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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023121725
(43)【公開日】2023-08-31
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230824BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230824BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230824BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/10 ZNA
C12P21/08
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023002891
(22)【出願日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】P 2022024417
(32)【優先日】2022-02-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505155528
【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】梁 明秀
(72)【発明者】
【氏名】宮川 敬
(72)【発明者】
【氏名】笠松 誠
(72)【発明者】
【氏名】大竹 則久
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対し感染を阻害する抗体、および該抗体の製造方法を提供する。
【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各レセプター・バインディング・ドメイン（ＲＢＤ）をエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を提供する。
【選択図】図５０
【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各レセプター・バインディング・ドメイン（ＲＢＤ）をエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を提供する。
【選択図】図５０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各レセプター・バインディング・ドメイン（ＲＢＤ）をエピトープとして認識し、
かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項2】
さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、請求項１に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項3】
前記ＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項4】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
【請求項5】
前記抗体が、以下の（ａ）もしくは（ｂ）、又はこれらとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合において競合する抗体である、請求項１に記載の抗体：
（ａ）重鎖可変領域が、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１４に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体；
（ｂ）重鎖可変領域が、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１８に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号２１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
（ａ）重鎖可変領域が、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１４に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体；
（ｂ）重鎖可変領域が、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１８に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号２１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体のタンパク質部分をコードする、単離された
ＤＮＡ。
ＤＮＡ。
【請求項7】
以下の（ｃ）～（ｇ）の工程を含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の製造方法；
（ｃ）ＤＮＡ免疫法により、ヒト以外の動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の型のＲＢＤ遺伝子を含む発現ベクターを投与し、当該動物の抗体産生細胞を回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で回収した抗体産生細胞又はそれを用いて作製したハイブリドーマの中から、工程（ｃ）のＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を分泌する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ｈｉＶＮＴ法を用いて、ウイルス様粒子が細胞へ侵入することを阻害する効果が高い抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；並びに
（ｇ）工程（ｆ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマを培養し、産生された抗体を回収する工程。
（ｃ）ＤＮＡ免疫法により、ヒト以外の動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の型のＲＢＤ遺伝子を含む発現ベクターを投与し、当該動物の抗体産生細胞を回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で回収した抗体産生細胞又はそれを用いて作製したハイブリドーマの中から、工程（ｃ）のＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を分泌する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ｈｉＶＮＴ法を用いて、ウイルス様粒子が細胞へ侵入することを阻害する効果が高い抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；並びに
（ｇ）工程（ｆ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマを培養し、産生された抗体を回収する工程。
【請求項8】
工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に結合性をさらに有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択し、
製造される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、請求項７に記載の製造方法。
製造される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
工程（ｃ）において、ＲＢＤ遺伝子が配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項10】
工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の製造方法。
【請求項11】
工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して感染阻害活性を有する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は２０１９年から発生したウイルスであり、ウイルス表面から突出するスパイクタンパク質と大きなＲＮＡゲノムを特徴とするエンベロープを持った一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染はこのスパイクタンパク質の部分配列（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ：以下、ＲＢＤと記す）が宿主細胞の受容体と結合することをきっかけとし、ウイルスキャプシドと宿主細胞の融合後、ウイルスが細胞へと侵入する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には様々な株があり、当初見いだされた野生型や、その後見いだされた変異型Ｂ．１．１．７（以下、「アルファ型」とする。）、Ｂ．１．３５１（以下、「ベータ型」とする。）、Ｐ．１（以下、「ガンマ型」とする。）、Ｂ．１．６１７．２（以下、「デルタ型」とする。）、及びＢＡ．１（以下、「オミクロン型」とする。）等がある。特にスパイクタンパク質のアミノ酸残基に変異が起きたものの中には、自然感染またはワクチンにより獲得した抗スパイクタンパク質抗体の感染阻害活性を下げることがある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には様々な株があり、当初見いだされた野生型や、その後見いだされた変異型Ｂ．１．１．７（以下、「アルファ型」とする。）、Ｂ．１．３５１（以下、「ベータ型」とする。）、Ｐ．１（以下、「ガンマ型」とする。）、Ｂ．１．６１７．２（以下、「デルタ型」とする。）、及びＢＡ．１（以下、「オミクロン型」とする。）等がある。特にスパイクタンパク質のアミノ酸残基に変異が起きたものの中には、自然感染またはワクチンにより獲得した抗スパイクタンパク質抗体の感染阻害活性を下げることがある。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した時の治療方法の一つとして抗体カクテル療法が挙げられる。例えばこの手法であるＲＥＧＮ－ＣＯＶ２はプラセボに勝るウイルスロードの低減を確認している（非特許文献１）。
それ故、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の種類に関わらず感染阻害活性能のある抗体を開発することは重要である。
一方、抗体作製法として、ペプチドまたは組み換えタンパク質（大腸菌系、哺乳細胞系、無細胞系）を動物に免疫して抗体を得ることが一般的であるが、感染阻害活性を有する抗体を得ることは困難である。
それ故、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の種類に関わらず感染阻害活性能のある抗体を開発することは重要である。
一方、抗体作製法として、ペプチドまたは組み換えタンパク質（大腸菌系、哺乳細胞系、無細胞系）を動物に免疫して抗体を得ることが一般的であるが、感染阻害活性を有する抗体を得ることは困難である。
【0004】
また近年では、細胞単離技術と分子生物学技術の発展により、新型コロナ感染症回復者末梢血からウイルス感染阻害活性を有する抗体を産生するＢ細胞を単離して、遺伝子組み換え技術によって抗体を作製することも可能となりつつあるが、末梢血のＢ細胞からウイルス感染阻害活性を有する抗体を効率よく得ることは困難である。
一方、抗ウイルス抗体を作製するための手法の一つとしてＤＮＡ免疫法が知られている（特許文献１、非特許文献２から４）。この手法は抗原タンパク質遺伝子を含む発現ベクターを動物に投与することにより、動物の体内で天然の立体構造を有する抗原タンパク質が発現するため、抗原タンパク質に対して高い特異性や結合力を有した抗体の作製が可能である。
一方、抗ウイルス抗体を作製するための手法の一つとしてＤＮＡ免疫法が知られている（特許文献１、非特許文献２から４）。この手法は抗原タンパク質遺伝子を含む発現ベクターを動物に投与することにより、動物の体内で天然の立体構造を有する抗原タンパク質が発現するため、抗原タンパク質に対して高い特異性や結合力を有した抗体の作製が可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特表２００２－５３００６５号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎ．ＥＮＧＬ．ＭＥＤ．３８４；３（２０２１年）
【非特許文献2】ＪＳ．Ｂｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４，１ ４６２６－１４６３１（１９９７年）
【非特許文献3】Ｓ．Ｇｕｒｕｎａｙｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８．１．９２７（２０００年）
【非特許文献4】Ｄ．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６（６３６５ １５２－１５４）（１９９２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対し感染を阻害する抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを発現する遺伝子を投与したラットから作製した抗体産生ハイブリドーマから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染阻害活性を有するモノクローナル抗体を取得することに成功した。これらのモノクローナル抗体は、ＲＢＤをエピトープとし様々な株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して同様に感染阻害能を持っていた。
【0009】
即ち、上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各レセプター・バインディング・ドメイン（ＲＢＤ）をエピトープとして認識し、
かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［２］さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、［１］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［３］前記ＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、［１］又は［２］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［４］前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、［２］又は［３］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［５］前記抗体が、以下の（ａ）もしくは（ｂ）、又はこれらとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合において競合する抗体である、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体：
（ａ）重鎖可変領域が、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１４に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体；
（ｂ）重鎖可変領域が、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸
配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１８に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号２１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の抗体のタンパク質部分をコードする、単離されたＤＮＡ。
［７］以下の（ｃ）～（ｇ）の工程を含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の製造方法；
（ｃ）ＤＮＡ免疫法により、ヒト以外の動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の型のＲＢＤ遺伝子を含む発現ベクターを投与し、当該動物の抗体産生細胞を回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で回収した抗体産生細胞又はそれを用いて作製したハイブリドーマの中から、工程（ｃ）のＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を分泌する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ｈｉＶＮＴ法を用いて、ウイルス様粒子が細胞へ侵入することを阻害する効果が高い抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；並びに
（ｇ）工程（ｆ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマを培養し、産生された抗体を回収する工程。
［８］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に結合性をさらに有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択し、
製造される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、［７］に記載の製造方法。
［９］工程（ｃ）において、ＲＢＤ遺伝子が配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、［７］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各レセプター・バインディング・ドメイン（ＲＢＤ）をエピトープとして認識し、
かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有することを特徴とする、単離された、
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［２］さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、［１］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［３］前記ＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、［１］又は［２］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［４］前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、［２］又は［３］に記載の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体。
［５］前記抗体が、以下の（ａ）もしくは（ｂ）、又はこれらとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合において競合する抗体である、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体：
（ａ）重鎖可変領域が、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１４に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１５に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体；
（ｂ）重鎖可変領域が、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸
配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号１８に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ
軽鎖可変領域が、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び
配列番号２１に示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の抗体のタンパク質部分をコードする、単離されたＤＮＡ。
［７］以下の（ｃ）～（ｇ）の工程を含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して感染阻害活性を有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の製造方法；
（ｃ）ＤＮＡ免疫法により、ヒト以外の動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の型のＲＢＤ遺伝子を含む発現ベクターを投与し、当該動物の抗体産生細胞を回収する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で回収した抗体産生細胞又はそれを用いて作製したハイブリドーマの中から、工程（ｃ）のＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を分泌する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ｈｉＶＮＴ法を用いて、ウイルス様粒子が細胞へ侵入することを阻害する効果が高い抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程；並びに
（ｇ）工程（ｆ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマを培養し、産生された抗体を回収する工程。
［８］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に結合性をさらに有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択し、
製造される抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対して感染阻害活性を有する、［７］に記載の製造方法。
［９］工程（ｃ）において、ＲＢＤ遺伝子が配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１、２、３、４または５で示されるアミノ酸配列を含む、［７］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤのアミノ酸配列が、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む、［８］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対し感染阻害活性を有する抗体を得ることができる。また、好ましい態様においては、オミクロン型に対しても感染阻害活性を有する抗体を得ることができる。その抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療、予防、診断及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染メカニズムを解明するために利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の各ＲＢＤをエピトープとして認識し結合し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に対して宿主細胞への感染を阻害する活性を有する、単離された抗体であり、いわゆる中和抗体である。その中でもさらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤをもエピトープとして認識し、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対しても感染阻害活性を有する抗体が好ましい。なお、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体がエピトープとして認識し結合するのは、各ＲＢＤの全体又は部分であって良く、通常は部分である。
本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。好ましくはモノクローナル抗体である。
本明細書において「単離された」とは、生体内に存在するものではないことを意味する。例えば、ある個体で産生され、該個体内に存在する状態の抗体は含まれない。
本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。好ましくはモノクローナル抗体である。
本明細書において「単離された」とは、生体内に存在するものではないことを意味する。例えば、ある個体で産生され、該個体内に存在する状態の抗体は含まれない。
【0013】
本明細書において抗体とは特に限定は無く、インタクト（全長）の抗体でもよく、また
エピトープへの結合性を有する限りそのフラグメントであってもよい。
例えば、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖、および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子があげられる。
重鎖はそれぞれ、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。重鎖定常領域は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤのいずれの定常領域であってもよい。
軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。軽鎖定常領域は、κまたはλであってよい。
ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる高度に保存された領域とに分類される。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ 第５版）、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔの定義が最も一般的に使用されており、本明細書中のＣＤＲはＫａｂａｔの定義に基づいている。ＶＨ領域およびＶＬ領域はそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端への方向でＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。
エピトープへの結合性を有する限りそのフラグメントであってもよい。
例えば、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖、および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子があげられる。
重鎖はそれぞれ、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。重鎖定常領域は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤのいずれの定常領域であってもよい。
軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。軽鎖定常領域は、κまたはλであってよい。
ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる高度に保存された領域とに分類される。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ 第５版）、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔの定義が最も一般的に使用されており、本明細書中のＣＤＲはＫａｂａｔの定義に基づいている。ＶＨ領域およびＶＬ領域はそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端への方向でＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。
【0014】
なお本発明の抗体はマウス、ラット、ヒト、ウサギ、トリ、ヤギ等由来の抗体でもよく、由来する動物種に限定されるものではない。またＣＤＲを保存しＦＲを別の動物由来のアミノ酸残基に変更した改良抗体や、一つの抗体分子の中に二つの特異性を有する二重特異性抗体などであってもよい。さらにラクダ科動物由来の重鎖のみからなるＶＨＨ抗体であってもよい。
【0015】
一方、抗体のフラグメントの例としては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＬ１ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含むフラグメント
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ領域およびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一のアームのＶＬ領域およびＶＨ領域からなるフラグメント
が挙げられる。このうち（ｉｖ）Ｆｖフラグメントの２つの領域であるＶＬ領域およびＶＨ領域は通常別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし、かつ合成リンカーを介して両領域が結合した態様（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＬ１ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含むフラグメント
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ領域およびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一のアームのＶＬ領域およびＶＨ領域からなるフラグメント
が挙げられる。このうち（ｉｖ）Ｆｖフラグメントの２つの領域であるＶＬ領域およびＶＨ領域は通常別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし、かつ合成リンカーを介して両領域が結合した態様（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
【0016】
本発明の抗体は、サブクラス（例えばヒトであれば４種類：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在）による限定は特になく、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の必要性に応じ、適宜選択すればよい。ＡＤＣＣやＣＤＣで目的細胞を死滅させることを目的とした抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが高くなるサブクラスを選択すればよく、またＡＤＣＣやＣＤＣが不要な抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが低くなるサブクラスを選択すればよい。なお抗体におけるＡＤＣＣやＣＤＣの増強または減少は、抗体の定常領域のアミノ酸残基を置換および、抗体に付加する糖鎖を変更することで行なってもよい。
【0017】
本発明の抗体の好ましい態様として、抗体の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ以下に示すアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
重鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１０又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１～３の他の何れか１つ：配列番号１１又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１～３の他の何れか１つ：配列番号１２又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１３又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１４又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１５又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１０又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１～３の他の何れか１つ：配列番号１１又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１～３の他の何れか１つ：配列番号１２又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１３又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１４又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１～３の何れか１つ：配列番号１５又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列
【0018】
本発明の抗体のより好ましい態様として、抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３が、それぞれ以下に示すアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１０又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１１又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号１２又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号１３又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号１４又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号１５又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１０又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１１又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号１２又は配列番号１８に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号１３又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号１４又は配列番号２０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号１５又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列
【0019】
本発明の抗体として別の好ましい態様としては以下の（ａ）又は（ｂ）である；
（ａ）重鎖可変領域が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体、
（ｂ）重鎖可変領域が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
（ａ）重鎖可変領域が配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体、
（ｂ）重鎖可変領域が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含む抗体。
【0020】
また本発明の抗体のさらに好ましい態様として、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下の（Ａ）、（Ｂ）のいずれかである抗体が挙げられる。
（Ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１０に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１１に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１２に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む。
（Ｂ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１６に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１７に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１８に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１９に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２０に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む。
ここで前者（Ａ）としては、例えば後述の実施例で得られた抗体ｍ６があげられ、後者（Ｂ）としては、例えば抗体ｍ１７があげられる。
（Ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１０に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１１に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１２に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む。
（Ｂ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１６に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１７に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１８に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１９に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２０に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む。
ここで前者（Ａ）としては、例えば後述の実施例で得られた抗体ｍ６があげられ、後者（Ｂ）としては、例えば抗体ｍ１７があげられる。
【0021】
なお、本発明の抗体は、前述したＲＢＤへの結合能を有している限り、前記例示したアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加が生じていてもよい。具体的には、抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、前記例示したアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってよい。
前記同一性については、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ロー
カルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算して算出することができる。
また、前記「複数個」とは、例えば２個、３個、又は４個であってよい。
前記同一性については、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ロー
カルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算して算出することができる。
また、前記「複数個」とは、例えば２個、３個、又は４個であってよい。
【0022】
前記アミノ酸の置換は、保守的置換が好ましい。「保守的置換」とは、抗体の機能特性（活性）を実質的に改変しないように、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることである。
例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸の例として、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
また、互いに置換することができるアミノ酸残基の他の例として、バリン－ロイシン－イソロイシン間の置換、フェニルアラニン－チロシン間の置換、リシン－アルギニン間の置換、アラニン－バリン間の置換、グルタミン酸－アスパラギン酸間の置換、アスパラギン－グルタミン間の置換、なども挙げられる。
例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸の例として、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
また、互いに置換することができるアミノ酸残基の他の例として、バリン－ロイシン－イソロイシン間の置換、フェニルアラニン－チロシン間の置換、リシン－アルギニン間の置換、アラニン－バリン間の置換、グルタミン酸－アスパラギン酸間の置換、アスパラギン－グルタミン間の置換、なども挙げられる。
【0023】
また本発明の抗体の別の態様として、抗体の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ以外のアミノ酸配列を、ヒト以外の動物に由来する抗体のアミノ酸配列からヒトに由来する抗体のアミノ酸配列へと変更させた抗体（ヒト化抗体）が挙げられる。抗体のアミノ酸配列全体におけるヒト抗体のアミノ酸配列の割合を増加させることにより、当該抗体をヒト体内に適用した際に異物として排除されにくくなるというメリットが得られる。
【0024】
また本発明の抗体の別の好ましい態様として、抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号８又は９に記載のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらは後述の実施例で得られる抗体ｍ６とｍ１７にそれぞれ相当する。
また本発明の抗体のさらに別の好ましい態様として、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらは後述の実施例で得られる抗体ｍ６とｍ１７にそれぞれ相当する。
また本発明の抗体のさらに別の好ましい態様として、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号６又は７に記載のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらは後述の実施例で得られる抗体ｍ６とｍ１７にそれぞれ相当する。
【0025】
さらに本発明の抗体は、ＣＤＲ以外の領域についても前述したアミノ酸配列に限定されるものではなく、前述した保守的アミノ酸置換体も本発明の抗体に含まれる。
【0026】
また本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、修飾することができる。ここでいう修飾は、本発明の抗体のＲＢＤとの特異的結合活性を向上させるための修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。
【0027】
上記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
【0028】
また、本発明の抗体のグリコシル化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の親和性を調整するために行われてもよい。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を
導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
【0029】
本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型ＲＢＤとの解離定数が、５．０×１０－９Ｍ以下、好ましくは１．０×１０－９Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０－１０Ｍ以下、１．０×１０－１０Ｍ以下、５．０×１０－１１Ｍ以下、１．０×１０－１１Ｍ以下、５．０×１０－１２Ｍ以下又は１．０×１０－１２Ｍ以下の高い親和性を有することが好ましい。また、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、オミクロン型ＲＢＤとの解離定数も上述と同様の高い親和性を有することが好ましい。上記解離定数は、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、Ｏｃｔｅｔシステム（ザルトリウス社）により速度評価キットソフトウェアを用いて測定してもよい。
【0030】
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が宿主細胞の細胞表面に結合し、宿主細胞内で増殖された後、細胞外に放出されるまでの過程をいう。したがって、本明細書において「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の阻害」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の上記一連の過程のうち少なくとも一つを阻害又は抑制することをいう。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が宿主細胞の細胞表面のウイルス受容体に結合する経路及び／又は宿主細胞内にＨＣＶゲノムが侵入する経路を阻害することである。
【0031】
また、本明細書はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合において本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と競合する抗体（競合抗体）をも提供する。ここで「競合する」とは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上の部位と、競合抗体が結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上の部位とが同一であること、又は本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と競合抗体とが互いにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合の立体的障害となるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上の部位に結合することを意味する。すなわち、本発明における「競合抗体」は、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と完全に又は部分的に同一のエピトープを認識する。
通常、かかる競合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型、及びデルタ型のいずれに対しても生じる。また、かかる競合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対しても生じることが好ましい。
また、競合抗体には、前述した「フラグメント」が含まれてよい。
通常、かかる競合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型、及びデルタ型のいずれに対しても生じる。また、かかる競合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に対しても生じることが好ましい。
また、競合抗体には、前述した「フラグメント」が含まれてよい。
【0032】
競合抗体を同定するには、当技術分野で通常用いられている競合アッセイが使用されてよい。例えば、競合抗体が過剰に存在する場合、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合を少なくとも１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、又はそれ以上阻止する（例えば、低減させる）。
このような競合アッセイは、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能であり、そのような方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ法、ＬＲＥＴ法等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体等及び／又は抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのＲＢＤ）を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
このような競合アッセイは、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能であり、そのような方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ法、ＬＲＥＴ法等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体等及び／又は抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのＲＢＤ）を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
【0033】
さらに本明細書は、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合において前記抗体と競合する抗体の、タンパク質部分をコードする単離されたＤＮＡをも提供する。
当技術分野の当業者であれば、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体のアミノ酸配列に基づいて、そのタンパク質部分をコードするＤＮＡ配列を定法により設計することができる。また、これを用いて公知の遺伝子工学的手法により公知の操作をすることができる。
当技術分野の当業者であれば、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体のアミノ酸配列に基づいて、そのタンパク質部分をコードするＤＮＡ配列を定法により設計することができる。また、これを用いて公知の遺伝子工学的手法により公知の操作をすることができる。
【0034】
本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、前述のように工程（ｃ）～（ｇ）を含む方法によって製造することができる。以下、各工程について説明する。
【0035】
工程（ｃ）は、ＤＮＡ免疫法により、ヒト以外の動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ遺伝子を含む発現ベクターを投与し、当該動物の抗体産生細胞を回収する工程である。このとき、ＲＢＤ遺伝子は通常はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型から選択される任意の１つの型のものであり、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型、デルタ型及びオミクロン型から選択される任意の１つの型のものである。また、ＲＢＤ遺伝子は配列番号１～５、３１の何れかで示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むことが好ましく、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むことがより好ましい。ＤＮＡ免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、対象抗原タンパク質を膜結合型タンパク質として細胞表面上に局在させるのが好ましい。ＲＢＤは本来分泌タンパク質であるため、ＲＢＤを細胞表面上に局在させることが好ましい。
【0036】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で回収した抗体産生細胞又はそれを用いて作製したハイブリドーマの中から、工程（ｃ）のＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を分泌する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程である。
選択の方法は、公知の方法を適宜採用することができ、例えばＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤタンパク質を固相に固定化し、それに対して結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを、イムノアッセイにより選択することができる。またハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、ＤＮＡ免疫法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、所望のＲＢＤタンパク質に結合性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
選択の方法は、公知の方法を適宜採用することができ、例えばＤＮＡ免疫法に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤタンパク質を固相に固定化し、それに対して結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを、イムノアッセイにより選択することができる。またハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、ＤＮＡ免疫法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、所望のＲＢＤタンパク質に結合性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【0037】
工程（ｅ）は、工程（ｄ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程である。選択の方法は、公知の方法を適宜採用することができ、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤタンパク質に結合性を有する抗体を選択することにより行うことができ、具体的には前記ＲＢＤタンパク質を固相にそれぞれ固定化し、それらに対して結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを、イムノアッセイにより選択することにより行うことができる。
工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことが好ましい。より具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型のＲＢＤは配列番号１に、アルファ型のＲＢＤは配列番号２に、ベータ型のＲＢＤは配列番号３に、ガンマ型のＲＢＤは配列番号４に、デルタ型のＲＢＤは配列番号５に示される
アミノ酸配列を含むことが好ましい。
また工程（ｅ）において、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択することが好ましい。選択の方法は上述と同様に行うことができる。このとき使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
工程（ｅ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤのアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むことが好ましい。より具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型のＲＢＤは配列番号１に、アルファ型のＲＢＤは配列番号２に、ベータ型のＲＢＤは配列番号３に、ガンマ型のＲＢＤは配列番号４に、デルタ型のＲＢＤは配列番号５に示される
アミノ酸配列を含むことが好ましい。
また工程（ｅ）において、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型に結合性を有する抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択することが好ましい。選択の方法は上述と同様に行うことができる。このとき使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン型のＲＢＤは、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0038】
工程（ｆ）は、工程（ｅ）で選択した抗体産生細胞又はハイブリドーマの中から、ｈｉＶＮＴ法を用いて、ウイルス様粒子が細胞へ侵入することを阻害する効果が高い抗体を産生する抗体産生細胞又はハイブリドーマを選択する工程である。このｈｉ－ＶＮＴ法は、相互作用することによってＮａｎｏＬｕｃ発光酵素が形成されるＨｉＢｉＴタグとＬｇＢｉＴを用いた測定方法で、ＨｉＢｉＴタグをもつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｈｉ－ＶＬＰ）が表面に露出したウイルス様粒子が、ＬｇＢｉＴを安定的に発現するＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に侵入した量を容易に定量できる方法である（参考文献１：Ｋ． Ｍｉｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １２， Ｉｓｓｕｅ １２， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０２０， Ｐａｇｅｓ ９８７-９９０）。ウイルス様粒子が細胞に
侵入する際に、抗体を反応系に同時に添加することにより、抗体の侵入阻害活性を評価することができる。
侵入する際に、抗体を反応系に同時に添加することにより、抗体の侵入阻害活性を評価することができる。
【0039】
工程（ｇ）は、工程（ｆ）で選択された抗体産生細胞又はハイブリドーマを培養し、産生された抗体を回収する工程である。培養・回収の方法は公知の方法を採用することができる。
【0040】
なお、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体はタンパク質であることから、遺伝子組換えの手法により製造することもできる。例えば、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのまま宿主細胞に導入しても製造することができ、またプロモーターやシグナルペプチドを含む発現ベクターにクローニングし、当該ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで製造することもできる。抗体や低分子化抗体をコードするポリヌクレオチドを設計する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。前記宿主細胞には特に限定はなく、一例として、哺乳動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）が挙げられる。中でも、抗体分子を発現させる場合は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。前記宿主細胞には特に限定はなく、一例として、哺乳動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）が挙げられる。中でも、抗体分子を発現させる場合は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
【0041】
前記発現ベクターは、宿主に応じたプロモーターやシグナルペプチドを含んでいればよい。一例をあげると、哺乳動物を宿主として用いた場合、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーターが例示でき、さらに各種分泌
タンパク質に付加されているシグナルペプチドを組合せればよい。また宿主細胞に大腸菌を用いる場合にはＴ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが例示でき、シグナルペプチドはＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥおよびＴｏｒＴが例示できる。また発現タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を選択するために、必要であれば抗生物質のような薬剤マーカーを前記発現ベクターに導入してもよい。さらにＣＨＯ細胞で高発現細胞株を作製するときに行なわれる遺伝子増幅のためのマーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子）を前記発現ベクターに含んでいてもよい。
タンパク質に付加されているシグナルペプチドを組合せればよい。また宿主細胞に大腸菌を用いる場合にはＴ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが例示でき、シグナルペプチドはＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥおよびＴｏｒＴが例示できる。また発現タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を選択するために、必要であれば抗生物質のような薬剤マーカーを前記発現ベクターに導入してもよい。さらにＣＨＯ細胞で高発現細胞株を作製するときに行なわれる遺伝子増幅のためのマーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子）を前記発現ベクターに含んでいてもよい。
【0042】
形質転換体を培養することで発現した抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせることで、前記形質転換体の培養物から精製・回収することができる。
【0043】
ＲＢＤを認識する抗体は、ＲＢＤそのもの、ＲＢＤの部分領域からなるオリゴペプチド、スパイクタンパク質またはその部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することでも得ることができる。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いるヒト以外の哺乳動物でもよく、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いるヒト以外の哺乳動物でもよく、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
【実施例0044】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を具体的に説明するための例示であり、本発明の技術範囲を制限するものではない。
【0045】
＜実施例１＞ ＤＮＡ免疫用ベクターの構築
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ＲＢＤのＣ末端側にＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーを付加したタンパク質（以下、ＧＰＩアンカー型ＲＢＤ）を発現可能なプラスミドベクターを構築した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ＲＢＤのＣ末端側にＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーを付加したタンパク質（以下、ＧＰＩアンカー型ＲＢＤ）を発現可能なプラスミドベクターを構築した。
【0046】
（１）下記（ａ）のプライマーを用いて、野生型のＲＢＤとアルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤの各ｃＤＮＡ（それぞれ配列番号２２～２６）のポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ－ＰＣＲ法により増幅した。
（ａ）ＧＰＩアンカー型ＲＢＤ発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号２７
５’－ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｃｇｃｇｔｔｃａａｃｃａａｃ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号２８
５’－ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｇａａａｔｔｇａｃａｃａｔｔ－３’
（ａ）ＧＰＩアンカー型ＲＢＤ発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号２７
５’－ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｃｇｃｇｔｔｃａａｃｃａａｃ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号２８
５’－ｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｇａａａｔｔｇａｃａｃａｔｔ－３’
【0047】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカーのコード領域とＦＬＡＧタグのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）で得られたＲＴ－ＰＣＲ増幅産物を挿入し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＲＢＤの発現プラスミドを構築した。
【0048】
（３）（２）で構築した発現プラスミドに挿入されているポリヌクレオチドにより発現されるＲＢＤが、想定通り細胞表面に局在していることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３－１）（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＲＢＤ発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３－２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＣＳ添加ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＲＢＤを一過性発現させた。
（３－３）（３－２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を添加し、３０分静置した。
（３－４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行なった。なお、陰性対照として遺伝子導入をしていない２９３Ｔ細胞株培養液を用いて同様な解析を行なった。
（３－１）（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＲＢＤ発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３－２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ＦＣＳ添加ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＲＢＤを一過性発現させた。
（３－３）（３－２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を添加し、３０分静置した。
（３－４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行なった。なお、陰性対照として遺伝子導入をしていない２９３Ｔ細胞株培養液を用いて同様な解析を行なった。
【0049】
ＦＡＣＳ解析の結果を図１及び図２に示す。解析の結果、陰性対照である遺伝子導入をしていない場合（図１）は蛍光標識された細胞によるシグナルの増加、いわゆるシフトが認められなかった。一方、ＧＰＩアンカー型ＲＢＤ発現プラスミドを導入した場合（図２）は蛍光標識された細胞によるシフトが認められた。本結果より、発現したＦＬＡＧタグペプチドを付加したＧＰＩアンカー型ＲＢＤが細胞表面上に局在していることが示された。
【0050】
＜実施例２＞ ＲＢＤタンパク質の調製
各種組換ＲＢＤの発現評価及び精製工程のため、５’末端にＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ及びＦＬＡＧタグを、３’末端にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特開２００９－２４０３００号公報）をそれぞれコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入した、分泌型の野生型ＲＢＤ又はアルファ型、ベータ型、ガンマ型若しくはデルタ型ＲＢＤを発現可能なプラスミドを調製した。作製した各種組換えＲＢＤの構造を図３に、具体的な調製方法を以下に示す。
各種組換ＲＢＤの発現評価及び精製工程のため、５’末端にＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ及びＦＬＡＧタグを、３’末端にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特開２００９－２４０３００号公報）をそれぞれコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入した、分泌型の野生型ＲＢＤ又はアルファ型、ベータ型、ガンマ型若しくはデルタ型ＲＢＤを発現可能なプラスミドを調製した。作製した各種組換えＲＢＤの構造を図３に、具体的な調製方法を以下に示す。
【0051】
（１）ＲＢＤのｃＤＮＡから設計した下記（ａ）のプライマーを用いて、野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型のＲＢＤに相当する各ポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ－ＰＣＲ法により増幅した。
（ａ）ＦＬＡＧ、ＢＮＣペプチド融合ＲＢＤ発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号２９
５’－ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｃｇｃｇｔｔｃａａｃｃａａｃ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号３０
５’－ｃａｇａａｃｔｔｔｇｃａｇａｔａｔｃｇａａａｔｔｇａｃａｃａｔｔ－３’
（ａ）ＦＬＡＧ、ＢＮＣペプチド融合ＲＢＤ発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号２９
５’－ｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｃｇｃｇｔｔｃａａｃｃａａｃ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号３０
５’－ｃａｇａａｃｔｔｔｇｃａｇａｔａｔｃｇａａａｔｔｇａｃａｃａｔｔ－３’
【0052】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＶ部位に、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）のＲＴ－ＰＣＲ増幅産物を挿入し、各種分泌型ＲＢＤ発現プラスミドを構築した。
【0053】
（３）常法に従い、（２）で構築した各種分泌型ＲＢＤ発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞株（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により一過性に発現した。培養１週間後の培養液を遠心分離し、上清を各種分泌型ＲＢＤ溶液として回収した。
【0054】
（４）（３）の回収物を配列のＮ末端側にあるＳｔｒｅｐ－ＩＩタグ（ＩＢＡ社製）を利用し、市販の精製キット（ＩＢＡ社製）で各種のＲＢＤのみを精製した。
【0055】
（５）ビオチン標識した各種ＲＢＤは、（４）の精製物から市販のビオチン標識キット（同仁化学，ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２）を用いて，作製した。
【0056】
＜実施例３＞ＤＮＡ免疫法によるモノクローナル抗体作製
（１）＜実施例１＞で作製した野生型ＲＢＤ遺伝子を挿入したプラスミドベクターをＤＮＡ量として１００μｇ含むように１００μＬのＰＢＳ溶液にて調製し、それをＷｉｓｔａｒラットに投与することで、Ｗｉｓｔａｒラットを免疫した。
（１）＜実施例１＞で作製した野生型ＲＢＤ遺伝子を挿入したプラスミドベクターをＤＮＡ量として１００μｇ含むように１００μＬのＰＢＳ溶液にて調製し、それをＷｉｓｔａｒラットに投与することで、Ｗｉｓｔａｒラットを免疫した。
【0057】
（２）初回の免疫から２日後、５日後、７日後、９日後、１６日後、２３日後、３０日後にプラスミドを投与した後、ラットの鼠径部リンパ節及び腸骨リンパ節を採取し、Ｂ細胞を回収した。
【0058】
（３）電気融合法により（２）のＢ細胞とマウスミエローマ細胞（ｓｐ２／０）を融合させ、ハイブリドーマを作製した。
【0059】
（４）実施例２で作製したビオチン標識した野生型ＲＢＤを用い、反応性を示すクローンを選択した。具体的には下記に示す方法で実施した。
（４－１）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（富士フィルム和光純薬社製）５０ｎｇ（１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ）を３８４穴イムノプレート（グライナー社製）に添加し、室温で１時間放置した。
（４－２）続いてＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）により３回の洗浄後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を８０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、４℃にて一昼夜保存、コーティングした。
（４－３）ＴＢＳＴにより１回洗浄を行い、実施例２で作製したビオチン標識したＲＢＤ（但し、免疫に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に相当するもの）（１μｇ／ｍＬ溶液）を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（４－１）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（富士フィルム和光純薬社製）５０ｎｇ（１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ）を３８４穴イムノプレート（グライナー社製）に添加し、室温で１時間放置した。
（４－２）続いてＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）により３回の洗浄後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を８０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、４℃にて一昼夜保存、コーティングした。
（４－３）ＴＢＳＴにより１回洗浄を行い、実施例２で作製したビオチン標識したＲＢＤ（但し、免疫に用いたＲＢＤ遺伝子が発現するＲＢＤタンパク質に相当するもの）（１μｇ／ｍＬ溶液）を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
【0060】
（４－４）ＴＢＳＴにより３回洗浄を行い、ハイブリドーマ細胞の培養上清を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（４－５）ＴＢＳＴにより３回洗浄を行なった後、ＡＬＰ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（１００００倍希釈、Ｍｅｒｃｋ社製）およびＴＢＳＴを５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（４－６）ＴＢＳＴにより３回洗浄を行ない、ＡＬＰの基質である４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）を５０μＬ／ウェルにて添加し、蛍光強度を測定することで検出し、目的のクローンを選択した。図４にその結果を示す。
（４－７）スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行いハイブリドーマ１，２，４，６，８，１２，１７，１８，２２，２７，２８，３１として樹立した。
（４－５）ＴＢＳＴにより３回洗浄を行なった後、ＡＬＰ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（１００００倍希釈、Ｍｅｒｃｋ社製）およびＴＢＳＴを５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（４－６）ＴＢＳＴにより３回洗浄を行ない、ＡＬＰの基質である４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）を５０μＬ／ウェルにて添加し、蛍光強度を測定することで検出し、目的のクローンを選択した。図４にその結果を示す。
（４－７）スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行いハイブリドーマ１，２，４，６，８，１２，１７，１８，２２，２７，２８，３１として樹立した。
【0061】
（５）得られたハイブリドーマを、ＨＴ培地により約１０日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ用培地により培養を続けた。ハイブリドーマ細胞培養培地は、１０％ＦＣＳ添加ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用いた。また、前記培地にＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を添加したものをＨＡＴ培地として、ＨＴ（Ｓｉｇｍａ）を添加したものをＨＴ培地としてそれぞれ用いた。
【0062】
（６）（５）の培養上清を回収し、ＭｏｎｏＳｐｉｎ ＰｒｏＧ（ジーエルサイエンス株式会社製）による精製によって、ハイブリドーマ１，２，４，６，８，１２，１７，１８，２２，２７，２８，３１からそれぞれモノクローナル抗体ｍ１、ｍ２、ｍ４、ｍ６、ｍ８、ｍ１２、ｍ１７，ｍ１８、ｍ２２、ｍ２７、ｍ２８、ｍ３１を回収した。
【0063】
＜実施例４＞抗体のＲＢＤに対する結合活性の測定
結合活性の評価は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
結合活性の評価は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
【0064】
（１）試薬カップの作製
２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。）
配列番号１～５の野生型ＲＢＤ、アルファ型、ベータ型、ガンマ型又はデルタ型を固定化した微粒子を含む溶液を微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリフォスファターゼ標識したモノクローナル抗体ｍ１、ｍ２、ｍ４、ｍ６、ｍ８、ｍ１２、ｍ１７，ｍ１８、ｍ２２、ｍ２７、ｍ２８又はｍ３１と溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、抗体結合活性測定用試薬カップとした。
２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。）
配列番号１～５の野生型ＲＢＤ、アルファ型、ベータ型、ガンマ型又はデルタ型を固定化した微粒子を含む溶液を微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリフォスファターゼ標識したモノクローナル抗体ｍ１、ｍ２、ｍ４、ｍ６、ｍ８、ｍ１２、ｍ１７，ｍ１８、ｍ２２、ｍ２７、ｍ２８又はｍ３１と溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、抗体結合活性測定用試薬カップとした。
【0065】
（２）測定
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（１）で作製した抗体結合活性測定用試薬カップをセットし、３０μＬの希釈液を試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。結果を図５に示す。図５は野生型ＲＢＤへの抗体価に対する変異型ＲＢＤへの抗体価の比率を示したグラフである。図５から明らかなように、抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８が野生型及び前記４種のどの変異型のＲＢＤに対しても親和性が高いと評価された。
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（１）で作製した抗体結合活性測定用試薬カップをセットし、３０μＬの希釈液を試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。結果を図５に示す。図５は野生型ＲＢＤへの抗体価に対する変異型ＲＢＤへの抗体価の比率を示したグラフである。図５から明らかなように、抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８が野生型及び前記４種のどの変異型のＲＢＤに対しても親和性が高いと評価された。
【0066】
＜実施例５＞ｈｉ－ＶＮＴ法による抗体の感染阻害活性の測定
（１）細胞の継代とプラスミドの構築、ｈｉＶＮＴ－ＳＡＲＳ２による侵入量の定量
細胞の調製、プラスミドの構築、ｈｉＶＮＴ法を用いた中和活性測定は、公知の方法に準じて行った（前記参考文献１）。抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８の細胞への感染阻害活性の測定を、各種ＲＢＤ（配列番号１（野生型）、２（アルファ型）、３（ベータ型）、４（ガンマ型）及び５（デルタ型））を用いて行った。抗体の対照群として非特許文献１に記載のＣａｓｉｒｉｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９３３）、ｉｍｅｄｅｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９８７）を用いた。
（１）細胞の継代とプラスミドの構築、ｈｉＶＮＴ－ＳＡＲＳ２による侵入量の定量
細胞の調製、プラスミドの構築、ｈｉＶＮＴ法を用いた中和活性測定は、公知の方法に準じて行った（前記参考文献１）。抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８の細胞への感染阻害活性の測定を、各種ＲＢＤ（配列番号１（野生型）、２（アルファ型）、３（ベータ型）、４（ガンマ型）及び５（デルタ型））を用いて行った。抗体の対照群として非特許文献１に記載のＣａｓｉｒｉｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９３３）、ｉｍｅｄｅｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９８７）を用いた。
【0067】
図６～３０に、対照の抗体としてＲＥＧＮ１０９３３、及びＲＥＧＮ１０９８７の、並びに取得抗体であるｍ６、ｍ１７、及びｍ１８の、ｈｉ－ＶＮＴ法を用いた細胞への阻害活性のグラフを示す。図から明らかなように、ｍ６、ｍ１７が野生型及び前記４種のどの変異型のＲＢＤに対しても細胞への感染阻害活性があると評価された。
【0068】
＜比較例１＞生ウイルスによる抗体の感染阻害活性の測定
生ウイルスによる抗体の感染阻害活性の測定は公知の方法に準じて行った（前記参考文献１）。これは野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞への感染と同時に、希釈系列を作製したｍ６、ｍ１７、又はｍ１８抗体を添加することにより、抗体の感染阻害活性を定量する方法である。各ＲＢＤ（配列番号１、２、３、４及び５）を用いて測定を行った。抗体の対照群として実施例５と同様にＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７を用いた。
生ウイルスによる抗体の感染阻害活性の測定は公知の方法に準じて行った（前記参考文献１）。これは野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞への感染と同時に、希釈系列を作製したｍ６、ｍ１７、又はｍ１８抗体を添加することにより、抗体の感染阻害活性を定量する方法である。各ＲＢＤ（配列番号１、２、３、４及び５）を用いて測定を行った。抗体の対照群として実施例５と同様にＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７を用いた。
【0069】
図３１～５５に対照抗体ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、及び取得抗体であるｍ６、ｍ１７、ｍ１８の生ウイルスを用いた細胞への阻害活性のグラフを示す。図から明らかなように、ｍ１７が野生型及び前記４種のどの変異型のＲＢＤに対しても細胞への感染阻害活性があると評価された。さらにｍ６がベータ型とデルタ型のＲＢＤに対して細胞への感染阻害活性があると評価された。
【0070】
＜実施例６＞中和力価（ＮＴ５０）の計算
実施例５及び比較例１における、ＮＴ５０の計算は以下の計算式に従った。
実施例５及び比較例１における、ＮＴ５０の計算は以下の計算式に従った。
【0071】
【数1】
【0072】
なお、ＲＬＵとは、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）である。表１に実施例５により算出されたＮＴ５０を、表２に比較例１により算出されたＮＴ５０の結果を示す。
【0073】
【表1】
【0074】
【表2】
【0075】
以上の結果から、抗体ｍ６はベータ型とデルタ型に対して、抗体ｍ１７はどの型に対しても高い中和活性のある抗体であることが明らかとなり、実施例１～５に記載の抗体の製造方法により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型の感染阻害活性を持つ抗体を取得することが示された。
【0076】
＜実施例７＞モノクローナル抗体ｍ６、ｍ１７の遺伝子配列
（１）実施例３にて取得したモノクローナル抗体ｍ６、ｍ１７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を以下の方法により決定した。
（１－１）抗体のサブクラス
それぞれの抗体のハイブリドーマの培養上清を用いて、ＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ
ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ（ＢＩＯ－ＲＡＤ製）により、抗体のサブクラスを確認した。アイソタイプの解析の結果、すべての抗体がＨ鎖がＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖がκであることが示された。
（１－２）遺伝子配列の解析結果をもとに、ｍ６、ｍ１７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を特定した（ｓｙｄ Ｌａｂｓ社に委託）。ｍ６の翻訳した重鎖可変領域、軽鎖可変領域をそれぞれ配列番号６、８に、ｍ１７の翻訳した重鎖可変領域、軽鎖可
変領域をそれぞれ配列番号７、９に示す。
（１）実施例３にて取得したモノクローナル抗体ｍ６、ｍ１７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を以下の方法により決定した。
（１－１）抗体のサブクラス
それぞれの抗体のハイブリドーマの培養上清を用いて、ＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ
ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ（ＢＩＯ－ＲＡＤ製）により、抗体のサブクラスを確認した。アイソタイプの解析の結果、すべての抗体がＨ鎖がＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖がκであることが示された。
（１－２）遺伝子配列の解析結果をもとに、ｍ６、ｍ１７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列を特定した（ｓｙｄ Ｌａｂｓ社に委託）。ｍ６の翻訳した重鎖可変領域、軽鎖可変領域をそれぞれ配列番号６、８に、ｍ１７の翻訳した重鎖可変領域、軽鎖可
変領域をそれぞれ配列番号７、９に示す。
【0077】
＜実施例８＞ｈｉ－ＶＮＴ法によるオミクロン／ＢＡ．１変異株に対する抗体の感染阻害活性の測定
実施例５と同様の方法によって細胞の調製、プラスミドの構築、ｈｉ－ＶＮＴ法を用いた測定を行った。具体的には、抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８の感染阻害活性の測定を、オミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤ（配列番号３１）を用いて行った。抗体の対照群として非特許文献１に記載のＣａｓｉｒｉｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９３３）、ｉｍｅｄｅｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９８７）を用いた。
実施例５と同様の方法によって細胞の調製、プラスミドの構築、ｈｉ－ＶＮＴ法を用いた測定を行った。具体的には、抗体ｍ６、ｍ１７、ｍ１８の感染阻害活性の測定を、オミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤ（配列番号３１）を用いて行った。抗体の対照群として非特許文献１に記載のＣａｓｉｒｉｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９３３）、ｉｍｅｄｅｖｉｍａｂ（ＲＥＧＮ１０９８７）を用いた。
【0078】
図５６～６０に、対照の抗体としてＲＥＧＮ１０９３３、及びＲＥＧＮ１０９８７の、並びに取得抗体であるｍ６、ｍ１７、及びｍ１８の、ｈｉ－ＶＮＴ法を用いた細胞への阻害活性のグラフを示す。図から明らかなように、ｍ６、ｍ１７がオミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤに対して細胞への感染阻害活性があると評価され、ｍ１８は細胞への感染阻害活性はあるもののかなり低いと評価された。
【0079】
＜比較例２＞生ウイルスによるオミクロン／ＢＡ．１変異株に対する抗体の感染阻害活性の測定
比較例１と同様の方法によって、生ウイルスによる抗体の感染阻害活性の測定を行った。抗体ｍ６，ｍ１７、ｍ１８の感染阻害活性の測定を、オミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤ（配列番号３１）を用いて行った。抗体の対照群として実施例５と同様にＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７を用いた。
比較例１と同様の方法によって、生ウイルスによる抗体の感染阻害活性の測定を行った。抗体ｍ６，ｍ１７、ｍ１８の感染阻害活性の測定を、オミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤ（配列番号３１）を用いて行った。抗体の対照群として実施例５と同様にＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７を用いた。
【0080】
図６１～６５に対照抗体ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７、及び取得抗体であるｍ６、ｍ１７、ｍ１８の生ウイルスを用いた細胞への阻害活性のグラフを示す。図から明らかなように、ｍ６とｍ１７がオミクロン／ＢＡ．１変異株のＲＢＤに対して細胞への感染阻害活性があると評価された。
【0081】
＜実施例９＞中和力価（ＮＴ５０）の計算
実施例８及び比較例２における、ＮＴ５０の計算は実施例６と同様の方法によって行った。
表３に実施例８により算出されたＮＴ５０を、表４に比較例２により算出されたＮＴ５０の結果を示す。
実施例８及び比較例２における、ＮＴ５０の計算は実施例６と同様の方法によって行った。
表３に実施例８により算出されたＮＴ５０を、表４に比較例２により算出されたＮＴ５０の結果を示す。
【0082】
【表3】
【0083】
【表4】
【0084】
以上の結果から、抗体ｍ６、ｍ１７はオミクロン／ＢＡ．１変異株に対しても中和活性のある抗体であることが明らかとなり、実施例１～５に記載の抗体の製造方法により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン／ＢＡ．１変異株の感染阻害活性を持つ抗体を取得することが示された。
【0085】
＜実施例１０＞抗体のオミクロン／ＢＡ．１型ＲＢＤに対する結合活性の測定
結合活性の評価は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
結合活性の評価は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
【0086】
（１）試薬カップの作製
２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。）
野生型ＲＢＤ（配列番号１）又はオミクロン／ＢＡ．１型ＲＢＤ（配列番号３１）を固定化した微粒子を含む溶液を微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリフォスファターゼ標識したモノクローナル抗体ｍ１、ｍ２、ｍ４、ｍ６、ｍ８、ｍ１２、ｍ１７，ｍ１８、ｍ２２、ｍ２７、ｍ２８又はｍ３１と溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、抗体結合活性測定用試薬カップとした。
２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。）
野生型ＲＢＤ（配列番号１）又はオミクロン／ＢＡ．１型ＲＢＤ（配列番号３１）を固定化した微粒子を含む溶液を微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリフォスファターゼ標識したモノクローナル抗体ｍ１、ｍ２、ｍ４、ｍ６、ｍ８、ｍ１２、ｍ１７，ｍ１８、ｍ２２、ｍ２７、ｍ２８又はｍ３１と溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、抗体結合活性測定用試薬カップとした。
【0087】
（２）測定
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（１）で作製した抗体結合活性測定用試薬カップをセットし、３０μＬの希釈液を試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。
全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（１）で作製した抗体結合活性測定用試薬カップをセットし、３０μＬの希釈液を試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。
【0088】
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型、アルファ型、ベータ型、ガンマ型及びデルタ型に感染阻害活性を有する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療及び予防用の医薬として使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【配列表】