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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023100186
(43)【公開日】2023-07-18
(54)【発明の名称】乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20230710BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230710BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230710BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230710BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/686 Z
G01N33/50 P
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022000691
(22)【出願日】2022-01-05
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載日：令和３年１月１９日、掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊｖｍｓ／ａｄｖｐｕｂ／０／ａｄｖｐｕｂ＿２０－０４８３／＿ａｒｔｉｃｌｅ／－ｃｈａｒ／ｅｎ、刊行物名及び該当頁：Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．８３（３）：３７０－３７７，２０２１（ｄｏｉ：１０．１２９２／ｊｖｍｓ．２０－０４８３）
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107342
【弁理士】
【氏名又は名称】横田 修孝
(74)【代理人】
【識別番号】100155631
【弁理士】
【氏名又は名称】榎 保孝
(74)【代理人】
【識別番号】100137497
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 未知子
(74)【代理人】
【識別番号】100207907
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 桃子
(74)【代理人】
【識別番号】100217294
【弁理士】
【氏名又は名称】内山 尚和
(72)【発明者】
【氏名】前田 真吾
(72)【発明者】
【氏名】酒居 幸生
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA13
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ43
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS36
(57)【要約】
【課題】乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法および治療方法の選択方法の提供。
【解決手段】本発明によれば、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定する工程を含む、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法が提供される。本発明によればまた、前記予後予測方法を実施する工程と、予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法が提供される。
【選択図】図２
【解決手段】本発明によれば、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定する工程を含む、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法が提供される。本発明によればまた、前記予後予測方法を実施する工程と、予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法が提供される。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法であって、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項2】
ＨＥＲ２遺伝子のコピー数の測定をＰＣＲ法により実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加を該被験動物の予後の不良の指標とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
被験動物において対照遺伝子のコピー数をさらに測定する工程を含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
被験動物における対照遺伝子のコピー数に対するＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比率（コピー数比率）が、健常イヌ科動物のコピー数比率（カットオフ値）を上回る場合に、被験動物の予後が不良であることが示される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
癌再発の予測方法である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載に記載の予後予測方法を実施する工程と、前記予後予測方法により予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
乳腺癌はイヌに発生する腫瘍で最も頻度が高い悪性腫瘍である。早期に外科的に完全切除できれば予後は良好であることが多いが、術後しばしば再発することもある。
【0003】
イヌ科動物ではこれまでに尿試料を用いた癌を検出する方法が知られているが（特許文献１）、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の術後の再発や予後を予測するバイオマーカーは確立されていない。また初診時に既に転移している場合もあり、そのような状況では薬剤による内科療法など、適切な治療方法の選択が必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１９－１２６２９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法の提供を目的とする。本発明はまた、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは今般、乳癌に罹患したイヌにおいて、乳腺組織サンプルにおけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数増加（以下、単に「ＨＥＲ２コピー数増加」ということがある）とＨＥＲ２のタンパク質過剰発現との間には有意な相関が認められないことを見出した。本発明者らはまた、乳癌に罹患したイヌにおいて、ＨＥＲ２コピー数増加が認められた群はＨＥＲ２コピー数増加が認められない群と比較して生存期間が有意に短く、予後が不良である一方、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現が認められた群とＨＥＲ２タンパク質過剰発現が認められない群との間には生存期間に有意な差が認められないことを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【0007】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法であって、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定する工程を含んでなる、前記方法。
［２］ＨＥＲ２遺伝子のコピー数の測定をＰＣＲ法により実施する、上記［１］に記載の方法。
［３］被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加を該被験動物の予後の不良の指標とする、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］被験動物において対照遺伝子のコピー数をさらに測定する工程を含んでなる、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］被験動物における対照遺伝子のコピー数に対するＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比率（コピー数比率）が、健常イヌ科動物のコピー数比率（カットオフ値）を上回る場合に、被験動物の予後が不良であることが示される、上記［４］に記載の方法。
［６］癌再発の予測方法である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法であって、上記［１］～［６］のいずれかに記載に記載の予後予測方法を実施する工程と、前記予後予測方法により予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、前記方法。
［１］乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後予測方法であって、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定する工程を含んでなる、前記方法。
［２］ＨＥＲ２遺伝子のコピー数の測定をＰＣＲ法により実施する、上記［１］に記載の方法。
［３］被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加を該被験動物の予後の不良の指標とする、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］被験動物において対照遺伝子のコピー数をさらに測定する工程を含んでなる、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］被験動物における対照遺伝子のコピー数に対するＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比率（コピー数比率）が、健常イヌ科動物のコピー数比率（カットオフ値）を上回る場合に、被験動物の予後が不良であることが示される、上記［４］に記載の方法。
［６］癌再発の予測方法である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法であって、上記［１］～［６］のいずれかに記載に記載の予後予測方法を実施する工程と、前記予後予測方法により予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、前記方法。
【0008】
本発明によれば、乳癌に罹患したイヌ科動物の予後を予測することができるため、予測結果に基づいて被験動物にとって適切な治療方法を選択できる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明の具体的説明】
【0010】
本発明の方法はイヌ科動物に対して実施することができる。イヌ科動物に属する動物としては、例えば、イエイヌが挙げられる。なお、本明細書において、「イエイヌ」と「イヌ」および「犬」は同義である。
【0011】
本発明の方法により予後を予測できる、あるいは癌再発を予測できる対象動物は乳腺癌に罹患したイヌ科動物である。乳腺癌に罹患しているかは組織病理学的評価などに基づいて獣医師により行われる。なお、本明細書において、「乳腺癌」は「乳癌」および「乳腺悪性腫瘍」と同義である。
【0012】
本発明の方法は、被験動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数を測定することにより実施することができる。本発明の方法では、後述のように、対照遺伝子のコピー数に対するＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比率を算出するため、被験動物の乳腺組織における対照遺伝子のコピー数の測定も合わせて実施することができる。
【0013】
ＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数の測定は、ＰＣＲ法、次世代配列決定法、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法などの公知の方法により行うことができるが、高感度検出の観点からＰＣＲ法が好ましく、さらに迅速かつ簡便な検出の観点からデジタルＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲがより好ましい。特に、デジタルＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲは、被験動物から採取した試料について、ＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数を同時に測定することができ、容易に比率を算出することができる点で有利である。デジタルＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲは、いずれも市販の装置、試薬およびキットなどを使用して実施することができる。ＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数の測定に当たって必要となるプローブやプライマーは、後述の公知の配列情報を元に設計することができる。
【0014】
本発明の方法において、予後予測および癌再発の予測の指標となるＨＥＲ２遺伝子は、検査対象となるイヌ科動物のＨＥＲ２遺伝子とすることができる。ＨＥＲ２遺伝子の塩基配列は本技術分野において周知であり、例えば、イエイヌのＨＥＲ２遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩにGene ID：403883 (ERBB2 erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 [Canis lupus familiaris (dog)])として登録されており、これを利用することができる。
【0015】
対照遺伝子は、癌（特に、乳腺癌）の存在によってもコピー数が変動しない遺伝子または染色体もしくはその一領域を選択することができ、例えば、ＣＦＡ８（イエイヌの染色体８）の一領域（例えば、Shapiro SG et al., Chromosome Res. 2015 Jun;23(2):311-331参照）が挙げられる。対照遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩなどの公知のデータベースに登録された塩基配列を利用することができる。
【0016】
本発明の方法は、ＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数の測定に先立って、被験動物の乳腺組織を採取する工程を含んでいてもよい。乳腺組織の採取は被験動物に対して外科的切除により実施できる。なお、本発明の方法は乳腺癌の診断が確定していない被験動物から乳腺組織を採取してもよい。この場合、ＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数の測定を行うとともに、採取した乳腺組織を使用し、組織病理学的評価に基づいて乳腺癌の診断を行ってもよい。すなわち、組織病理学的評価により乳腺癌と診断された被験動物について本発明による予後予測や癌再発の予測を行うことができる。
【0017】
後記実施例に示される通り、乳腺癌に罹患したイヌ科動物においては、被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加が該被験動物の予後の不良と相関し、被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の減少が該被験動物の予後の良好と相関する。従って本発明の方法では、被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加を該被験動物の予後の不良の指標とすることで乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後を予測することができる。本発明の方法ではまた、被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の増加を該被験動物の癌再発の可能性の指標とすることで乳腺癌に罹患したイヌ科動物の癌再発の可能性を予測することができる。
【0018】
本発明の方法の一態様においては、被験動物のＨＥＲ２遺伝子のコピー数の対照遺伝子のコピー数に対する比率（以下、単に「コピー数比率」ということがある）が、健常イヌ科動物のコピー数比率（以下、単に「カットオフ値」ということがある）を上回る場合に、被験動物の予後が不良であること、あるいは被験動物において癌が再発する可能性が高いことが示される。従って、本発明の方法は、被験動物のＨＥＲ２遺伝子および対照遺伝子のコピー数の測定の後に、コピー数比率を算出する工程と、該比率がカットオフ値を上回る場合に被験動物の予後が不良であると、あるいは被験動物において癌が再発する可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。この判定工程は獣医師によらず行うことができるが、最終的な診断は獣医師により行われることはいうまでもない。
【0019】
ここで、健常イヌ科動物は、癌や癌以外の疾患を有していないイヌ科動物を意味する。また、健常イヌ科動物は、被験動物と同じ種とすることが望ましく、例えば、イエイヌを被験動物とする場合には、健常イヌ科動物としてはイエイヌを選択することができる。
【0020】
本発明の方法の実施に当たっては、あらかじめ健常イヌ科動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数と対照遺伝子のコピー数とを測定しておき、カットオフ値を準備した上で上記判定工程を実施することができる。すなわち、本発明の方法は、健常イヌ科動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数と対照遺伝子のコピー数とを測定し、健常イヌ科動物のコピー数比率を算出する工程をさらに含んでいてもよい。
【0021】
本発明の方法においては、上記カットオフ値は、健常イヌ科動物から得られたコピー数比率の平均値とすることができる。本発明の方法においてはまた、上記カットオフ値は、下記式：
カットオフ値＝（健常イヌ科動物のコピー数比率の平均値）＋ｋ×（健常イヌ科動物のコピー数比率の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～４の定数であり、好ましくはｋ＝１～４または２～４であり、特にｋ＝約３とすることができる。）
により算出される値とすることができる。上記のいずれの場合も、複数の健常イヌ科動物から得られたコピー数比率を算出に用いることができる。また、標準偏差は公知の方法に従って算出することができる。被験動物がイエイヌであり、対照遺伝子がＣＦＡ８（イエイヌの染色体８）の一領域である場合には、上記式により算出されるカットオフ値は約１．１とすることができる。
カットオフ値＝（健常イヌ科動物のコピー数比率の平均値）＋ｋ×（健常イヌ科動物のコピー数比率の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～４の定数であり、好ましくはｋ＝１～４または２～４であり、特にｋ＝約３とすることができる。）
により算出される値とすることができる。上記のいずれの場合も、複数の健常イヌ科動物から得られたコピー数比率を算出に用いることができる。また、標準偏差は公知の方法に従って算出することができる。被験動物がイエイヌであり、対照遺伝子がＣＦＡ８（イエイヌの染色体８）の一領域である場合には、上記式により算出されるカットオフ値は約１．１とすることができる。
【0022】
本発明の方法は、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の予後を予測することができるとともに、癌再発を予測することができる。従って、本発明の方法は、乳腺癌の治療に補助的に用いることができる。例えば、本発明の方法により被験動物の予後が不良である（あるいは被験動物について癌再発の可能性が高い）と評価された場合には、抗癌剤治療を含む内科治療を検討する；診察回数、検査回数および／または検査項目（例えばレントゲン検査、ＣＴ検査）を増やして転移または再発の有無を確認するなどの適切な処置を選択することができる。また本発明の方法により被験動物の予後が良好である（あるいは被験動物について癌再発の可能性が低い）と評価された場合には、経過観察を行うなどの適切な処置を選択することができる。すなわち、乳腺癌に罹患したイヌ科動物については、予後が不良である場合と、予後が良好である場合があるが、本発明の方法の方法により予後が不良であること、あるいは癌再発の可能性が高いことが事前に予測できた場合には、診察および／または検査の機会を増やすことにより転移や再発を早期発見することができ、より適切な治療を実施できる点で有利である。
【0023】
すなわち、本発明の別の面によれば、本発明の予後予測方法を実施する工程と、前記予後予測方法により予測された被験動物の予後に基づいて適切な治療方法を選択する工程を含む、乳腺癌に罹患したイヌ科動物の治療方法の選択方法が提供される。治療方法の選択は、場合によっては他の検査所見（例えば、Ｘ線検査、超音波検査、血液検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
【実施例0024】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本実施例の被験動物はいずれもイエイヌである。また、被験動物から得た臨床データおよびサンプルの使用については飼い主からインフォームドコンセントを得た。
【0025】
例１：乳癌組織におけるＨＥＲ２タンパク質過剰発現およびＨＥＲ２遺伝子コピー数増加と、乳癌患犬の予後との関係
（１）乳腺組織サンプルの調製
本研究は、東京大学獣医医療センターにおいて病理組織学的検査により乳癌と診断された乳癌患犬（ｎ＝３４）、乳腺腫と診断された乳腺腫患犬（ｎ＝１４）および正常と診断された健常犬（ｎ＝１１）について行った。乳癌患犬から外科手術により採取した乳腺組織を乳癌組織サンプルとした。同様に乳腺腫患犬および健常犬から外科手術により採取した乳腺組織をそれぞれ、乳腺腫組織サンプル、正常組織サンプルとした。得られた各乳腺組織をホルマリンで固定し、パラフィン包埋後、常温で保存した。診断は組織病理学的評価に基づいて行った。具体的には、乳腺組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色標本を、日本獣医病理学専門家協会の認定を受けた２名の病理学者によって評価した。各標本はGoldschmidtらにより提案された方法（Goldschmidt, M. et al., Vet. Pathol. 2011; 48: 117-131.参照）に従って分類および等級付けされた。
（１）乳腺組織サンプルの調製
本研究は、東京大学獣医医療センターにおいて病理組織学的検査により乳癌と診断された乳癌患犬（ｎ＝３４）、乳腺腫と診断された乳腺腫患犬（ｎ＝１４）および正常と診断された健常犬（ｎ＝１１）について行った。乳癌患犬から外科手術により採取した乳腺組織を乳癌組織サンプルとした。同様に乳腺腫患犬および健常犬から外科手術により採取した乳腺組織をそれぞれ、乳腺腫組織サンプル、正常組織サンプルとした。得られた各乳腺組織をホルマリンで固定し、パラフィン包埋後、常温で保存した。診断は組織病理学的評価に基づいて行った。具体的には、乳腺組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色標本を、日本獣医病理学専門家協会の認定を受けた２名の病理学者によって評価した。各標本はGoldschmidtらにより提案された方法（Goldschmidt, M. et al., Vet. Pathol. 2011; 48: 117-131.参照）に従って分類および等級付けされた。
【0026】
（２）ＨＥＲ２の免疫組織化学
ＨＥＲ２の免疫組織化学染色は公知の方法（Tsuboi, M. et al., Vet. Pathol. 2019; 56: 369-376.参照）に従って行った。すなわち、上記（１）で得られたホルマリン固定パラフィン包埋標本の４μｍの薄切スライド切片を脱パラフィン化し、再水和し、３％過酸化水素－メタノールで室温で５分間処理した後、ターゲット回収溶液（ｐＨ９．０、Ｄａｋｏ社）で９８℃のウォーターバスで４０分間加熱した。１時間冷却した後、切片をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、８％スキムミルク－ＴＢＳで３７℃で４０分間インキュベートした。切片をウサギポリクローナル抗ヒトｃ－ｅｒｂＢ－２腫瘍タンパク質（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）抗体（希釈率１：１００、Ｄａｋｏ社）と３７℃で４０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧポリマー（Ｄａｋｏ社）と３７℃で１時間インキュベートした。反応生成物は、３，３’－ジアミノベンジジン（同仁堂社）およびＴＢＳ中の０．０３％Ｈ２Ｏ２を使用して可視化された。対比染色はメイヤーのヘマトキシリンで実施した。ポジティブコントロールはＨＥＲ２を過剰発現することが知られているイヌの尿路上皮癌組織（特許文献１参照）で調製した。ネガティブコントロールは一次抗体を省略して調製した。
ＨＥＲ２の免疫組織化学染色は公知の方法（Tsuboi, M. et al., Vet. Pathol. 2019; 56: 369-376.参照）に従って行った。すなわち、上記（１）で得られたホルマリン固定パラフィン包埋標本の４μｍの薄切スライド切片を脱パラフィン化し、再水和し、３％過酸化水素－メタノールで室温で５分間処理した後、ターゲット回収溶液（ｐＨ９．０、Ｄａｋｏ社）で９８℃のウォーターバスで４０分間加熱した。１時間冷却した後、切片をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、８％スキムミルク－ＴＢＳで３７℃で４０分間インキュベートした。切片をウサギポリクローナル抗ヒトｃ－ｅｒｂＢ－２腫瘍タンパク質（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）抗体（希釈率１：１００、Ｄａｋｏ社）と３７℃で４０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧポリマー（Ｄａｋｏ社）と３７℃で１時間インキュベートした。反応生成物は、３，３’－ジアミノベンジジン（同仁堂社）およびＴＢＳ中の０．０３％Ｈ２Ｏ２を使用して可視化された。対比染色はメイヤーのヘマトキシリンで実施した。ポジティブコントロールはＨＥＲ２を過剰発現することが知られているイヌの尿路上皮癌組織（特許文献１参照）で調製した。ネガティブコントロールは一次抗体を省略して調製した。
【0027】
免疫組織化学法の判定基準（定量化）は以下の通りである。
スコア０：反応性がまったくない
スコア１＋：任意の割合の細胞で弱く不完全な膜免疫反応性を示す
スコア２＋：３０％以下の細胞で強く完全な膜免疫反応性を示すか、あるいは少なくとも１０％の細胞で弱くまたはわずかな不均一で完全な膜免疫性を示す。
スコア３＋：３０％を超える細胞で強く、完全で均一な膜免疫反応性（チキンワイヤーパターン）を表す
スコア０：反応性がまったくない
スコア１＋：任意の割合の細胞で弱く不完全な膜免疫反応性を示す
スコア２＋：３０％以下の細胞で強く完全な膜免疫反応性を示すか、あるいは少なくとも１０％の細胞で弱くまたはわずかな不均一で完全な膜免疫性を示す。
スコア３＋：３０％を超える細胞で強く、完全で均一な膜免疫反応性（チキンワイヤーパターン）を表す
【0028】
スコアが０、１＋および２＋のサンプルは、ＨＥＲ２過剰発現ネガティブとして分類され、スコアが３＋のサンプルは、ＨＥＲ２過剰発現ポジティブとして分類された。一部の腫瘍細胞および正常な乳腺上皮細胞で細胞質免疫反応性が検出されたが、これらは考慮されなかった。
【0029】
（３）ＨＥＲ２遺伝子コピー数の定量
ＤＮＡは、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して、製造元の指示に従って上記（１）で得られた各乳腺組織サンプルから抽出した。既に確立された技術であるｄＰＣＲアッセイをＨＥＲ２コピー数の評価に使用した。ＨＥＲ２のプライマーおよびＴａｑＭａｎＭＧＢプローブ並びに参照遺伝子は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して設計した。参照遺伝子は、イヌの第８染色体（ＣＦＡ８）の領域内で設計した。ゲノム異常に関する以前の研究（Beck, J. et al., PLoS One 2013; 8: e75485.）によると、この領域はイヌの乳癌では比較的安定していた。具体的には以下のプライマーおよびプローブを使用した。
ＤＮＡは、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して、製造元の指示に従って上記（１）で得られた各乳腺組織サンプルから抽出した。既に確立された技術であるｄＰＣＲアッセイをＨＥＲ２コピー数の評価に使用した。ＨＥＲ２のプライマーおよびＴａｑＭａｎＭＧＢプローブ並びに参照遺伝子は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して設計した。参照遺伝子は、イヌの第８染色体（ＣＦＡ８）の領域内で設計した。ゲノム異常に関する以前の研究（Beck, J. et al., PLoS One 2013; 8: e75485.）によると、この領域はイヌの乳癌では比較的安定していた。具体的には以下のプライマーおよびプローブを使用した。
【0030】
ＨＥＲ２遺伝子
フォワードプライマー：GTGGTGAGGCTGGTTTTCAGA（配列番号１）
リバースプライマー：CCTGTCCTCCCACCTCTTCAT（配列番号２）
プローブ（ＦＡＭ標識）：TAACCGCTAAGCAGTATGT（配列番号３）
フォワードプライマー：GTGGTGAGGCTGGTTTTCAGA（配列番号１）
リバースプライマー：CCTGTCCTCCCACCTCTTCAT（配列番号２）
プローブ（ＦＡＭ標識）：TAACCGCTAAGCAGTATGT（配列番号３）
【0031】
ＣＦＡ８遺伝子
フォワードプライマー：TGCAGAGTTTGATTTGTTGTTTGAA（配列番号４）
リバースプライマー：TGGAAGAAGGTGCATTTTTCTGA（配列番号５）
プローブ（ＶＩＣ標識）：AATGCCTTTGACCAGTGGGTAGCC（配列番号６）
フォワードプライマー：TGCAGAGTTTGATTTGTTGTTTGAA（配列番号４）
リバースプライマー：TGGAAGAAGGTGCATTTTTCTGA（配列番号５）
プローブ（ＶＩＣ標識）：AATGCCTTTGACCAGTGGGTAGCC（配列番号６）
【0032】
ＨＥＲ２およびＣＦＡ８プローブは、それぞれ６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および４，７，２’－トリクロロ－７’－フェニル－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）で標識した。ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３ＤデジタルＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して行った。すなわち、各１５μｌの反応混合物には、２Ｘ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３ＤデジタルＰＣＲマスターミックスｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、９００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭの各プローブおよびホルマリン固定パラフィン包埋標本のイヌ乳腺組織の２０ｎｇのゲノムＤＮＡが含まれるよう準備した。次いで、ＰＣＲ反応混合物をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３ＤデジタルＰＣＲチップローダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３ＤデジタルＰＣＲ ２０Ｋチップｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にロードした。２０Ｋチップには２０，０００個のウェルが含まれ、その中にＤＮＡをランダムかつ均一に分布させた。増幅は、ＰｒｏＦｌｅｘＴＭ ２ｘ Ｆｌａｔ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、以下の条件下で実施した。
・９６℃で１０分間の変性。
・６０℃で２分間、９８℃で３０秒間、６０℃で２分間を３９サイクル。
・その後温度を１０℃に維持。
・９６℃で１０分間の変性。
・６０℃で２分間、９８℃で３０秒間、６０℃で２分間を３９サイクル。
・その後温度を１０℃に維持。
【0033】
次いで、ＰＣＲチップをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３ＤデジタルＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にロードした。ポジティブおよびネガティブのプロットをカウントし、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ３Ｄ ＡｎａｌｙｓｉｓＳｕｉｔｅＴＭバージョン３．１．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でポアソン分布を使用してＨＥＲ２：ＣＦＡ８比を計算した。
【0034】
（４）結果
ア 乳腺組織におけるＨＥＲ２コピー数
正常組織サンプル、乳腺腫組織サンプルおよび乳癌組織サンプルにおけるＨＥＲ２：ＣＦＡ８比の中央値（範囲）は、それぞれ０．８８（０．６９～０．９８）、１．００（０．６１～１．１８）および１．１０（０．６１～２．３５）であった（図１）。乳癌組織サンプルにおけるＨＥＲ２：ＣＦＡ８の比率は、正常組織サンプルよりも有意に高かったが（Ｐ＝０．００６８）、乳腺腫症例よりもやや高かった（図１）。正常組織サンプルと乳腺腫組織サンプルの比率には有意差はなかった。
ア 乳腺組織におけるＨＥＲ２コピー数
正常組織サンプル、乳腺腫組織サンプルおよび乳癌組織サンプルにおけるＨＥＲ２：ＣＦＡ８比の中央値（範囲）は、それぞれ０．８８（０．６９～０．９８）、１．００（０．６１～１．１８）および１．１０（０．６１～２．３５）であった（図１）。乳癌組織サンプルにおけるＨＥＲ２：ＣＦＡ８の比率は、正常組織サンプルよりも有意に高かったが（Ｐ＝０．００６８）、乳腺腫症例よりもやや高かった（図１）。正常組織サンプルと乳腺腫組織サンプルの比率には有意差はなかった。
【0035】
乳腺組織におけるＨＥＲ２コピー数増加の普遍的な閾値を決定するために、正常組織サンプルにおけるＨＥＲ２：ＣＦＡ８比の平均＋３×標準偏差が計算され、１．１２であることが判明した。従って、ＨＥＲ２：ＣＦＡ８比＞１．１２が普遍的閾値として定義された。この閾値に基づいて、ＨＥＲ２コピー数増加は１４／３４（４１％）の乳癌組織サンプルと２／１４（１４％）の乳腺腫組織サンプルで検出された（表１）。正常組織サンプルではＨＥＲ２コピー数増加は検出されなかった。
【0036】
【表1】
【0037】
イ 乳腺組織におけるＨＥＲ２タンパク質の発現
各サンプルのＨＥＲ２免疫反応性は以下の通りであった。
正常組織サンプル：７／８（８８％）がスコア０、１／８（１３％）がスコア１＋。
乳腺腫組織サンプル：２／１４（１４％）がスコア０、１０／１４（７１％）がスコア１＋、２／１４（１４％）がスコア２＋。
乳癌組織サンプル：１３／３４（３８％）がスコア０、１２／３４（３５％）がスコア１＋、６／３４（１８％）がスコア２＋、３／３４（９％）がスコア３＋。
各サンプルのＨＥＲ２免疫反応性は以下の通りであった。
正常組織サンプル：７／８（８８％）がスコア０、１／８（１３％）がスコア１＋。
乳腺腫組織サンプル：２／１４（１４％）がスコア０、１０／１４（７１％）がスコア１＋、２／１４（１４％）がスコア２＋。
乳癌組織サンプル：１３／３４（３８％）がスコア０、１２／３４（３５％）がスコア１＋、６／３４（１８％）がスコア２＋、３／３４（９％）がスコア３＋。
【0038】
すべての正常組織サンプルおよび乳腺腫組織サンプルは、ＨＥＲ２過剰発現ネガティブとして分類されたが、乳癌組織サンプルにおいては、ＨＥＲ２過剰発現ポジティブが、３／３４（９％）で観察された（表１）。
【0039】
また、ＨＥＲ２コピー数増加は、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現を伴う２／３（６７％）の乳癌組織サンプルで検出されたが、ＨＥＲ２過剰発現は、ＨＥＲ２コピー数増加を伴う２／１４（１４％）の乳癌組織サンプルで観察された（表２）。ＨＥＲ２コピー数増加とＨＥＲ２のタンパク質過剰発現との間に有意な相関は認められなかった。
【0040】
【表2】
【0041】
ウ ＨＥＲ２コピー数増加およびタンパク質過剰発現の生存率への影響
乳癌組織サンプルの症例はすべて生存分析に使用された。ＨＥＲ２コピー数増加およびタンパク質過剰発現のそれぞれの生存率への影響をカプラン－マイヤー曲線で図２に示した。
乳癌組織サンプルの症例はすべて生存分析に使用された。ＨＥＲ２コピー数増加およびタンパク質過剰発現のそれぞれの生存率への影響をカプラン－マイヤー曲線で図２に示した。
【0042】
乳癌組織サンプルの症例には、ＨＥＲ２コピー数増加を伴う１４例と、ＨＥＲ２コピー数増加を伴わない２０例が含まれていた。２つのグループ間で年齢と避妊去勢手術の状態に有意差は見られなかった。本研究中に、２１／３４の乳癌症例が死亡した。死亡したイヌには、ＨＥＲ２コピー数増加を伴う１０例と、ＨＥＲ２コピー数増加を伴わない１１例が含まれていた。ＨＥＲ２コピー数増加を伴う場合と伴わない場合の生存期間の中央値は、それぞれ２４３日（範囲：７９～７１１日）および５１５日（範囲：１１～２００８日）であった。ＨＥＲ２コピー数増加を伴う症例の生存期間は、ＨＥＲ２コピー数増加を伴わない症例よりも大幅に短かった（Ｐ＝０．０２７６；図２Ａ）。
【0043】
乳癌組織サンプルの症例にはまた、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を伴う３例と、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を伴わない３１例が含まれていた。２つのグループ間で年齢と避妊去勢手術の状態に有意差は見られなかった。本研究中に、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を伴う２例と、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を伴わない１９例が死亡した。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を伴う場合と伴わない場合の生存期間の中央値は、それぞれ７１１日（範囲：９９～２００８日）と３１３日（範囲：１１～１６１５日）であった。２つのグループ間で生存期間に有意差は見られなかった（Ｐ＝０．３４６６；図２Ｂ）。
【0044】
エ 考察
乳癌に罹患したイヌにおいて、ＨＥＲ２コピー数増加を伴う群はＨＥＲ２コピー数増加を伴わない群と比較して生存期間が有意に短く、予後が不良であった。一方、乳癌に罹患したイヌにおいて、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現を伴う群とＨＥＲ２タンパク質過剰発現を伴わない群との間には生存期間に有意差が認められなかった。ここで、乳癌に罹患したイヌにおいて、乳腺組織サンプルにおけるＨＥＲ２コピー数増加とＨＥＲ２のタンパク質過剰発現との間には有意な相関は認められなかった。従って、乳癌に罹患したイヌ科動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数は、被験動物の予後の指標となるが、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現は被験動物の予後の指標とはならないことが示された。
乳癌に罹患したイヌにおいて、ＨＥＲ２コピー数増加を伴う群はＨＥＲ２コピー数増加を伴わない群と比較して生存期間が有意に短く、予後が不良であった。一方、乳癌に罹患したイヌにおいて、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現を伴う群とＨＥＲ２タンパク質過剰発現を伴わない群との間には生存期間に有意差が認められなかった。ここで、乳癌に罹患したイヌにおいて、乳腺組織サンプルにおけるＨＥＲ２コピー数増加とＨＥＲ２のタンパク質過剰発現との間には有意な相関は認められなかった。従って、乳癌に罹患したイヌ科動物から得られた乳腺組織におけるＨＥＲ２遺伝子のコピー数は、被験動物の予後の指標となるが、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現は被験動物の予後の指標とはならないことが示された。
【図1】
【図2】
【配列表】