ホーム > 特許ランキング > 雪印メグミルク株式会社
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023135295
(43)【公開日】2023-09-28
(54)【発明の名称】ＩｇＡ産生促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/02 20060101AFI20230921BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230921BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20230921BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20230921BHJP
A23L 2/02 20060101ALI20230921BHJP
A23L 2/66 20060101ALI20230921BHJP
A23K 20/147 20160101ALI20230921BHJP
【ＦＩ】
A61K38/02
A61P37/04
A23L33/18
A23L2/00 F
A23L2/02 C
A23L2/52 101
A23L2/00 J
A23K20/147
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022040433
(22)【出願日】2022-03-15
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小畠 英史
(72)【発明者】
【氏名】福留 博文
(72)【発明者】
【氏名】冠木 敏秀
(72)【発明者】
【氏名】酒井 史彦
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4B117
4C084
【Ｆターム（参考）】
2B150DC23
4B018LB01
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD09
4B018MD25
4B018MD29
4B018MD34
4B018MD71
4B018MD90
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF02
4B018MF06
4B018MF12
4B018MF14
4B117LC04
4B117LG03
4B117LK08
4B117LK12
4B117LK15
4B117LK18
4B117LK24
4B117LP06
4B117LP20
4C084AA02
4C084BA05
4C084BA34
4C084CA38
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZB091
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、免疫細胞からのＩｇＡ産生を促進し、感染予防効果を有する新規な素材を提供することである。
【解決手段】スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、
前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、
前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、
前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、
前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
【請求項2】
前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースの合算量が２０重量％以上である請求項１に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
【請求項3】
前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である請求項１又は請求項２に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
【請求項4】
スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記糖鎖の構造が、以下の（１）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
前記糖鎖の構造が、以下の（１）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
【請求項5】
前記糖鎖の構造が、
前記（１）及び 前記（２）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上である、請求項４に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
前記（１）及び 前記（２）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上である、請求項４に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
【請求項6】
シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
【請求項7】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飲食品。
【請求項8】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用医薬品。
【請求項9】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＩｇＡ産生促進用組成物に関する。特に、シアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡ産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
κ－カゼイングリコマクロペプチド（以下、単にＧＭＰということがある）は、牛乳のκ－カゼインにレンネット又はペプシンを作用させた時に生成する糖ペプチドであって、チーズホエー中に含まれている。また、ＧＭＰは、κ－カゼインのＣ末端側６４個のアミノ酸からなるペプチド鎖にＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｏ－Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｏ－ｄｉＡｃ－Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃが結合している（非特許文献１、２）。
【0003】
ＧＭＰは、複数の機能性に寄与する可能性が期待されている（非特許文献３）。ＧＭＰによる様々な有益な効果については、特にＧＭＰのシアル酸を含んだ糖鎖構造が重要なのではないか、と推察されている。一方で、非特許文献４では、ＧＭＰがＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、リポ多糖）によるＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（以下、単にＩｇＡということがある）産生促進作用を増強することが示されているが、その作用にＧＭＰの糖鎖構造が関与しているかどうかは明らかにされていない。
【0004】
ＩｇＡは自然免疫に働く主要な抗体のひとつである。特に分泌型ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）は粘膜免疫の主役であり、消化管や呼吸器における免疫機構の最前線として機能している。腸管においてＳＩｇＡは粘膜筋板のプラズマ細胞から分泌され、上皮を貫通し、上皮の表面に分泌されて、抗原や病原性細菌を捕捉することでそれらが上皮に接着するのを防止する。これらのことから、ＩｇＡは生体の感染防御に働くことが期待されており、これまでにいくつかのＩｇＡ産生を上昇させるための解決手段が開示されている。
【0005】
特許文献１は、ＩｇＡ産生活性を促進させてＩｇＡ産生量を増加させ、優れた感染防御およびアレルギ－反応を阻止するＩｇＡ産生促進剤及びＩｇＡ産生促進飲食品を提供することを目的とし、その解決手段として乳由来の乳脂肪球皮膜又は乳κ－カゼイン由来のグリコマクロペプチドを有効成分としたことを特徴とするＩｇＡ産生促進剤を開示している。しかし、特許文献１には、ＧＭＰ自体のＩｇＡ産生促進作用が記載されているにすぎず、その作用と構造の関係については示唆されていない。
【0006】
特許文献２は、免疫賦活用組成物、ならびに免疫賦活に有用な飲食品および医薬組成物を提供することを課題とし、その解決手段としてビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）に属するビフィズス菌および／または該ビフィズス菌の処理物を含有してなることを特徴とする免疫賦活用組成物、ならびにそれを含む免疫賦活に有用な飲食品および医薬組成物を開示している。しかし、同様に、ビフィズス菌やその処理物自体の効果について示されているにすぎない。
【0007】
特許文献３は、腸内大腸菌、インフルエンザウイルス、エップシュタインバーウイルスに起因する感染症の防御効果を有し、しかもこれらの細菌やウイルスの変異等により同効果が失われることがなく、かつ安全性の点で何ら問題もない感染防御剤を提供することを課題とし、その解決手段としてシアル酸結合タンパク質、例えばκ－カゼイン、もしくはＧＭＰを腸内大腸菌、インフルエンザウイルスあるいはエップシュタインバーウイルスに対する感染防御剤の有効成分とすることを開示している。しかし、本文献ではシアル酸結合タンパク質による感染防御効果が示されているが、その効果は病原体やウイルスとシアル酸との相互作用によるものであるとされており、ＩｇＡ産生促進作用については開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開平５－３３９１６１
【特許文献2】特許第５００１８３０号
【特許文献3】特許第２６３１４７０号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｔ．Ｓａｉｔｏ，Ｔ．Ｉｔｏｈ．１９９２．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｏ－Ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｋ－ｃａｓｅｉｎ． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７５：１７６８－１７７４．
【非特許文献2】Ｈ．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｔ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ａ．Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ｌｉ，Ｔ．Ｋａｂｕｋｉ，Ｋ．Ｉｔｏ，Ｆ．Ｓａｋａｉ．２０２１．Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｙｋａｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏn ｏｆ ｓｉａｌｙｌｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｂｏｖｕｌｉｎｅ ｍｉｌｋ ｇｌｙｃｏｍａｃｒｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．１０４：１４３３－１４４４．
【非特許文献3】Ｌ．Ｃｏｒｄｏｖａ－Ｄａｖａｌｏｓ,Ｍ．Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｅ．Ｓａｌｉｎａｓ． ２０１９．Ｇｌｙｃｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ Ａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．１１：５９８．
【非特許文献4】Ｓ．Ｙｕｎ，Ｙ．Ｓｕｇｉｔａ－Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｓ．Ｋｕｍａｇａｉ，Ｋ．Ｙａｍａｕｃｈｉ．１９９５．Ｇｌｙｃｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｅｓｅ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＩｇＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｐｌｅｅｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ（Ｊｐｎ）．６７：４５８－４６２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の課題は、免疫細胞からのＩｇＡ産生を促進し、感染予防効果を有する新規な素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本願発明者らは、ＧＭＰから得られるシアリル糖ペプチドの構造に着目し、よりＩｇＡ産生促進作用に優れたシアリル糖ペプチドを得るために鋭意検討したところ、特定の分子量、特定の糖鎖構造、特定の構成糖比のシアリル糖ペプチドに強力なＩｇＡ産生促進作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明には以下の構成が含まれる。
〔１〕スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、
前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、
前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
〔２〕前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースの合算量が２０重量％以上である〔１〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔３〕前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である〔１〕又は〔２〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔４〕スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記糖鎖の構造が、以下の（１）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
〔５〕前記糖鎖の構造が、
前記（１）及び 前記（２）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上である、〔４〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔６〕シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飲食品。
〔８〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用医薬品。
〔９〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飼料。
〔１〕スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであり、
前記ガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合し、
前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
〔２〕前記シアル酸と前記ガラクト－Ｎ－ビオースの合算量が２０重量％以上である〔１〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔３〕前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である〔１〕又は〔２〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔４〕スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記糖鎖の構造が、以下の（１）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
〔５〕前記糖鎖の構造が、
前記（１）及び 前記（２）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上である、〔４〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔６〕シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飲食品。
〔８〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用医薬品。
〔９〕〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飼料。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＧＭＰよりも優れたシアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡ産生促進用組成物を提供することができる。
また、当該シアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡ産生促進用飲食品、ＩｇＡ産生促進用医薬品、ＩｇＡ産生促進用飼料を提供することができる。
また、当該シアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡ産生促進用飲食品、ＩｇＡ産生促進用医薬品、ＩｇＡ産生促進用飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明のシアリル糖ペプチド組成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析結果を示すチャートである。
【図2】ＰＢＭＣに本発明のシアリル糖ペプチド組成物もしくはＧＭＰを添加して培養した場合の培養上清中のＩｇＡ濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明のシアリル糖ペプチドを有効成分として含むＩｇＡ産生促進用組成物、及びシアリル糖ペプチドを有効成分として含むＩｇＡ産生促進作用を有する飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
【0015】
（シアリル糖ペプチド）
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物の有効成分であるシアリル糖ペプチドは、以下の（ａ）～（ｅ）の性質を有する。
（ａ）スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）及び／又はセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）残基を有するペプチドに糖鎖が結合していること。
（ｂ）分子量が５００以上３，０００以下であること。
（ｃ）糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであること。
（ｄ）前記糖鎖のガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合していること。
（ｅ）シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１の範囲にあること。
ここで、シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースの合算量は、組成物中（固形重量中）２０重量％以上であるものが好ましい。
また、シアリル糖ペプチドの分子量の下限はさらに好ましくは１，０００以上である。なお、ＧＭＰの分子量は７，０００であることから、５００以上３，０００以下の本発明のシアリル糖ペプチドとは大きく異なり、その物性も大きく異なることが予想される。
また、本発明のシアリル糖ペプチドは、ペプチド鎖が１アミノ酸残基以上１３アミノ酸残基以下であることが好ましい。
さらにまた、本発明のシアリル糖ペプチドはアセチル化したシアル酸を含むものも用いることができる。
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物の有効成分であるシアリル糖ペプチドは、以下の（ａ）～（ｅ）の性質を有する。
（ａ）スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）及び／又はセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）残基を有するペプチドに糖鎖が結合していること。
（ｂ）分子量が５００以上３，０００以下であること。
（ｃ）糖鎖がシアル酸及びガラクト－Ｎ－ビオースからなるものであること。
（ｄ）前記糖鎖のガラクト－Ｎ－ビオースが前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、シアル酸はガラクト－Ｎ－ビオースに結合していること。
（ｅ）シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースのモル比が１：１～２：１の範囲にあること。
ここで、シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースの合算量は、組成物中（固形重量中）２０重量％以上であるものが好ましい。
また、シアリル糖ペプチドの分子量の下限はさらに好ましくは１，０００以上である。なお、ＧＭＰの分子量は７，０００であることから、５００以上３，０００以下の本発明のシアリル糖ペプチドとは大きく異なり、その物性も大きく異なることが予想される。
また、本発明のシアリル糖ペプチドは、ペプチド鎖が１アミノ酸残基以上１３アミノ酸残基以下であることが好ましい。
さらにまた、本発明のシアリル糖ペプチドはアセチル化したシアル酸を含むものも用いることができる。
【0016】
本発明のシアリル糖ペプチドのより具体的な一態様としては、スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したペプチドであって、糖鎖が以下の（１）～（５）からなる群から選ばれる１つ以上であるペプチドが挙げられる。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
上記の糖鎖を１つ以上含むペプチドであるから、２つ以上含むペプチドも含まれ、同じ種類の糖鎖を２つ以上含むものや、２種以上を含むものが挙げられる。例えば、（１）を２つ含むペプチドや、（１）を含み、（２）～（５）からなる群から１つ以上をさらに含むペプチドであってもよい。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
上記の糖鎖を１つ以上含むペプチドであるから、２つ以上含むペプチドも含まれ、同じ種類の糖鎖を２つ以上含むものや、２種以上を含むものが挙げられる。例えば、（１）を２つ含むペプチドや、（１）を含み、（２）～（５）からなる群から１つ以上をさらに含むペプチドであってもよい。
【0017】
本発明のシアリル糖ペプチドは、典型的には、ＧＭＰ等を酵素等で加水分解することにより得ることができる。
ＧＭＰはκ－カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳においてはκ－カゼインの１０６－１６９残基に相当し、分子量は約７，０００である。本発明の糖ペプチド組成物の原料となるＧＭＰは、牛乳のほか、ヤギ、ヒツジなどの獣乳由来のホエー中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
また、本発明のシアリル糖ペプチドは、微生物、植物、動物の臓器の抽出物を酵素などで加水分解することにより調製することもできる。さらに、化学的に合成されたもの、もしくは遺伝子組換え体で調製したものでもよい。
ＧＭＰはκ－カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳においてはκ－カゼインの１０６－１６９残基に相当し、分子量は約７，０００である。本発明の糖ペプチド組成物の原料となるＧＭＰは、牛乳のほか、ヤギ、ヒツジなどの獣乳由来のホエー中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
また、本発明のシアリル糖ペプチドは、微生物、植物、動物の臓器の抽出物を酵素などで加水分解することにより調製することもできる。さらに、化学的に合成されたもの、もしくは遺伝子組換え体で調製したものでもよい。
【0018】
（シアリル糖ペプチドの製造方法）
本発明のシアリル糖ペプチドの製造方法についてその一態様を示し説明する。本発明のシアリル糖ペプチドは、例えばＧＭＰを加水分解することにより得られるため、まず、ＧＭＰの製造方法の一態様について説明する。
ＧＭＰを含む組成物は、特許第２６７３８２８号、または特開平６－２５２９７号公報に記載の方法により調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエータンパク質濃縮物、除タンパク質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調製した後、分画分子量１０，０００～５０，０００の膜を用い、限外ろ過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調製した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調製する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをｐＨ６．０以上に調製し４０～７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清タンパク質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
本発明のシアリル糖ペプチドの製造方法についてその一態様を示し説明する。本発明のシアリル糖ペプチドは、例えばＧＭＰを加水分解することにより得られるため、まず、ＧＭＰの製造方法の一態様について説明する。
ＧＭＰを含む組成物は、特許第２６７３８２８号、または特開平６－２５２９７号公報に記載の方法により調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエータンパク質濃縮物、除タンパク質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調製した後、分画分子量１０，０００～５０，０００の膜を用い、限外ろ過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調製した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調製する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをｐＨ６．０以上に調製し４０～７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清タンパク質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
【0019】
得られた組成物中のＧＭＰ量は、例えば、特許第３３７２４９９号公報の実施例に示されるようなウレアーＳＤＳ電気泳動法により分析することができる。
次に、このようにして得られるＧＭＰをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量５００以上３，０００以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のシアリル糖ペプチドを製造することができる。また、上記のような乳質原料物質からＧＭＰを分離することなく、ＧＭＰを含有する乳質原料物質を直接酵素処理しても、同様のシアリル糖ペプチドを調製することができる。
次に、このようにして得られるＧＭＰをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量５００以上３，０００以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のシアリル糖ペプチドを製造することができる。また、上記のような乳質原料物質からＧＭＰを分離することなく、ＧＭＰを含有する乳質原料物質を直接酵素処理しても、同様のシアリル糖ペプチドを調製することができる。
【0020】
本発明のシアリル糖ペプチド製造に用いるプロテアーゼの種類は、ペプチド結合を加水分解し、上記分子量と糖鎖を有する本発明のシアリル糖ペプチドを得ることができるものであれば特に限定されるものではなく、１種類、又は複数のエンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼを用いることができる。好ましくは、食品や医薬品の製造に使用可能な酵素がよく、アクチナーゼＥ（科研ファルマ）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ）、ヌクレイシン（ＨＢＩ）、オリエンターゼＡＹ（ＨＢＩ）、スミチームＦＰ（新日本化学工業）、スミチームＳＰＰ－Ｇ（新日本化学工業）、プロテアーゼＡ（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）、アルカラーゼ（ノボザイム）、フレーバーザイム（ノボザイム）などを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。
【0021】
本発明のシアリル糖ペプチドは、上記のとおり、典型的にはＧＭＰを加水分解して得られることから、精製度合によって、精製された単一のシアリル糖ペプチドであってもよいし、複数のシアリル糖ペプチドの混合物であってもよいし、本発明のシアリル糖ペプチド以外の成分を含むものであってもよい。本願明細書中、本発明のシアリル糖ペプチドを含むものをシアリル糖ペプチド組成物ということがあるが、特にことわらない限り上記いずれの場合も含まれる意味で用いる。
【0022】
（シアリル糖ペプチドのＩｇＡ産生促進作用の評価）
本発明のシアリル糖ペプチドによるＩｇＡ産生促進作用は、シアリル糖ペプチドを投与した場合と非投与の場合における唾液、腸管、腸の内容物、または糞便中のＩｇＡ量を比較し、非投与よりもシアリル糖ペプチド投与の方が増加した場合に本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。さらに好ましくは、ＧＭＰを投与の場合における唾液、腸管、腸の内容物、または糞便中のＩｇＡ量を比較し、ＧＭＰ投与よりもシアリル糖ペプチド投与の方が増加した場合に本発明のＩｇＡ産生促進作用が顕著であると評価することができる。
また、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＩｇＡ測定試験において、培地中にシアリル糖ペプチドを添加した場合と非添加の場合における培地中のＩｇＡ濃度を比較し、非添加よりもシアリル糖ペプチド添加の方がＩｇＡ濃度が高い場合に、本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。さらに好ましくはＧＭＰを添加した場合におけるＩｇＡ濃度を比較し、ＧＭＰ添加よりもシアリル糖ペプチド添加の方がＩｇＡ濃度が高い場合に、本発明のＩｇＡ産生促進作用が顕著であると評価することができる。
本発明のシアリル糖ペプチドによるＩｇＡ産生促進作用は、シアリル糖ペプチドを投与した場合と非投与の場合における唾液、腸管、腸の内容物、または糞便中のＩｇＡ量を比較し、非投与よりもシアリル糖ペプチド投与の方が増加した場合に本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。さらに好ましくは、ＧＭＰを投与の場合における唾液、腸管、腸の内容物、または糞便中のＩｇＡ量を比較し、ＧＭＰ投与よりもシアリル糖ペプチド投与の方が増加した場合に本発明のＩｇＡ産生促進作用が顕著であると評価することができる。
また、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＩｇＡ測定試験において、培地中にシアリル糖ペプチドを添加した場合と非添加の場合における培地中のＩｇＡ濃度を比較し、非添加よりもシアリル糖ペプチド添加の方がＩｇＡ濃度が高い場合に、本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。さらに好ましくはＧＭＰを添加した場合におけるＩｇＡ濃度を比較し、ＧＭＰ添加よりもシアリル糖ペプチド添加の方がＩｇＡ濃度が高い場合に、本発明のＩｇＡ産生促進作用が顕著であると評価することができる。
【0023】
（シアリル糖ペプチドを含む飲食品、医薬品、飼料）
本発明の上記製造方法により得られたシアリル糖ペプチドは、そのまま飲食品の素材、原材料として用いることができ、シアリル糖ペプチドを添加すること以外は、各食品の定法により製造すればよい。
したがって、本発明の有効量の糖ペプチド組成物はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む飲食品は、ＩｇＡ産生促進作用を有する飲食品として提供される。
本発明の上記製造方法により得られたシアリル糖ペプチドは、そのまま飲食品の素材、原材料として用いることができ、シアリル糖ペプチドを添加すること以外は、各食品の定法により製造すればよい。
したがって、本発明の有効量の糖ペプチド組成物はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む飲食品は、ＩｇＡ産生促進作用を有する飲食品として提供される。
【0024】
本発明の上記製造方法により得られたシアリル糖ペプチドは、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、糖ペプチド組成物を添加すること以外は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明のシアリル糖ペプチドを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、糖ペプチド組成物をそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、ＩｇＡ産生促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む医薬品は、ＩｇＡ産生促進作用を有する医薬品として提供される。
したがって、本発明のシアリル糖ペプチドを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、糖ペプチド組成物をそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、ＩｇＡ産生促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む医薬品は、ＩｇＡ産生促進作用を有する医薬品として提供される。
【0025】
本発明の上記製造方法により得られたシアリル糖ペプチドは、そのまま飼料の原材料として用いることができ、シアリル糖ペプチドを添加すること以外は、飼料の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のシアリル糖ペプチドは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む飼料は、ＩｇＡ産生促進作用を有する飼料として提供される。
したがって、本発明の有効量のシアリル糖ペプチドは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のシアリル糖ペプチドを含む飼料は、ＩｇＡ産生促進作用を有する飼料として提供される。
【0026】
（シアリル糖ペプチドの摂取量）
本発明のシアリル糖ペプチドを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてＩｇＡ産生促進作用を有する組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
本発明のシアリル糖ペプチドの一日の投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、糖ペプチド組成物を１日当り０．１ｇ以上を摂取すればよく、１ｇ以上が好ましく、１０ｇ以上がさらに好ましい。なお、本発明のシアリル糖ペプチドは、ＧＭＰよりもＩｇＡ産生促進作用が高いことから（試験例２，図２）、ＧＭＰよりも少ない摂取量でＧＭＰよりも高いＩｇＡ産生促進作用が期待できる。
本発明のシアリル糖ペプチドを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてＩｇＡ産生促進作用を有する組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
本発明のシアリル糖ペプチドの一日の投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、糖ペプチド組成物を１日当り０．１ｇ以上を摂取すればよく、１ｇ以上が好ましく、１０ｇ以上がさらに好ましい。なお、本発明のシアリル糖ペプチドは、ＧＭＰよりもＩｇＡ産生促進作用が高いことから（試験例２，図２）、ＧＭＰよりも少ない摂取量でＧＭＰよりも高いＩｇＡ産生促進作用が期待できる。
【0027】
本発明のシアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡの産生促進作用は、当該作用を介して、健康の維持・増進及び種々の感染防御作の向上が期待できることから、健常人も含めたすべてのヒト、動物が対象とされる。また、このうちでも特に生体内におけるＩｇＡ産生促進を必要とするヒト又は動物に好ましく用いられ、例えば、上記のＩｇＡ産生促進作用評価方法によりＩｇＡの産生量が基準値よりも低い対象が摂取することで本発明の作用効果を確認することができる。
なお、前述の特許文献３にはシアル酸結合タンパク質による感染防御効果が開示されているが、当該効果はシアル酸の病原菌への付着作用によるものであり、ＩｇＡ産生促進作用とは基本的に異なる。ＩｇＡは細菌だけでなく細菌が産生する毒素等にも結合することが可能であり、感染時には病原体や病原毒素に結合してこれらが体内に侵入することを防いでいる。このように、本発明のシアリル糖ペプチドのＩｇＡ産生促進作用は本発明によって初めて見出された作用であり、ＩｇＡ産生促進作用を介して、様々な用途に利用できる。
なお、前述の特許文献３にはシアル酸結合タンパク質による感染防御効果が開示されているが、当該効果はシアル酸の病原菌への付着作用によるものであり、ＩｇＡ産生促進作用とは基本的に異なる。ＩｇＡは細菌だけでなく細菌が産生する毒素等にも結合することが可能であり、感染時には病原体や病原毒素に結合してこれらが体内に侵入することを防いでいる。このように、本発明のシアリル糖ペプチドのＩｇＡ産生促進作用は本発明によって初めて見出された作用であり、ＩｇＡ産生促進作用を介して、様々な用途に利用できる。
【実施例0028】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕本発明のシアリル糖ペプチド組成物の調製方法
１．ＧＭＰの製造方法
ホエータンパク質濃縮物（サンラクトＮ－２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調製した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／Ｍ２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行ない、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行ない、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行ない、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。
〔実施例１〕本発明のシアリル糖ペプチド組成物の調製方法
１．ＧＭＰの製造方法
ホエータンパク質濃縮物（サンラクトＮ－２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調製した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／Ｍ２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行ない、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行ない、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行ない、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。
【0029】
２．シアリル糖ペプチド組成物の製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、２５ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これを８Ｎ水酸化カリウム水溶液（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７に調整後、エンド型プロテアーゼ（アルカラーゼ、ノボザイム）およびエキソ型プロテアーゼ（フレーバーザイム、ノボザイム）を添加して５０℃で４時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ ＥＰ１９－４０、ポール）を用いて１．２５倍濃縮した。続けて、２０ｋｇの濃縮液に対して５倍の透析ろ過を行ない、濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、シアリル糖ペプチド組成物Ａを１２５ｇ得た。
上記１．で得られたＧＭＰを用い、２５ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これを８Ｎ水酸化カリウム水溶液（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７に調整後、エンド型プロテアーゼ（アルカラーゼ、ノボザイム）およびエキソ型プロテアーゼ（フレーバーザイム、ノボザイム）を添加して５０℃で４時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ ＥＰ１９－４０、ポール）を用いて１．２５倍濃縮した。続けて、２０ｋｇの濃縮液に対して５倍の透析ろ過を行ない、濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、シアリル糖ペプチド組成物Ａを１２５ｇ得た。
【0030】
３．１種類の酵素でのシアリル糖ペプチド組成物の製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、２５ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これを８Ｎ水酸化カリウム水溶液（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７に調整後、エンド型プロテアーゼ（アクチナーゼＡＳ、科研ファルマ）を０．１５％（ｗ／ｗ）添加して５０℃で４時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ ＥＰ１９－４０、ポール）を用いて１．２５倍濃縮した。続けて、２０ｋｇの濃縮液に対して５倍の透析ろ過を行ない、濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、シアリル糖ペプチド組成物Ｂを２７１．７ｇ得た。
上記１．で得られたＧＭＰを用い、２５ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これを８Ｎ水酸化カリウム水溶液（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７に調整後、エンド型プロテアーゼ（アクチナーゼＡＳ、科研ファルマ）を０．１５％（ｗ／ｗ）添加して５０℃で４時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ ＥＰ１９－４０、ポール）を用いて１．２５倍濃縮した。続けて、２０ｋｇの濃縮液に対して５倍の透析ろ過を行ない、濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、シアリル糖ペプチド組成物Ｂを２７１．７ｇ得た。
【0031】
〔実施例２〕シアリル糖ペプチド組成物Ａのシアリダーゼ処理
実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａを２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２０ｍｇ／ｍＬに調製し、それにシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来：Ｓｉｇｍａ，Ｎ２８７６－２５ＵＮ）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０時間反応させた。酵素添加なしのブランクは、酵素を添加せずに同条件で反応させた。反応後は５分間ボイルすることで反応を停止させた。得られた反応液は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。ＳＥＣ分析には、２本のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ（東ソー）を装着したＬ－２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）システムを用い、ＵＶ２１４ｎｍの吸収を検出した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリル溶液を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで１２０分間室温でアイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）に溶出した。
ＳＥＣ分析の結果を図１に示す。７０分付近に大きなピークが認められたが、このピークは酵素反応に用いた酢酸緩衝液である。
シアリル糖ペプチド組成物の主要なピークは５０分から６０分の間に認められたが、これらはシアリダーゼ処理することで全体的に低分子側にシフトした。このことから、調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａの主体は、シアル酸を含有する化合物であることが明らかとなった
実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａを２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２０ｍｇ／ｍＬに調製し、それにシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来：Ｓｉｇｍａ，Ｎ２８７６－２５ＵＮ）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０時間反応させた。酵素添加なしのブランクは、酵素を添加せずに同条件で反応させた。反応後は５分間ボイルすることで反応を停止させた。得られた反応液は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。ＳＥＣ分析には、２本のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ（東ソー）を装着したＬ－２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）システムを用い、ＵＶ２１４ｎｍの吸収を検出した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリル溶液を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで１２０分間室温でアイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）に溶出した。
ＳＥＣ分析の結果を図１に示す。７０分付近に大きなピークが認められたが、このピークは酵素反応に用いた酢酸緩衝液である。
シアリル糖ペプチド組成物の主要なピークは５０分から６０分の間に認められたが、これらはシアリダーゼ処理することで全体的に低分子側にシフトした。このことから、調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａの主体は、シアル酸を含有する化合物であることが明らかとなった
【0032】
〔実施例３〕シアリル糖ペプチド組成物ＡのＬＣ／ＭＳを用いた構造解析
ＬＣ／ＭＳ分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＰａｒａｄｉｇｍＭＳ２（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に接続したイオントラップ型質量分析計ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、（ＬＣ－ＥＳＩ－ＩＴ ＭＳ）、分離カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（φ０．２ｍｍ×１５０ｍｍ，ジーエルサイエンス）を装着した。移動相には、０．１％のギ酸を含んだ２％アセトニトリル溶液（Ａ液）、および０．１％ギ酸を含んだ９０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。糖ペプチド組成物Ａを５０％アセトニトリル－０．１％ギ酸溶液で１００μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬをＨＰＬＣに導入した。移動相は２μＬ／ｍｉｎで通液し、試料導入後０分から９０分の間にＢ液の割合を０％から４５％まで直線的に増加させた。質量分析計は、ＭＳ測定（ｍ／ｚ４００－２０００，ポジティブモード）とＭＳ／ＭＳ測定を行なった。
ＬＣ／ＭＳ分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＰａｒａｄｉｇｍＭＳ２（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に接続したイオントラップ型質量分析計ＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、（ＬＣ－ＥＳＩ－ＩＴ ＭＳ）、分離カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（φ０．２ｍｍ×１５０ｍｍ，ジーエルサイエンス）を装着した。移動相には、０．１％のギ酸を含んだ２％アセトニトリル溶液（Ａ液）、および０．１％ギ酸を含んだ９０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。糖ペプチド組成物Ａを５０％アセトニトリル－０．１％ギ酸溶液で１００μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬをＨＰＬＣに導入した。移動相は２μＬ／ｍｉｎで通液し、試料導入後０分から９０分の間にＢ液の割合を０％から４５％まで直線的に増加させた。質量分析計は、ＭＳ測定（ｍ／ｚ４００－２０００，ポジティブモード）とＭＳ／ＭＳ測定を行なった。
【0033】
ＭＳ／ＭＳ測定は、ＭＳのうち強度の高い順に５つのイオンを自動的にプレカーサーイオンとして選択し、コリジョンエネルギー３５Ｖで破壊して生じたプロダクトイオンのｍ／ｚの差が２９２であるものをＮｅｕ５Ａｃ、３３４をＮ，Ｏ－ジアセチルノイラミン酸（Ｏ－Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ）、３７６をＮ，Ｏ，Ｏ－トリアセチルノイラミン酸（Ｏ，Ｏ－ｄｉＡｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ）、２０３をＧａｌＮＡｃ、１６２をＧａｌと帰属し、プロダクトイオンのパターンから糖鎖構造を決定した。糖鎖が完全に解離したと思われるイオンのｍ／ｚをペプチドにプロトンが付加したイオンに由来すると推定し、そのｍ／ｚに相当するペプチド配列をＧＭＰの配列中から探索することで、糖ペプチドの構造を推定した。
【0034】
実施例１で調製したシアリル糖ペプチド組成物Ａについて、ＬＣ／ＭＳ分析で得られたＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルから、糖ペプチド組成物に含まれる糖ペプチドの糖鎖構造を推定した。
表１に、ＬＣ／ＭＳ分析で検出したシアリル糖ペプチドの糖鎖構造を示す。その結果、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであった。検出した多くの糖ペプチドが、シアル酸を２分子結合したＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮａｃの糖鎖構造（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ３，４，５，６，７）を有していたが、シアル酸が１分子であるＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ １）やＧａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ２）も検出された。さらに、シアル酸のＯ－アセチル体であるＮ，Ｏ－ジアセチルノイラミン酸（Ｏ－Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ， Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ４）、およびＮ，Ｏ，Ｏ－トリアセチルノイラミン酸（Ｏ－ｄｉＡｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ， Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ５）も検出された。また、一つのペプチド鎖に２本の糖鎖が結合した糖ペプチド（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ６，７）も検出された。
表１に、ＬＣ／ＭＳ分析で検出したシアリル糖ペプチドの糖鎖構造を示す。その結果、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであった。検出した多くの糖ペプチドが、シアル酸を２分子結合したＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮａｃの糖鎖構造（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ３，４，５，６，７）を有していたが、シアル酸が１分子であるＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ １）やＧａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ２）も検出された。さらに、シアル酸のＯ－アセチル体であるＮ，Ｏ－ジアセチルノイラミン酸（Ｏ－Ａｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ， Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ４）、およびＮ，Ｏ，Ｏ－トリアセチルノイラミン酸（Ｏ－ｄｉＡｃ－Ｎｅｕ５Ａｃ， Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ５）も検出された。また、一つのペプチド鎖に２本の糖鎖が結合した糖ペプチド（Ｇｌｙｃａｎ ｔｙｐｅ ６，７）も検出された。
【0035】
ＭＳ／ＭＳスペクトル解析から検出したペプチド鎖は、いずれもウシのグリコマクロペプチドのペプチド鎖に含まれるペプチド鎖であった。検出したすべての糖ペプチドのペプチド鎖にはセリンまたはスレオニン残基が１分子以上存在し、ペプチド鎖長は最も短いもので１残基、最も長いもので１３残基であった。また、検出したペプチド鎖の分子量は、７４５から２９２８の範囲であった。
【0036】
【表1】
【0037】
〔実施例４〕シアリル糖ペプチド組成物の構成糖と存在比
シアリル糖ペプチド組成物は糖鎖とペプチド鎖から成るが、その作用にはシアリル糖ペプチド組成物中の糖鎖の構成糖とその含量が重要と考えられる。
実施例３で示したように、シアリル糖ペプチド組成物の糖鎖は、シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃ）、およびガラクト－Ｎ－ビオース（ＧＮＢ：Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）から成ることが明らかとなった。よって、次に糖ペプチド組成物中のシアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースのそれぞれの量を測定し、これらの存在比を調べた。
シアリル糖ペプチド組成物は糖鎖とペプチド鎖から成るが、その作用にはシアリル糖ペプチド組成物中の糖鎖の構成糖とその含量が重要と考えられる。
実施例３で示したように、シアリル糖ペプチド組成物の糖鎖は、シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃ）、およびガラクト－Ｎ－ビオース（ＧＮＢ：Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）から成ることが明らかとなった。よって、次に糖ペプチド組成物中のシアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースのそれぞれの量を測定し、これらの存在比を調べた。
【0038】
実施例１で調製したＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物中のシアル酸量は、以下に記載した方法で測定した。すなわち、シアル酸量を測定するために、ねじ口試験管に１００μＬのサンプル溶液、８００μＬの水、および１００μＬの１Ｎ硫酸溶液を添加し、ブロックヒーターを用いて８０℃で４５分間、加熱した。冷却後、等量の１００ｍＭの水酸化ナトリウムで中和した後、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。得られた反応液中の糖含量はＣａｒｂｏｐａｋ ＰＡ１カラムを装着したＤＩＯＮＥＸ ＩＣＸ－５０００ＤＰシステムを用いて測定した。
【0039】
実施例１で調製したＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物Ａ、Ｂからガラクト－Ｎ－ビオースを遊離させるために、まず実施例２に記載した方法でＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物をシアリダーゼ処理した。シアリダーゼ処理後のＧＭＰおよびシアリル糖ペプチド組成物は、引き続きＯ－グルカナーゼ（エンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ）処理することで、糖ペプチド組成物からガラクト－Ｎ－ビオースを遊離させた。遊離したガラクト－Ｎ－ビオースは、Ｃａｒｂｏｐａｋ ＰＡ１カラムを装着したＤＩＯＮＥＸ ＩＣＸ－５０００ＤＰシステムを用いて測定した。結果を表２に示す。
【0040】
シアリル糖ペプチド組成物中のシアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃ）とガラクト－Ｎ－ビオース（ＧＮＢ：Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）の含量は、ＧＭＰよりもシアリル糖ペプチド組成物の方が高い値となった。また、シアル酸：ＧＮＢは、ＧＭＰでは１．５：１であり、本発明のシアリル糖ペプチド組成物では、１．８：１、１．７：１であった。
また、シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースの量を合算したトータルの糖含量は、糖ペプチド組成物ＡはＧＭＰよりも４．７倍、糖ペプチド組成物ＢはＧＭＰよりも２．８倍高い含量となり、ＧＭＰの糖鎖が濃縮されたことが明らかとなった。
また、シアル酸とガラクト－Ｎ－ビオースの量を合算したトータルの糖含量は、糖ペプチド組成物ＡはＧＭＰよりも４．７倍、糖ペプチド組成物ＢはＧＭＰよりも２．８倍高い含量となり、ＧＭＰの糖鎖が濃縮されたことが明らかとなった。
【0041】
【表2】
【0042】
〔試験例１〕シアリル糖ペプチド組成物のＩｇＡ産生促進効果の検討
１．試験方法
（１）細胞の調製
凍結保存されたＨｕｍａｎ ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：末梢血単核細胞）（Ｌｏｔ．４６６０ＭＡ２０：ＡＳＴＲＡＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を３７℃の水浴で溶解し、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－０９３：Ｇｉｂｃｏ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．４２Ｑ３７８０Ｋ：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（１１１２００５２：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（１１１４００５０：Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１ｍＭ）（１１３６００７０：Ｇｉｂｃｏ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標） ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．０５ｍＭ）（１９８－１５７８１：富士フイルム和光純薬）を添加した培地で洗浄した後に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６ｗｅｌｌプレートに播種した。
１．試験方法
（１）細胞の調製
凍結保存されたＨｕｍａｎ ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：末梢血単核細胞）（Ｌｏｔ．４６６０ＭＡ２０：ＡＳＴＲＡＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を３７℃の水浴で溶解し、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－０９３：Ｇｉｂｃｏ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．４２Ｑ３７８０Ｋ：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（１１１２００５２：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（１１１４００５０：Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１ｍＭ）（１１３６００７０：Ｇｉｂｃｏ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標） ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．０５ｍＭ）（１９８－１５７８１：富士フイルム和光純薬）を添加した培地で洗浄した後に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６ｗｅｌｌプレートに播種した。
【0043】
（２）試験水準の調製
播種した細胞にシアリル糖ペプチド組成物ＡもしくはＧＭＰを０．８、４、もしくは２０μｇ／ｍＬ含む培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．４、２、もしくは１０μｇ／ｍＬ）して５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で７日間培養した。培養後の９６ｗｅｌｌプレートから培地を回収し、遠心分離（１，５００×ｇ、４℃、５分間）によって細胞を除去してＩｇＡ濃度測定用サンプルとした。
試料を添加しない水準をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６（ＡＦ－２００－０６：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した水準をＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとした。
試験はｎ＝６で実施した。シアリル糖ペプチド組成物ＡもしくはＧＭＰの培地中の最終濃度は、０．４、２、１０μｇ／ｍＬである。
播種した細胞にシアリル糖ペプチド組成物ＡもしくはＧＭＰを０．８、４、もしくは２０μｇ／ｍＬ含む培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．４、２、もしくは１０μｇ／ｍＬ）して５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で７日間培養した。培養後の９６ｗｅｌｌプレートから培地を回収し、遠心分離（１，５００×ｇ、４℃、５分間）によって細胞を除去してＩｇＡ濃度測定用サンプルとした。
試料を添加しない水準をＣｏｎｔｒｏｌ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６（ＡＦ－２００－０６：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した水準をＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとした。
試験はｎ＝６で実施した。シアリル糖ペプチド組成物ＡもしくはＧＭＰの培地中の最終濃度は、０．４、２、１０μｇ／ｍＬである。
【0044】
（３）ＩｇＡ濃度の測定方法
ＩｇＡ濃度の測定はＥＬＩＳＡ法にて実施した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ＩｇＡ，α Ｃｈａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．０５Ｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）（Ｃ３０４１：Ｓｉｇｍａ）で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） ９６ｗｅｌｌ ＥＩＡ／ＲＩＡ ｐｌａｔｅ）（３５９０：Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して４℃で一晩静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１４Ｍ ＮａＣｌ，１％ＢＳＡ）３００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で１時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０倍希釈したサンプル５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔで０．１６μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ＩｇＡ，αＣｈａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＭ） ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（００－４２０１－５６：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で十分な発色が認められるまで静置した後に１Ｎ ＨＣｌ １００μＬ／ｗｅｌｌを加え、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
測定結果は、ＯＤ４５０の値からＯＤ６２０の値を引いて補正した。測定は１サンプルにつき２連で実施し、その平均を測定値として採用した。また、ＩｇＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍを標品として検量線を作成し、各サンプルの測定値からＩｇＡ濃度を算出した。
ＩｇＡ濃度の測定はＥＬＩＳＡ法にて実施した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ＩｇＡ，α Ｃｈａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．０５Ｍ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）（Ｃ３０４１：Ｓｉｇｍａ）で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） ９６ｗｅｌｌ ＥＩＡ／ＲＩＡ ｐｌａｔｅ）（３５９０：Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して４℃で一晩静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１４Ｍ ＮａＣｌ，１％ＢＳＡ）３００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で１時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０倍希釈したサンプル５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔで０．１６μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ＩｇＡ，αＣｈａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＭ） ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（００－４２０１－５６：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で十分な発色が認められるまで静置した後に１Ｎ ＨＣｌ １００μＬ／ｗｅｌｌを加え、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
測定結果は、ＯＤ４５０の値からＯＤ６２０の値を引いて補正した。測定は１サンプルにつき２連で実施し、その平均を測定値として採用した。また、ＩｇＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍを標品として検量線を作成し、各サンプルの測定値からＩｇＡ濃度を算出した。
【0045】
２．試験結果
評価の結果、シアリル糖ペプチド組成物Ａを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した水準で、Ｃｏｎｔｒｏｌ水準およびＧＭＰ添加水準と比較して有意なＩｇＡ濃度の増加が認められた（図２）。また、シアリル糖ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）添加水準では２４．５ｎｇ／ｍＬのＩｇＡ濃度が認められ、Ｃｏｎｔｒｏｌ水準（１２．８ｎｇ／ｍＬ）の約１．９倍、ＧＭＰ（１０μｇ／ｍＬ）添加水準（７．６ｎｇ／ｍＬ）の約３．２倍であった。この結果より、本発明のシアリル糖ペプチド組成物はＩｇＡ産生促進作用を示し、その作用はＧＭＰよりも強いものであると考えられた。
図中、ａ、ｂ、ｃの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
評価の結果、シアリル糖ペプチド組成物Ａを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した水準で、Ｃｏｎｔｒｏｌ水準およびＧＭＰ添加水準と比較して有意なＩｇＡ濃度の増加が認められた（図２）。また、シアリル糖ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）添加水準では２４．５ｎｇ／ｍＬのＩｇＡ濃度が認められ、Ｃｏｎｔｒｏｌ水準（１２．８ｎｇ／ｍＬ）の約１．９倍、ＧＭＰ（１０μｇ／ｍＬ）添加水準（７．６ｎｇ／ｍＬ）の約３．２倍であった。この結果より、本発明のシアリル糖ペプチド組成物はＩｇＡ産生促進作用を示し、その作用はＧＭＰよりも強いものであると考えられた。
図中、ａ、ｂ、ｃの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【0046】
〔実施例５〕サプリメントの製造
実施例１で得られたシアリル糖ペプチド組成物粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のＩｇＡ産生促進用サプリメントを製造した。
実施例１で得られたシアリル糖ペプチド組成物粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のＩｇＡ産生促進用サプリメントを製造した。
【0047】
〔実施例６〕飲料の製造
表３に示した配合により原料を混合し、容器に重点した後、加熱殺菌して、本発明のＩｇＡ産生促進用飲料を製造した。
表３に示した配合により原料を混合し、容器に重点した後、加熱殺菌して、本発明のＩｇＡ産生促進用飲料を製造した。
【0048】
【表3】
【0049】
〔実施例７〕医薬品（カプセル剤）の製造
表４に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明のＩｇＡ産生促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
表４に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明のＩｇＡ産生促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
【0050】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明によれば、シアリル糖ペプチドを有効成分とする新規なＩｇＡ産生促進用組成物、及びシアリル糖ペプチドを有効成分とするＩｇＡ産生促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。
【図1】
【図2】
