特開 2023-132274 ３次元細胞培養装置およびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023132274

(43)【公開日】2023-09-22

(54)【発明の名称】３次元細胞培養装置およびその利用

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20230914BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230914BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230914BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00

C12M1/00 A

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022037499

(22)【出願日】2022-03-10

(71)【出願人】

【識別番号】390011442

【氏名又は名称】株式会社マンダム

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】河野 まおり

(72)【発明者】

【氏名】高石 雅之

(72)【発明者】

【氏名】木下 和彦

(72)【発明者】

【氏名】石原 康宏

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA08

4B029AA27

4B029BB11

4B029CC02

4B029DB19

4B029DF10

4B029DG01

4B029FA15

4B029GA08

4B029GB08

4B029GB10

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】３次元細胞を用いて、気相曝露での被験物質の評価を行うに際し、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止する。
【解決手段】本培養装置（１０）は、インサートカップ（１）とウェルプレート（３）との間に設けられ、ウェルプレート（３）にインサートカップ（１）が挿入された際に生じる隙間部（３ｂ）を埋める空隙防止プレート（２）を備えている。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

３次元細胞を保持するインサートカップと、
前記インサートカップが挿入され、培養液を保持するウェルを有するウェルプレートと、
前記インサートカップと前記ウェルプレートとの間に設けられ、前記ウェルプレートに前記インサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋める空隙防止プレートと、を備える、３次元細胞培養装置。

【請求項2】

前記インサートカップ内の３次元細胞に対して、被験物質を噴霧する噴霧装置を備える、請求項１に記載の３次元細胞培養装置。

【請求項3】

前記インサートカップと前記被験物質を含む気相とを被覆する被覆部材を備える、請求項２に記載の３次元細胞培養装置。

【請求項4】

前記空隙部は、少なくとも、前記インサートカップの外周面と前記ウェルの内周面との間の隙間部を含む、請求項１～３の何れか１項に記載の３次元細胞培養装置。

【請求項5】

前記空隙部は、少なくとも、前記インサートカップの内部と前記ウェル内部とを連通し、前記インサートカップの側壁に形成された連通部を含む、請求項１～４の何れか１項に記載の３次元細胞培養装置。

【請求項6】

被験物質による３次元細胞の影響を評価する３次元細胞の被験物質に対する評価方法であって、
請求項１～５の何れか１項に記載の３次元細胞培養装置を用いて、前記インサートカップ内の３次元細胞に対して、被験物質を噴霧する噴霧工程を含む、３次元細胞の被験物質に対する評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、３次元細胞培養装置およびその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

培養細胞を２次元的な伸展により増殖させることで得られる培養物は、細胞としての増殖過程や機能性等の研究対象として用いることができる。しかし、そのような培養物は、生体内の組織とはかけ離れており、組織を対象とした研究に用いることは困難である。そこで、培養細胞を３次元的に培養することにより得られる３次元モデルを用いて、生体組織における現象を再現し、生体組織に与える影響を評価する技術が、創薬、再生医療等、様々な分野で求められている。

【0003】

これまでに、３次元モデルの培養に関する技術は、複数報告されているが、ウェルプレートとインサートカップとを用いて培養細胞を３次元的に培養する技術が汎用されている。当該技術では、培地が充填されたウェルプレートのウェル内に、底面に多孔膜を備えたインサートカップを設置する。そして、インサートカップの多孔膜に培養細胞を播種し、３次元的に培養する。例えば特許文献１には、３次元培養皮膚を入れたプレート（ウェルプレート＋インサートカップ）に対して、蓋にあけた穴にガラスリングをはめることにより、三次元培養皮膚の表面のみを外気に直接触れさせている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０２０－２０２７５４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、上述のような、ウェルプレートとインサートカップとを備えた３次元細胞培養装置では、３次元細胞の表面に対して被験物質を含む気相を曝露したとき、以下の問題がある。

【0006】

すなわち、市販のウェルプレートおよび市販のインサートカップを使用した場合、ウェルプレートにインサートカップが挿入された際に、ウェル内の空間と外気（気相）とを連通する空隙部が生じる。このため、このように空隙部が生じた３次元細胞培養装置を用いて気相曝露を行った場合、空隙部を介して、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解してしまう。その結果、インサートカップ内の３次元細胞は、最外層の培養細胞から被験物質と接触するのに加え、培地側の培養細胞から被験物質と接触してしまう。それゆえ、３次元細胞を気相曝露して、気相に含まれる被験物質に対する３次元細胞の評価を正確に行うことができないという問題がある。

【0007】

本発明の一態様は、３次元細胞を用いて、気相曝露での被験物質の評価を行うに際し、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止し得る３次元細胞培養装置およびその利用を実現することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ウェルプレートにインサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋める空隙防止プレートを、インサートカップとウェルプレートとの間に設けることにより、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明の一態様は以下である。

【0009】

〔１〕３次元細胞を保持するインサートカップと、前記インサートカップが挿入され、培養液を保持するウェルを有するウェルプレートと、前記インサートカップと前記ウェルプレートとの間に設けられ、前記ウェルプレートに前記インサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋める空隙防止プレートと、を備える、３次元細胞培養装置。

【0010】

〔２〕前記インサートカップ内の３次元細胞に対して、被験物質を噴霧する噴霧装置を備える、〔１〕の３次元細胞培養装置。

【0011】

〔３〕前記インサートカップと前記被験物質を含む気相とを被覆する被覆部材を備える、〔２〕の３次元細胞培養装置。

【0012】

〔４〕前記空隙部は、少なくとも、前記インサートカップの外周面と前記ウェルの内周面との間の隙間部を含む、〔１〕～〔３〕の何れかの３次元細胞培養装置。

【0013】

〔５〕前記空隙部は、少なくとも、前記インサートカップの内部と前記ウェル内部とを連通し、前記インサートカップの側壁に形成された連通部を含む、〔１〕～〔４〕の何れかの３次元細胞培養装置。

【0014】

〔６〕被験物質による３次元細胞の影響を評価する３次元細胞の被験物質に対する評価方法であって、
〔１〕～〔５〕の何れかの３次元細胞培養装置を用いて、前記インサートカップ内の３次元細胞に対して、被験物質を噴霧する噴霧工程を含む、３次元細胞の被験物質に対する評価方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明の一態様によれば、気相曝露での被験物質の評価を行うに際し、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置の一構成例を示し、１０１は上側から見た上面図であり、１０２は１０１におけるＩ－Ｉ線断面図であり、１０３は１０１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。

【図2】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置の他の構成例を示し、２０１は上側から見た上面図であり、２０２は２０１におけるＩＩＩ－ＩＩＩ線断面図であり、２０３は２０１におけるＩＶ－ＩＶ線断面図であり、２０４は、インサートカップのカップ本体の構成を示す側面図である。

【図3】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置のさらに他の構成例を示す断面図である。

【図4】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置のさらに他の構成例を示す断面図である。

【図5】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置に備えられた空隙防止プレートの一具体例の構成を示す斜視図である。

【図6】本発明の実施形態に係る３次元細胞培養装置に備えられた空隙防止プレートの他の具体例の構成を示す斜視図である。

【図7】実施例１にて使用した３次元細胞培養装置の概略構成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。

【0018】

〔１．本発明の実施形態の概要〕
本発明者らは、気相曝露での被験物質の評価を行うに際し、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止し得る３次元細胞培養装置について鋭意検討を行った。その結果、ウェルプレートにインサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋める空隙防止プレートを、インサートカップとウェルプレートとの間に設けることにより、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止できることを見出した。

【0019】

本発明の実施形態によれば、上記空隙防止プレートをウェルプレートに設置し、さらに当該空隙防止プレートの上にインサートカップを設置することにより、ウェル内の培地が外気に通じることがなく、培地と外気とを隔離することができる。このため、皮膚、角膜、鼻粘膜、肺、気道等の３次元細胞モデルに対して被験物質を含む気相を曝露した際に、培地に溶解した被験物質を考慮することなく、気相曝露に対する影響を正確に評価できるので、化粧品分野、医療分野等の種々の分野において、有用である。

【0020】

また、本発明の実施形態によれば、３次元細胞の気相曝露試験のために、専用のウェルプレートおよびインサートカップを使用することなく、市販品を用意すればよい。それゆえ、容易に３次元細胞の気相曝露試験を実施できる。

【0021】

〔２．３次元細胞培養装置〕
本発明の一実施形態に係る３次元細胞培養装置（以下、「本培養装置」と称する。）は、３次元細胞を保持するインサートカップと、前記インサートカップが挿入され、培養液を保持するウェルを有するウェルプレートと、前記インサートカップと前記ウェルプレートとの間に設けられ、前記ウェルプレートに前記インサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋める空隙防止プレートと、を備える、装置である。

【0022】

上記の構成によれば、空隙防止プレートによって、前記ウェルプレートに前記インサートカップが挿入された際に生じる空隙部が埋められるので、ウェルプレートのウェル内の培地が外気と通じることがなく、培地と外気とを隔離することができる。その結果、上記の構成によれば、被験物質を含む気相がウェル内の培地に溶解するのを防止できる。また、３次元細胞の最外表層に対して被験物質を含む気相を曝露した際に、培地に溶解した被験物質を考慮することなく、気相曝露に対する影響を正確に評価できる。

【0023】

また、これまで、気相曝露するために、専用の装置を用いるしかなかった。そして、装置の種類によっては、装置に３次元細胞を直接設置する。このため、３次元細胞への毒性を考慮すると、比較的短時間の気相曝露しかできず、３次元細胞に対して数時間気相曝露することは困難であった。また、３次元細胞サンプルの影響を評価するために培養液中に放出された細胞外放出因子を測定しようとしても、上記専用の装置では３次元細胞の通常培養ができないため、培地を用いた評価は困難であった。

【0024】

本培養装置を用いれば、３次元細胞を長時間気相曝露できるとともに、３次元細胞の通常培養を行いつつ、３次元細胞に対して気相曝露することができる。

【0025】

本明細書において「３次元細胞」とは、培養細胞の層が少なくとも２層以上積層され、３次元構造を有する細胞塊あるいは組織を意図する。さらには、細胞以外に、細胞外マトリックスが含まれていてもよい。細胞外マトリックスが含まれる場合、細胞が細胞外マトリックスを介して、少なくとも２層以上積層された構造物を意図する。細胞外マトリックスとは、生体内またはin vitroで培養された細胞において、細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、および／または生体因子を保持する役割等の機能を果たす生体内物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、テネイシン、エラスチン等が挙げられる。

【0026】

本発明の一実施形態において、３次元細胞が形成する細胞塊・組織は、生体内において、少なくともその一部が外気に曝される組織を構成するものであることが好ましく、例えば、皮膚組織、気管上皮組織、食道組織、各種粘膜組織（例えば、口腔粘膜組織、鼻粘膜組織、眼球組織等）、肺胞上皮組織等が挙げられる。

【0027】

３次元細胞を構成する細胞の種類としては、少なくともその一部が外気に曝される組織を構成する細胞であればよく、特に限定されないが、上述した組織を構成する細胞を好ましく例示できる。例えば、表皮細胞（例えば、角化細胞、基底細胞）、筋上皮細胞、管腔細胞、口粘膜細胞、血管細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞）、皮脂細胞（例えば、皮脂腺基底細胞、分化皮脂腺細胞、成熟皮脂腺細胞）、上皮細胞、線維芽細胞、肺胞上皮細胞等が挙げられる。３次元細胞を構成する細胞は、生体内から取得したものであってもよいし、市販されたものでもよい。また、幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞）、前駆細胞（例えば、神経前駆細胞）等から分化誘導して作製したものであってもよい。３次元細胞を構成する細胞の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。

【0028】

以下、本培養装置の一実施形態およびについて、図１～図４に基づいて説明する。なお、本培養装置が図１～図４で示される３次元細胞培養装置に限定されないことは言うまでもない。

【0029】

（本培養装置の構成例）
図１は、本培養装置の一構成例を示し、図１の１０１は上側から見た上面図であり、図１の１０２は図１の１０１におけるＩ－Ｉ線断面図であり、図１の１０３は図１の１０１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。

【0030】

図１の１０１～１０３に示されるように、本培養装置１０は、インサートカップ１と、空隙防止プレート２と、ウェル３ａを複数有するウェルプレート３と、を備えている。ウェルプレート３のウェル３ａそれぞれには、培地が充填される。本培養装置１０は、ウェルプレート３のウェル３ａそれぞれに対して、１つのインサートカップ１が挿入される構成である。

【0031】

インサートカップ１は、３次元細胞を保持するカップである。より具体的には、インサートカップ１は、つば部１ａと、カップ本体１ｂと、多孔質膜１ｃと、を有する。つば部１ａは、平板状であり、カップ本体１ｂの上端部分の２箇所からウェルプレート３へ向かって延びている。つば部１ａにおけるカップ本体１ｂと反対側の端部の下面は、ウェルプレート３の上面に接触する。つば部１ａは、ウェルプレート３のウェル３ａに対して、カップ本体１ｂを支持する役割がある。多孔質膜１ｃは、細胞が透過できない一方、培地などが透過可能な孔を有する膜である。カップ本体１ｂの底部に設けられている。本培養装置１０では、多孔質膜１ｃ上にて、３次元細胞を構成する細胞が播種され培養される。本培養装置１０では、多孔質膜１ｃの裏側、すなわち多孔質膜１ｃの培養表面と反対側からウェル３ａ内の培地が供給され得る。なお、インサートカップ１として、市販品を使用することができる。

【0032】

ウェルプレート３は、インサートカップ１のカップ本体１ｂを挿入可能なウェル３ａを有していればよい。ウェルプレート３は、従来公知の構造のものを使用することができ、市販品であってもよい。ウェルプレート３のウェル３ａには、少なくともインサートカップ１の多孔質膜１ｃに接触する程度の量の培地が充填される。

【0033】

空隙防止プレート２は、インサートカップ１とウェルプレート３との間に設けられたプレートである。それゆえ、インサートカップ１、空隙防止プレート２、およびウェルプレート３が組み合わさった構成において、インサートカップ１またはウェルプレート３を取り外すことなしに、当該構成から空隙防止プレート２を取り外すことができない。図１の１０２に示されるように、空隙防止プレート２の上面には、インサートカップ１のつば部１ａが載置されている。また、空隙防止プレート２は、ウェルプレート３の上面に載置されている。図１の１０１～１０３には示されていないが、空隙防止プレート２には、インサートカップ１のつば部１ａの下面の構造と嵌合する嵌合部が設けられていてもよい。

【0034】

ここで、ウェルプレート３のウェル３ａにインサートカップ１が挿入されたとき、空隙部が生じる。本培養装置１０では、インサートカップ１のカップ本体１ｂの外周面とウェル３ａの内周面との間に、上記空隙部としての隙間部３ｂが生じている。空隙防止プレート２は、隙間部３ｂを埋める、すなわち隙間部３ｂを上側から閉塞する閉塞領域２ａを有する。図１の１０１に示すように、閉塞領域２ａは、ウェル３ａの側壁の上端を覆い、インサートカップ１まで延在する。そして、閉塞領域２ａのインサートカップ１側の縁部は、カップ本体１ｂの外周形状に適合した形状となっている。換言すると、空隙防止プレート２は、隙間部３ｂを閉塞する平板状の本体を有し、当該本体には、その側壁がカップ本体１ｂの外周形状に適合した開口部が形成された構成であるといえる。

【0035】

本培養装置１０によれば、空隙防止プレート２は、ウェルプレート３のウェル３ａにインサートカップ１が挿入された際に生じる隙間部３ｂを埋める構成となっているので、外気とウェル３ａ内の空間とを隔離することができる。それゆえ、３次元細胞に対して被験物質を含む気相を曝露した際に、被験物質を含む気相がウェル３ａ内の培地に溶解するのを防止できる。空隙防止プレート２は、ウェル３ａ内の空間を、インサートカップ１のカップ本体１ｂ内の空間を含む外気と連通しないように隔離する隔離プレートであるともいえる。

【0036】

被験物質を含む気相の曝露による３次元細胞の評価において、空隙防止プレート２の材料は、被験物質と反応しない、または被験物質を吸収しない材料であればよく、被験物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、空隙防止プレート２の材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アモルファスポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。

【0037】

図２は、本培養装置の他の構成例を示し、図２の２０１は上側から見た上面図であり、図２の２０２は図２の２０１におけるＩＩＩ－ＩＩＩ線断面図であり、図２の２０３は図２の２０１におけるＩＶ－ＩＶ線断面図であり、図２の２０４は、インサートカップ１Ａのカップ本体１ｂの構成を示す側面図である。

【0038】

図２の２０１～２０３に示される本培養装置１０Ａは、インサートカップ１Ａおよび空隙防止プレート２Ａの構成が図１の１０１～１０３に示された構成と異なる。

【0039】

インサートカップ１Ａは、つば部１ａと、カップ本体１ｂと、多孔質膜１ｃと、凹部１ｄ（連通部）を有する。図２の２０４に示すように、凹部１ｄは、カップ本体１ｂの側壁に形成されており、カップ本体１ｂの側壁の上端から下方に凹んでいる。

【0040】

ここで、本培養装置１０Ａにおいても、ウェルプレート３のウェル３ａにインサートカップ１Ａが挿入されたとき、空隙部が生じる。本培養装置１０Ａでは、本培養装置１０と同様に、インサートカップ１のカップ本体１ｂの外周面とウェル３ａの内周面との間に、上記空隙部としての隙間部３ｂが生じている。それに加えて、凹部１ｄが、インサートカップ１のカップ本体１ｂの内部とウェル３ａの内部とを連通する連通部となる。空隙防止プレート２Ａは、隙間部３ｂを埋める閉塞領域２ａと、凹部１ｄを埋める凸部２ｂと、を有する。凸部２ｂは、空隙防止プレート２Ａの下面から突出して形成されており、凸部２ｂの下側の縁部は、凹部１ｄの上側の形状に適合した形状となっている。このため、空隙防止プレート２Ａにインサートカップ１Ａが載置されたとき、カップ本体１ｂの側壁に形成された凹部１ｄは、凸部２ｂに隙間なく合わさる。

【0041】

凹部１ｄは、インサートカップ１の操作性を向上させるために設けられている。図２の２０４に示すように、カップ本体１ｂの側壁に凹部１ｄが形成されることにより、凸部１ｅが形成されることになる。凸部１ｅは、インサートカップ１Ａをピンセットでつまむためのつまみ部として機能する。なお、凹部１ｄは、図２の２０４に示す構成に限定されず、ウェルプレート３のウェル３ａにインサートカップ１が挿入された際に、カップ本体１ｂの内部とウェル３ａの内部とを連通するように、カップ本体１ｂの側壁に形成されていればよい。

【0042】

本培養装置１０Ａによれば、空隙防止プレート２Ａは、ウェルプレート３のウェル３ａにインサートカップ１が挿入された際に生じる隙間部３ｂおよび連通部としての凹部１ｄを埋める構成となっている。このため、空隙防止プレート２Ａにより、外気とウェル３ａ内の空間とを隔離することができる。それゆえ、３次元細胞に対して被験物質を含む気相を曝露した際に、被験物質を含む気相がウェル３ａ内の培地に溶解するのを防止できる。

【0043】

図３は、本培養装置のさらに他の構成例を示す断面図である。図３に示すように、本培養装置１０Ｂは、噴霧装置４と、被覆部材５と、を備えている点が図１の１０１～１０３に示す構成と異なる。噴霧装置４は、インサートカップ１内の３次元細胞に対して、被験物質Ｍを噴霧する装置である。また、被覆部材５は、インサートカップ１と被験物質Ｍを含む気相とを被覆する部材である。

【0044】

図３に示すように、噴霧装置４は、被覆部材５に取り付けられている。噴霧装置４は、被覆部材５内の空間に被験物質Ｍを噴霧する。噴霧装置４は、被験物質Ｍを噴霧できる装置であれば、従来公知のものを採用することができる。噴霧装置４としては、例えば、ネブライザー、エアゾール、ディスペンサーなどが挙げられる。また、噴霧装置４は、超音波を用いた噴霧器であってもよい。この場合、噴霧粒子の径は、特に限定されず、１～４５マイクロメートルが好ましく、１～８マイクロメートルがより好ましい。

【0045】

被験物質Ｍは、対象とする３次元細胞の種類に応じて適宜設定可能である。被験物質Ｍの具体例としては、ＰＭ２．５等の微粒子、エアゾール製品等の噴射物（液体）、ガス等の気体が挙げられる。

【0046】

被覆部材５は、少なくともインサートカップ１を被覆する箱体である。噴霧装置４により噴霧された被験物質Ｍは、被覆部材５内に留まり、被覆部材５の外部へ排出されない。

【0047】

３次元細胞に対して被験物質Ｍを気相曝露する場合、一定の密度または濃度で被験物質Ｍを曝露させるために、気相曝露するための一定の空間を創る必要がある。そして、当該空間における被験物質Ｍの濃度を考慮する必要がある。「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」（化審法）およびＧＨＳ（Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals）においても、気体や粉体の曝露において、体積を考慮するのが一般的である。特に３次元細胞の評価においては、複数のサンプルを同時に処理するため、噴霧装置４と３次元細胞の表面との距離、または噴霧装置４から噴霧される粒子の大きさによっては、複数のサンプルのうち特定のサンプルに被験物質Ｍが集中してしまう。このため、被験物質Ｍによっては、３次元細胞の複数のサンプルに対して確実に被験物質Ｍを気相曝露することは困難であった。

【0048】

本培養装置１０Ｂによれば、被覆部材５により、３次元細胞に曝露される被験物質Ｍの濃度が一定に保たれる。本培養装置１０Ｂでは、被覆部材５内の空間が、３次元細胞に対して被験物質Ｍを含む気相を曝露するための空間（以下、気相曝露空間と称する場合がある）となる。

【0049】

なお、被覆部材５は、少なくともインサートカップ１を覆う箱体であれば、特に限定されない。また、被覆部材５の構成は、気相曝露されるインサートカップ１の数、位置等に応じて適宜設定可能である。例えば、被覆部材５は、インサートカップ１毎に覆う箱体であってもよいし、ウェルプレート３およびウェルプレート３に配置されたインサートカップ１の全体を覆う箱体であってもよい。また、被覆部材５は、ウェルプレート３に配置されたインサートカップ１のうち、一部の２つ以上のインサートカップ１を覆う箱体であってもよい。

【0050】

また、被覆部材５は、適宜設けられる部材であり、本培養装置１０Ｂに被覆部材５が設けられていない構成も本培養装置に含まれる。３次元細胞に対して被験物質Ｍの濃度が極めて高い気相を曝露することにより、確実に被験物質Ｍを３次元細胞の表面に接触できるのであれば、被覆部材５を省略してもよい。

【0051】

図４は、本培養装置のさらに他の構成例を示す断面図である。図４に示すように、本培養装置１０Ｃは、台座６を備えている点が図３に示す構成と異なる。台座６は、インサートカップ１、空隙防止プレート２、およびウェルプレート３で構成される装置本体を載置するための台である。台座６上には、被覆部材５も載置される。本培養装置１０Ｃでは、被覆部材５と台座６とにより形成された空間が、気相曝露空間となる。

【0052】

台座６には、ＣＯ_２発生剤が収納されていてもよい。これにより、気相曝露空間にＣＯ_２が供給される。ＣＯ_２発生剤により、気相曝露空間内のＣＯ_２濃度は、例えば、１．０～１０．０％、好ましくは３．０～８．０％、より好ましくは４．０～５．０％に調整される。これにより、例えば、長時間（例えば一晩）３次元細胞を培養しつつ気相曝露することができる。

【0053】

（空隙防止プレートの具体例）
上述したように、本培養装置において、空隙防止プレートは、ウェルプレートにインサートカップが挿入された際に生じる空隙部を埋めるような構造となっている。それゆえ、空隙防止プレートの形状は、インサートカップおよびウェルプレートの形状に適合する。

【0054】

ここで、ウェルプレートの複数の市販品では、（１）外周部の形状、（２）各ウェルの周囲の構造および形状等が市販品毎で異なる。また、インサートカップの複数の市販品についても、外周形状が市販品毎で異なる。このため、種々のウェルプレートおよびインサートカップの市販品の形状に適合するように、最大公約数的に、空隙防止プレートの厚さまたは形状が設定されていることが好ましい。すなわち、空隙防止プレートの厚さまたは形状は、種々のウェルプレートおよびインサートカップの市販品に共通する形状に適合するように設定されていることが好ましい。

【0055】

図５は、空隙防止プレートの一具体例の構成を示す斜視図である。図５に示す空隙防止プレート２Ｂは、図１に示す空隙防止プレート２の具体例である。空隙防止プレート２Ｂは、４個×３個のウェルに対応している。閉塞領域２ａは、これらウェルそれぞれに対して設けられている。また、空隙防止プレート２Ｂには、切り欠き部２ｃが形成されている。切り欠き部２ｃは、インサートカップのつば部の下面の構造と嵌合する嵌合部として機能する。

【0056】

図６は、空隙防止プレートの他の具体例の構成を示す斜視図である。図６に示す空隙防止プレート２Ｃは、図２に示す空隙防止プレート２Ａの具体例である。空隙防止プレート２Ｂと同様に、空隙防止プレート２Ｃは、４個×３個のウェルに対応している。閉塞領域２ａおよび凸部２ｂは、これらウェルそれぞれに対して設けられている。また、空隙防止プレート２Ｂと同様に、空隙防止プレート２Ｃは、切り欠き部２ｃを有している。

【0057】

〔３．３次元細胞の被験物質に対する評価方法〕
本発明の一実施形態に係る次元細胞の被験物質に対する評価方法（以下、本評価方法と称する場合がある）は、被験物質による３次元細胞の影響を評価する方法である。本評価方法は、上述した３次元細胞培養装置を用いて、上記インサートカップ内の３次元細胞に対して、被験物質を噴霧する噴霧工程を含む。

【0058】

上記の構成によれば、培地に被験物質が溶け込まないため、三次元細胞の最外層の細胞に対する被験物質の影響を正確に評価できる。

【0059】

本評価方法で用いられる本培養装置としては、特に限定されないが、例えば、図１～図４で示される本培養装置１０、１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃが挙げられる。

【0060】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例0061】

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

【0062】

（実施例１）
図７は、実施例１にて使用した３次元細胞培養装置１０Ｄの概略構成を示す図である。図７に示すように、３次元細胞培養装置１０Ｄでは、台座６に、インサートカップ１、空隙防止プレート２、および２４ウェルプレートで構成される装置本体が載置されている。そして、被覆部材５は、上記装置本体および台座６の両方を上から覆うように構成されている。台座６の下には、ＣＯ_２発生装置（アネロパック（登録商標））が配置されている。また、被覆部材５には、噴霧装置４としてネブライザーヘッドが取り付けられている。

【0063】

まず、インサートカップ１内で３次元皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ―ＭＯＤＥＬ：株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）を培養した。そして、空隙防止プレート２と共に、３次元皮膚モデルが培養されたインサートカップ１を２４ウェルプレートに配置し、３次元細胞培養装置１０Ｄにセットした。そして、この３次元細胞培養装置１０Ｄを用いて、細胞障害性試験を実施した。

【0064】

まず、ネブライザーヘッド（噴霧装置４）に４０％エタノール溶液を１０ｍｌ入れ、３次元皮膚モデルに対して、一定の噴霧量で１時間かけて全量曝露した。その後、後培養として、３７℃インキュベーターにて上記３次元皮膚モデルを２４時間培養した。２４時間培養後の３次元皮膚モデルの細胞生存率に基づく細胞障害性を細胞毒性アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ―８：同仁化学研究所製）を用いて測定した。

【0065】

（比較例１）
空隙防止プレート２無しで、３次元皮膚モデルが培養されたインサートカップ１を２４ウェルプレートに配置した以外、実施例１と同様に細胞障害性試験を実施した。

【0066】

（結果）
実施例１では、３次元皮膚モデルの細胞生存率は、気相曝露していない未処理の３次元皮膚モデルの細胞生存率と比較して、１０３％であった。一方、比較例１では、３次元皮膚モデルの細胞生存率は、未処理の３次元皮膚モデルの細胞生存率と比較して、７９％であった。比較例１の結果から、エタノール溶液が培養液に混入することにより、細胞毒性が認められた。

【0067】

実施例１の３次元皮膚モデルの細胞生存率から、４０％エタノール溶液の噴霧曝露は、３次元皮膚モデルの角質層からのみの曝露において、３次元皮膚モデルに対して細胞毒性を示さないことがわかった。一方、比較例１では、エタノール溶液が培養液に混入し、３次元皮膚モデルの基底層側から曝露することによって、３次元皮膚モデルに対して細胞障害性が起こった。その結果、比較例１では、本来測定すべき細胞毒性を適切に評価できていないと考えられる。一方、実施例１では、空隙防止プレート２を配置することによって、３次元皮膚モデルに対する噴霧曝露において、細胞毒性を適切に評価できると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0068】

本発明は、化粧品分野、医療分野等に、広く利用することができる。

【符号の説明】

【0069】

１、１Ａ インサートカップ
１ｄ 凹部（空隙部、連通部）
２、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ 空隙防止プレート
２ｂ 凸部
３ ウェルプレート
３ａ ウェル
３ｂ 隙間部（空隙部）
４ 噴霧装置
５ 被覆部材
１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ 本培養装置（３次元細胞培養装置）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】