特開 2023-109963 メタン生成補酵素を用いた電気化学的バイオガス生産システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023109963

(43)【公開日】2023-08-08

(54)【発明の名称】メタン生成補酵素を用いた電気化学的バイオガス生産システム

(51)【国際特許分類】

   C12P 5/02 20060101AFI20230801BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230801BHJP

   C12M 1/107 20060101ALN20230801BHJP

【ＦＩ】

C12P5/02

C12M1/00 H

C12M1/107

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023087168

(22)【出願日】2023-05-26

(62)【分割の表示】P 2021526831の分割

【原出願日】2020-06-17

(31)【優先権主張番号】P 2019118681

(32)【優先日】2019-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(72)【発明者】

【氏名】金子 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】辻村 清也

(57)【要約】      （修正有）

【課題】還元剤が不要な持続可能な反応系からなる、アルキル化合物を基質として炭化水素ガスを製造するための電気化学的リアクターシステムを提供する。
【解決手段】溶液中のメタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を、電極反応により電気化学的に維持しながら、補酵素Ｆ４３０によりアルキル化合物基質を還元して炭化水素ガスを生産できる電気化学的リアクターシステムであり、補酵素ＦＤ４３０に基質を添加するだけで持続可能なバイオガスの製造を可能とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

溶液中で炭素数が１～４のアルキル化合物を基質として、触媒として未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０を作用させて、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法。

【請求項2】

前記炭素数が１～４のアルキル化合物が、Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンであり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基である、請求項１に記載の炭化水素ガスを生産する方法。

【請求項3】

前記アルキル化合物Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－ＡのＡが、立体障害を起こさない無機または有機置換基である、請求項２に記載の炭化水素ガスを生産する方法。

【請求項4】

還元剤の存在下で行う、請求項１ないし３のいずれかに記載の炭化水素ガスを生産する方法。

【請求項5】

還元剤の非存在下、溶液中の未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元することにより、酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。

【請求項6】

溶液中に陰極である作用電極と対電極である陽極とを備え、陰極および陽極を電力供給源に接続した密閉した電気化学的リアクターを用いる、請求項５に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。

【請求項7】

前記酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０が触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０である、請求項５または６に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。

【請求項8】

さらに電子運搬体を用いる、請求項５または６に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。

【請求項9】

触媒反応後の酸化された不活性なメタン生成補酵素Ｆ４３０を、基質を含む触媒反応系中で電気化学的に還元して再生することを特徴とする、メタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法。

【請求項10】

還元剤の非存在下、溶液中に触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と、基質である炭素数が１～４のアルキル化合物と、電極とを存在させ、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性を電極反応により電気化学的に維持しながら触媒反応を行うことを特徴とする、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガス製造方法。

【請求項11】

密閉した触媒反応容器内の溶液中で、触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と基質である炭素数が１～４のアルキル化合物を反応させて、炭化水素ガスを製造する装置において、前記触媒反応容器内に、電力供給源に接続した陰極である作用電極と陽極とを備え、触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０を電気化学的に還元して再生することを特徴とする、炭化水素ガス製造装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、再生可能エネルギーの一種であるバイオマスから発生するバイオガスの従来の生産システムとは異なる、微生物を用いる必要のない新たなバイオガス生産システムに関する。

【背景技術】

【0002】

持続可能な社会の実現のためには、安全で安定的なエネルギーの供給が不可欠であることから、再生可能エネルギーの利用拡大が期待されている。再生可能エネルギーの一種としてのメタン発酵システムにより、バイオマスから発生するバイオガスの需要も拡大している。このバイオガスは、約６０％のメタンと約４０％の二酸化炭素、その他に硫化水素やシロキサン等の微量不純物を含む。
メタン発酵槽を用いる従来のバイオガス生産システムでは、微生物とバイオマスを使用する大規模な施設が必要なために、微生物の活性維持等その他の設備の維持、管理には多大なコストがかかり、バイオガスを安価に生産できないという欠点がある。

【0003】

この微生物が生産するバイオメタンとは、メタン生成菌によるメタンの生合成であり、メチル補酵素Ｍ還元酵素を介して行われる。
細胞の中（生体内）でメタンは７つの一連の反応によって生成され、メタン生成の基質は、二酸化炭素だけではなくメタノール、メチルアミン、ギ酸、酢酸など多様なＣ１、Ｃ２化合物がメタン生成の基質となり得る。そして、いずれの基質を用いる場合も一連の反応の最後のステップの反応は共通しており、それが、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）からメチル基が脱離してメタンが生じる反応である。この反応を触媒するのが、メチル補酵素Ｍ還元酵素であり、その酵素の触媒部位がメタン生成補酵素Ｆ４３０であることが既に解明されている（非特許文献１～３参照）。

【0004】

非特許文献１には、メタン生成菌からのメタン生成補酵素Ｆ４３０を、ペンタメチルエステル化修飾して活性化したＦ４３０Ｍ誘導体を用いて、生体外でＣＨ_３－Ｓ－、ＣＨ_３－Ｏ－、ＣＨ_３－ハロゲン等のメチル化合物をメタンに変換できるか実験したことが記載され、その結果、ヨウ化メタン等幾つかのメチル化合物のメタン化に成功したものの、細胞内での本来のメチル補酵素Ｍ還元酵素の基質であるＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭやジメチルスルフィド（ＤＭＳ）を、メタン化できなかったことが報告されている。
また、非特許文献２には、ペンタメチルエステル化Ｆ４３０の電極応答性を有機溶媒中で調べたことが、非特許文献３には、未修飾の熱抽出Ｆ４３０の有機溶媒中での電極応答性について、それぞれ報告されている。

【0005】

最近、嫌気性古細菌におけるブタン酸化の代謝経路の第１ステップで、メタンに特異的であるとされていたメチル補酵素Ｍ還元酵素がブタンに作用することが報告されており（非特許文献４）、メチル補酵素Ｍ還元酵素により、ブチルＳＣｏＭからブタンが生成されること、および他の短鎖アルカンでも同様であることが示唆されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】J.CHEM.SOC.,CHEM.COMMUN.(1988)P.293-294

【非特許文献2】J.AM.CHEM.SOC.(2003) Vol.125, No.43, p.13120-13125

【非特許文献3】Inorganica Chimica Acta (1990) Vol.170, p.161-163

【非特許文献4】Nature (2016) Vol.539, p.396-401

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

微生物を用いたバイオガス生産では、メタン菌の活性維持が困難であるという課題がある。本発明の解決しようとする課題は、メタン菌を用いないバイオガスの生産方法を提供することである。
また、本発明の課題の一つは、メタン生成を触媒するメタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を、電極反応により電気化学的に維持、コントロールする再生方法を提供することである。
さらに、本発明の課題は、メタン菌を用いないバイオガスの生産方法において、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性状態を電気化学的に維持、コントロールすることにより、還元剤が不要で持続可能な反応系からなるバイオガス生産システムを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、メチル補酵素Ｍ還元酵素から、メタン生成補酵素Ｆ４３０を単離するに際し、酸化を防ぐために低温条件下で単離し保存することにより、エステル化等の修飾をすることなく、安定的なネイティブＦ４３０標本を得ることに成功した。そして、この単離された未修飾Ｆ４３０を用いることにより、酵素の本来の基質であるＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ以外のメチル化合物、さらにはメチル以外のアルキル化合物を基質として還元することができ、メタンを含む炭化水素ガスを生産できることを見出し、本発明を完成した。

【0009】

また、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元反応には、補酵素Ｆ４３０を還元するための還元剤を必要とするが、還元剤を使わなくても、溶液中のＦ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元できることを見出した。そして、この２価のＮｉを有する酸化された補酵素Ｆ４３０を、電気化学的に還元して活性化するプロセスと、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元触媒反応による炭化水素ガス生産反応を組み合わせることにより、炭化水素ガス生産における持続可能な生産システムの構築に至り、本発明を完成させた。

【0010】

本発明は、以下の（１）ないし（４）の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法に関する。
（１）溶液中で炭素数が１～４のアルキル化合物を基質として、触媒として未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０を作用させて、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガスを生産する方法。
（２）前記炭素数が１～４のアルキル化合物が、Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンであり、Ｒは炭素数１～４のアルキル基である、上記（１）に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
（３）前記アルキル化合物Ｒ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－ＡのＡが、立体障害を起こさない無機または有機置換基である、上記（２）に記載の炭化水素ガスを生産する方法。
（４）還元剤の存在下で行う、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の炭化水素ガスを製造する方法。

【0011】

また、本発明は、以下の（５）ないし（８）の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法、または（９）のメタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法に関する。
（５）還元剤の非存在下、溶液中の未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）を、電極反応により電気化学的にＮｉ（１価）に還元することにより、酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（６）溶液中に陰極である作用電極と対電極である陽極とを備え、陰極および陽極を電力供給源に接続した密閉した電気化学的リアクターを用いる、上記（５）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（７）前記酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０が触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０である、上記（５）または（６）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（８）さらに電子運搬体を用いる、上記（５）または（６）に記載の酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を還元して活性化する方法。
（９）触媒反応後の酸化された不活性なメタン生成補酵素Ｆ４３０を、基質を含む触媒反応系中で電気化学的に還元して再生することを特徴とする、メタン生成補酵素Ｆ４３０のメタン生成補酵素活性を維持する方法。

【0012】

さらに、本発明は、以下の（１０）の炭化水素ガス製造方法、または（１１）の炭化水素ガス製造装置に関する。
（１０）還元剤の非存在下、溶液中に触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と、基質である炭素数が１～４のアルキル化合物と、電極とを存在させ、メタン生成補酵素Ｆ４３０の活性を電極反応により電気化学的に維持しながら触媒反応を行うことを特徴とする、基質と同じ炭素数の炭素数１～４の炭化水素ガス製造方法。
（１１）密閉した触媒反応容器内の溶液中に、触媒である未修飾のメタン生成補酵素Ｆ４３０と基質である炭素数が１～４のアルキル化合物を反応させて、炭化水素ガスを製造する装置において、前記触媒反応容器内に、電力供給源に接続した陰極である作用電極と陽極とを備えて、触媒反応後のメタン生成補酵素Ｆ４３０を電気化学的に還元して再生することを特徴とする、炭化水素ガス製造装置。

【発明の効果】

【0013】

本発明の炭素数１～４の炭化水素ガスを製造する方法によれば、従来のバイオガス生産におけるメタン発酵槽による微生物とバイオマスを使用する大規模な施設が不要なために、設備の維持、管理にかかるコストが少なく、バイオガスを安価に生産することができる。
また、生体内のメタン生成補酵素Ｆ４３０が基質にできないアルキル化合物を基質とできるため、メタン以外の炭化水素を、一段階の触媒反応により簡単に製造することができる。

【0014】

さらに、触媒反応により酸化されたメタン生成補酵素Ｆ４３０を、還元剤を用いることなく、電極反応により電気化学的に還元して活性化して再生できるため、触媒反応容器中に基質を添加するだけで、持続可能に炭化水素ガスを製造することができるという、還元剤が不要なクリーンな反応系からなる小規模施設での革新的なバイオガス生産システムを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】未修飾メタン生成補酵素Ｆ４３０による、３種類の異なる基質からの化学的メタン生成実験結果を示す。

【図2】メタン生成補酵素Ｆ４３０を用いた電気化学的メタン生成の反応様式の概略図を示す。

【図3】電極－メディエーター－メタン生成補酵素Ｆ４３０－基質相互作用を示すサイクリックボルタンメトリーの結果。

【図4】電気化学的メタン生成実験結果を示す。

【図5】電極－メディエーター－メタン生成補酵素Ｆ４３０－基質相互作用の系を用いて、３種類の異なる炭素数２～４の基質からの化学的炭化水素ガス生成実験結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、古細菌のメタン生成菌によるメタンの生合成の最終段階において、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）からメチル基が脱離してメタンが生じる反応を触媒するメチル補酵素Ｍ還元酵素から、その酵素の触媒部位であるメタン生成補酵素Ｆ４３０を、化学構造を維持した状態で単離精製できたことに基づき、発展、完成させたものである。

【0017】

メタン生成補酵素Ｆ４３０（以下、「補酵素Ｆ４３０」ともいう。）の化学構造は、式（１）に示すニッケル含有修飾テトラピロールであり、二重結合が５つしかない最も還元されたテトラピロール構造を有する。

【化1】

【0018】

メタン生成菌中で補酵素Ｆ４３０が触媒する反応は、メチル補酵素Ｍ還元反応であり、下記式（２）の反応によりメタンを生成する。

【化2】

【0019】

本発明者らにより、メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ由来のメチル補酵素Ｍ還元酵素から、補酵素Ｆ４３０を低温条件で単離し保存することにより、化学構造を維持した未修飾の補酵素Ｆ４３０標品を単離精製することができた。
本明細書において未修飾の補酵素Ｆ４３０とは、末端の基が修飾されていないネイティブな補酵素Ｆ４３０を意味する。また、未修飾の補酵素Ｆ４３０は、既知の全てのメタン生成菌から単離精製することが可能である。

【0020】

未修飾の補酵素Ｆ４３０の単離精製は、まず、メタン生成菌を水溶液中氷浴上で超音波破砕を行い、抽出液を遠心分離して上澄み液を回収する。Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）カラムに上澄み液を通液し、濾液を全て回収し、次にこの濾液を、Ｃ１８固相抽出カラム（Ｓｅｐ－ｐａｃｋ Ｗａｔｅｒ社製）に通液し、吸着成分をメタノールで回収し、補酵素Ｆ４３０画分とする。補酵素Ｆ４３０画分は、ＨＰＬＣ作業までエバポレーターで乾固し、－２０℃で保存する。

【0021】

補酵素Ｆ４３０画分からの補酵素Ｆ４３０の精製は、２段階の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行う。
１段階目のＨＰＬＣは、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＳｅｍｉＰｒｅｐ ＲＰ－１８ｅを用いてグラジエント分析にて行い、補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離する。２段階目のＨＰＬＣは、ＨＹＰＥＲＣＡＲＢ ５μｍを用いてグラジエント分析にて行い、補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離する。
脱塩のため、希釈した単離溶液をＨＬＢ固相抽出カラムに通液し、吸着成分をメタノールで回収する。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、補酵素Ｆ４３０精製物とする。精製した補酵素Ｆ４３０は－２０℃で保存する。

【0022】

この補酵素Ｆ４３０精製物を触媒として使用し、緩衝液にＦ４３０と基質候補と還元剤を添加して室温で反応させ、補酵素Ｆ４３０により還元されて炭化水素ガスを生産できる基質を探索した結果、本来の基質であるＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭの他にも、この基質と還元部位の構造が類似するＲ－Ｓ－Ａ、Ｒ－Ｏ－Ａ、またはＲ－ハロゲンから選ばれるアルキル化合物を還元できることがわかった。ここで、置換基Ｒは、炭素数が６以下のアルキル基であり、好ましくは炭素数１～４のアルキル基であり、補酵素Ｆ４３０により還元され、対応する炭素数が１～６の炭化水素ガスが生産される。様々な基質と反応させて炭化水素ガスを生産できる。
置換基Ａは、立体障害を起こさない無機または有機置換基であって補酵素Ｆ４３０が基質として作用可能であれば任意の基が使用でき、金属、ハロゲン、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）、炭素数が１～２０好ましくは１～１０の低級または高級鎖状アルキル基、環状アルキル基等、芳香族基、安息香酸基、スルホニウム基が例示される。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。

【0023】

補酵素Ｆ４３０による反応は、嫌気性条件下で行われる。「嫌気性」とは、酸素の濃度が約１％未満の雰囲気に維持された液体または気体を有する密封反応容器を意味し、反応溶液を窒素やアルゴンなどの不活性ガスでバブリングして溶存酸素を脱気し、反応容器の上部空間を不活性ガスで置換することにより、通常達成される。

【0024】

この嫌気条件下、密閉反応容器の緩衝液中に、アルキル化合物基質と等量の還元剤と補酵素Ｆ４３０を加え、容器の上部空間を不活性ガスで置換して、室温で約１時間から２日反応させることにより、炭化水素ガスを生産することができる。反応性についてはｐＨ依存性があり、ｐＨ８以上のアルカリ条件が必要であり、ｐＨ１０付近で最大となる。
緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ、Ｔｒｉｓ／ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｃｈｅｓ、Ｃａｐｓ等の汎用の緩衝液を用いることができる。

【0025】

アルキル化合物の還元反応を触媒すると、補酵素Ｆ４３０に含まれるＮｉが、１価から２価に酸化されて補酵素Ｆ４３０が不活性になるため、触媒反応系には還元剤の添加が必要となる。還元剤としては、例えば、クエン酸チタン、ジチオナイト等の汎用の還元剤を用いることができる。還元剤の存在下、補酵素Ｆ４３０の作用によりＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭが還元されてメタンガスが生成し、生体反応を再現することができる。還元剤の存在下で補酵素Ｆ４３０を用いるメタン生成を、下記の電気化学的メタン生成と対照的に、本明細書において化学的メタン生成という。

【0026】

さらに、Ｒ－Ｓ－ＡのＡがアルキル基であるＤＭＳや、ハロゲンがＩであるＲ－ハロゲンを還元することもでき、メタンガスを生産できるだけでなく、Ｒがエチル基であるエチル化合物を基質にして、エタンガスを生産できるという新たな補酵素Ｆ４３０の機能が見出された。

【0027】

次に、還元剤を用いることなく、酸化された補酵素Ｆ４３０の２価のＮｉを、電極反応により電気化学的に１価に還元して活性化できるか試みた。この補酵素Ｆ４３０を用いる電気化学的メタン生成の反応様式の概略図を図２に示す。
図２のように電子運搬体を用いてもよく、例えば、ビオロゲン色素であるメチルビオロゲン（ＭＶ）等を用いる。ビオロゲン色素以外にも、アキノン色素、トリフエニルメタン色素、フタロシアニン類、メチン色素、ピロール色素、ポルフイリン誘導体等を用いることができるが、ビオロゲン色素のメチルビオロゲン、ベンジルビオロゲンが好ましい。
概略図では、電流源に由来する電子ｅが電子運搬体ＭＶに移され、この電子運搬体がその電子を酸化された補酵素Ｆ４３０に与え、補酵素Ｆ４３０を還元する。還元された補酵素Ｆ４３０は、基質であるＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ等を還元し、このようにして電気化学的にメタンガスが生成される。

【0028】

酸素を遮断して反応容器内で電気化学的に補酵素Ｆ４３０を還元する電気化学的還元において、緩衝液中に作用電極としての陰極と対電極としての陽極を挿入する。陰極には、金属、例えば、銅、鉄、ニッケル、水銀、または鋼や、炭素、グラファイトを用い、陽極には、白金、グラファイト、またはチタンを用いる。
緩衝液に、電子運搬体ＭＶのみを添加した場合をコントロールとして、ＭＶと補酵素Ｆ４３０と基質のＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭの三者を同時に添加した場合と、三者のうち二者を選択して同時に添加した場合で、スキャンレート１０ｍＶ／ｓでのサイクリックボルタンメトリーを行い、その結果、図３に示すように三者を同時に添加した場合のみ、図２の反応が進行して電流が流れたことから、酸化された補酵素Ｆ４３０のＮｉを、電極反応により電気化学的に還元して活性化できることが示された。

【0029】

補酵素Ｆ４３０が電気化学的に再生できることが確認されたことから、反応容器内で補酵素Ｆ４３０の中心金属Ｎｉ（２価）をＮｉ（１価）に電気化学的に還元するプロセスと、補酵素Ｆ４３０によるアルキル化合物の還元による炭化水素ガス生産反応を組み合わせた、炭化水素ガス製造のための新たな電気化学リアクターシステムを構築した。
図４に結果を示した実験では、密閉容器中の緩衝液に、補酵素Ｆ４３０と基質を添加して、挿入した電極に通電する。溶液のｐＨは６～１２、好ましくは８～１１、より好ましくはｐＨ１０で実施する。陰極電圧は、標準水素電極に対し－０．１～－１．５Ｖである。

【0030】

反応開始から経時的に生成物をガスクロマトグラフィーで解析した結果から、反応開始後約１時間でメタンおよびエチレンの生成が確認され、時間の経過に伴い生成物の量が線形的に増加することから、本発明の炭化水素ガス製造のための電気化学リアクターシステムが作動することが確認させた。

【0031】

以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【実施例0032】

＜補酵素Ｆ４３０の単離精製＞
メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉＤＳＭ ８００^Ｔ株を１％（約ｐＨ２）ギ酸水溶液中氷浴上で超音波破砕を行った。抽出液を遠心分離（１３０００ｇ×３０分）により固液分離して、上澄み液を回収した。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１晩平衡化したＱ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）をカラムに充填後、イオン交換水でコンディショニングを行い、カラムに上澄み液を通液し、濾液を全て回収した。Ｃ１８固相抽出カラム（Ｓｅｐ－ｐａｃｋ Ｗａｔｅｒ社製）をメタノールで洗浄し、１％ギ酸でコンディショニングを行い、上述の濾液を固相抽出カラムに通液し、吸着成分をメタノールで回収し、補酵素Ｆ４３０画分とした。補酵素Ｆ４３０画分は、ＨＰＬＣ作業までエバポレーターで乾固し、－２０℃で保存した。

【0033】

補酵素Ｆ４３０画分からの補酵素Ｆ４３０の精製は、２段階の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。
１段階目のＨＰＬＣは、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＳｅｍｉＰｒｅｐ ＲＰ－１８ｅ（１００ｍｍ×１０ｍｍ)を用いてグラジエント分析にて行った。移動相Ａ：１００ｍＭ ＮａＣｌＯ_４ ｉｎ ＨＣｌＯ_４／Ｈ_２Ｏ（ｐＨ２．３）,移動相Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，グラジエント条件：１ｍＬ／ｍｉｎ,０％ Ｂ ａｔ ０ｍｉｎ，２ｍｉｎまでに２０％ Ｂ，２０ｍｉｎまでに２６％Ｂ。
補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離した。単離溶液は移動相Ａにて５倍程度に希釈後、以下の方法で脱塩した。
メタノール洗浄および移動相Ａでコンディショニングを行ったＣ１８固相抽出カラムに、希釈単離溶液を通液し、吸着成分を２５０ｍＬのイオン交換水で洗浄後、メタノールで回収する。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、２段階目のＨＰＬＣ分析まで－２０℃で保存した。

【0034】

２段階目のＨＰＬＣは、ＨＹＰＥＲＣＡＲＢ ５μｍ（１００ｍｍ×９．５ｍｍ）を用いてグラジエント分析にて行った。移動相Ａ：ＨＣｌＯ_４／Ｈ_２Ｏ（ｐＨ１）,移動相Ｂ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，グラジエント条件：１ｍＬ／ｍｉｎ,０％ Ｂ ａｔ ０ｍｉｎ，３ｍｉｎまでに３０％ Ｂ，７０ｍｉｎまでに５３％Ｂ。
補酵素Ｆ４３０はフラクションコレクターを用いて単離した。単離溶液は移動相Ａにて５倍程度に希釈後、以下の方法で脱塩した。
メタノール洗浄および移動相Ａでコンディショニングを行ったＨＬＢ固相抽出カラムに、希釈単離溶液を通液し、吸着成分を２５０ｍＬのイオン交換水で洗浄後、メタノールで回収した。回収した溶液はエバポレーターで乾固し、補酵素Ｆ４３０精製物とした。精製した補酵素Ｆ４３０は－２０℃で保存した。

【実施例0035】

＜補酵素Ｆ４３０の基質＞
実施例１で精製した未修飾の補酵素Ｆ４３０を用いて、補酵素Ｆ４３０が基質とできるアルキル化合物を探索した。
補酵素Ｆ４３０ １μｍｏｌ、固体の基質ＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ １００μｍｏｌをバイアル瓶内に計りとり、Ｎ－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。還元剤であるクエン酸チタン １００μｍｏｌを添加後、水溶液をアルゴンバブリングにより脱気し、ブチルゴム栓およびアルミキャップを用いて密栓して、室温にて反応開始させた。
同様に、補酵素Ｆ４３０ １μｍｏｌを添加したバイアル瓶内のＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０．４）に、室温で液体のアルキル化合物 ＣＨ_３－Ｓ－ＣＨ_３（ｄｉｍｅｔｙｈｙｌｓｕｌｆｉｄｅ）またはＣＨ_３－Ｉ（ｉｏｄｅｍｅｔｈａｎｅ）各１００μｍｏｌと、還元剤であるクエン酸チタン １００μｍｏｌを添加後、水溶液をアルゴンバブリングにより脱気し、ブチルゴム栓およびアルミキャップを用いて密栓して、室温にて反応開始させた。

【0036】

経時的に気相を採取して、ガスクロマトグラフィーにより炭化水素成分の定量を行った。結果を図１に示し、補酵素Ｆ４３０は、３つのいずれの基質にも作用すること解明された。
メタン生成菌（生体）内では、メチル補酵素Ｍ（ＣｏＭ）を含む化合物（ＣＨ_３－Ｓ－ＣｏＭ：メチルＳＣｏＭ）を基質としてメチル基を還元する補酵素Ｆ４３０が、生体外で本来の基質を還元できることが初めて示された。さらに、本来の基質と作用部分の構造が類似したアルキル化合物を基質とできることがわかった。
しかも、補酵素Ｆ４３０の生体外反応では、本来の基質でない基質を用いた方がメタンガスの収率が高いことや、メタンが酸化重合したエチレンが生成することも観察された。