＣαのＣ２ドメインが結合し、さらに固定化補助タンパク質に含まれるＢＣ２ＬＣＮレクチンのアミノ酸配列がホモ３量体構造を形成するため、９量体型ＰＫＣαＣ２ドメイン構造となる。
【0224】
［２］複合脂質結合性担体の製造
不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））１００μＬを採取し、上清を除去した。
不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））１００μＬを採取し、上清を除去した。
【0225】
上清を除去した磁性微粒子を、固定用緩衝液（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄した。
【0226】
あらかじめ限外ろ過膜などを用いて固定用緩衝液に置換した［１］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎ（表１２の実施例１７の条件ａ）またはｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎ（表１２の実施例１７の条件ｂ）を、固定化補助タンパク質の濃度に換算して０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に調整後、前記の洗浄した磁性微粒子に、固定化補助タンパク質量に換算して４．５μｇ添加し、室温で１０分間混和した。
【0227】
上清を除去し、固定用緩衝液で３回洗浄後、エクソソーム結合用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］、ｐＨ７．３）で１回洗浄し、ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体を固定化した担体を作製した。
【0228】
コントロールとして、ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体と結合していないビオチン標識固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴおよび（ＢＣ２ＬＣＮｍ２）－３ＳｐｙＴを、同様な方法でそれぞれ磁性微粒子に固定化し、ビオチン標識固定化補助タンパク質３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎ（表１２の比較例６の条件ｃ）および３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎ（表１２の比較例６の条件ｄ）固定化担体を作製した。
【0229】
［３］細胞外小胞溶液の調製
前立腺がん細胞株（ＰＣ３細胞）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５％添加したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。培養したＰＣ３細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地で懸濁後、６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで播種、懸濁し、さらに３日間培養した。
前立腺がん細胞株（ＰＣ３細胞）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５％添加したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。培養したＰＣ３細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地で懸濁後、６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで播種、懸濁し、さらに３日間培養した。
【0230】
培養後、培養上清を全量（約２ｍＬ）回収し、３００×Ｇで１０分間、室温で遠心分離して浮遊細胞を除去後、上清１．５ｍＬを回収した。回収した上清をさらに３０００×Ｇで１０分間、４℃で遠心分離して細胞デブリを除去後、上清１．２ｍＬを回収し、さらに１６０００×Ｇで６０分間、４℃で遠心分離し、上清１ｍＬを別のチューブに移した。
【0231】
別のチューブに移した上清１ｍＬとＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）１ｍＬとを混合し、２５９０００×Ｇで７０分間、４℃で超遠心分離し、上清１．８ｍＬを除去した。残った沈殿物をＰＢＳ１．８ｍＬで懸濁し、２５９０００×Ｇ、７０分間、４℃で超遠心分離して洗浄後、上清１．８ｍＬを除去し、残った沈殿物を含む０．２ｍＬを細胞外小胞溶液とした。
【0232】
［４］細胞外小胞の分離
上記［２］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体固定化担体（表１２の実施例１７の条件ａ、ｂ）ならびに比較例６の固定化補助タンパク質固定化担体（表１２の比較例６の条件ｃ、ｄ）をそれぞれ入れた容器に、上記［３］で作製した細胞外小胞溶液２０μＬを添加後、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。振とう後に７．５μＬの上清を採取し、これを「上清液」とした。
上記［２］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体固定化担体（表１２の実施例１７の条件ａ、ｂ）ならびに比較例６の固定化補助タンパク質固定化担体（表１２の比較例６の条件ｃ、ｄ）をそれぞれ入れた容器に、上記［３］で作製した細胞外小胞溶液２０μＬを添加後、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。振とう後に７．５μＬの上清を採取し、これを「上清液」とした。
【0233】
残りの上清も除去した後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で２回洗浄した。７．５μＬの５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ水溶液を添加し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌した後、７．５μＬの上清を採取し、これを「ＥＤＴＡ溶出液」とした。
【0234】
残りの上清も除去した後、７．５μＬの２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液を添加し、再度ボルテックスミキサーで撹拌し、７．５μＬの２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＴＴ非含有）（ＡＴＴＯ社製）を添加後、全量を回収し、これを「ＳＤＳ溶出液」とした。
【0235】
上清液およびＥＤＴＡ溶出液、ＳＤＳ溶出液を熱処理後、電気泳動用ポリアクリルアミドゲル（ｅ－ＰＡＧＥＬ Ｅ－Ｒ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ製）を用いて電気泳動を行ない、（４）［４－４］と同様にしてウェスタンブロッティングを行なった。ただし、細胞外小胞の検出抗体は抗ＣＤ９マウス抗体を１次抗体とし、ＨＲＰ標識抗マウス抗体を２次抗体とした。
【0236】
実施例１７および比較例６の固定化担体による細胞外小胞分離の結果を図１１に示す。
【0237】
実施例１７のビオチン標識３量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎを固定化した複合脂質結合性担体（表１２の実施例１７の条件ａ）からキレート剤であるＥＤＴＡを含むＥＤＴＡ溶出液で細胞外小胞の溶出を行なったとき（レーン番号５）、細胞外小胞溶液中に含まれる細胞外小胞（レーン番号４）に相当する明瞭なバンドが確認されたことから、実施例１７の複合脂質結合性担体は細胞外小胞溶液中に含まれる細胞外小胞を吸着したことが示された。さらに、上記複合脂質結合性担体からＥＤＴＡにより細胞外小胞を含む溶出液を溶出した後に続けて変性剤であるＳＤＳを含むＳＤＳ溶出液で担体表面の吸着タンパク質の溶出を行なったとき（レーン番号６）の細胞外小胞に相当するバンドがほぼ確認できないことから、複合脂質結合性担体に吸着した細胞外小胞の多くはＥＤＴＡにより回収できることが示された。
【0238】
一方、コントロールとして作製した、ビオチン標識固定化補助タンパク質３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎのみを固定化した担体（表１２の比較例６の条件ｃ）で細胞分離を行なったとき、ＥＤＴＡ溶出液（レーン番号２）およびＳＤＳ溶出液（レーン番号３）には細胞外小胞溶液中に含まれる細胞外小胞（レーン番号１）に相当するバンドがほぼ確認できないことから、細胞外小胞が、使用した不溶性担体および３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎへの非特異的吸着をしないことわかる。
【0239】
実施例１７のビオチン標識９量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎを固定化した複合脂質結合性担体（表１２の実施例１７の条件ｂ）およびそのコントロールである固定化補助タンパク質のみを固定化した担体（表１２の比較例６の条件ｄ）も、前記３量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体と同様の結果であった。９量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体固定化担体のＥＤＴＡ溶出液（レーン番号１１）のバンドのシグナル強度は上清液（レーン番号１０）およびＳＤＳ溶出液（レーン番号１２）と比較して顕著に強く、９量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体固定化担体に細胞外小胞が吸着し、その多くがＥＤＴＡにより回収されたことが示された。
【0240】
一方、コントロールとして作製した、ビオチン標識固定化補助タンパク質３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎのみを固定化した担体（表１２の比較例６の条件ｄ）で細胞分離を行なったとき、ＥＤＴＡ溶出液（レーン番号８）でバンドがあり、これは３量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体用のコントロールを固定化した担体（比較例６の条件ｃ、レーン番号２）と比較してシグナル強度が強いことから、３ＳｐｙＴ＿ＢＣ２ＬＣＮｍ２－Ｂｉｏｔｉｎを固定化した担体では若干の非特異的吸着が起きていることが示唆された。しかし吸着した細胞外小胞量はＰＫＣのＣ２ドメインを含む担体（表１２の実施例１７の条件ｂ）の方が多いことから、９量体ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体を固定した複合脂質結合性担体においても、細胞外小胞を吸着、回収できることが明らかとなった。
【0241】
［実施例１８］ 固定化補助タンパク質を含む複合脂質結合性担体による細胞培養上清からの細胞外小胞の単離
［１］固定化補助タンパク質とタンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質の構造体およびその固定化担体
実施例１７［１］および［２］と同様にして、リン酸化酵素Ｃ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ（表１２の実施例１７の条件ａ）および固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（表１２の比較例６の条件ｃ）を作製した。
［１］固定化補助タンパク質とタンパク質リン酸化酵素のＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質の構造体およびその固定化担体
実施例１７［１］および［２］と同様にして、リン酸化酵素Ｃ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ（表１２の実施例１７の条件ａ）および固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（表１２の比較例６の条件ｃ）を作製した。
【0242】
［２］ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎの不溶性担体への固定化
不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））１００μＬを採取し、上清を除去した。上清を除去した磁性微粒子を、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む固定用緩衝液（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄した。
不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用い、当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））１００μＬを採取し、上清を除去した。上清を除去した磁性微粒子を、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む固定用緩衝液（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄した。
【0243】
あらかじめ限外ろ過膜などを用いてＣａＣｌ２を含む固定用緩衝液に置換した［１］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎ（表１２の実施例１７の条件ａ）の溶液を、固定化補助タンパク質の濃度に換算して０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に調整後、前記の洗浄した磁性微粒子に、固定化補助タンパク質量に換算して４．５μｇ添加し、室温で１０分間混和した。
【0244】
上清を除去し、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む固定用緩衝液で３回洗浄後、２ｍＭのＣａＣｌ２を含むＴＢＳ－Ｔ緩衝液で１回洗浄し、ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎ固定化担体を作製した。
【0245】
コントロールとして、ＰＫＣαのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質と結合していないビオチン標識固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを同様な方法で磁性微粒子に固定化し、ビオチン標識固定化補助タンパク質３ＳｐｙＴ―Ｂｉｏｔｉｎ固定化担体（表１２の比較例６の条件ｃ）を作製した。
【0246】
［３］細胞培養上清の調製
前立腺がん細胞株（ＰＣ３細胞）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５％添加したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。培養したＰＣ３細胞を、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（あらかじめ限外濾過膜処理によりエクソソームを除去済）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地で２日間培養後、培養上清を回収した。
前立腺がん細胞株（ＰＣ３細胞）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１５％添加したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。培養したＰＣ３細胞を、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（あらかじめ限外濾過膜処理によりエクソソームを除去済）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地で２日間培養後、培養上清を回収した。
【0247】
回収した培養上清を３００×Ｇで１０分間、室温で遠心分離して浮遊細胞を除去後、上清を回収した。さらに１２００×Ｇで２０分間、４℃で遠心分離して細胞デブリを除去後、上清を回収した。回収した上清をさらに１００００×Ｇで３０分間、４℃で遠心分離して粒径の大きい細胞外小胞を除去後、上清１．２ｍＬを回収し、さら１６０００×Ｇで６０分間、４℃で遠心分離し、上清を回収し、これを細胞培養上清とした。
【0248】
［４］細胞外小胞の分離
上記［２］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ固定化担体ならびに固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを固定化した担体をそれぞれ入れた容器に、上記［３］で作製した１ｍＬの細胞培養上清に２ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したものを入れ、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。振とう後に７．５μＬの上清を採取し、これを「上清液」とした。
上記［２］で作製したＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ固定化担体ならびに固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを固定化した担体をそれぞれ入れた容器に、上記［３］で作製した１ｍＬの細胞培養上清に２ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したものを入れ、当該容器を１０℃で３時間、振とうした。振とう後に７．５μＬの上清を採取し、これを「上清液」とした。
【0249】
残りの上清も除去した後、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ－Ｔ緩衝液で２回洗浄した。７．５μＬの５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）水溶液を添加し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌した後、７．５μＬの上清を採取し、これを「ＥＤＴＡ溶出液」とした。
【0250】
残りの上清も除去した後、７．５μＬの２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）水溶液を添加し、再度ボルテックスミキサーで撹拌し、７．５μＬの２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＴＴ非含有）（ＡＴＴＯ製）を添加後、全量を回収し、これを「ＳＤＳ溶出液」とした。
【0251】
上清液およびＥＤＴＡ溶出液、ＳＤＳ溶出液および細胞外小胞標品として実施例１７［３］で作製した細胞外小胞溶液および［３］で作製した細胞培養上清を熱処理後、実施例１７［４］と同様にして、電気泳動およびウェスタンブロッティング、抗体による細胞外小胞の検出を行なった。
【0252】
ＰＫＣαＣ２ドメイン構造体ＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎを固定化した複合脂質結合性担体（表１２の実施例１７の条件ａ）および比較例６の固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ固定化担体（表１２の比較例６の条件ｃ）による細胞外小胞分離の結果を図１２に示す。
【0253】
ｒＰＫＣａＣ２／３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎを固定化した複合脂質結合性担体（表１２の実施例１７の条件ａ）（表１２の実施例１７の条件ａ）からキレート剤であるＥＤＴＡを含むＥＤＴＡ溶出液（レーン番号３）で細胞外小胞の溶出を行なったとき、細胞外小胞（図８のレーン０）に相当する明瞭なバンドが確認されたことから、キレート剤で処理することにより、ＰＫＣαＣ２ドメインを含む複合脂質結合性担体に吸着した細胞外小胞を回収できることが明らかとなった。また、細胞培養上清（レーン番号１）に含まれる細胞外小胞のバンドと比較し顕著にシグナル強度が強いことから、細胞培養上清中に含まれる細胞外小胞を前記複合脂質結合性担体上に選択的に濃縮できることが示唆される。さらに、上前記複合脂質結合性担体からＥＤＴＡにより細胞外小胞を含む溶出液を得た後に続けて変性剤であるＳＤＳを含むＳＤＳ溶出液（レーン番号５）で担体表面の吸着タンパク質の溶出を行なったとき、細胞外小胞に相当するバンドはＥＤＴＡ溶出液と比較し薄いことから、複合脂質結合性担体に吸着した細胞外小胞の多くはＥＤＴＡにより回収できることが示された。
【0254】
一方、３ＳｐｙＴ－Ｂｉｏｔｉｎのみを固定化した担体（表１２の比較例６の条件ｃ）で細胞分離を行なったとき、ＥＤＴＡ溶出液（レーン番号２）およびＳＤＳ溶出液（レーン番号４）の細胞外小胞に相当するバンドは確認できるが、前記複合脂質結合性担体を用いた場合（ＥＤＴＡ溶出液：レーン番号３、ＳＤＳ溶出液：レーン番号４）と比較し薄いことから、細胞外小胞は使用した不溶性担体およびそれに固定化した固定化補助タンパク質へ若干の吸着をするものの、その量はＰＫＣαのＣ２ドメインのアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を固定化した担体と比較しごく少ないことが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】