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特開2023-125435細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する新規キャリア分子

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023125435

(43)【公開日】2023-09-07

(54)【発明の名称】細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する新規キャリア分子

(51)【国際特許分類】

C07K 7/00 20060101AFI20230831BHJP

C12N 5/07 20100101ALI20230831BHJP

【ＦＩ】

C07K7/00 ZNA

C12N5/07

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022029516

(22)【出願日】2022-02-28

(71)【出願人】

【識別番号】304021277

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100141139

【弁理士】

【氏名又は名称】及川周

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田洋孝

(72)【発明者】

【氏名】築地真也

(72)【発明者】

【氏名】澤田隼佑

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BA30

4B065BD50

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA40

4H045BA51

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA20

(57)【要約】

【課題】細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する技術を提供する。
【解決手段】下記式（１）で表される化合物（式（１）中、Ｘ^１は水素原子、アセチル基又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^２は－ＮＨ_２、－ＯＨ又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^１とＸ^２の少なくとも一方は－Ｌ^２－Ｒ^２であり、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立に、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表し、Ｒ^２は、結合性官能基、又は、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から誘導された１価の基を表し、ｍ、ｎは、０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、１～４の整数を表す。）。
［化１］

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）で表される化合物。

【化1】

【請求項2】

前記式（１）中のＬ^２が、－Ｓ－Ｓ－基を含む、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記式（１）におけるｍ及びｎの合計が５以上である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

前記式（１）におけるＸ^１が－Ｌ^２－Ｒ^２であり、ｎが７以下であるか、又は、前記式（１）におけるＸ^２が－Ｌ^２－Ｒ^２であり、ｍが７以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

細胞に接触させた場合に、前記細胞の細胞膜を透過して細胞内に導入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

前記分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質が、ペプチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質を細胞透過性の物質に改変する方法であって、
前記細胞膜非透過性の物質に下記式（２）で表される基又は下記式（２’）で表される基を結合させる工程を含む方法。

【化2】

［式（２）及び式（２’）中、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立に、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表し、ｍ、ｎは、それぞれ独立に０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、それぞれ独立に１～４の整数を表す。また、式（２）中、Ｘ^３は、－ＮＨ_２又は－ＯＨを表し、式（２’）中、Ｘ^４は、水素原子又はアセチル基を表す。］

【請求項8】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質を対象細胞の細胞質に導入する方法であって、
下記式（２）で表される基又は下記式（２’）で表される基が結合した前記物質を前記対象細胞に接触させる工程を含む方法。

【化3】

［式（２）及び式（２’）中、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立に、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表し、ｍ、ｎは、それぞれ独立に０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、それぞれ独立に１～４の整数を表す。式（２）中、Ｘ^３は、－ＮＨ_２又は－ＯＨを表し、式（２’）中、Ｘ^４は、水素原子又はアセチル基を表す。］

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する新規キャリア分子に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、合成低分子医薬の分野は行き詰まりも指摘されており、医薬品開発の中心は抗体医薬をはじめとしたバイオ医薬にシフトしている。このような状況の中、ペプチド医薬は低分子医薬の問題を克服する次世代医薬基盤として期待されている。

【0003】

しかしながら、ペプチドは一般的に細胞膜透過性がないため、細胞内のタンパク質を標的としたペプチド創薬の大きなボトルネックとなっている。このため、ペプチドを細胞内に導入できる汎用的な技術の開発が求められている。

【0004】

これまでに、ペプチドを細胞内に導入するための技術がいくつか開発されてきたが、エンドサイトーシス経由での細胞内導入である場合が多い（例えば、非特許文献１を参照。）。エンドサイトーシス経由でペプチドが細胞内に導入された場合、ペプチドはエンドソーム内に内包されるため、効果的に薬効を発揮することができない。

【0005】

一方、ピレンブチレート法（例えば、非特許文献２を参照。）によれば、細胞質にペプチドを送達することができる。しかしながら、この手法では、細胞を高濃度の別の化合物で前処理する必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Futaki S., Membrane-permeable Arginine-Rich Peptides and the Translocation Mechanisms, Adv Drug Deliv Rev., 57 (4), 547-548, 2005.

【非特許文献2】Takeuchi T., et al., Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate, ACS Chem Biol., 1 (5),299-303, 2006.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

このように、ペプチド等の細胞膜非透過性の物質を細胞質に直接送達する汎用的な技術は未だ確立されていない。そこで、本発明は、細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物。

【化1】

［式（１）中、Ｘ^１は水素原子、アセチル基又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^２は－ＮＨ_２、－ＯＨ又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^１とＸ^２の少なくとも一方は－Ｌ^２－Ｒ^２であり、Ｌ^１及びＬ^２は、それぞれ独立に、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表し、Ｒ^２は、結合性官能基、又は、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から誘導された１価の基を表し、ｍ、ｎは、それぞれ独立に０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、それぞれ独立に１～４の整数を表す。］
［２］前記式（１）中のＬ^２が、－Ｓ－Ｓ－基を含む、［１］に記載の化合物。
［３］前記式（１）におけるｍ及びｎの合計が５以上である、［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］前記式（１）におけるＸ^１が－Ｌ^２－Ｒ^２であり、ｎが７以下であるか、又は、前記式（１）におけるＸ^２が－Ｌ^２－Ｒ^２であり、ｍが７以下である、［１］～［３］のいずれかに記載の化合物。
［５］細胞に接触させた場合に、前記細胞の細胞膜を透過して細胞内に導入される、［１］～［４］のいずれかに記載の化合物。
［６］前記分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質が、ペプチドである、［１］～［５］のいずれかに記載の化合物。
［７］分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質を細胞透過性の物質に改変する方法であって、前記細胞膜非透過性の物質に下記式（２）で表される基又は下記式（２’）で表される基を結合させる工程を含む方法。

【化2】

【化3】

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１（ａ）は、実験例３で使用したＳＨ２－ＥＧＦＰの構造を示す模式図である。図１（ｂ）及び（ｃ）は、実験例３の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図2】細胞膜局在の実験系を説明する模式図である。

【図3】図３（ａ）は、実験例５で使用したｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰの構造を示す模式図である。図３（ｂ）及び（ｃ）は、実験例５の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図4】図４（ａ）は、実験例７で使用した１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰの構造を示す模式図である。図４（ｂ）及び（ｃ）は、実験例７の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図5】図５（ａ）及び（ｂ）は、実験例１０の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図6】図６（ａ）及び（ｂ）は、実験例１３の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図7】図７（ａ）及び（ｂ）は、実験例１６の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図8】図８（ａ）は、実験例１８で使用したＤＤ－ＹＦＰの構造を示す模式図である。図８（ｂ）及び（ｃ）は、実験例１８の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図9】不安定化変異型ｅＤＨＦＲの実験系を説明する模式図である。

【図10】図１０（ａ）及び（ｂ）は、実験例２０の結果を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。

【図11】図１１は、実験例２２の結果を示す顕微鏡写真である。

【図12】図１２は、実験例２３の結果を示す顕微鏡写真である。

【図13】図１３は、実験例２４の結果を示す顕微鏡写真である。

【図14】図１４は、実験例２６、２９、３０、３３の結果を示す顕微鏡写真である。

【図15】図１５は、実験例３５の結果を示す顕微鏡写真である。

【図16】図１６（ａ）は、各化合物のペプチド導入率を算出した結果を示すグラフである。図１６（ｂ）は、各化合物の細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。

【図17】図１７（ａ）～（ｃ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害実験を説明する模式図である。

【図18】図１８（ａ）は、実験例３７におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）の結果を数値化したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

一実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を提供する。

【0012】

【化4】

【0013】

実施例において後述するように、本実施形態の化合物を動物細胞に接触させると、細胞膜を透過して細胞内に導入される。この過程において、本実施形態の化合物は、エンドサイトーシスにより細胞質に導入されるか、あるいは、エンドサイトーシスによらず、細胞膜を直接透過することにより細胞質に導入される。

【0014】

本実施形態の化合物は、従来法と異なり、細胞を別の化合物で前処理することなく、培地に添加するだけで、細胞質に導入することができる。また、本実施形態の化合物を生体に投与することにより、エンドサイトーシスにより生体の細胞の細胞質に送達するか、あるいは、エンドサイトーシスによらず、細胞膜を直接透過して生体の細胞の細胞質に送達することができる。

【0015】

式（１）で表される化合物において、Ｒ^２は結合性官能基であってもよいし、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から誘導された１価の基であってもよい。

【0016】

結合性官能基としては、例えば、アジド基、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基、スクシニミジルエステル基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ケト基等が挙げられる。

【0017】

Ｒ^２が結合性官能基である化合物は、当該結合性官能基による結合反応により、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の任意の物質に結合させることにより、細胞膜非透過性の物質を細胞膜透過性の物質に変換するために用いることができる。

【0018】

例えば結合性官能基がＤＢＣＯ基である場合、式（１）で表される化合物を、アジド基を有する化合物と接触させることにより、クリック反応により結合させることができる。また、例えば結合性官能基がスクシニミジルエステル基である場合、式（１）で表される化合物を、第一級アミンを有する化合物と接触させることにより、アミド結合を形成させて結合させることができる。また、例えば結合性官能基がマレイミド基である場合、式（１）で表される化合物を、チオール基を有する化合物と接触させることにより、チオエーテル結合を形成させて結合させることができる。

【0019】

本実施形態の化合物において、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から誘導された１価の基とは、例えば、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から、アジド基を除いた基、アミノ基を除いた基、チオール基を除いた基等であってもよい。

【0020】

細胞膜非透過性の物質とは、例えば、動物細胞の培地中に添加しても細胞中に導入されない物質を意味する。例えば、培地中に５μＭの濃度で添加して３０分インキュベート後に、細胞質中における物質濃度が５ｎＭ未満である物質を細胞膜非透過性の物質と判断することができる。

【0021】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質は、ペプチドであってもよい。ペプチドは、直鎖状のペプチドであってもよいし、環状のペプチドであってもよい。また、天然アミノ酸のみからなるペプチドであってもよいし、特殊アミノ酸を含むペプチドであってもよい。特殊アミノ酸を含むペプチドとしては、ペプトイドが挙げられる。特殊アミノ酸としては、例えば、アセチル化アミノ酸、クロロアセチル化アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、β－アミノ酸等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0022】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質としては、医薬、研究用物質等が挙げられる。分子量５００未満の医薬は低分子医薬と呼ばれる。また、分子量５００～２０００程度の医薬は中分子医薬と呼ばれる。中分子医薬としては、ペプチド医薬が挙げられる。

【0023】

より具体的な、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質としては、実施例において後述する、ＨＡペプチド、ＳＨ２ペプチド、ＧＣＮ４ペプチド、ＰＩ３Ｋインヒビターペプチド、フルオレセイン等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0024】

一実施形態において、本発明は、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質を細胞透過性の物質に改変する方法であって、前記細胞膜非透過性の物質に下記式（２）で表される基又は下記式（２’）で表される基を結合させる工程を含む方法を提供する。

【化5】

【0025】

例えば、細胞膜透過性がない医薬に、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基を結合させることにより、上記式（１）で表される化合物を得ることができる。この結果、細胞膜透過性がない医薬を、エンドサイトーシスにより細胞質に導入するか、あるいは、エンドサイトーシスによらず、細胞膜を直接透過することにより細胞質に導入し、薬効を発揮させることができる医薬に変換することができる。これにより、例えばペプチド創薬を飛躍的に加速することができる。

【0026】

細胞膜透過性がない物質に、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基を結合させる方法としては、上述した方法が挙げられる。具体的には、式（１）で表される化合物において、Ｒ^２が結合性官能基である化合物を、細胞膜透過性がない物質と接触させることにより、当該結合性官能基と細胞膜透過性がない物質との結合反応により、細胞膜透過性がない物質に、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基を結合させることができる。

【0027】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質が医薬である場合、上記式（１）で表される化合物は、医薬を直接細胞質に送達する薬物送達システムであるということができる。

【0028】

分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質は、研究用物質であってもよい。研究用物質としては、特に限定されず、例えば、化合物ライブラリ、標識物質、糖等が挙げられる。糖はオリゴ糖であってもよい。化合物ライブラリとしては、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、ペプチドライブラリ等が挙げられる。

【0029】

上記式（１）で表される化合物、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基において、Ｌ^１は、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表す。Ｌ^１は、Ｒ^１で表される基と、下記式（３）で表される基とを結合するリンカーとして機能する基であれば特に限定されない。また、Ｌ^１の長さは、本発明の効果が得られる程度であれば特に限定されない。Ｌ^１は、アミノ酸の側鎖に由来する基であってもよい。

【0030】

【化6】

［式（３）中、Ｘ^１は水素原子、アセチル基又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^２は－ＮＨ_２、－ＯＨ又は－Ｌ^２－Ｒ^２を表し、Ｘ^１とＸ^２の少なくとも一方は－Ｌ^２－Ｒ^２であり、Ｌ^２は、それぞれ独立に、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^２は、結合性官能基、又は、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質から誘導された１価の基を表し、ｍ、ｎは、それぞれ独立に０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、それぞれ独立に１～４の整数を表す。］

【0031】

上記式（１）で表される化合物、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基において、Ｌ^２は、Ｒ^２で表される基と、下記式（４）で表される基又は下記式（４’）で表される基とを結合するリンカーとして機能する基であれば特に限定されない。また、Ｌ^２の長さは、本発明の効果が得られる程度であれば特に限定されない。また、上記式（１）で表される化合物において、Ｌ^２は、上述した結合性官能基の一部を含んでいてもよい。

【0032】

【化7】

［式（４）及び式（４’）中、Ｌ^１は、１又は複数の－Ｃ－が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－に置換されていてもよい炭素数１～５０の２価の炭化水素基を表し、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表し、ｍ、ｎは、それぞれ独立に０～２０の整数を表し、ｐ、ｑは、それぞれ独立に１～４の整数を表す。また、式（４）中、Ｘ^３は、－ＮＨ_２又は－ＯＨを表し、式（４’）中、Ｘ^４は、水素原子又はアセチル基を表す。］

【0033】

実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物を、細胞質内に導入した後、Ｒ^２で表される基と、上記式（４）で表される基とを切断したい場合、例えば、Ｌ^２に－Ｓ－Ｓ－基を含ませるとよい。この場合、上記式（１）で表される化合物は、細胞質内に導入された後、細胞質内の還元的条件により切断される。

【0034】

上記式（１）で表される化合物、上記式（２）で表される基又は上記式（２’）で表される基において、下記式（５）又は下記式（６）で表される基は、正電荷を有するアミノ酸残基又はその誘導体を含むことができる。正電荷を有するアミノ酸残基としては、リジン残基、アルギニン残基等が挙げられる。下記式（５）又は下記式（６）で表される基は、これらのアミノ酸残基のうち１種を単独で含んでいてもよいし、複数種類を混合して含んでいてもよい。下記式（５）又は下記式（６）で表される基は、なかでも、リジン残基であることが好ましい。実施例において後述するように、リジン残基を用いることにより、細胞毒性を抑えつつ、細胞内への導入効率が格段に上昇する傾向がある。

【0035】

【化8】

［式（５）中、ｍ、ｐの定義は上記式（１）におけるものと同様である。］

【0036】

【化9】

［式（６）中、ｎ、ｑの定義は上記式（１）におけるものと同様である。］

【0037】

上記式（５）におけるｍが０である場合、上記式（５）は単結合を表す。同様に、上記式（６）におけるｎが０である場合、上記式（６）は単結合を表す。

【0038】

上記式（５）におけるｐが４である場合、上記式（５）で表される基はアミノ酸のリジン残基又はそのポリマーである。また、上記式（６）におけるｑが４である場合、上記式（６）で表される基はアミノ酸のリジン残基又はそのポリマーである。リジン残基はＬ体であってもよいしＤ体であってもよい。また、Ｌ体とＤ体の双方を含んでいてもよい。リジン残基の誘導体としては、例えば、上記式（５）におけるｐ又は上記式（６）におけるｑが４以外である基が挙げられる。

【0039】

上記式（５）又は上記式（６）で表される基がＬ体のリジン残基を含む場合、上記式（１）で表される化合物が細胞質内に導入された後、上記式（５）又は上記式（６）で表される基の部分が切断されやすい傾向がある。また、上記式（５）又は上記式（６）で表される基がＤ体のリジン残基を含む場合、上記式（１）で表される化合物が細胞質内に導入された後、上記式（５）又は上記式（６）で表される基の部分が切断されにくくなる傾向がある。

【0040】

上記式（５）で表される基において、ｍが２以上である場合、各繰り返し単位は同一であってもよく異なっていてもよい。同様に、上記式（６）で表される基において、ｎが２以上である場合、各繰り返し単位は同一であってもよく異なっていてもよい。

【0041】

実施例において後述するように、ｍ又はｎの数を適宜調整することにより、上記式（１）で表される化合物の細胞への導入効率、細胞毒性等を調整することができる。

【0042】

例えば、上記式（１）におけるｍ及びｎの合計は５以上であってもよい。実施例において後述するように、上記式（１）におけるｍ及びｎの合計が大きいほど、上記式（１）で表される化合物の細胞への導入効率が上昇する傾向がある。例えば、上記式（１）におけるｎが０であり、ｍが５以上であってもよい。

【0043】

また、上記式（１）におけるｍ及びｎの合計は１０以下であってもよい。実施例において後述するように、ｍ及びｎの合計が１０以下であると、上記式（１）で表される化合物の細胞毒性が低減される傾向がある。例えば、上記式（１）におけるｎが０であり、ｍが１０以下であってもよい。

【0044】

また、上記式（１）で表される化合物において、Ｒ^１は化合物の端部に近いことが好ましい。また、Ｒ^１はＲ^２から離れていることが好ましい。より具体的には、上記式（１）におけるＸ^１が－Ｌ^２－Ｒ^２である場合、ｎは小さいことが好ましく、ｍは大きいことが好ましい。また、上記式（１）におけるＸ^２が－Ｌ^２－Ｒ^２である場合、ｎは大きいことが好ましく、ｍは小さいことが好ましい。

【0045】

例えば、上記式（１）におけるＸ^１が－Ｌ^２－Ｒ^２である場合、上記式（１）におけるｎが７以下であることが好ましく、ｎが６以下であることが好ましく、ｎが５以下であることが好ましく、ｎが４以下であることが好ましく、ｎが３以下であることが好ましく、ｎが２以下であることが好ましく、ｎが１以下であることが好ましく、ｎが０であることが好ましい。

【0046】

また、上記式（１）におけるＸ^２が－Ｌ^２－Ｒ^２である場合、上記式（１）におけるｍが７以下であることが好ましく、ｍが６以下であることが好ましく、ｍが５以下であることが好ましく、ｍが４以下であることが好ましく、ｍが３以下であることが好ましく、ｍが２以下であることが好ましく、ｍが１以下であることが好ましく、ｍが０であることが好ましい。

【0047】

上記式（１）におけるｍ及びｎが上記の範囲である場合、上記式（１）で表される化合物の細胞への導入効率が上昇する傾向がある。

【0048】

上記式（１）又は（２）で表される化合物において、Ｒ^１は、イソプレン単位数１～５のプレニル基、炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアシル基又は炭素数１０～３０の飽和若しくは不飽和のアルキル基を表す。より具体的なＲ^１としては、実施例において後述する、ファルネシル基、パルミトイル基、オレオイル基等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0049】

実施例において後述するように、Ｒ^１がこのような構造であることにより、上記式（１）で表される化合物を動物細胞と接触させるだけで、上記式（１）で表される化合物をエンドサイトーシスにより細胞質に導入するか、あるいは、エンドサイトーシスによらず、細胞膜を直接透過することにより細胞質に導入することができる。

【0050】

また、上記式（１）で表される化合物が細胞質内に導入された後、上記式（１）におけるＬ^２、又は、上記式（１）における式（５）の部分が切断されると、Ｒ^２は細胞質内に局在することになる。

【0051】

一方、上記式（１）で表される化合物が細胞質内に導入された後、上記式（１）におけるＬ^２、又は、上記式（１）における式（５）の部分が切断されなかった場合、Ｒ^２は、Ｒ^１の性質に応じて細胞の特定の領域に局在することになる。特定の領域としては、例えば細胞膜が挙げられる。

【0052】

実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物は、ペプチド固相合成法を利用した方法により合成することができる。

【0053】

式（１）で表される具体的な化合物としては、実施例において後述する、化合物（７）～（１９）、（２６）等が挙げられるがこれらに限定されない。

【0054】

式（１）で表される化合物において、Ｒ^２が医薬から誘導された基である場合、式（１）で表される化合物は医薬化合物であるということができる。医薬化合物は薬学的に許容される担体と混和して医薬組成物として製剤化されていてもよい。

【0055】

医薬組成物における製剤化の例としては、特に限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。または、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体と混合した無菌性溶液又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。

【0056】

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油等の香味剤等が挙げられる。

【0057】

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水等のベヒクルを用いて通常の製剤実施にしたがって処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０と併用してもよい。

【0058】

また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

【0059】

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

【0060】

化合物の投与量は、投与する薬物、患者の症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、例えばは約１．０から５０ｍｇ、例えば約１．０から２０ｍｇであると考えられる。

【0061】

非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は、投与する薬物、投与対象、対象臓器、患者の症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、例えば約０．１から２０ｍｇ、例えば約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与することが適切であると考えられる。

【0062】

一実施形態において、本発明は、分子量１００～５０００の細胞膜非透過性の物質を対象細胞の細胞質に導入する方法であって、上記式（２）又は上記式（２’）で表される基が結合した前記物質を前記対象細胞に接触させる工程を含む方法を提供する。

【0063】

本実施形態の方法は、インビトロで行ってもよいし、インビボで行ってもよい。また、対象細胞は、生体外の細胞であってもよいし、ヒト又は非ヒト動物の生体内の細胞であってもよい。

【実施例0064】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0065】

［実験例１］
（ＤＢＣＯ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４，６，８，１０）の合成）
下記スキーム（１）にしたがって、下記式（７）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４，６，８，１０）」という場合がある。）を合成した。

【0066】

【化10】

【0067】

【化11】

【0068】

具体的には、スキーム（１）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－^ＤＫｎ^ＤＣ（ｎ＝４，６，８，１０）を合成した。

【0069】

Ｆｍｏｃ脱保護は、室温で１５分間、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２０％ピペリジンを用いて行った。また、アミノ酸カップリング反応は、ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（３．１当量）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、３．０当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３．０当量）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６．０当量）の混合物を用いて室温で行った。また、全てのＦｍｏｃ脱保護及びカップリング工程は、Ｋａｉｓｅｒ試験によってモニターした。また、全ての洗浄手順はＤＭＦを用いて行った。

【0070】

まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（１２７ｍｇ、１００μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0071】

Ｔｒｔ，Ｂｏｃ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８^ＤＣを得た。

【0072】

続いて、ＤＭＦ／アセトニトリル／水＝２／１／１（０．０５％ＴＦＡ）の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫｎ^ＤＣ（ｎ＝４，６，８，１０）、酢酸亜鉛二水和物、トランス，トランス－ファルネシルブロミドを溶解してファルネシル化した。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４，６，８，１０）を透明固体として得た。

【0073】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：
ＤＢＣＯ－^ＤＫ４Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，１５５９．９２７０；ｆｏｕｎｄ，１５６０．１４５２
ＤＢＣＯ－^ＤＫ６Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，１８１６．１１６９；ｆｏｕｎｄ，１８１７．２４９８
ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，２０７２．３０６８；ｆｏｕｎｄ，２０７３．３８８２
ＤＢＣＯ－^ＤＫ１０Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，２３２８．４９６７；ｆｏｕｎｄ，２３２９．５０６８

【0074】

［実験例２］
（ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（２）にしたがって、下記式（８）で表される化合物（以下、「ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0075】

【化12】

【0076】

【化13】

【0077】

具体的には、まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（４６．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｆ_２Ｐｍｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0078】

ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ（ＳＨ２ペプチド）を得た。ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＤＸＶＰＭＬＫ（配列番号１、Ｘ＝ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ））であり、分子量は約１０４５．０９であった。

【0079】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0080】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ－Ｈ］^－，３１１４．７１１２；ｆｏｕｎｄ，３１１５．７２４９

【0081】

［実験例３］
（ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒによる局在化の検討）
ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）Ｃ末端由来のＳｒｃｈｏｍｏｌｏｇｙ２ｄｏｍａｉｎ（ＳＨ２ドメイン）－ＥＧＦＰ（以下、「ＳＨ２－ＥＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＳＨ２－ＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、ＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0082】

図１（ａ）は、ＳＨ２－ＥＧＦＰの構造を示す模式図である。ＳＨ２－ＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号２に示す。図１（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0083】

図１（ｂ）は、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加前のＳＨ２－ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図１（ｃ）は、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に撮影したＳＨ２－ＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に、ＳＨ２－ＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0084】

この結果は、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒがＳＨ２－ＥＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在するＳＨ２－ＥＧＦＰのＳＨ２ドメインがＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒのＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0085】

図２は、細胞膜局在の実験系を説明する模式図である。図２における「キャリア分子」は、本実験例におけるＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒに該当する。図２における「ＴａｒｇｅｔＰｒｏｔｅｉｎ－蛍光タンパク質」は、本実験例におけるＳＨ２－ＥＧＦＰに該当する。図２に示すように、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒをＳＨ２－ＥＧＦＰ発現細胞に接触させると、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒは細胞膜を透過して細胞質に導入される。続いて、細胞質に存在するＳＨ２－ＥＧＦＰのＳＨ２ドメインがＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒのＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅと結合して複合体を形成する。続いて、形成された複合体が、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在する。この結果、細胞膜においてＥＧＦＰの蛍光が観察される。

【0086】

［実験例４］
（ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（３）にしたがって、下記式（９）で表される化合物（以下、「ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0087】

【化14】

【0088】

【化15】

【0089】

具体的には、まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（６９．８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0090】

Ｂｏｃ、Ｐｂｆ、ＯｔＢｕ、Ｔｒｔ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＣＮ４ペプチド）を得た。ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＫ（配列番号３）であり、分子量は約２５０８．８７であった。

【0091】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0092】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，４５７９．６６７７；ｆｏｕｎｄ，４５８０．１３１９

【0093】

［実験例５］
（ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒによる局在化の検討）
Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ（以下、「ｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１５μＭとなるようにＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、ｓｆＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0094】

図３（ａ）は、ｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰの構造を示す模式図である。ｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号４に示す。ｓｃＦｖＧＣＮ４はＧＣＮ４ペプチドに結合する一本鎖抗体である。図３（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0095】

図３（ｂ）は、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加前のｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図３（ｃ）は、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に撮影したｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａの添加から３０分後に、ｓｆＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0096】

この結果は、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒがｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在するｓｃＦｖＧＣＮ４－ｓｆＧＦＰのｓｃＦｖＧＣＮ４がＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒのＧＣＮ４ペプチドと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＧＣＮ４ｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0097】

［実験例６］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（４）にしたがって、下記式（１０）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0098】

【化16】

【0099】

【化17】

【0100】

具体的には、まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（６９．８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0101】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ（ＨＡペプチド）を得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１２９７．３９であった。

【0102】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＨＡｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0103】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３３６８．８８４３；ｆｏｕｎｄ，３３６８．３０８１

【0104】

［実験例７］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒによる局在化の検討）
Ｆｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）－ｍＥＧＦＰ（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度２.５μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、ｍＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0105】

図４（ａ）は、１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰの構造を示す模式図である。１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号６に示す。ＦｒａｎｋｅｎｂｏｄｙはＨＡペプチドに結合する一本鎖抗体である。図４（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0106】

図４（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加前の１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図４（ｃ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に撮影した１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に、ｍＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0107】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒが１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在する１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰのＦｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）がＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＦａｒのＨＡペプチドと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0108】

［実験例８］
（ＤＢＣＯ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４の合成）
下記スキーム（５）にしたがって、下記式（１１）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４」という場合がある。）を合成した。

【0109】

【化18】

【0110】

【化19】

【0111】

具体的には、スキーム（５）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－^ＤＫ４^ＤＣ^ＤＫ４を合成した。

【0112】

【0113】

まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0114】

【0115】

続いて、ＤＭＦ／アセトニトリル／水＝２／１／１（０．０５％ＴＦＡ）の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ４^ＤＣ^ＤＫ４、酢酸亜鉛二水和物、トランス，トランス－ファルネシルブロミドを溶解してファルネシル化した。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－^ＤＫ４^ＤＣ^ＤＫ４を透明固体として得た。

【0116】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，１８６８．１１９０；ｆｏｕｎｄ，１８６８．２７３６

【0117】

［実験例９］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４の合成）
下記スキーム（６）にしたがって、下記式（１２）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４」という場合がある。）を合成した。

【0118】

【化20】

【0119】

【化21】

【0120】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４とＨＡｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４を白色固体として得た。

【0121】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３３６８．８８４３；ｆｏｕｎｄ，３３６８．８３１０

【0122】

［実験例１０］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４による局在化の検討）
Ｆｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）－ｍＥＧＦＰ（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４を添加した。続いて、ｍＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0123】

図５（ａ）及び（ｂ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0124】

図５（ａ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４の添加前の１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図５（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４の添加から３０分後に撮影した１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４の添加から３０分後に、ｍＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0125】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４が１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在する１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰのＦｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）がＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４のＨＡペプチドと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ４Ｆａｒ^ＤＫ４のファルネシル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0126】

この結果は、上記式（１）におけるＲ^１（本実験例においてはファルネシル基）が、上記式（１）で表される化合物の末端に位置していなくても、上記式（１）で表される化合物が細胞膜を透過することができることを示す。

【0127】

［実験例１１］
（ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌの合成）
下記スキーム（７）にしたがって、下記式（１３）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌ」という場合がある。）を合成した。

【0128】

【化22】

【0129】

【化23】

【0130】

具体的には、スキーム（７）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌを合成した。

【0131】

Ｆｍｏｃ脱保護は、室温で１５分間、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２０％ピペリジンを用いて行った。ｉｖＤｄｅ脱保護は、室温で３０分間、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５％ヒドラジンを用いて行った。また、アミノ酸カップリング反応は、ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（３．１当量）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、３．０当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３．０当量）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６．０当量）の混合物を用いて室温で行った。また、全てのＦｍｏｃ脱保護及びカップリング工程は、Ｋａｉｓｅｒ試験によってモニターした。また、全ての洗浄手順はＤＭＦを用いて行った。

【0132】

まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。最後にｉｖＤｄｅ脱保護を行い、Ｐａｌｍｉｔｉｃａｃｉｄをカップリングした。

【0133】

Ｂｏｃ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌを得た。

【0134】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，２０４０．４３５９；ｆｏｕｎｄ，２０４０．５４９１

【0135】

［実験例１２］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌの合成）
下記スキーム（８）にしたがって、下記式（１４）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌ」という場合がある。）を合成した。

【0136】

【化24】

【0137】

【化25】

【0138】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＰａｌとＨＡｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌを白色固体として得た。

【0139】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３５９８．１１７５；ｆｏｕｎｄ，３５９９．６７００

【0140】

［実験例１３］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌによる局在化の検討）
Ｆｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）－ｍＥＧＦＰ（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度２．５μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌを添加した。続いて、ｍＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0141】

図６（ａ）及び（ｂ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0142】

図６（ａ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌの添加前の１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図６（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌの添加から３０分後に撮影した１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌの添加から３０分後に、ｍＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0143】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌが１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在する１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰのＦｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）がＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＰａｌのＨＡペプチドと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｐａｌのパルミトイル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0144】

この結果は、上記式（１）におけるＲ^１が、ファルネシル基以外の基であっても、上記式（１）で表される化合物が細胞膜を透過することができることを示す。

【0145】

［実験例１４］
（ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｏｌｅの合成）
下記スキーム（９）にしたがって、下記式（１５）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｏｌｅ」という場合がある。）を合成した。

【0146】

【化26】

【0147】

【化27】

【0148】

具体的には、スキーム（９）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｐａｌを合成した。

【0149】

【0150】

まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。最後にｉｖＤｄｅ脱保護を行い、Ｏｌｅｉｃａｃｉｄをカップリングした。

【0151】

【0152】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，２０６６．４５１５；ｆｏｕｎｄ，２０６６．４９２２

【0153】

［実験例１５］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅの合成）
下記スキーム（１０）にしたがって、下記式（１６）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅ」という場合がある。）を合成した。

【0154】

【化28】

【0155】

【化29】

【0156】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｏｌｅ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＯｌｅとＨＡｐｅｐｔｉｄｅを連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅを白色固体として得た。

【0157】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ－Ｈ］^－，３６２２．１１８６；ｆｏｕｎｄ，３６２３．２３６５

【0158】

［実験例１６］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅによる局在化の検討）
Ｆｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）－ｍＥＧＦＰ（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度２．５μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅを添加した。続いて、ｍＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0159】

図７（ａ）及び（ｂ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは１０μｍである。

【0160】

図７（ａ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅの添加前の１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。また、図７（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅの添加から３０分後に撮影した１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅの添加から３０分後に、ｍＥＧＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0161】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅが１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在する１５Ｆ１１－ｍＥＧＦＰのＦｒａｎｋｅｎｂｏｄｙ（１５Ｆ１１）がＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８ＯｌｅのＨＡペプチドと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－^ＤＫ８Ｏｌｅのオレオイル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。

【0162】

この結果は、上記式（１）におけるＲ^１が、ファルネシル基以外の基であっても、上記式（１）で表される化合物が細胞膜を透過することができることを更に指示するものである。

【0163】

［実験例１７］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（１１）にしたがって、下記式（１７）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0164】

【化30】

【0165】

【化31】

【0166】

具体的には、まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８．０ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ｅｔｈｙｌ－ＳＳ－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｉｃｄ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。最後にｉｖＤｄｅ脱保護を行い、ＴＭＰａｃｉｄをカップリングした。

【0167】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．２２であった。

【0168】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0169】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，４０１８．１５５９；ｆｏｕｎｄ，４０１８．１７１５

【0170】

［実験例１８］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの細胞内導入の検討）
ｅＤＨＦＲ（ＤｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＤｏｍａｉｎ）－ＹＦＰ（以下、「ＤＤ－ＹＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＤＤ－ＹＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、ＹＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0171】

図８（ａ）は、ＤＤ－ＹＦＰの構造を示す模式図である。ＤＤ－ＹＦＰのアミノ酸配列を配列番号７に示す。ＤＤ－ＹＦＰは細胞内で発現された後、速やかに分解する。これに対し、ＤＤ－ＹＦＰにｅＤＨＦＲのリガンドであるＴＭＰが結合すると、安定化され、分解されなくなることで、細胞内のＹＦＰの蛍光強度が増大する。

【0172】

図８（ｂ）及び（ｃ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。図８（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加前のＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の写真である。また、図８（ｃ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から６０分後に撮影したＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から６０分後に、細胞質においてＹＦＰの蛍光が検出されたことが明らかとなった。

【0173】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８ＦａｒがＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在するＤＤ－ＹＦＰがＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８ＦａｒのＴＭＰと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、細胞質に拡散したことを示す。細胞質内は還元条件下にあるため、細胞質内にＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒが取り込まれた後、ジスルフィド結合が切断される。この結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰと^ＤＫ８Ｆａｒは分離する。そして、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰはＤＤ－ＹＦＰと結合してＤＤ－ＹＦＰが安定化され、細胞内発現量が上昇し、細胞質に拡散する。

【0174】

図９は、不安定化変異型ｅＤＨＦＲの実験系を説明する模式図である。図９における「キャリア分子」は、本実験例におけるＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒに該当する。図９における「不安定化変異型ｅＤＨＦＲ－ＹＦＰ」は、本実験例におけるＤＤ－ＹＦＰに該当する。ＤＤ－ＹＦＰは不安定化変異型であるため、発現後すぐに分解される。

【0175】

図９に示すように、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８ＦａｒをＤＤ－ＹＦＰ発現細胞に接触させると、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒは細胞膜を透過して細胞質に導入される。続いて、細胞質に存在するＤＤ－ＹＦＰがＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８ＦａｒのＴＭＰと結合して複合体を形成する。その結果、ＤＤ－ＹＦＰが安定化され、分解されなくなり、存在量が上昇する。

【0176】

また、細胞質内の還元条件により、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒのジスルフィド結合が切断される。この結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰと^ＤＫ８Ｆａｒが分離する。その結果、ＤＤ－ＹＦＰが細胞質に拡散する。

【0177】

なお、後述するように、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒのジスルフィド結合を有しないＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８ＦａｒをＤＤ－ＹＦＰ発現細胞に接触させると、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒは細胞膜を透過して細胞質に導入される。続いて、細胞質に存在するＤＤ－ＹＦＰがＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８ＦａｒのＴＭＰと結合して複合体を形成する。ここで、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒは、細胞質内の還元条件においても切断されない。この結果、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在する。この結果、細胞膜においてＹＦＰの蛍光が観察される。

【0178】

［実験例１９］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（１２）にしたがって、下記式（１８）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0179】

【化32】

【0180】

【化33】

【0181】

具体的には、まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８．０ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－８－Ａｏｃ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。最後にｉｖＤｄｅ脱保護を行い、ＴＭＰａｃｉｄをカップリングした。

【0182】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅを得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．２２であった。

【0183】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0184】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３９９５．２５１５；ｆｏｕｎｄ，３９９６．３７０４

【0185】

［実験例２０］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒの細胞内導入の検討）
ｅＤＨＦＲ（ＤｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄＤｏｍａｉｎ）－ＹＦＰ（以下、「ＤＤ－ＹＦＰ」という場合がある。）を発現させたＨｅＬａ細胞（以下、「ＤＤ－ＹＦＰ発現細胞」という場合がある。）の培地に終濃度１μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、ＹＦＰの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0186】

図１０（ａ）及び（ｂ）は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。

【0187】

図１０（ａ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加前のＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の写真である。また、図１０（ｂ）は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から６０分後に撮影したＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の写真である。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から６０分後に、ＤＤ－ＹＦＰが細胞膜に局在したことが明らかとなった。

【0188】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８ＦａｒがＤＤ－ＹＦＰ発現細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に存在するＤＤ－ＹＦＰのｅＤＨＦＲがＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８ＦａｒのＴＭＰと結合して複合体を形成し、更に、形成された複合体が、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒのファルネシル基の存在により、細胞膜に局在したことを示す。なお、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＴＭＰ－Ａｏｃ－^ＤＫ８Ｆａｒは細胞質内の還元条件下においても切断されない。

【0189】

［実験例２１］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）の合成）
下記スキーム（１３）にしたがって、下記式（１９）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）」という場合がある。）を合成した。

【0190】

【化34】

【0191】

【化35】

【0192】

具体的には、まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（７６．０ｍｇ、６０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ｅｔｈｙｌ－ＳＳ－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｉｃｄ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。最後にｉｖＤｄｅ脱保護を行い、５（６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＬ）をカップリングした。

【0193】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．１２であった。

【0194】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫｎＦａｒとＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）を白色固体として得た。

【0195】

ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ４Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３０５４．７；ｆｏｕｎｄ，３５１１．３
ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ６Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３７６０．８；ｆｏｕｎｄ，３７６６.７
ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，４０１７.０３；ｆｏｕｎｄ，４０１７.８
ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ１０Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，４２７３．２；ｆｏｕｎｄ，４２８０．６

【0196】

［実験例２２］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）の細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）を添加した。続いて、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒの添加から３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0197】

図１１は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは８０μｍである。図１１中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光が検出されたことが明らかとなった。

【0198】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）が、エンドサイトーシスではなく、細胞の細胞膜を直接透過して細胞質に導入され、細胞質に拡散したことを示す。より詳細には、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫｎＦａｒ（ｎ＝４、６、８、１０）が細胞質に導入された後、ジスルフィド結合が切断され、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬと^ＤＫｎＦａｒが分離し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬが細胞質に拡散したことを示す。

【0199】

［実験例２３］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、経時的にＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0200】

図１２は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは４０μｍである。図１２中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。また、「ｂｅｆｏｒｅ」はＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ添加前の写真であることを示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加後、経時的に細胞質におけるＦＬの蛍光が増大することが明らかとなった。

【0201】

［実験例２４］
（エンドサイトーシスの阻害）
ＨｅＬａ細胞の培地の温度を４℃に調整し、エンドサイトーシスを阻害した。続いて、培地に終濃度５μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。続いて、３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0202】

図１３は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは４０μｍである。図１３中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に、細胞質においてＦＬの蛍光が検出されたことが明らかとなった。

【0203】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの細胞質への導入は、エンドサイトーシスによらないことを示す。すなわち、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒは、細胞膜を直接透過して細胞質に導入されることを示す。

【0204】

［実験例２４］
（ＤＢＣＯ－^ＤＫ８の合成）
下記スキーム（１４）にしたがって、下記式（２０）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－^ＤＫ８」という場合がある。）を合成した。

【0205】

【化36】

【0206】

【化37】

【0207】

具体的には、スキーム（１４）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－^ＤＫ８を合成した。

【0208】

【0209】

まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（４６．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｃｉｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0210】

【0211】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，１７６５．１０９８；ｆｏｕｎｄ，１７６５．０４２９

【0212】

［実験例２５］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８の合成）
下記スキーム（１５）にしたがって、下記式（２１）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８」という場合がある。）を合成した。

【0213】

【化38】

【0214】

【化39】

【0215】

【0216】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．１２であった。

【0217】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８とＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８を白色固体として得た。

【0218】

ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３７０９．８；ｆｏｕｎｄ，３７１６．１

【0219】

［実験例２６］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８の細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８を添加した。続いて、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0220】

図１４は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは８０μｍである。図１４中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光が検出されなかったことが明らかとなった。

【0221】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８が細胞の細胞膜を透過せず、細胞外に拡散したことを示す。

【0222】

［実験例２７］
（ＤＢＣＯ－Ｆａｒの合成）
下記スキーム（１６）にしたがって、下記式（２２）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0223】

【化40】

【0224】

【化41】

【0225】

具体的には、スキーム（１６）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－Ｆａｒを合成した。

【0226】

【0227】

まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（３８ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0228】

Ｔｒｔ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－^ＤＣを得た。

【0229】

続いて、ＤＭＦ／アセトニトリル／水＝２／１／１（０．０５％ＴＦＡ）の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＣ、酢酸亜鉛二水和物、トランス，トランス－ファルネシルブロミドを溶解してファルネシル化した。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－Ｆａｒを透明固体として得た。

【0230】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｎａ］^＋，８６５．３４１３；ｆｏｕｎｄ，８６５．２７８２

【0231】

［実験例２８］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒの合成）
下記スキーム（１７）にしたがって、下記式（２３）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0232】

【化42】

【0233】

【化43】

【0234】

【0235】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．１２であった。

【0236】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－Ｆａｒ、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－ＦａｒとＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒを黄色固体として得た。

【0237】

ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ－Ｈ］^－，２９９１．３；ｆｏｕｎｄ，３００１．１

【0238】

［実験例２９］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒの細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒを添加した。続いて、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒの添加から３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0239】

図１４は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは８０μｍである。図１４中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒの添加から３０分後に、ＦＬの蛍光が検出されなかったことが明らかとなった。

【0240】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｆａｒが細胞の細胞膜を透過せず、細胞外に拡散したことを示す。

【0241】

［実験例３０］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３の細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を添加した。続いて、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0242】

図１４は、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは８０μｍである。図１４中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬの添加から３０分後に、ＦＬの蛍光が検出されなかったことが明らかとなった。

【0243】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３が細胞の細胞膜を透過せず、細胞外に拡散したことを示す。

【0244】

［実験例３１］
（ＤＢＣＯ－Ｒ８の合成）
下記スキーム（１８）にしたがって、下記式（２４）で表される化合物（以下、「ＤＢＣＯ－Ｒ８」という場合がある。）を合成した。

【0245】

【化44】

【0246】

【化45】

【0247】

具体的には、スキーム（１８）に示すように、まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を利用した標準的な固相ペプチド合成プロトコールにしたがって、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でＤＢＣＯ－Ｒ８を合成した。

【0248】

【0249】

まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（４６．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｄｏｘ－ＯＨ、ＤＢＣＯａｉｃｄをビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0250】

Ｐｂｆ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＤＢＣＯ－Ｒ８を得た。

【0251】

［実験例３２］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８の合成）
下記スキーム（１９）にしたがって、下記式（２５）で表される化合物（以下、「ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８」という場合がある。）を合成した。

【0252】

【化46】

【0253】

【化47】

【0254】

【0255】

ＯｔＢｕ、ｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を得た。ＨＡｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＹＰＹＤＶＰＤＰＹＡＫ（配列番号５）であり、分子量は約１９４７．１２であった。

【0256】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－Ｒ８、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬＰ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－Ｒ８とＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８を黄色固体として得た。

【0257】

ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，３９３３．９；ｆｏｕｎｄ，３９３４．２

【0258】

［実験例３３］
（ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８の細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８を添加した。続いて、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ＰＩ染色し、ＰＩの蛍光を検出することにより死細胞を検出した。

【0259】

図１４は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは８０μｍである。図１４中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８の添加から３０分後に、ＦＬの蛍光はエンドソームシグナルとしてのみ検出され、細胞質からは検出されなかったことが明らかとなった。

【0260】

この結果は、ＨＡｐｅｐｔｉｄｅ－ＦＬ－ＳＳ－Ｒ８がエンドサイトーシス経路で細胞の細胞膜を透過し、エンドソームに留まり、細胞質にはほとんど進入しないことを示す。なお、Ｒ８は、従来、細胞膜を透過するペプチドとして利用されてきたものである。

【0261】

［実験例３４］
（ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
下記スキーム（２０）にしたがって、下記式（２６）で表される化合物（以下、「ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0262】

【化48】

【0263】

【化49】

【0264】

具体的には、まず、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）（７６．０ｍｇ、６０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ｅｔｈｙｌ－ＳＳ－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｉｃｄ、５（６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＬ）をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0265】

樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を得た。

【0266】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＦＬ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを黄色固体として得た。

【0267】

ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ，ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］^＋，２７６４．４７９１；ｆｏｕｎｄ，２７６５．６３７４

【0268】

［実験例３５］
（ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの細胞内導入の検討）
ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加した。また、比較のために、ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭ又は１０μＭとなるようにフルオレセイン（ＦＬ）を添加した試料も用意した。なお、フルオレセインは細胞膜非透過性の化合物である。続いて、ＦＬの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

【0269】

図１５は、顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは４０μｍである。図１５中、「ＦＬ」はフルオレセインの蛍光を観察した写真を示し、「ＰＩ」はＰＩの蛍光を観察した写真を示し、「ＤＩＣ」は微分干渉顕微鏡写真を示す。その結果、ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの添加から３０分後に、細胞質においてＦＬの蛍光が検出されたことが明らかとなった。一方、ＦＬを培地に添加したＨｅＬａ細胞からはＦＬの蛍光は検出されなかった。

【0270】

この結果は、ＦＬ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒが細胞の細胞膜を透過して細胞質に導入され、細胞質に拡散したことを示す。

【0271】

図１６（ａ）は、実験例２２、実験例２６、実験例３５の結果に基づいて、各化合物のペプチド導入率を算出した結果を示すグラフである。ペプチド導入率は、下記式（Ｆ１）に基づいて算出した。
ペプチド導入率（％）＝細胞質からＦＬの蛍光が検出された細胞数／全細胞数×１００…（Ｆ１）

【0272】

図１６（ｂ）は、実験例２２、実験例２６、実験例３５の結果に基づいて、各化合物の細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。細胞生存率（％）は、下記式（Ｆ２）に基づいて算出した。
細胞生存率（％）＝（１－（ＰＩの蛍光が検出された細胞数／全細胞数））×１００…（Ｆ２）

【0273】

図１６（ａ）及び（ｂ）中、グラフの値は、細胞３０個超の結果に基づいた平均値±標準偏差を示す。

【0274】

［実験例３６］
（ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの合成）
生理活性ペプチドの細胞内導入の実験例として、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅの導入を検討した。標的経路として、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ／ＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＢ）経路を選択した。この経路は、代謝や細胞増殖等のあらゆる細胞機能に関与するシグナル伝達経路である。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性亢進は、癌や神経疾患等の様々なヒト疾患に関連することが知られており、重要な創薬標的である。本実験例では、ＰＩ３ＫのＳＨ２ドメインに結合することでＰＩ３Ｋの活性化を阻害するＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅを細胞質に導入し、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路のシグナル伝達を阻害することを目的とした。ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅを細胞質に効率的に導入することが可能であれば、下流のＡｋｔのリン酸化が減少するものと期待した。

【0275】

まず、下記スキーム（２１）にしたがって、下記式（２７）で表される化合物（以下、「ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒ」という場合がある。）を合成した。

【0276】

【化50】

【0277】

【化51】

【0278】

具体的には、まず、Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）（４６．５ｍｇ、２０μｍｏｌ）をＦｍｏｃ脱保護し、洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ_２）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ｅｔｈｙｌ－ＳＳ－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｆ_２Ｐｍｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、無水酢酸をビルディングブロックとして、Ｆｍｏｃ脱保護及びカップリング反応を繰り返した。

【0279】

ＯｔＢｕ脱保護及び樹脂からの切断は、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％水を含有するＴＦＡを用いて実施した。続いて、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－Ｎ３を得た。ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列はＤＸＶＰＭＬＫ（配列番号１、Ｘ＝ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ））であり、分子量は約１２０９．３５であった。

【0280】

続いて、水／アセトニトリル＝１／１の混合溶液にＤＢＣＯ－^ＤＫ８Ｆａｒ、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－Ｎ３を溶解してクリック反応させ、ＤＢＣＯ－^ＤＫ８ＦａｒとＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－Ｎ３を連結させた。続いて、セミ分取Ｃ１８カラム上、０．１％ＴＦＡと０．１％水和ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを白色固体として得た。

【0281】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｃａｌｃｄｆｏｒ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋，１６４１．３７３１；ｆｏｕｎｄ，１６４１．８８６１

【0282】

［実験例３７］
（ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８ＦａｒによるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路阻害の検討）
図１７（ａ）～（ｃ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害実験を説明する模式図である。図１７（ａ）は、細胞をＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）で刺激しない場合を示す。この場合、ＰＩ３Ｋは活性化されず、下流のＡｋｔのリン酸化も認められない。図１７（ｂ）は、細胞をＥＧＦで刺激した場合を示す。この場合、ＰＩ３Ｋが活性化され、下流のＡｋｔがリン酸化される。図１７（ｃ）は、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒの存在下で、細胞をＥＧＦで刺激した場合を示す。この場合、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒが細胞膜を透過して細胞質に導入され、ＰＩ３Ｋに結合する。その結果、ＰＩ３Ｋの活性化が阻害される。その結果、下流のＡｋｔのリン酸化も抑制される。

【0283】

ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害実験を行った。ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５μＭとなるようにＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒを添加し、２０分間処理した。次にＨｅＬａ細胞を洗浄し、ＨｅＬａ細胞の培地に終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるようにＥＧＦを添加し、５分間処理した。次にＨｅＬａ細胞を洗浄し、細胞溶解液を用いて、ＨｅＬａ細胞の溶解物を作製した。次にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）とウエスタンブロッティング法を用いて、ＨｅＬａ細胞の溶解物を分子量で分離し、Ａｋｔのリン酸化を定量解析した。

【0284】

図１８（ａ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング法によってＡｋｔのリン酸化を定量解析した結果を示す写真である。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）に基づいてＡｋｔのリン酸化を数値化したグラフである。

【0285】

ＨｅＬａ細胞をＥＧＦで刺激した場合には、Ａｋｔのリン酸化（Ｔ３０８とＳ４７３）が顕著に増加した（図１８（ａ）及び（ｂ）、Ｌａｎｅ２）。これに対して、ＨｅＬａ細胞をＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒで処理したのちにＥＧＦで刺激した場合には、Ａｋｔのリン酸化（Ｔ３０８とＳ４７３）が抑制された（図１８（ａ）及び（ｂ）、Ｌａｎｅ３）。対照的に、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－Ｎ３を用いて同じ実験を行った場合には、Ａｋｔのリン酸化（Ｔ３０８とＳ４７３）の減少は観察されなかった（図１８（ａ）及び（ｂ）、Ｌａｎｅ４）。

【0286】

この結果は、ＳＨ２ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳＳ－^ＤＫ８Ｆａｒが、細胞質に導入され、ＰＩ３Ｋの活性化を阻害することで下流のＡｋｔのリン酸化を阻害したことを示す。

【産業上の利用可能性】

【0287】

本発明によれば、細胞膜非透過性の物質を動物細胞の細胞質に送達する技術を提供することができる。

【図1】