特開 2023-102604 アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質製造法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023102604

(43)【公開日】2023-07-25

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質製造法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20230718BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20230718BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20230718BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230718BHJP

【ＦＩ】

C12P21/02 C ZNA

C07K16/10

C07K14/705

C12N1/21

C12N15/09

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022003193

(22)【出願日】2022-01-12

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】湯本 達弥

(72)【発明者】

【氏名】大江 正剛

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA26X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】 遺伝子工学的手法により得られた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を用いて、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供すること。
【解決手段】 誘導性のプロモーターおよびＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を培養する工程と、前記大腸菌の菌体濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下に達した時点で終濃度で０．０４ｍＭ以上４ｍＭ以下となるようイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加し、前記大腸菌からＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、前記発現したＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質製造法により、前記課題を解決する。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

誘導性のプロモーターおよびアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を培養する工程と、
前記大腸菌の菌体濃度が一定濃度に達した時点で誘導剤を添加し、前記大腸菌からアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質を発現させる工程と、
前記発現したアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質を回収する工程とを含む、
アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質製造法であって、
前記一定濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下であり、前記誘導剤が終濃度で０．０４ｍＭ以上４ｍＭ以下のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドである、前記製造法。

【請求項2】

遺伝子組換え大腸菌を培養する工程を、炭素源および窒素源を含む流加液を培養途中に流加する、流加培養で実施し、かつ培養開始時の培地ならびに前記流加液に含まれる炭素源および窒素源が、それぞれ以下に示す態様である、請求項１に記載の製造法；
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。

【請求項3】

アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつアデノ随伴ウイルス結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつアデノ随伴ウイルス結合活性を有するポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を用いて、前記タンパク質を効率的に製造する方法に関する。特に本発明は、高密度に培養した前記大腸菌から、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現させることで、前記タンパク質を効率的に製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、以下、ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）の非エンベロープ型一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型のＡＡＶは、正二十面体構造の直径２０ｎｍから３０ｎｍ程の粒子であり、３種類のカプシドタンパク（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）約６０分子が、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで構成されている。自立した増殖能は無く、増殖にはアデノウイルスやヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスを必要とする。ウイルス粒子の中には約５ｋｂの一本鎖ゲノムＤＮＡが格納されている。ゲノムＤＮＡの構成としては、両末端にＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と言われる、複製やウイルス粒子中へのゲノムＤＮＡのパッケージングに関与するＴ字型のヘアピン構造を有し、２つのＩＴＲに挟まれる形で、複製や転写を調節するＲｅｐタンパク（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）、ウイルス粒子を形成するカプシドタンパク（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）、およびウイルス粒子の形成を促進するＡＡＰ（Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードしたポリヌクレオチドを有している。

【0003】

ＡＡＶは近年、遺伝子治療用ベクターとしての開発が急速に押し進められている。一例として、２０１２年に遺伝子治療薬として初めてＥＭＤ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）に承認されたリポ蛋白リパーゼ欠損症の治療薬であるＧｌｙｂｅｒａ（ｕｎｉＱｕｒｅ社製）や、２０１７年に遺伝子治療薬として初めてＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認された希少疾患遺伝性網膜ジストロフィーの治療薬であるＬｕｘｔｕｒｎａ（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）があり、新たな治療法として注目されている。

【0004】

遺伝子治療用ベクターとしてのＡＡＶの特長は、非分裂細胞（神経細胞、筋細胞、肝細胞等）へ効率良く遺伝子導入が可能なこと、標的細胞で遺伝子発現が長期間持続すること、ＡＡＶが非病原性ウイルスであり他のウイルスベクターと比較し高い安全性が期待できること、等が挙げられる。一方で、遺伝子発現効率が高くないため、治療効果を発揮するためには膨大な量のベクターを必要とするといった欠点がある。

【0005】

遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単にＡＡＶベクターとも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。

【0006】

ＡＡＶベクターの精製にあたっては、不溶性担体と、当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィーによる方法が知られている（特許文献１）。しかしながら前記吸着剤で使用する、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造を、遺伝子工学的手法により得られた、前記タンパク質を発現可能な大腸菌を用いて行なう場合、培地当たりの前記タンパク質の発現量が低いという課題があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】ＷＯ２０２１／１０６８８２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、遺伝子工学的手法により得られた、アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質を発現可能な大腸菌を用いて、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは前記課題に対し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な大腸菌の培養条件、および当該タンパク質の発現条件を鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。

【0010】

すなわち本発明の第一の態様は、
誘導性のプロモーターおよびＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を培養する工程と、
前記大腸菌の菌体濃度が一定濃度に達した時点で誘導剤を添加し、前記大腸菌からＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、
前記発現したＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、
ＡＡＶ結合性タンパク質製造法であって、
前記一定濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下であり、前記誘導剤が終濃度で０．０４ｍＭ以上４ｍＭ以下のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である、前記製造法である。

【0011】

また本発明の第二の態様は、
遺伝子組換え大腸菌を培養する工程を、炭素源および窒素源を含む流加液を培養途中に流加する、流加培養で実施し、かつ培養開始時の培地ならびに前記流加液に含まれる炭素源および窒素源が、それぞれ以下に示す態様である、前記第一の態様に記載の製造法である；
［培養開始時の培地］炭素源：２０ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：８０ｇ／Ｌ以下の酵母エキス
［流加液］炭素源：３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下のグルコース、窒素源：１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下の酵母エキス。

【0012】

また本発明の第三の態様は、
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記第一または第二の態様に記載の製造法である；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

本発明において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株の限定は特になく、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌Ｗ３１１０株、および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が例示できる。

【0015】

本発明において、大腸菌の遺伝子組換えに用いる、誘導性のプロモーターおよびＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入する発現ベクターは、大腸菌で異種タンパク質を発現可能なベクターであれば良く、一例としてｐＵＣプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、およびｐＥＴプラスミドベクターが挙げられる。

【0016】

本発明の製造法で製造するＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶと結合可能なポリペプチドであれば特に制限はなく、インテグリンなどのラミニン受容体、抗ＡＡＶ抗体やＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が例示できる。

【0017】

ＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶＲである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドが挙げられる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。

【0018】

なお配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＡＶＲの一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（公式データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、アクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である。

【0019】

前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１およびＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、
ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。

【0020】

前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、が挙げられる。また前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換が挙げられる。

【0021】

前記（ｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。

【0022】

なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。

【0023】

前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。

【0024】

本発明の製造法で製造するＡＡＶ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質が存在する溶液からの分析・精製の迅速化やタンパク質の安定化等に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、Ｃ－ｍｙｃタグ等が挙げられる。

【0025】

さらに本発明の製造法で製造するＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよく、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ，ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。

【0026】

本発明において、発現ベクターに挿入するＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは例えば、
（Ｉ）ＡＡＶ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＡＡＶ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、
で作製できる。

【0027】

前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。具体的には、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。

【0028】

本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地は前記大腸菌が増殖し、かつＡＡＶ結合性タンパク質が発現し得るものであればよい。炭素源の一例として、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、粗糖、糖蜜が挙げられ、中でもグルコースが好ましい。窒素源は酵母エキスが好ましいが、ポリペプトン、カゼインおよびその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキス等を窒素源として用いても良い。無機塩の一例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、硫酸マンガン（ＩＩ）、塩化マンガン（ＩＩ）が挙げられる。ビタミン類の一例としては、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンが挙げられる。

【0029】

本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養方法に特に限定はなく、回分培養、半回分培養（流加培養ともいう）、および潅流培養のいずれかで培養してもよく、それらを組み合せて培養してもよい。ただし培養開始時に炭素源や窒素源といった栄養源を一度に培地に投入すると、大腸菌の増殖および前記大腸菌によるＡＡＶ結合性タンパク質の発現が阻害され、かつ有機酸などの副生成物も生産されるため、前記タンパク質の発現効率および得られた前記タンパク質の品質に悪影響を与える可能性がある。そのため、培養開始時に投入する栄養源は最小限とし、培養中に栄養源を適宜供給（流加）しながら培養する流加培養で遺伝子組換え大腸菌を培養すると好ましい。

【0030】

本発明において、遺伝子組換え大腸菌の培養を流加培養で行なう際、培養開始時に投入する炭素源および窒素源の濃度は、炭素源がグルコースの場合は２０ｇ／Ｌ以下に、窒素源が酵母エキスの場合は８０ｇ／Ｌ以下に、それぞれすると好ましい。流加する炭素源と窒素源は高濃度の溶液とすると培養液の液量増加を抑えられるため好ましい。具体的には、
炭素源がグルコースの場合は３００ｇ／Ｌ以上９００ｇ／Ｌ以下に、窒素源が酵母エキスの場合は１００ｇ／Ｌ以上５００ｇ／Ｌ以下に、それぞれすると好ましい。なお前述した無機塩をさらに加えても良い。

【0031】

流加培養で遺伝子組換え大腸菌を培養する際、炭素源および窒素源の流加は、培地中における当該炭素源および窒素源の濃度を所定の低濃度を維持しながら行なう必要がある。なお本明細書において「所定の低濃度」とは、炭素源が枯渇せず有機酸等の副生成物が生産しない濃度のことをいう。具体例として、グルコースを炭素源とした場合、炭素源濃度が５ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行なうと、副生成物である有機酸の蓄積により大腸菌の増殖やＡＡＶ結合性タンパク質の発現を抑制する可能性があることから、少なくとも５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下である。炭素源の枯渇をモニターする方法に特に限定はなく、一例として呼吸活性の低下によりモニターできる。呼吸活性の低下は、例えば培養液の溶存酸素濃度（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ、以下、ＤＯ）の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇、炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特に、ＤＯは炭素源が枯渇すると微生物の呼吸活性が低下し急激に上昇することから、応答が速い点で、炭素源の枯渇をモニターするのに好ましい指標である。

【0032】

本発明における、遺伝子組換え大腸菌の培養条件は、大腸菌が増殖し、かつＡＡＶ結合性タンパク質を発現し得るものであれば特に限定は無いが、培養温度は１５℃以上５０℃以下が好ましく、特に好ましい温度は２０℃以上３３℃以下である。ｐＨは６以上８以下が好ましい。培養時間は任意に設定できるが、通常は数時間以上１００時間以下に設定される。

【0033】

本発明の製造方法は、誘導性のプロモーターおよびＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を培養することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を製造する際、培養液中に含まれる前記大腸菌の濃度が一定の高濃度（高密度）に達した時点で、誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度で０．０４ｍＭ以上４ｍＭとなるよう添加することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現させることを特徴としている。なお本明細書において「一定の高濃度（高密度）」とは、菌体濃度が６００ｎｍの吸光度（ＯＤ_６００）で７０以上１２０以下のことを指し、好ましくはＯＤ_６００で９０以上１２０以下である。またＩＰＴＧの添加量を、終濃度で０．０８ｍＭ以上０．４ｍＭ以下にするとＡＡＶ結合性タンパク質の発現量が特に向上するため、好ましい。

【0034】

前述した方法で発現したＡＡＶ結合性タンパク質を回収するには、遺伝子組換え大腸菌における前記タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して前記タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＡＡＶ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することで菌体を破砕し、ＡＡＶ結合性タンパク質を抽出後、精製すればよい。

【0035】

回収したＡＡＶ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製が挙げられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、前記タンパク質を高純度に調製できる。

【0036】

得られたＡＡＶ結合性タンパク質のＡＡＶに対する結合活性を測定する方法としては、例えば一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ－ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いてＡＡＶ結合性タンパク質を分離後、色素や免疫学的方法で染色し比色定量する方法が挙げられる。また別の例として、ＡＡＶに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記）や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。ＥＬＩＳＡ法による活性定量で求めてもよいが、後者の方法が簡便で好ましい。ＥＬＩＳＡ法におけるＡＡＶ結合性タンパク質と反応させる抗体の組み合わせは前記タンパク質が定量できる方法であれば特に限定されない。ＥＬＩＳＡの検出法についても特に限定はなく、例えば、市販されている、標識に用いた酵素の特異的発色試薬、蛍光試薬または化学発光試薬を用いて検出すればよい。具体的には、標識に用いた酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた場合は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＢｅｎｚｉｄｉｎｅ）などの発色基質をＨＲＰおよび過酸化水素で酸化反応後、比色定量する方法がある。なお結合活性の測定に使用するＡＡＶは、ＡＡＶベクターでもＶＬＰ（ウイルス様粒子）でもよい。また、ＡＡＶ結合性タンパク質に対し結合活性を示せば、どのセロタイプ（血清型）のＡＡＶベクターおよびＶＬＰを使用してもよい。

【発明の効果】

【0037】

本発明は、誘導性のプロモーターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌を一定の菌体濃度になるまで培養し、誘導剤を添加することでＡＡＶ結合性タンパク質を発現させた後、当該発現したタンパク質を回収することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を製造する方法において、前記一定の菌体濃度が６００ｎｍの吸光度で７０以上１２０以下の高密度であり、添加する誘導剤が終濃度０．０４ｍＭ以上４ｍＭ以下のイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドであることを特徴としている。本発明により、ＡＡＶ結合性タンパク質を大量かつ効率良く製造できる。なお本発明の製造方法で得られたＡＡＶ結合性タンパク質は医薬品、臨床検査薬、バイオセンサーやＡＡＶ分離剤のリガンドとして利用できる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】誘導時に添加するＩＰＴＧの量と、アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の培養液当たりの生産量との関係をまとめた結果を表した図である。

【実施例0039】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0040】

実施例１ 誘導剤濃度検討
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質ＡＶＲ１０ｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）および誘導性のプロモーターを挿入した発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を、２×ＹＴ培地（トリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩：５０ｍｇ／Ｌ）に植菌し、３０℃で１６時間、前培養を行なった。なおＡＶＲ１０ｓ（配列番号２）は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＩＺＡ０、配列番号１）の細胞外ドメイン１および２（ＰＫＤ１およびＰＫＤ２）に相当する、３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基において、以下の（ｉ）から（ｘ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では６番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ｉｉ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では３１番目）のチロシンがセリンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では５１番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｖ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では６０番目）のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１の３８１番目（配列番号２では７０番目）のバリンがアラニンに置換
（ｖｉ）配列番号１の３８２番目（配列番号２では７１番目）のイソロイシンがバリンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では７９番目）のグリシンがセリンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では８８番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ｉｘ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１６５番目）のセリンがアルギニンに置換
（ｘ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では１７６番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換

【0041】

（２）表１に示す組成からなる培地１．２Ｌに（１）の前培養液３６ｍＬを添加して、本培養を行なった。培養装置はエイブル社製ＢＭＳ－０３ＰＩを使用し、撹拌速度４００から７００ｒｐｍ、空気の通気量１．５Ｌ／分、培養温度３０℃、ｐＨ６．８から７．２とした。なお培養中におけるｐＨの変動は、１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水または５０％（ｗ／ｖ）リン酸の添加により前記範囲に制御した。

【0042】

【表1】

【0043】

（３）ＢＭＳ－０３ＰＩに付属のＤＯ（溶存酸素濃度）電極により測定したＤＯが４０％飽和を超えた時点で流加ポンプを起動し、ＤＯが再び４０％飽和以下となるまで表２に示す組成からなる流加培地を供給する操作を、培養終了まで継続した。

【0044】

【表2】

【0045】

（４）培養開始１９時間後から２１時間後の時点で、培養温度を２５℃、撹拌速度を６００ｒｐｍに変更し、ＩＰＴＧを添加することで、ＡＡＶ結合性タンパク質の発現誘導をかけた。なお培養開始１９時間後から２１時間後の時点で、培養液の６００ｎｍの吸光度（ＯＤ_６００）は７０から１２０の範囲内にあり、添加したＩＰＴＧは終濃度で０．００４４ｍＭ、０．０２３ｍＭ、０．０５１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５５ｍＭ、２．７ｍＭのいずれかである。

【0046】

（５）培養開始から４８時間後、培養を終了し、培養液の遠心分離により、培養菌体を回収した。

【0047】

（６）得られた菌体を、市販の抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、メルク社製）を用いて、試薬に添付の標準プロトコルに従い抽出し、遠心分離操作により上清（無細胞抽出液）を得た。

【0048】

（７）得られた無細胞抽出液を、濃度既知のＡＡＶ結合性タンパク質標準品と並べて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。

【0049】

（８）画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ １０．０、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＡＡＶ結合性タンパク質に相当するバンドの濃度を定量し、前記標準品における前記バンド濃度との比較から、無細胞抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を定量し、培養液当たりの生産量を算出した。

【0050】

比較例１ 誘導剤非添加での培養
実施例１（４）においてＩＰＴＧを添加しなかったこと、および実施例１（５）の培養終了時間を培養開始４３時間後としたこと以外は、実施例１と同様の操作を行なった。

【0051】

実施例１および比較例１での培養条件および培養結果を表３に示す。また実施例１および比較例１の培養で生産したＡＡＶ結合性タンパク質の、培養液当たりの生産量をまとめた結果を図１に示す。ＯＤ_６００で７０から１２０となる高密度条件で培養した、誘導性のプロモーターおよびＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを含む遺伝子組換え大腸菌から、前記タンパク質を発現させる際、誘導剤として終濃度０．０５５ｍＭ以上のＩＰＴＧを添加すると、ＩＰＴＧの添加量が終濃度０．０２３ｍＭ以下およびＩＰＴＧ未添加のときと比較し、培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質生産量が向上した。図１より、ＩＰＴＧの添加量が終濃度で０．１１ｍＭおよび０．２５ｍＭのとき、培養液当たりのＡＡＶ結合性タンパク質生産量が顕著に向上していた。

【0052】

【表3】

【図1】

【配列表】

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