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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023122159
(43)【公開日】2023-09-01
(54)【発明の名称】免疫グロブリン吸着剤の製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/22 20060101AFI20230825BHJP
C07K 14/735 20060101ALI20230825BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20230825BHJP
C07K 17/04 20060101ALI20230825BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230825BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230825BHJP
【ＦＩ】
C07K1/22 ZNA
C07K14/735
C07K17/00
C07K17/04
C12N15/12
C07K16/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022025664
(22)【出願日】2022-02-22
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】谷口 直優
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
(72)【発明者】
【氏名】早川 勇太
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA60
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA34
4H045EA65
4H045FA74
4H045FA81
(57)【要約】
【課題】 抗体の分取目的にも利用可能な高い抗体吸着量を有する免疫グロブリン吸着剤を製造する方法を提供すること。
【解決手段】 不溶性担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を導入する工程と、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはその塩存在下でヒトＦｃγＲＩＩＩａを前記官能基を介して固定化させる工程とを含む、免疫グロブリン吸着剤の製造方法により、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決手段】 不溶性担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を導入する工程と、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはその塩存在下でヒトＦｃγＲＩＩＩａを前記官能基を介して固定化させる工程とを含む、免疫グロブリン吸着剤の製造方法により、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
不溶性担体に免疫グロブリン結合性タンパク質を固定化可能な官能基を導入する工程と、当該官能基を介して前記タンパク質を固定化させる工程とを含む、免疫グロブリン吸着剤の製造方法であって、
免疫グロブリン結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａであり、前記タンパク質を固定化させる工程を終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはその塩存在下で行なう、前記方法。
免疫グロブリン結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａであり、前記タンパク質を固定化させる工程を終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはその塩存在下で行なう、前記方法。
【請求項2】
官能基を導入する工程で不溶性担体に導入した官能基量が、当該担体１ｇあたり２．０μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
官能基がハロアセチル基またはマレイミド基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下に示す（１）から（３）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫グロブリン吸着剤の製造方法に関する。より詳しくは本発明は、不溶性担体に導入した、免疫グロブリン結合性タンパク質を固定化可能な官能基を介して、前記タンパク質を固定化させて、前記吸着剤を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体医薬品は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬品である。抗体医薬品は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬品は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。
【0003】
抗体医薬品の製造は培養工程と精製工程とを含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また精製工程では、粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。
【0004】
前記アフィニティークロマトグラフィーでは抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられる。抗体医薬品を低コストかつ大量に製造するには、前記アフィニティー担体への抗体医薬品の吸着量を向上させる必要があり、そのためには、抗体医薬品と特異的に結合可能なリガンドを適切な方法で固定化したアフィニティー担体を製造する必要がある。
【0005】
従来より、不溶性担体を最適化することで抗体医薬品との吸着量を向上させる試みがなされている。例えば、特許文献１には、不溶性担体の構造に着目し、非多孔質の粒子ではなく、多孔質の粒子を用いることで抗体吸着量の向上を達成している。しかしながら、大量製造を目的とした場合、抗体の吸着量が不十分であり、前記吸着剤を工業的な抗体医薬品の製造における抗体の分取目的に適用するのは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０２０－１２５２８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、抗体の分取目的にも利用可能な高い抗体吸着量を有する免疫グロブリン吸着剤を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、免疫グロブリン結合性タンパク質を不溶性担体に固定化させる際の反応条件を最適化することで、従来よりも吸着量が向上した免疫グロブリン吸着剤を製造できた。
【0009】
すなわち、本発明は以下の［１］から［４］に記載の態様を包含する。
【0010】
［１］不溶性担体に免疫グロブリン結合性タンパク質を固定化可能な官能基を導入する工程と、当該官能基を介して前記タンパク質を固定化させる工程とを含む、免疫グロブリン吸着剤の製造方法であって、免疫グロブリン結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａであり、前記タンパク質を固定化させる工程を終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはその塩存在下で行なう、前記方法。
【0011】
［２］官能基を導入する工程で不溶性担体に導入した官能基量が、当該担体１ｇあたり２．０μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下である、［１］に記載の方法。
【0012】
［３］官能基がハロアセチル基またはマレイミド基である、［１］または［２］に記載の方法。
【0013】
［４］ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下に示す（１）から（３）のいずれかから選択されるポリペプチドである、［１］から［３］のいずれかに記載の方法；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0015】
本発明において、免疫グロブリン結合性タンパク質として用いる、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの一例として、
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、および
（３）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、および
（３）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
【0016】
前記（２）における、「１もしくは数個」とは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、免疫グロブリン結合活性を有する限り、特開２０１５－０８６２１６号公報、特開２０１６－１６９１９７号公報、特開２０１７－１１８８７１号公報、特開２０１８－１９７２２４号公報およびＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
【0017】
なお前記（２）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（２）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0018】
前記（２）の好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、および
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、および
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
【0019】
前記（３）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0020】
本発明で用いる不溶性担体は、後述する、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を導入でき、かつ免疫グロブリンの吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性の物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。またＳｈｏｄｅｘ（昭和電工社製）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（デュポン社製）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（ＪＮＣ社製）、ＰＯＲＯＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、トヨパール（東ソー社製）といった公知のクロマトグラフィー用担体であってもよい。
【0021】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基（以下、単に「活性化官能基」とも表記する）の一例として、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド基が例示できる。中でもハロアセチル基またはマレイミド基が好ましい。
【0022】
不溶性担体表面に活性化官能基を導入する方法としては、担体表面に有するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して活性化官能基を有する化合物を導入する方法があげられる。中でも、ヒドロキシ基を有した不溶性担体にエポキシ基を導入後、当該エポキシ基に対し活性化官能基を導入する方法が好ましい。
【0023】
不溶性担体表面に有するヒドロキシ基にエポキシ基を導入する化合物（以下、エポキシ化試薬とする）としては、エピクロロヒドリン、エビブロモヒドリンなどのエピハロヒドリン類、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、などのジグリシジルエーテル類、１，７－オクタジエンジエポキシドなどのアルキルジエンジエポキサイド類を例示できる。このうちポリエチレングリコールジグリシジルエーテルの繰返し単位は－Ｃ２Ｈ４Ｏ－の繰返し数が１から１０のものを用いると好ましい。エポキシ基を導入するには、例えば水酸化ナトリウムもしくは炭酸カリウム等の無機塩基の水溶液中や、水素化ホウ素ナトリウムを含む水酸化ナトリウムもしくは炭酸カリウム等の無機塩基の水溶液中で反応させて導入すればよい。
【0024】
前述したエポキシ化試薬により担体表面にエポキシ基を導入後、活性化官能基としてカルボキシ基を導入する場合は、例えば、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、などのカルボキシ化試薬を用いて導入すればよい。また活性化官能基としてアミノ基を導入する場合は、例えば、エチレンジアミン、１，３－プロパンジアミン、プトレシン、カダベリン、ヘキサメチレンジアミン、１，８－オクタンジアミン、１，１０－デカンジアミン、１，１２－ドデカンジアミン、ｏ－フェニレンジアミン、ｍ－フェニレンジアミン、ｐ－フェニレンジアミン、トランス－１，４－シクロヘキサンジアミン、トランス－１，２－シクロヘキサンジアミン、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－エチレンジアニリン、スペルミジン、スペルミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、Ｎ，Ｎ’－ビス（２－アミノエチル）－１，３－プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’―ビス（３－アミノプロピル）エチレンジアミン、トリエチレングリコールビス（２－アミノエチル）エーテル、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（３－アミノプロピル）アミン、トリス（４－アミノフェニル）アミンなどのアミノ化試薬を用いて導入すればよい。
【0025】
不溶性担体表面に有するエポキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアミノ基に対し、活性化官能基としてマレイミド基を導入する場合は、例えば、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのマレイミド化試薬を用いて導入すればよい。
【0026】
不溶性担体表面に有するエポキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基に対し、活性化官能基としてハロアセチル基を導入する場合は、例えば、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのハロアセチル化試薬を用いて導入すればよい。またハロアセチル基を導入する方法の別の態様として、不溶性担体表面に有するエポキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化する方法がある。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、前記ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0027】
不溶性担体表面にカルボキシ基を有している場合、当該カルボキシ基に対し、縮合剤と添加剤を用いて活性化官能基を導入する方法もある。前記縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールが例示できる。また前記添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールが例示できる。
【0028】
不溶性担体表面に活性化官能基を導入する際の反応溶媒としては、水が通常用いられるが、その他ｎ－ヘキサン、ベンゼン、キシレンなどの炭化水素類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、クロロホルム、クロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類、エタノールやメチルセロソルブなどのアルコール類、アセトンやメチルイソブチルケトンなどのケトン類を用いてもよく、１，４－ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルオキサイドを用いてもよい。またこれら溶媒を単一で用いてもよく、混合溶媒系で用いてもよい。また不溶性担体表面に活性化官能基を導入する際、特に触媒は用いる必要はないが、水酸化ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩を触媒として用いてもよい。
【0029】
不溶性担体表面に導入したハロアセチル基またはマレイミド基などの活性化官能基を介して、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを結合させる際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃以上５０℃以下の温度範囲の中から官能基の反応性やリガンドの安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃以上３５℃以下の範囲である。また、ｐＨは８．０以上１０以下が好ましく、ｐＨは８．０以上９．０以下がさらに好ましい。
【0030】
本発明は、前述した方法で不溶性担体表面に導入した活性化官能基を介してヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に結合させる際に、終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはその塩存在下で行なうことを特徴としている。一般に、不溶性担体表面へのヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化量を向上させることにより、リガンド固定化ゲルの抗体吸着量が向上する。また、アルカリ洗浄により、ヒトＦｃγＲＩＩＩａがゲルから遊離し、抗体吸着量が低下するため、リガンド固定化ゲルのアルカリ安定性の観点からも、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化量を向上させることが好ましい。還元剤として用いられるＴＣＥＰのリン原子には非共有電子対が存在しており、求核性を有するため、不溶性担体表面に導入したハロアセチル基またはマレイミド基などの活性化官能基との反応性を有する。活性化官能基を介して、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体表面に導入させる際、ＴＣＥＰはヒトＦｃγＲＩＩＩａ中に導入した固定化用システイン残基を反応活性な状態にする役割を果たすため、一定量を添加しなければならない一方、ＴＣＥＰの前記性質により、ヒトＦｃγＲＩＩＩａと競合し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの活性化官能基への結合を阻害する。そこで、ＴＣＥＰの濃度を低下させることにより、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化量を向上させることができる。ＴＣＥＰの塩としてはＴＣＥＰ塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を例示できる。なおＴＣＥＰまたはその塩の存在量を終濃度０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすると好ましい。
【0031】
本発明の好ましい態様として、前述した方法で不溶性担体表面に導入した活性化官能基量を当該担体１ｇあたり２．０μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下とし、かつ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰまたはその塩存在下で前記活性化官能基を介したヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化反応をさせる方法があげられる。当該担体の不溶性担体表面に導入した活性化官能基量を当該範囲にすることにより、不溶性担体表面に導入するヒトＦｃγＲＩＩＩａの配向性を制御できるため、抗体吸着量を向上させることができる。なお活性化官能基量を不溶性担体１ｇあたり３．０μｍｏｌ以上１０μｍｏｌ以下とすると、より好ましい。
【発明の効果】
【0032】
本発明は、不溶性担体にヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を導入する工程と、当該官能基を介してヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化させる工程とを含む方法で免疫グロブリン吸着剤を製造する際、前記固定化させる工程を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰまたはその塩存在下で行なうことを特徴としている。本発明の製造方法で得られた免疫グロブリン吸着剤は従来よりも免疫グロブリン（抗体）吸着量が向上しており、抗体医薬品の工業的な製造で用いる、抗体分取カラムの製造に寄与できる。
【実施例0033】
本発明の各実施形態について、実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら例により何ら限定されるものではない。
【0034】
実施例１ ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を導入した不溶性担体の作製
（１）ヒドロキシ基を有したゲルへのエポキシ基の導入
（１－１）表面にヒドロキシ基を有したポリメタクリレートゲル（東ソー社製、トヨパール）スラリーをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥することでサクションドライゲルを調製した。
（１－２）サクションドライゲル１．０ｇに、５ｍＬの１，４－ジオキサン、０．５ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、ならびにエポキシ化試薬を（ａ）５．０ｍｍｏｌ、（ｂ）２．４ｍｍｏｌ、（ｃ）１．７ｍｍｏｌおよび（ｄ）１．０ｍｍｏｌのいずれか添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間から撹拌振とう反応した。
（１－３）反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回、それぞれ洗浄することでエポキシ基を導入した不溶性担体（以下、エポキシトヨパールと命名する）を作製した。
（１）ヒドロキシ基を有したゲルへのエポキシ基の導入
（１－１）表面にヒドロキシ基を有したポリメタクリレートゲル（東ソー社製、トヨパール）スラリーをグラスフィルター上で吸引ろ過後、そのまま吸引乾燥することでサクションドライゲルを調製した。
（１－２）サクションドライゲル１．０ｇに、５ｍＬの１，４－ジオキサン、０．５ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、ならびにエポキシ化試薬を（ａ）５．０ｍｍｏｌ、（ｂ）２．４ｍｍｏｌ、（ｃ）１．７ｍｍｏｌおよび（ｄ）１．０ｍｍｏｌのいずれか添加し、５０℃に設定した撹拌振とう器内で１６時間から撹拌振とう反応した。
（１－３）反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回、それぞれ洗浄することでエポキシ基を導入した不溶性担体（以下、エポキシトヨパールと命名する）を作製した。
【0035】
（２）エポキシトヨパールへのアミノ基の導入
（２－１）（１）で得られたエポキシトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、３．５ｍｍｏｌのアミノ化試薬（トリス（２－アミノエチル）アミン）、および２ｍＬの１，４－ジオキサンを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間から２４時間撹拌振とう反応した。
（２－２）（２－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでアミノ基を導入したゲル（以下、アミノトヨパールと命名する）を作製した。
（２－１）（１）で得られたエポキシトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、３．５ｍｍｏｌのアミノ化試薬（トリス（２－アミノエチル）アミン）、および２ｍＬの１，４－ジオキサンを添加し、４５℃に設定した撹拌振とう器内で４時間から２４時間撹拌振とう反応した。
（２－２）（２－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、水で４回、１，４－ジオキサンで４回洗浄することでアミノ基を導入したゲル（以下、アミノトヨパールと命名する）を作製した。
【0036】
（３）アミノトヨパールへのハロアセチル基の導入
（３－１）アミノトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、７．５ｍＬの１，４－ジオキサン、２．５ｍＬの水、０．５ｍｍｏｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）、および０．５ｍｍｏｌのハロアセチル化試薬（ヨード酢酸）を添加し、２５℃に設定した撹拌振とう器内で２時間撹拌振とう反応した。
（３－２）（３－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、１，４－ジオキサンで４回、水で４回、それぞれ洗浄することで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基（活性化官能基）である、ハロアセチル基を導入したゲル（以下、ハロアセチルトヨパールと命名する）を作製した。
（３－１）アミノトヨパール１．０ｇ（サクションドライゲル）に、７．５ｍＬの１，４－ジオキサン、２．５ｍＬの水、０．５ｍｍｏｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）、および０．５ｍｍｏｌのハロアセチル化試薬（ヨード酢酸）を添加し、２５℃に設定した撹拌振とう器内で２時間撹拌振とう反応した。
（３－２）（３－１）の反応終了後、反応液をグラスフィルター上で吸引ろ過し、１，４－ジオキサンで４回、水で４回、それぞれ洗浄することで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基（活性化官能基）である、ハロアセチル基を導入したゲル（以下、ハロアセチルトヨパールと命名する）を作製した。
【0037】
（４）ハロアセチル基量の測定
（４－１）（３）で作製したハロアセチルトヨパール１ｍＬに対し５０％（ｖ／ｖ）スラリーとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）を添加した。
（４－２）作製したスラリーを均一化後、当該スラリー１００μＬ（ハロアセチルトヨパールとしては５０μＬ）をスピンカラム（コスモスピンフィルターＨ（孔径０．４５μｍ）、ナカライテスク社製）に添加し、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、サクションドライゲルを調製した。
（４－３）サクションドライゲルに、５０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ α－チオグリセロール、３０μＬのＰＢＳ、および２０μＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、４０℃で１時間撹拌した。
（４－４）２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、反応液をろ液として回収した。
（４－５）（４－４）で回収したろ液５０μＬに、９４０μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、および２０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ ２，２’－ジピリジルジスルフィドを添加し、吸光度を測定した。余剰分のα－チオグリセロールを２，２’－ジピリジルジスルフィドが還元分解することで生じる２－チオピロリドンの吸光度から未反応のα－チオグリセロール量を求め、ハロアセチル基と反応したα－チオグリセロール量を逆算することで、ハロアセチルトヨパールに導入されたハロアセチル基を定量した。
（４－１）（３）で作製したハロアセチルトヨパール１ｍＬに対し５０％（ｖ／ｖ）スラリーとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）を添加した。
（４－２）作製したスラリーを均一化後、当該スラリー１００μＬ（ハロアセチルトヨパールとしては５０μＬ）をスピンカラム（コスモスピンフィルターＨ（孔径０．４５μｍ）、ナカライテスク社製）に添加し、２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、サクションドライゲルを調製した。
（４－３）サクションドライゲルに、５０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ α－チオグリセロール、３０μＬのＰＢＳ、および２０μＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を添加し、４０℃で１時間撹拌した。
（４－４）２０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、反応液をろ液として回収した。
（４－５）（４－４）で回収したろ液５０μＬに、９４０μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、および２０μＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ ２，２’－ジピリジルジスルフィドを添加し、吸光度を測定した。余剰分のα－チオグリセロールを２，２’－ジピリジルジスルフィドが還元分解することで生じる２－チオピロリドンの吸光度から未反応のα－チオグリセロール量を求め、ハロアセチル基と反応したα－チオグリセロール量を逆算することで、ハロアセチルトヨパールに導入されたハロアセチル基を定量した。
【0038】
ハロアセチルトヨパールに導入されたハロアセチル基量はハロアセチルトヨパール１ｇあたり、（１－２）で（ａ）５．０ｍｍｏｌのエポキシ化試薬を添加した場合は１９μｍｏｌであり、（１－２）で（ｂ）２．４ｍｍｏｌのエポキシ化試薬を添加した場合は１１．２μｍｏｌであり、（１－２）で（ｃ）１．７ｍｍｏｌのエポキシ化試薬を添加した場合は８．５μｍｏｌであり、（１－２）で（ｄ）１．０ｍｍｏｌのエポキシ化試薬を添加した場合は４．９μｍｏｌであった。
【0039】
実施例２ ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した不溶性担体の評価（その１）
（１）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを３０ｍｇ含む溶液に、終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌのアルギニン／アルギニン塩酸塩混合物、および終濃度０．１から２．０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を添加して３０分間静置後、ハロアセチル基が１ｇあたり１１．２μｍｏｌ導入されたハロアセチルトヨパール（実施例１（１－２）（ｂ）の反応条件）１．０ｇ（サクションドライゲル）を添加し、２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化量の定量に用いるために反応溶液を回収した。なお本実施例では、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとして、ＷＯ２０１９／０８３０４８号公報で開示のＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を使用した。ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。また前記ＦｃＲ３６ｉは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）からなるポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目（配列番号２では２８番目に相当）のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドである。
（１）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを３０ｍｇ含む溶液に、終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌのアルギニン／アルギニン塩酸塩混合物、および終濃度０．１から２．０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を添加して３０分間静置後、ハロアセチル基が１ｇあたり１１．２μｍｏｌ導入されたハロアセチルトヨパール（実施例１（１－２）（ｂ）の反応条件）１．０ｇ（サクションドライゲル）を添加し、２５℃で２時間反応させた。反応終了後、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化量の定量に用いるために反応溶液を回収した。なお本実施例では、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとして、ＷＯ２０１９／０８３０４８号公報で開示のＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を使用した。ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。また前記ＦｃＲ３６ｉは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基）からなるポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目（配列番号２では２８番目に相当）のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドである。
【0040】
（２）反応終了後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）、２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）の順で洗浄することでヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化担体（以下単に、リガンド固定化ゲルと命名する）を作製した。
【0041】
（３）サイズ排除カラムを用いたＨＰＬＣ分析により、（１）で回収した溶液に含まれる未反応ヒトＦｃγＲＩＩＩａをピークとして検出した。ピーク面積値から未反応量を算出し、反応溶液調製時に添加したヒトＦｃγＲＩＩＩａ量より差し引くことで、不溶性担体に結合したヒトＦｃγＲＩＩＩａ量、および固定化率を算出した。
【0042】
比較例１
実施例２（１）でＴＣＥＰ－ＨＣｌを添加しなかった他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
実施例２（１）でＴＣＥＰ－ＨＣｌを添加しなかった他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
【0043】
実施例２および比較例１の結果を合わせて表１に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａを当該ＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を介して不溶性担体に固定化させる際、終濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰ－ＨＣｌ存在下で行なうと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化率が８５％以上に達した。以上の結果から、前記固定化を、終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰまたはその塩存在下で行なうことで、リガンド固定化ゲルの抗体吸着量が向上することが示唆される。
【0044】
【表1】
【0045】
実施例３ ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した不溶性担体の評価（その２）
（１）ハロアセチルトヨパールとしてハロアセチル基が１ｇあたり１９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ａ）の反応条件）、８．５μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｃ）の反応条件）または４．９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｄ）の反応条件）導入されたトヨパールを用い、ＴＣＥＰ－ＨＣｌの添加量を終濃度０．３ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
（１）ハロアセチルトヨパールとしてハロアセチル基が１ｇあたり１９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ａ）の反応条件）、８．５μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｃ）の反応条件）または４．９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｄ）の反応条件）導入されたトヨパールを用い、ＴＣＥＰ－ＨＣｌの添加量を終濃度０．３ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
【0046】
（２）（１）で作製したリガンド固定化ゲル１ｍＬに対し５０％（ｖ／ｖ）スラリーとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）を添加した。
【0047】
（３）作製したスラリーを均一化後、当該スラリー１００μＬ（固定化ゲルとしては５０μＬ）をスピンカラム（コスモスピンフィルターＨ（孔径０．４５μｍ）、ナカライテスク社製）に添加し、４７００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、サクションドライゲルを調製した。
【0048】
（４）サクションドライゲルにＰＢＳを１５０μＬ添加し、４７００ｒｐｍで１分間遠心分離した。本操作を３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【0049】
（５）洗浄後のゲルに、１５０μＬのＰＢＳ、および６０μＬの人免疫グロブリン溶液（グロブリン筋注１５００ｍｇ／１０ｍＬ「ＪＢ」、日本血液製剤機構製）を順次添加後、２５℃にて２時間撹拌することで、リガンド固定化ゲルに免疫グロブリン（抗体）を吸着させた。
【0050】
（６）（５）の吸着操作後、スピンカラムを４７００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより未吸着の抗体を含んだ溶液をリガンド固定化ゲルから分離した。
【0051】
（７）リガンド固定化ゲルに１５０μＬのＰＢＳを添加し、４７００ｒｐｍで１分間遠心分離する操作を３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【0052】
（８）リガンド固定化ゲルに１５０μＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を添加し、４７００ｒｐｍで１分間遠心分離する操作を３回繰り返すことで前記ゲルに吸着した抗体を溶出した。溶出液の吸光度を測定することで抗体の濃度を算出し、リガンド固定化ゲルへの抗体の吸着量を求めた。
【0053】
比較例２
（１）ハロアセチルトヨパールとしてハロアセチル基が１ｇあたり１９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ａ）の反応条件）導入されたトヨパールを用い、ＴＣＥＰ－ＨＣｌの添加量を終濃度１．０ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
（１）ハロアセチルトヨパールとしてハロアセチル基が１ｇあたり１９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ａ）の反応条件）導入されたトヨパールを用い、ＴＣＥＰ－ＨＣｌの添加量を終濃度１．０ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例２と同様な方法でリガンド固定化ゲルを作製し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化率を算出した。
【0054】
（２）（１）で作製したリガンド固定化ゲルへの抗体吸着量を、実施例３（２）から（７）に記載の方法で求めた。
【0055】
実施例３および比較例２の結果を合わせて表２に示す。なお表２において「抗体吸着量（相対値）」は、比較例２で作製したリガンド固定化ゲルでの吸着量を１００としたときの相対値で示している。
【0056】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａを当該ＦｃγＲＩＩＩａを固定化可能な官能基を介して不溶性担体に固定化させる際、終濃度０．３ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰ－ＨＣｌ存在下（実施例３）で行なうことで、終濃度１．０ｍｍｏｌ／ＬのＴＣＥＰ－ＨＣｌ存在下（比較例２）で行なったときと比較し、抗体吸着量が向上した。以上の結果から、表１の結果より、リガンド固定化ゲルの抗体吸着量が向上することが示唆された条件（終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰまたはその塩存在下）で固定化を行なうことで、リガンド固定化ゲルの抗体吸着量が向上することが確認された。
【0057】
さらにハロアセチルトヨパール１ｇあたりのハロアセチル基導入量を１９．０μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ａ）の反応条件）から、８．５μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｃ）の反応条件）または４．９μｍｏｌ（実施例１（１－２）（ｄ）の反応条件）に下げることで、さらに抗体吸着量が向上した。以上の結果から、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化を終濃度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のＴＣＥＰまたはその塩存在下で行なうのに加え、固定化に用いる不溶性担体に導入する官能基量を当該担体１ｇあたり２．０μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下とすることで、抗体吸着量がさらに向上することが示唆される。
【0058】
【表2】
【配列表】