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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023136665
(43)【公開日】2023-09-29
(54)【発明の名称】着床能の検出方法および着床障害の予測方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20230922BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230922BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022042463
(22)【出願日】2022-03-17
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業（ステップタイプＦＯＲＣＥ）、研究課題名「ヒト子宮内膜を用いた着床障害の診断ツールの開発」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107342
【弁理士】
【氏名又は名称】横田 修孝
(74)【代理人】
【識別番号】100155631
【弁理士】
【氏名又は名称】榎 保孝
(74)【代理人】
【識別番号】100137497
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 未知子
(74)【代理人】
【識別番号】100207907
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 桃子
(74)【代理人】
【識別番号】100217294
【弁理士】
【氏名又は名称】内山 尚和
(72)【発明者】
【氏名】廣田 泰
(72)【発明者】
【氏名】福井 大和
(72)【発明者】
【氏名】藍川 志津
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS39
4B063QX10
(57)【要約】
【課題】新規な着床能の検出方法および新規な着床障害の予測方法の提供。
【解決手段】本発明によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床能の検出方法または着床障害の予測方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、検出方法または予測方法が提供される。本発明によれば、被験対象の着床能の検出または着床障害の予測を簡便かつ的確に実施できる点で有利である。
【選択図】図２
【解決手段】本発明によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床能の検出方法または着床障害の予測方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、検出方法または予測方法が提供される。本発明によれば、被験対象の着床能の検出または着床障害の予測を簡便かつ的確に実施できる点で有利である。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床能の検出方法または着床障害の予測方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、検出方法または予測方法。
【請求項2】
ＰＲＣ２関連遺伝子が、(1)ＯＳＲ１遺伝子、(2)ＳＣＵＢＥ１遺伝子、(3)ＨＯＸＡ１３遺伝子、(4)ＭＥＧＦ１０遺伝子、(5)ＴＲＰＭ６遺伝子、(6)ＳＰＩＮＫ２遺伝子、(7)ＲＳＰＯ３遺伝子、(8)ＬＧＩ２遺伝子および(9)ＭＡＬ遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、請求項１に記載の検出方法または予測方法。
【請求項3】
ＥＺＨ２関連遺伝子が(10)ＥＺＨ２遺伝子および／または(11)ＣＣＮＤ２遺伝子である、請求項１または２に記載の検出方法または予測方法。
【請求項4】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子の発現レベルを測定する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法または予測方法。
【請求項5】
遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子が、(12)ＳＬＣ４６Ａ２遺伝子、(13)ＡＺＧＰ１遺伝子、(14)ＢＲＩＮＰ２遺伝子、(15)ＲＤＨ１２遺伝子、(16)ＳＳＴ遺伝子、(17)ＰＥＮＫ遺伝子および(18)ＣＨＩ３Ｌ２遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、請求項４に記載の検出方法または予測方法。
【請求項6】
前記被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして、着床能の有無を判定する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出方法または予測方法。
【請求項7】
遺伝子の発現レベルをＲＮＡ発現量で定量する、請求項１～６のいずれか一項に記載の検出方法または予測方法。
【請求項8】
被験対象が不妊症患者である、請求項１～７のいずれか一項に記載の検出方法または予測方法。
【請求項9】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、判定方法。
【請求項10】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床過程の異常を検出または予測するための着床過程の評価方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、評価方法。
【請求項11】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標とする着床能の診断マーカー、着床障害の予測マーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定マーカーまたは着床過程の評価マーカーであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断マーカー、予測マーカー、判定マーカーまたは評価マーカー。
【請求項12】
被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルの定量手段を含んでなる着床能の診断キット、着床障害の予測キット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定キットまたは着床過程の評価キットであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断キット、予測キット、判定キットまたは着床過程の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、着床能の検出方法および着床障害の予測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
不妊症は世界的な問題であり、日本においても女性の社会進出が進むとともに晩婚化、出産年齢の高齢化が顕著となり不妊治療を受けるカップルが増加している。不妊症に対する治療として、一般不妊治療であるタイミング法や人工授精で妊娠しなかった場合や一般不妊治療では妊娠困難と考えられる場合には、生殖補助医療（ＡＲＴ）と呼ばれる体外受精・胚移植（ＩＶＦ－ＥＴ）が行われる。ＡＲＴの治療周期数は年々増加し、２０１９年には４５．８万周期、出生数は６万人に上り、出生児の約１４人に１人はＡＲＴによる治療で妊娠し産まれている。このように、不妊治療におけるＡＲＴの重要性が益々高まっているなか、胚移植を繰り返しても妊娠に至らない反復着床不全（着床障害）が生殖医療において大きな問題となっている（非特許文献１および２）。
【0003】
一方で、着床障害は良好胚の子宮内への移植による反復不成功で定義されるように、受精卵を複数回移植しなければ診断することができない。しかしながら、胚移植前に子宮内膜の状態を診断する方法や着床障害を予測する方法はこれまでなかった。また、不妊患者に対して行われる子宮内膜組織による子宮内膜日付診や超音波断層法による子宮内膜厚の計測では着床能を機能的に評価することができず、現在まで有用とされる着床能を評価する指標はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Pirtea P,, et al., Life (Basel). 2021 Dec 27;12(1):39.
【非特許文献2】Franasiak JM,, et al., Fertil Steril. 2021 Dec;116(6):1436-1448.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、新規な着床能の検出方法および新規な着床障害の予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは今般、不妊症患者のうち生殖補助医療を受けて妊娠した患者群（対照群）と生殖補助医療を受けても妊娠しなかった群（着床障害群）に分類し、各群の着床期の子宮内膜組織検体における遺伝子の発現レベルをＲＮＡ発現量で比較した結果、ＰＲＣ２に関連する遺伝子群に差があることを確認した。本発明者らはまた、Ｅｚｈ２のノックアウトマウスの解析から、子宮のＥｚｈ２によるヒストンＨ３の２７番目のリジン残基のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）が着床過程に関与し、Ｅｚｈ２を欠損すると着床障害をきたすことを見出した。本発明者らはさらに、Ｅｚｈ２のノックアウトマウスと対照マウスの子宮の着床部位（妊娠６日目）における遺伝子の発現レベルをＲＮＡ発現量で比較した結果、Ｅｚｈ２のノックアウトマウスにおいてＲＮＡ発現量が増加した遺伝子の５’側上流のＨ３Ｋ２７ｍｅ３が有意に低下しており、このうち特に発現量が増加していた細胞周期に関連するＣｃｎｄ２の転写開始点付近の領域においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３が低下していることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【0007】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床能の検出方法または着床障害の予測方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、検出方法または予測方法。
［２］ＰＲＣ２関連遺伝子が、(1)ＯＳＲ１遺伝子、(2)ＳＣＵＢＥ１遺伝子、(3)ＨＯＸＡ１３遺伝子、(4)ＭＥＧＦ１０遺伝子、(5)ＴＲＰＭ６遺伝子、(6)ＳＰＩＮＫ２遺伝子、(7)ＲＳＰＯ３遺伝子、(8)ＬＧＩ２遺伝子および(9)ＭＡＬ遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、上記［１］に記載の検出方法または予測方法。
［３］ＥＺＨ２関連遺伝子が、(10)ＥＺＨ２遺伝子および／または(11)ＣＣＮＤ２遺伝子である、上記［１］または［２］に記載の検出方法または予測方法。
［４］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子の発現レベルを測定する工程をさらに含む、上記［１］～［３］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［５］遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子が、(12)ＳＬＣ４６Ａ２遺伝子、(13)ＡＺＧＰ１遺伝子、(14)ＢＲＩＮＰ２遺伝子、(15)ＲＤＨ１２遺伝子、(16)ＳＳＴ遺伝子、(17)ＰＥＮＫ遺伝子および(18)ＣＨＩ３Ｌ２遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、上記［４］に記載の検出方法または予測方法。
［６］前記被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして、着床能の有無を判定する工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［７］遺伝子の発現レベルをＲＮＡ発現量で定量する、上記［１］～［６］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［８］被験対象が不妊症患者である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［９］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、判定方法。
［１０］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床過程の異常を検出または予測するための着床過程の評価方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、評価方法。
［１１］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標とする着床能の診断マーカー、着床障害の予測マーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定マーカーまたは着床過程の評価マーカーであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断マーカー、予測マーカー、判定マーカーまたは評価マーカー。
［１２］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルの定量手段を含んでなる着床能の診断キット、着床障害の予測キット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定キットまたは着床過程の評価キットであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断キット、予測キット、判定キットまたは着床過程の評価キット。
［１］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床能の検出方法または着床障害の予測方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、検出方法または予測方法。
［２］ＰＲＣ２関連遺伝子が、(1)ＯＳＲ１遺伝子、(2)ＳＣＵＢＥ１遺伝子、(3)ＨＯＸＡ１３遺伝子、(4)ＭＥＧＦ１０遺伝子、(5)ＴＲＰＭ６遺伝子、(6)ＳＰＩＮＫ２遺伝子、(7)ＲＳＰＯ３遺伝子、(8)ＬＧＩ２遺伝子および(9)ＭＡＬ遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、上記［１］に記載の検出方法または予測方法。
［３］ＥＺＨ２関連遺伝子が、(10)ＥＺＨ２遺伝子および／または(11)ＣＣＮＤ２遺伝子である、上記［１］または［２］に記載の検出方法または予測方法。
［４］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子の発現レベルを測定する工程をさらに含む、上記［１］～［３］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［５］遺伝子(1)～(11)以外の遺伝子が、(12)ＳＬＣ４６Ａ２遺伝子、(13)ＡＺＧＰ１遺伝子、(14)ＢＲＩＮＰ２遺伝子、(15)ＲＤＨ１２遺伝子、(16)ＳＳＴ遺伝子、(17)ＰＥＮＫ遺伝子および(18)ＣＨＩ３Ｌ２遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子である、上記［４］に記載の検出方法または予測方法。
［６］前記被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして、着床能の有無を判定する工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［７］遺伝子の発現レベルをＲＮＡ発現量で定量する、上記［１］～［６］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［８］被験対象が不妊症患者である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の検出方法または予測方法。
［９］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、判定方法。
［１０］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含んでなる、着床過程の異常を検出または予測するための着床過程の評価方法であって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、評価方法。
［１１］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標とする着床能の診断マーカー、着床障害の予測マーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定マーカーまたは着床過程の評価マーカーであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断マーカー、予測マーカー、判定マーカーまたは評価マーカー。
［１２］被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルの定量手段を含んでなる着床能の診断キット、着床障害の予測キット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定キットまたは着床過程の評価キットであって、前記遺伝子がＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子である、診断キット、予測キット、判定キットまたは着床過程の評価キット。
【0008】
本発明によれば、被験対象の着床能の検出または着床障害の予測を簡便かつ的確に実施できる点で有利である。本発明によればまた、不妊症患者のうち不妊治療を受けている患者において、不妊治療を継続するか否かの判断に活用することができる点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図2】図２は、不妊症患者のうち、検体採取後の胚移植により妊娠した患者群（対照群）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった患者群（着床障害群）における子宮内膜組織検体のＲＮＡ－Ｓｅｑの結果を示す。縦軸のＲＰＫＭ（Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads）は総リード数が１００万だった場合の各遺伝子のリード数を示し、横軸の妊娠と非妊娠は対照群と着床障害群をそれぞれ示す。
【図3】図３は、不妊症患者のうち、検体採取後の胚移植により妊娠した患者群（対照群）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった患者群（着床障害群）における子宮内膜組織検体のＲＮＡ－Ｓｅｑの結果を示す。縦軸のＲＰＫＭ（Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads）は総リード数が１００万だった場合の各遺伝子のリード数を示し、横軸の妊娠と非妊娠は対照群と着床障害群をそれぞれ示す。
【図4】図４ＡおよびＢは、不妊症患者のうち、検体採取後の胚移植により妊娠した患者群（対照群）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった患者群（着床障害群）における子宮内膜組織検体のＲＮＡ－Ｓｅｑの結果を示す。縦軸のＲＰＫＭ（Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads）は総リード数が１００万だった場合の各遺伝子のリード数を示し、横軸の妊娠と非妊娠は対照群と着床障害群をそれぞれ示す。
【図5】図５は、不妊症患者のうち、検体採取後の胚移植により妊娠した患者群（対照群）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった患者群（着床障害群）における子宮内膜組織検体のＲＮＡ－Ｓｅｑの結果を示す。縦軸のＲＰＫＭ（Reads Per Kilobase of exon per Million mapped reads）は総リード数が１００万だった場合の各遺伝子のリード数を示し、横軸の妊娠と非妊娠は対照群と着床障害群をそれぞれ示す。
【図7】図７は、妊娠初期におけるヒトとマウスのホルモン動態の概要を示す。縦軸はエストロゲンおよびプロゲステロンの血中濃度を示し、横軸は排卵日からの日数を示す。「Implantation window（着床の窓）」は、「子宮が着床能を保持している期間」をいう。
【図9】図９は、ＷＴマウスの妊娠子宮における、１日目（Ａ）、４日目（Ｂ）、６日目（Ｃ）、８日目（Ｄ）のＥｚｈ２遺伝子の発現パターンをそれぞれ示す。スケールバーは２００μｍ、ｌｅは管腔上皮、ｇｅは腺上皮、ｓは間質、ｄｅは間質が分化、増殖した脱落膜、ＡＭは血管反対側、Ｍは血管側をそれぞれ示す。
【図10】図１０Ａは、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの子宮（４日目）におけるＥｚｈ２の免疫染色の結果をそれぞれ示す。図１０Ｂは、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの子宮着床部位（５日目）のウエスタンブロットの結果をそれぞれ示す。
【図12】図１２ＡおよびＢは、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの各子宮（４日目）における胚盤胞の写真（スケールバーは１００μｍ）および胚盤胞の数をそれぞれ示す。図１２Ｃは、ｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの各子宮（４日目）のＫｉ６７の免疫染色を示す（スケールバーは５０μｍ、ｌｅは管腔上皮、ｇｅは腺上皮、ｓは間質をそれぞれ示す）。
【図15】図１５は、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの各子宮（６日目）におけるＨＥ染色（Ａ）、ＣＫ８免疫染色（Ｂ）および子宮内膜管腔上皮の状態（Ｃ）を示す（スケールバーは１００μｍ、ＡＭは血管反対側、Ｍは血管側、＊は胚をそれぞれ示す）。
【図18】図１８は、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの各子宮（６日目）の着床部位においてＨ３Ｋ２７ｍｅ抗体を用いてクロマチン免疫沈降（Ｃｈｉｐ）し、抽出したＤＮＡのＣｈｉｐ－ｓｅｑの結果をそれぞれ示す。
【発明の具体的説明】
【0010】
＜＜定義＞＞
「ＰＲＣ２」とはポリコーム群タンパク質複合体２（polycomb repressive complex 2）を意味し、ポリコーム群タンパク質（ＰｃＧ：Polycomb-group protein）の２つのクラスのうちの１つである。図１の模式図に示されるように、ＰＲＣ２は複数のタンパク質から構成され、ＥＺＨ２（enhancer of zeste homolog 2）、ＥＥＤ（embryonic ectoderm development）、ＳＵＺ１２（suppressor of zeste homolog 12）、ＲｂＡｐ４６／４８（retinoblastoma (Rb)-associated protein 46/48）が主な構成要素とされており（R. Margueron, et al., Nature 469, 343-349 (2011).）、クロマチンの構成単位であるヌクレオソームを構成するヒストン８量体のうちヒストンＨ３の２７番目のリジン残基をトリメチル化し、標的遺伝子の発現を抑制する。本明細書において、ヒストンＨ３の２７番目のリジン残基がメチル化された状態を「Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３」ということがある。
「ＰＲＣ２」とはポリコーム群タンパク質複合体２（polycomb repressive complex 2）を意味し、ポリコーム群タンパク質（ＰｃＧ：Polycomb-group protein）の２つのクラスのうちの１つである。図１の模式図に示されるように、ＰＲＣ２は複数のタンパク質から構成され、ＥＺＨ２（enhancer of zeste homolog 2）、ＥＥＤ（embryonic ectoderm development）、ＳＵＺ１２（suppressor of zeste homolog 12）、ＲｂＡｐ４６／４８（retinoblastoma (Rb)-associated protein 46/48）が主な構成要素とされており（R. Margueron, et al., Nature 469, 343-349 (2011).）、クロマチンの構成単位であるヌクレオソームを構成するヒストン８量体のうちヒストンＨ３の２７番目のリジン残基をトリメチル化し、標的遺伝子の発現を抑制する。本明細書において、ヒストンＨ３の２７番目のリジン残基がメチル化された状態を「Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３」ということがある。
【0011】
「ＥＺＨ２」は、ＰＲＣ２を構成するタンパク質の１つとして、ＰＲＣ２のメチル化活性において中心的な役割を果たすメチルトランスフェラーゼであり、ヒストンＨ３の２７番目のリジン残基にメチル基の付加を触媒する酵素である。
【0012】
「ＳＵＺ１２」は、ＰＲＣ２を構成するタンパク質の１つであり、ＥＺＨ２とともにヒストンＨ３の２７番目のリジン残基メチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ）に機能し、標的遺伝子の転写抑制に関与する。
【0013】
「ＯＳＲ１」は「酸化ストレス応答性キナーゼ１（Oxidative Stress-Responsive 1）」であり、ＯＳＲ１遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0014】
「ＳＣＵＢＥ１」は「シグナルペプチド、ＣＵＢドメインおよびＥＧＦ様ドメイン含有タンパク質１（signal peptide, CUB domain and EGF like domain containing 1）」であり、ＳＣＵＢＥ１遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0015】
「ＨＯＸＡ１３」は「ホメオボックスタンパク質ＨＯＸ－Ａ１３（Homeobox protein Hox-A13）」であり、ＨＯＸＡ１３遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0016】
「ＭＥＧＦ１０」は「複数のＥＧＦ様ドメインタンパク質１０（Multiple EGF Like Domains 10）」であり、ＭＥＧＦ１０遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0017】
「ＴＲＰＭ６」は「一過性受容体型電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６（Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 6）」であり、ＴＲＰＭ６遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0018】
「ＳＰＩＮＫ２」は「セリンプロテアーゼ阻害剤カザル型２（Serine protease inhibitor Kazal-type 2）」であり、ＳＰＩＮＫ２遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0019】
「ＲＳＰＯ３」は「Ｒスポンジン３（R-spondin 3）」であり、ＲＳＰＯ３遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0020】
「ＬＧＩ２」は「ロイシンリッチリピートＬＧＩファミリーメンバー２（Leucine-rich repeat LGI family member 2）」であり、ＬＧＩ２遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0021】
「ＭＡＬ」は「ミエリンリンパ球タンパク（Myelin and lymphocyte protein）」であり、ＭＡＬ遺伝子の発現がＨ３Ｋ２７ｍｅ３により調節される点でＰＲＣ２と関連する。
【0022】
「ＣＣＮＤ２」は「サイクリンＤ２」ともいい、サイクリンファミリーに属し、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６の調節サブユニットとして複合体を形成し、それらの活性化は細胞周期Ｇ１／Ｓ移行に必要とされる。
【0023】
「ＳＬＣ４６Ａ２」は「溶質キャリアファミリー４６メンバー２（Solute Carrier Family 46 Member 2）」である。
【0024】
「ＡＺＧＰ１」は「亜鉛アルファ－２－糖タンパク質１（Alpha-2-Glycoprotein 1, Zinc protein」である。
【0025】
「ＢＲＩＮＰ２」は「ＢＭＰ／レチノイン酸誘導性神経特異的タンパク質２（BMP/retinoic acid inducible neural specific protein 2）」である。
【0026】
「ＲＤＨ１２」とは「レチノールデヒドロゲナーゼ１２（retinol dehydrogenase 12）」であり、着床期のヒト子宮内膜間質に発現している。
【0027】
「ＳＳＴ」とは「ソマトスタチン（somatostatin）」であり、妊娠後のヒト子宮内膜間質で発現している。
【0028】
「ＰＥＮＫ」とは「プロエンケファリン（proenkephalin）」であり、ウシ、アカゲザル、マウスの着床期の子宮で発現している。
【0029】
「ＣＨＩ３Ｌ２」とは「キチナーゼ３様タンパク質２（chitinase 3 like 2）」である。
【0030】
妊娠の起点となる「着床」とは、胚と子宮内膜との間の器質的な結合が成立した状態をいい、「着床過程」とは、受精卵が分割を繰り返し発育した胚盤胞が子宮内膜という粘膜組織の管腔上皮へ接着し（胚接着）、その後子宮内膜の間質へ浸潤し（胚浸潤）、絨毛構造を形成するまでの一連の現象をいう。そして、本発明において、「着床能を有する」とは着床に至る能力を有することをいい、「着床能を有しない」とは着床に至る能力を有しないことをいう。
【0031】
本発明において、「着床障害」とは形態が良好な胚を用いて子宮内への胚移植を複数回行っても妊娠に至らない状態（Repeated Implantation Failure）を意味する。着床障害の原因は大きく「胚性因子」と「子宮因子」に分けられる。胚性因子は、受精卵における染色体の数的異常（異数性）が原因となることが多く、近年、着床前診断の一つで、胚の染色体異数性の検出による着床率の向上と流産率の低下を目的として国内でも臨床研究が行われている異数性の着床前遺伝子検査（ＰＧＴＡ：Preimplantation genetic testing for aneuploidy）により、胚移植当たりの妊娠率の向上が得られる可能性が示唆されている（T. Sato et al., Hum Reprod 34, 2340-2348 (2019).）。一方、子宮因子は、慢性子宮内膜炎、子宮内細菌叢異常、免疫学的異常など様々な要因が示唆されている。
【0032】
「不妊症」は、生殖適齢期にある男女が一定期間（約１年）避妊をせずに性交しているにもかかわらず、妊娠に至らない状態のことをいう。なお、明らかな不妊原因が存在する場合は、不妊の期間にかかわらず不妊症としてよい。
【0033】
本発明において、「不妊治療」は、「一般不妊治療」および「生殖補助医療」を含む意味で用いられる。「一般不妊治療」としては、タイミング法や人工授精が挙げられる。「生殖補助医療（ＡＲＴ：assisted reproductive technology）」は、妊娠を成立させるためにヒト卵子と精子、あるいは胚を取り扱うことを含むすべての治療あるいは方法をいい、生殖補助医療として体外受精・胚移植（ＩＶＦ－ＥＴ：in vitro fertilization and embryo transfer）、卵細胞質内精子注入・胚移植（ＩＣＳＩ－ＥＴ：intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer）および凍結・融解胚移植等の不妊症治療法が挙げられる。
【0034】
本発明において「子宮内膜組織検体」は、着床期に採取された検体であっても、着床期以外の時期に採取された検体であってもよいが、好ましくは着床期に採取された検体である。ここで、着床期は、排卵周期によるものであってもよく、ホルモン補充周期によるものであってもよい。また、本発明において、不妊治療を受ける対象（ヒト）において、排卵日の６～８日後（または黄体ホルモンの投与６～８日目）に採取された該対象の子宮内膜組織検体を使用することができる。
【0035】
本発明における「対象」は、ヒトを含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。本発明における「対象」は、正常な対象（健常者）も含まれるが、好ましくは不妊症患者である（不妊症と診断されている対象および不妊症と疑われる対象を含む）。
【0036】
＜＜マーカー遺伝子＞＞
本発明において着床能または着床障害の指標となる遺伝子（マーカー遺伝子）は、ＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子を少なくとも含む。
本発明において着床能または着床障害の指標となる遺伝子（マーカー遺伝子）は、ＰＲＣ２関連遺伝子、ＥＺＨ２関連遺伝子および／またはＳＵＺ１２遺伝子を少なくとも含む。
【0037】
本発明において指標となるＰＲＣ２関連遺伝子は、ＯＳＲ１遺伝子、ＳＣＵＢＥ１遺伝子、ＨＯＸＡ１３遺伝子、ＭＥＧＦ１０遺伝子およびＴＲＰＭ６遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子を少なくとも含む。本明細書において「ＯＳＲ１遺伝子、ＳＣＵＢＥ１遺伝子、ＨＯＸＡ１３遺伝子、ＭＥＧＦ１０遺伝子およびＴＲＰＭ６遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子」を「本発明の遺伝子ａ」または「遺伝子ａ」ということがある。本発明の遺伝子ａは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ａの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ａの発現レベルと比較して低いことを特徴とする。特に、本発明の遺伝子ａは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子発現レベルが着床障害を有しない対象と比較して１／２以下であるものとすることができる。
【0038】
本発明において指標となるＰＲＣ２関連遺伝子は、本発明の遺伝子ａに加えて、ＳＰＩＮＫ２遺伝子、ＲＳＰＯ３遺伝子、ＬＧＩ２遺伝子およびＭＡＬ遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子を少なくとも含む。本明細書において「ＳＰＩＮＫ２遺伝子、ＲＳＰＯ３遺伝子、ＬＧＩ２遺伝子およびＭＡＬ遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子」を「本発明の遺伝子ｂ」または「遺伝子ｂ」ということがある。本発明の遺伝子ｂは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｂの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｂの発現レベルと比較して高いことを特徴とする。特に、本発明の遺伝子ｂは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子発現レベルが着床障害を有しない対象と比較して２倍以上であるものとすることができる。
【0039】
本発明において指標となるＥＺＨ２関連遺伝子は、「ＥＺＨ２遺伝子」および／または「ＣＣＮＤ２遺伝子」を少なくとも含む。本明細書において「ＥＺＨ２遺伝子」を「本発明の遺伝子ｃ」または「遺伝子ｃ」といい、「ＣＣＮＤ２遺伝子」を「本発明の遺伝子ｄ」または「遺伝子ｄ」ということがある。本発明の遺伝子ｃは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｃの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｃの発現レベルと比較して低いことを特徴とする。本発明の遺伝子ｄは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｄの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｄの発現レベルと比較して高いことを特徴とする。
【0040】
本発明において指標となる「ＳＵＺ１２遺伝子」は、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中のＳＵＺ１２遺伝子の発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中のＳＵＺ１２遺伝子の発現レベルと比較して低いことを特徴とする。本明細書において「ＳＵＺ２遺伝子」を「本発明の遺伝子ｅ」または「遺伝子ｅ」ということがある。
【0041】
本発明において指標となる遺伝子は、本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅに加えて、ＳＬＣ４６Ａ２遺伝子および／またはＡＺＧＰ１遺伝子を少なくとも含む。本明細書において「ＳＬＣ４６Ａ２遺伝子および／またはＡＺＧＰ１遺伝子」を「本発明の遺伝子ｆ」または「遺伝子ｆ」ということがある。本発明の遺伝子ｆは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｆの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｆの発現レベルと比較して低いことを特徴とする。特に、本発明の遺伝子ｆは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子発現レベルが着床障害を有しない対象と比較して１／２以下であるものとすることができる。
【0042】
本発明において指標となる遺伝子は、本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆに加えて、ＢＲＩＮＰ２遺伝子、ＲＤＨ１２遺伝子、ＳＳＴ遺伝子、ＰＥＮＫ遺伝子およびＣＨＩ３Ｌ２遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子を少なくとも含む。本明細書において「ＢＲＩＮＰ２遺伝子、ＲＤＨ１２遺伝子、ＳＳＴ遺伝子、ＰＥＮＫ遺伝子およびＣＨＩ３Ｌ２遺伝子からなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子」を「本発明の遺伝子ｇ」または「遺伝子ｇ」ということがある。本発明の遺伝子ｇは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｇの発現レベルが着床障害を有しない対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子ｇの発現レベルと比較して高いことを特徴とする。特に、本発明の遺伝子ｇは、着床障害を有する対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子発現レベルが着床障害を有しない対象と比較して２倍以上であるものとすることができる。本明細書において、本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇのいずれかの遺伝子を「本発明の遺伝子」ということがある。
【0043】
＜＜着床能の検出方法＞＞
本発明の第一の側面によれば、着床能の検出方法が提供される。本発明の検出方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして着床能を検出することができる。すなわち、本発明の検出方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床能の有無と関連づけることを特徴とする。
本発明の第一の側面によれば、着床能の検出方法が提供される。本発明の検出方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして着床能を検出することができる。すなわち、本発明の検出方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床能の有無と関連づけることを特徴とする。
【0044】
本発明の検出方法においては、まず、（Ａ）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子（本発明の遺伝子）の発現レベルを測定する工程を実施することができる。遺伝子の発現レベルの測定は、公知の方法により実施することができ、例えば、ＲＮＡ発現量やタンパク質発現量の測定方法を利用できる。
【0045】
ＲＮＡ発現量の測定方法としては、次世代シーケンサーを利用したＲＮＡ－ｓｅｑ、定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法等が挙げられるが、迅速かつ簡便な検出の観点からＲＴ－ｑＰＣＲおよびデジタルＰＣＲが好ましい。
【0046】
タンパク質発現量の測定方法としては、抗体やアプタマーを利用したイムノアッセイとして、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡやＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、質量分析法等が挙げられるが、迅速かつ簡便な検出の観点からＥＩＡおよびＥＬＩＳＡが好ましい。
【0047】
本発明の検出方法においては、（Ｂ）工程（Ａ）で測定された本発明の遺伝子の発現レベルを指標にして、子宮内膜組織検体を採取した被験対象の着床能の有無を判定または評価する工程をさらに含むことができる。
【0048】
本発明の遺伝子が遺伝子ａ、ｃ、ｅおよびｆである場合、工程（Ｂ）は、（Ｂ－１―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｂ－１－２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床能がないと判定する工程とにより実施することができる。なお、本発明において「着床能がない」とは、「着床能がない可能性がある、あるいは着床能がない可能性が低い」を含む意味で用いられるものとする。
【0049】
工程（Ｂ－１－２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床能があると判定することもできる。なお、本発明において「着床能がある」とは、「着床能がある可能性がある、あるいは着床能がある可能性が高い」を含む意味で用いられるものとする。
【0050】
本発明の遺伝子が遺伝子ｂ、ｄおよびｇである場合、工程（Ｂ）は、（Ｂ－２―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｂ－２―２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床能がないと判定する工程とにより実施することができる。
【0051】
工程（Ｂ－２―２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床能があると判定することもできる。
【0052】
本発明において、「参照値」は、着床能を有する対象（正常対象）の子宮内膜組織検体における本発明の遺伝子の発現レベルの測定値から算出し、決定することができる。このような対象は、不妊症患者のうち不妊治療を受けて妊娠した対象が好ましいが、着床能を有する健常者であってもよい。本発明において参照値はまた、着床能を有しない対象、すなわち不妊症患者のうち不妊治療を受けても妊娠しなかった対象（着床障害対象）の子宮内膜組織検体における本発明の遺伝子の発現レベルの測定値から算出し、決定することができる。上記の参照値の決定方法においては、正常対象群または着床障害対象群の測定値の平均値、中央値、パーセンタイル値、最大値または最小値を使用することができる。パーセンタイル値は任意の値を選択することができ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５とすることができる。参照値を算出する際の正常対象および着床障害対象の例数は複数例が好ましく、例えば、２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上、５０例以上または１００例以上とすることができる。なお、参照値は本発明を実施する上で着床能の有無または着床障害の可能性の有無を区別する数値であり、この意味においてカットオフ値または境界値といい得る。
【0053】
本発明において参照値はまた、着床能を有する対象（正常対象）の子宮内膜組織検体における本発明の遺伝子の発現レベルの測定値と、着床能を有しない対象（着床障害対象）の子宮内膜組織検体における本発明の遺伝子の発現レベルの測定値に基づいて算出することもできる。例えば、着床障害対象群と、正常対象群について、子宮内膜組織検体における本発明の遺伝子の発現レベルを測定し、得られた測定値を用いてＲＯＣ（受信者動作特性曲線（Receiver Operating Characteristic curve））解析等の統計解析を行うことにより参照値を設定することができる。ＲＯＣ曲線の作成とＲＯＣ曲線に基づく参照値の設定は周知であり、感度や特異度の観点から当業者が適宜設定することができる。
【0054】
本発明において本発明の遺伝子を複数種組み合わせて指標とする場合や、本発明の遺伝子を他の臨床変数と組み合わせて指標とする場合には、指標となる複数種の遺伝子の発現レベルの測定値に対して一つの参照値を設定することもできる。例えば、一種の遺伝子の発現レベルの測定値に代えて、複数種の遺伝子の発現レベルの測定値の合計値、平均値、比率等を用いて参照値を算出することができ、あるいは、複数種の遺伝子の発現レベルの測定値に重み付けをした上で合計値、平均値、比率等を算出し、該算出値を用いて参照値を算出することができる。このようにして算出された参照値を本発明に用いる場合には、参照値の算出方法と同じ方法で被験対象の子宮内膜組織検体中の複数種の遺伝子の発現レベルの測定値を処理し、得られた数値をあらかじめ定めた参照値とを比較することで判定を行うことができる。
【0055】
本発明の検出方法の工程（Ｂ）においては、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、遺伝子ｃ、遺伝子ｅおよび遺伝子ｆからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが、正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象の着床能がないと判定することができる。
【0056】
本発明の検出方法の工程（Ｂ）においてはまた、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ｂ、遺伝子ｄおよび遺伝子ｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象の着床能がないと判定することができる。
【0057】
本発明の検出方法は、本発明の遺伝子を２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、または１６種以上のように組み合わせて実施することができ、例えば、一定数以上の種類の本発明の遺伝子の発現レベルが対照と比較して異なっている（高いまたは低い）場合に、被験対象の着床能がない（あるいは着床能がある）と判定することができる。
【0058】
本発明の検出方法において、着床能の有無の検出は、被験対象の子宮内膜組織検体の遺伝子レベルの測定に、他の臨床変数の測定を組み合わせて実施することができる。組み合わせる臨床変数としては、例えば、子宮内膜の炎症状態の観点から、子宮内膜間質におけるＣＤ１３８陽性細胞数が挙げられる。本発明の遺伝子をこのような臨床変数と組み合わせて使用することによりさらに検出精度を向上させることができる。ここで検出精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。
【0059】
本発明の検出方法によれば、被験対象の着床能を検出または評価することができる。したがって、本発明の検出方法は、着床能の診断に補助的に用いることができ、被験対象が着床能を有しているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明においては、着床能を有していない（あるいは有していない可能性がある）と判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が着床能を有していない（あるいは着床能を有していない可能性がある）と判断することができる。すなわち、本発明の検出方法は着床能の診断を補助する方法あるいは着床能の診断を支援する方法と言い換えることができる。
【0060】
本発明の検出方法によれば、被験対象から採取された子宮内膜組織検体に基づいて定量的に着床能の検出または評価を行うことができる。すなわち、本発明の検出方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に着床能を検出または評価できる点で有利である。このため本発明の検出方法は、着床能を検出または評価するための生体試料分析方法と言い換えることができる。本発明の検出方法によればまた、不妊症患者のうち不妊治療を受けている患者において、不妊治療を継続するか否かの判断に活用することができる点でも有利である。
【0061】
＜＜着床障害の予測方法＞＞
本発明の第二の側面によれば、着床障害の予測方法が提供される。本発明の予測方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして着床障害を予測することができる。すなわち、本発明の予測方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床障害の予測と関連づけることを特徴とする。
本発明の第二の側面によれば、着床障害の予測方法が提供される。本発明の予測方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして着床障害を予測することができる。すなわち、本発明の予測方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床障害の予測と関連づけることを特徴とする。
【0062】
本発明の予測方法においては、まず、（Ｃ）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子（本発明の遺伝子）の発現レベルを測定する工程を実施することができる。遺伝子の発現レベルの測定は、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
【0063】
本発明の予測方法においては、（Ｄ）工程（Ｃ）で測定された本発明の遺伝子の発現レベルを指標にして、子宮内膜組織検体を採取した被験対象の着床障害の可能性を判定または評価する工程をさらに含むことができる。
【0064】
本発明の遺伝子が遺伝子ａ、ｃ、ｅおよびｆである場合、工程（Ｄ）は、（Ｄ－１―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｄ－１－２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床障害の可能性があると判定する工程とにより実施することができる。なお、本発明において「着床障害の可能性がある」とは、「着床障害の可能性が高い」を含む意味で用いられるものとする。
【0065】
工程（Ｄ－１－２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床障害の可能性がないと判定することもできる。なお、本発明において「着床障害の可能性がない」とは、「着床障害の可能性が低い」を含む意味で用いられるものとする。
【0066】
本発明の遺伝子が遺伝子ｂ、ｄおよびｇである場合、工程（Ｄ）は、（Ｄ－２―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｄ－２―２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床障害の可能性があると判定する工程とにより実施することができる。
【0067】
工程（Ｄ－２―２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床障害の可能性がないと判定することもできる。
【0068】
本発明の予測方法の工程（Ｄ）においては、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、遺伝子ｃ、遺伝子ｅおよび遺伝子ｆからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象は着床障害の可能性があると判定することができる。
【0069】
本発明の予測方法の工程（Ｄ）においてはまた、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ｂ、遺伝子ｄおよび遺伝子ｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象は着床障害の可能性があると判定することができる。
【0070】
本発明の予測方法は、本発明の遺伝子を２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、または１６種以上のように組み合わせて実施することができ、例えば、一定数以上の種類の本発明の遺伝子の発現レベルが対照と比較して異なっている（高いまたは低い）場合に、被験対象は着床障害の可能性がある（あるいは着床障害の可能性がない）と判定することができる。
【0071】
本発明の予測方法において、着床障害の予測は、被験対象の子宮内膜組織検体の遺伝子レベルの測定に、他の臨床変数の測定を組み合わせて実施することができる。組み合わせる臨床変数としては、例えば、子宮内膜の炎症状態の観点から、子宮内膜間質におけるＣＤ１３８陽性細胞数が挙げられる。本発明の遺伝子をこのような臨床変数と組み合わせて使用することによりさらに予測精度を向上させることができる。ここで予測精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。
【0072】
本発明の予測方法によれば、被験対象の着床障害を予測または評価することができる。したがって、本発明の予測方法は、着床障害の診断に補助的に用いることができ、被験対象が着床障害の可能性があるか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明においては、着床障害の可能性があると判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が着床障害の可能性があると判断することができる。すなわち、本発明の予測方法は着床障害の診断を補助する方法あるいは着床障害の診断を支援する方法と言い換えることができる。
【0073】
本発明の予測方法によれば、被験対象から採取された子宮内膜組織検体に基づいて定量的に着床障害の可能性の予測または評価を行うことができる。すなわち、本発明の予測方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に着床障害を予測または評価できる点で有利である。このため本発明の予測方法は、着床障害を検出または評価するための生体試料分析方法と言い換えることができる。本発明の予測方法によればまた、不妊治療による治療を受けている患者において、不妊治療を継続するか否かの判断に活用することができる点でも有利である。
【0074】
本発明の予測方法は、上記に加えて、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
【0075】
＜＜不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法＞＞
本発明の第三の側面によれば、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法が提供される。本発明の判定方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして不妊治療による臨床的妊娠可能性を判定することができる。すなわち、本発明の判定方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の不妊治療による臨床的妊娠可能性と関連づけることを特徴とする。
本発明の第三の側面によれば、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定方法が提供される。本発明の判定方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして不妊治療による臨床的妊娠可能性を判定することができる。すなわち、本発明の判定方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の不妊治療による臨床的妊娠可能性と関連づけることを特徴とする。
【0076】
本発明の判定方法においては、まず、（Ｅ）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子（本発明の遺伝子）の発現レベルを測定する工程を実施することができる。遺伝子の発現レベルの測定は、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
【0077】
本発明の判定方法においては、（Ｆ）工程（Ｅ）で測定された本発明の遺伝子の発現レベルを指標にして、子宮内膜組織検体を採取した被験対象の不妊治療による臨床的妊娠可能性を評価する工程をさらに含むことができる。
【0078】
本発明の遺伝子が遺伝子ａ、ｃ、ｅおよびｆである場合、工程（Ｆ）は、（Ｆ－１―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｆ－１－２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の臨床的妊娠の可能性がないと評価する工程とにより実施することができる。なお、本発明において「臨床的妊娠の可能性がない」とは、「臨床的妊娠の可能性が低い」を含む意味で用いられる。
【0079】
工程（Ｆ－１－２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の臨床的妊娠の可能性があると評価することもできる。なお、本発明において「臨床的妊娠の可能性がある」とは、「臨床的妊娠の可能性が高い」を含む意味で用いられる。
【0080】
本発明の遺伝子が遺伝子ｂ、ｄおよびｇである場合、工程（Ｆ）は、（Ｆ－２―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｆ－２―２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の臨床的妊娠の可能性がないと評価する工程とにより実施することができる。
【0081】
工程（Ｆ－２―２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の臨床的妊娠の可能性があると判定することもできる。
【0082】
本発明の判定方法の工程（Ｆ）においては、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、遺伝子ｃ、遺伝子ｅおよび遺伝子ｆからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象は臨床的妊娠の可能性がないと評価することができる。
【0083】
本発明の判定方法の工程（Ｆ）においてはまた、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ｂ、遺伝子ｄおよび遺伝子ｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象は臨床的妊娠の可能性がないと評価することができる。
【0084】
本発明の判定方法は、本発明の遺伝子を２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、または１６種以上のように組み合わせて実施することができ、例えば、一定数以上の種類の本発明の遺伝子の発現レベルが対照と比較して異なっている（高いまたは低い）場合に、被験対象の不妊治療による臨床的妊娠の可能性がない（あるいは可能性がある）と判定することができる。
【0085】
本発明の判定方法において、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定は、被験対象の子宮内膜組織検体の遺伝子レベルの測定に、他の臨床変数の測定を組み合わせて実施することができる。組み合わせる臨床変数としては、例えば、子宮内膜の炎症状態の観点から、子宮内膜間質におけるＣＤ１３８陽性細胞数が挙げられる。本発明の遺伝子をこのような臨床変数と組み合わせて使用することによりさらに判定精度を向上させることができる。ここで判定精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。
【0086】
本発明の判定方法によれば、被験対象の不妊治療による臨床的妊娠可能性を判定することができる。したがって、本発明の判定方法は、不妊治療による臨床的妊娠可能性の診断に補助的に用いることができ、被験対象が不妊治療による臨床的妊娠の可能性があるか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明においては、不妊治療による臨床的妊娠の可能性があると判定された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が不妊治療による臨床的妊娠の可能性があると判断することができる。すなわち、本発明の判定方法は不妊治療による臨床的妊娠可能性の診断を補助する方法あるいは不妊治療による臨床的妊娠可能性の診断を支援する方法と言い換えることができる。
【0087】
本発明の判定方法によれば、被験対象から採取された子宮内膜組織検体に基づいて定量的に不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定を行うことができる。すなわち、本発明の判定方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に不妊治療による臨床的妊娠可能性を判定できる点で有利である。このため本発明の判定方法は、不妊治療による臨床的妊娠可能性を判定するための生体試料分析方法と言い換えることができる。本発明の判定方法によればまた、不妊治療による治療を受けている患者において、不妊治療を継続するか否かの判断に活用することができる点でも有利である。
【0088】
本発明の判定方法は、上記に加えて、本発明の検出方法および予測方法の記載に従って実施することができる。
【0089】
＜＜着床過程の評価方法＞＞
本発明の第四の側面によれば、着床過程の異常を検出または予測するための、着床過程の評価方法が提供される。本発明の評価方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして、着床過程の異常を検出または予測するために、着床過程を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床過程の異常と関連づけることを特徴とする。本発明の評価方法によれば、「着床過程」における異常を検出または予測するために用いることができ、好ましくは「胚接着から胚浸潤に至る過程」における異常を検出または予測するために用いることができる。ここで、本発明において、「着床過程の異常」とは、妊娠に及ぼす悪影響をいい、典型的には胚接着が正常に行われないことや胚接着後の胚浸潤が正常に行われないことをいう。
本発明の第四の側面によれば、着床過程の異常を検出または予測するための、着床過程の評価方法が提供される。本発明の評価方法によれば、被験対象の子宮内膜組織検体中の遺伝子の発現レベルを指標にして、着床過程の異常を検出または予測するために、着床過程を評価することができる。すなわち、本発明の評価方法は、遺伝子の発現レベルを被験対象の着床過程の異常と関連づけることを特徴とする。本発明の評価方法によれば、「着床過程」における異常を検出または予測するために用いることができ、好ましくは「胚接着から胚浸潤に至る過程」における異常を検出または予測するために用いることができる。ここで、本発明において、「着床過程の異常」とは、妊娠に及ぼす悪影響をいい、典型的には胚接着が正常に行われないことや胚接着後の胚浸潤が正常に行われないことをいう。
【0090】
本発明の評価方法においては、まず、（Ｇ）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子（本発明の遺伝子）の発現レベルを測定する工程を実施することができる。遺伝子の発現レベルの測定は、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
【0091】
本発明の評価方法においては、（Ｈ）工程（Ｇ）で測定された本発明の遺伝子の発現レベルを指標にして、子宮内膜組織検体を採取した被験対象の着床過程の異常の有無を判定する工程をさらに含むことができる。
【0092】
本発明の遺伝子が遺伝子ａ、ｃ、ｅおよびｆである場合、工程（Ｈ）は、（Ｈ－１―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｈ－１－２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床過程に異常があると判定する工程とにより実施することができる。なお、本発明において「着床過程に異常がある」とは、「着床過程に異常がある可能性がある、あるいは着床過程に異常がある可能性が高い」を含む意味で用いられるものとする。
【0093】
工程（Ｈ－１－２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床過程に異常がないと判定することもできる。なお、本発明において「着床過程に異常がない」とは、「着床過程に異常がない可能性がある、あるいは着床過程に異常がない可能性が高い」を含む意味で用いられるものとする。
【0094】
本発明の遺伝子が遺伝子ｂ、ｄおよびｇである場合、工程（Ｈ）は、（Ｈ－２―１）被験対象の子宮内膜組織検体中の本発明の遺伝子の発現レベルとあらかじめ定めた参照値とを比較する工程と、（Ｈ－２―２）被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以上であるか、または参照値よりも高い場合に被験対象の着床過程に異常があると判定する工程とにより実施することができる。
【0095】
工程（Ｈ－２―２）では、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子の発現レベルが参照値以下であるか、または参照値よりも低い場合に被験対象の着床過程に異常がないと判定することもできる。
【0096】
本発明の評価方法の工程（Ｈ）においては、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ａ、遺伝子ｃ、遺伝子ｅおよび遺伝子ｆからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも低いか、あるいは該平均値と比較して約０．９倍以下、約０．８５倍以下、約０．８倍以下、約０．７５倍以下、約０．７倍以下、約０．６５倍以下、約０．６倍以下、約０．５５倍以下、約０．５倍以下、約０．４５倍以下、約０．４倍以下または約０．３５倍以下である場合に、被験対象の着床過程に異常があると判定することができる。
【0097】
本発明の評価方法の工程（Ｈ）においてはまた、例えば、被験対象の子宮内膜組織検体中における本発明の遺伝子ｂ、遺伝子ｄおよび遺伝子ｇからなる群から選択される１種または２種以上の遺伝子の発現レベルが正常対象群の当該遺伝子の発現レベルの平均値よりも高いか、あるいは該平均値と比較して約１．０５倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上である場合に、被験対象の着床過程に異常があると判定することができる。
【0098】
本発明の評価方法は、本発明の遺伝子を２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、または１６種以上のように組み合わせて実施することができる、例えば、一定数以上の種類の本発明の遺伝子の発現レベルが対照と比較して異なっている（高いまたは低い）場合に、被験対象の着床過程に異常がある（あるいは異常がない）と判定することができる。
【0099】
本発明の評価方法において、着床過程の評価は、被験対象の子宮内膜組織検体の遺伝子レベルの測定に、他の臨床変数の測定を組み合わせて実施することができる。組み合わせる臨床変数としては、例えば、子宮内膜の炎症状態の観点から、子宮内膜間質におけるＣＤ１３８陽性細胞数が挙げられる。本発明の遺伝子をこのような臨床変数と組み合わせて使用することによりさらに判定精度を向上させることができる。ここで判定精度が向上するとは、ＲＯＣ解析を利用した場合には、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）が向上することを意味する。
【0100】
本発明の評価方法によれば、被験対象の着床過程における異常の検出または予測に用いることができる。したがって、本発明の判定方法は、着床過程の異常の診断に補助的に用いることができ、被験対象が着床過程に異常を有するか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師が行うことができる。例えば、本発明においては、着床過程に異常があると評価された被験対象については、医師が他の所見を参照しつつ被験対象が着床過程に異常があると判断することができる。すなわち、本発明の評価方法は着床過程の異常の診断を補助する方法あるいは着床過程の異常の診断を支援する方法と言い換えることができる。
【0101】
本発明の評価方法によれば、被験対象から採取された子宮内膜組織検体に基づいて定量的に着床過程の評価を行うことができる。すなわち、本発明の評価方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確に着床過程における異常の検出または予測のために着床過程を評価できる点で有利である。このため本発明の評価方法は、着床過程の異常を検出または予測するための生体試料分析方法と言い換えることができる。本発明の評価方法によればまた、不妊治療による治療を受けている患者において、不妊治療を継続するか否かの判断に活用することができる点でも有利である。
【0102】
本発明の判定方法は、上記に加えて、本発明の検出方法、予測方法および判定方法の記載に従って実施することができる。
【0103】
＜＜着床能の診断マーカーおよび着床障害の予測マーカー＞＞
本発明の第五の側面によれば、本発明の遺伝子を含んでなる、着床能の診断または検出に用いるためのマーカー、着床障害の予測に用いるためのマーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのマーカーおよび着床過程の評価に用いるためのマーカーと、着床能の診断または検出に用いるためのマーカー、着床障害の予測に用いるためのマーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのマーカーおよび着床過程の評価に用いるためのマーカーとしての、本発明の遺伝子の使用が提供される。本発明において、診断マーカー、検出マーカー、予測マーカー、判定マーカーおよび評価マーカーは、その存在および量が着床能の有無の診断、着床障害の可能性の予測、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定および着床過程の評価の指標となる物質をそれぞれいい、着床能の診断や検出、着床障害の予測、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定および着床過程の評価等のためのマーカーとしてそれぞれ用いることができるものである。すなわち、本発明のマーカーによれば、本発明の遺伝子を着床能の診断もしくは検出用のマーカー、着床障害の予測用のマーカー、または不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定もしくは着床過程の評価用のマーカーとして使用することができる。
本発明の第五の側面によれば、本発明の遺伝子を含んでなる、着床能の診断または検出に用いるためのマーカー、着床障害の予測に用いるためのマーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのマーカーおよび着床過程の評価に用いるためのマーカーと、着床能の診断または検出に用いるためのマーカー、着床障害の予測に用いるためのマーカー、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのマーカーおよび着床過程の評価に用いるためのマーカーとしての、本発明の遺伝子の使用が提供される。本発明において、診断マーカー、検出マーカー、予測マーカー、判定マーカーおよび評価マーカーは、その存在および量が着床能の有無の診断、着床障害の可能性の予測、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定および着床過程の評価の指標となる物質をそれぞれいい、着床能の診断や検出、着床障害の予測、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定および着床過程の評価等のためのマーカーとしてそれぞれ用いることができるものである。すなわち、本発明のマーカーによれば、本発明の遺伝子を着床能の診断もしくは検出用のマーカー、着床障害の予測用のマーカー、または不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定もしくは着床過程の評価用のマーカーとして使用することができる。
【0104】
本発明のマーカーは、上記に加えて、本発明の検出方法、予測方法、判定方法および評価方法の記載に従って実施することができる。
【0105】
＜＜着床能の診断キットおよび着床障害の予測キット＞＞
本発明の第六の側面によれば、子宮内膜組織における本発明の遺伝子の発現レベルの定量手段を含んでなる、着床能の診断または検出に用いるためのキット、着床障害の予測に用いるためのキット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのキットおよび着床過程の評価に用いるためのキットが提供される。本発明のキットは、典型的には、本発明の検出方法、予測方法、判定方法または評価方法に従ってなされる、着床能の診断もしくは検出用のキット、着床障害の予測用のキット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定用のキットまたは着床過程の評価用のキットである。本発明の遺伝子の発現レベルの定量は、本発明の検出方法に記載の遺伝子の発現レベルの測定方法に従って実施することができる。
本発明の第六の側面によれば、子宮内膜組織における本発明の遺伝子の発現レベルの定量手段を含んでなる、着床能の診断または検出に用いるためのキット、着床障害の予測に用いるためのキット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定に用いるためのキットおよび着床過程の評価に用いるためのキットが提供される。本発明のキットは、典型的には、本発明の検出方法、予測方法、判定方法または評価方法に従ってなされる、着床能の診断もしくは検出用のキット、着床障害の予測用のキット、不妊治療による臨床的妊娠可能性の判定用のキットまたは着床過程の評価用のキットである。本発明の遺伝子の発現レベルの定量は、本発明の検出方法に記載の遺伝子の発現レベルの測定方法に従って実施することができる。
【0106】
本発明のキットは、上記に加えて、本発明の検出方法、予測方法、判定方法および評価方法の記載に従って実施することができる。
【実施例0107】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0108】
例１：ヒトの子宮内膜組織を用いた検討（１）
例１では、不妊症患者の子宮内膜組織を採取し、採取後に生殖補助医療（胚移植）を受けて妊娠した不妊患者群（対照群）と採取後に生殖補助医療（胚移植）を受けたが妊娠しなかった不妊患者群（着床障害群）の子宮内膜組織検体におけるＲＮＡ発現レベルを比較検討した。
例１では、不妊症患者の子宮内膜組織を採取し、採取後に生殖補助医療（胚移植）を受けて妊娠した不妊患者群（対照群）と採取後に生殖補助医療（胚移植）を受けたが妊娠しなかった不妊患者群（着床障害群）の子宮内膜組織検体におけるＲＮＡ発現レベルを比較検討した。
【0109】
（１）方法
ア 子宮内膜組織検体
東京大学医学部附属病院を受診している８０名の不妊症患者から、インフォームドコンセントを行った上で、不妊原因精査のために採取した着床期子宮内膜検体の一部を子宮内膜組織検体として使用した。子宮内膜組織の採取に際しては、生殖補助医療として胚移植の際に行うホルモン投与を同様に行い、ホルモン補充周期による着床期（黄体ホルモン投与７日目）の子宮内膜を採取した。また、検体採取後の生殖補助医療として不妊治療周期に行った凍結融解胚移植による臨床的妊娠の有無を追跡調査した。なお、生殖補助医療として体外受精で初期胚移植の治療を受ける患者は着床期と推定される日の４日前に胚移植を行い、生殖補助医療として胚盤胞移植の治療を受ける患者は着床期と推定される日の２日前に胚移植を行った。
ア 子宮内膜組織検体
東京大学医学部附属病院を受診している８０名の不妊症患者から、インフォームドコンセントを行った上で、不妊原因精査のために採取した着床期子宮内膜検体の一部を子宮内膜組織検体として使用した。子宮内膜組織の採取に際しては、生殖補助医療として胚移植の際に行うホルモン投与を同様に行い、ホルモン補充周期による着床期（黄体ホルモン投与７日目）の子宮内膜を採取した。また、検体採取後の生殖補助医療として不妊治療周期に行った凍結融解胚移植による臨床的妊娠の有無を追跡調査した。なお、生殖補助医療として体外受精で初期胚移植の治療を受ける患者は着床期と推定される日の４日前に胚移植を行い、生殖補助医療として胚盤胞移植の治療を受ける患者は着床期と推定される日の２日前に胚移植を行った。
【0110】
イ ＲＮＡ抽出およびＲＮＡ－Ｓｅｑ
子宮内膜組織検体からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Qiagen）を用いて行った。検体採取後の胚移植により妊娠した不妊患者群（対照群）（４３名）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった不妊患者群（着床障害群）（３７名）の計８０検体のＲＮＡ－ｓｅｑをマクロジェン・ジャパンで行った。
子宮内膜組織検体からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Qiagen）を用いて行った。検体採取後の胚移植により妊娠した不妊患者群（対照群）（４３名）と検体採取後の胚移植により妊娠しなかった不妊患者群（着床障害群）（３７名）の計８０検体のＲＮＡ－ｓｅｑをマクロジェン・ジャパンで行った。
【0111】
ウ ＲＮＡ発現量の比較解析
ＲＮＡ－Ｓｅｑで得られたＲａｗリードファイルはヒトゲノム配列（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）上にＨｉｓａｔ２ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．０を用いてアライメントし、Ｓｕｂｒｅａｄツール中のｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ機能を用いて各遺伝子座上におけるリード数をカウントした。対照群と着床障害群との発現量を比較するため、リードカウントファイルをＤＥＳｅｑ２ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１６．１に供試し、２倍以上の発現量の変化を認めた遺伝子をＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ（ＤＥＧｓ）として評価した。なお、ＥＺＨ２関連遺伝子であるＥＺＨ２およびＣＣＮＤ２は、２倍以上の発現量の変化は認められなかったが解析対象とした。そして、これらの遺伝子を、Ｅｎｒｉｃｈｒを用いて２種類のデータベース（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｏａｄｍａｐ ｐｒｏｊｅｃｔ （National Institutes of Health）、ＣｈＥＡ ２０１６）と比較した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑで得られたＲａｗリードファイルはヒトゲノム配列（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）上にＨｉｓａｔ２ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．０を用いてアライメントし、Ｓｕｂｒｅａｄツール中のｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ機能を用いて各遺伝子座上におけるリード数をカウントした。対照群と着床障害群との発現量を比較するため、リードカウントファイルをＤＥＳｅｑ２ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１６．１に供試し、２倍以上の発現量の変化を認めた遺伝子をＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ（ＤＥＧｓ）として評価した。なお、ＥＺＨ２関連遺伝子であるＥＺＨ２およびＣＣＮＤ２は、２倍以上の発現量の変化は認められなかったが解析対象とした。そして、これらの遺伝子を、Ｅｎｒｉｃｈｒを用いて２種類のデータベース（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｏａｄｍａｐ ｐｒｏｊｅｃｔ （National Institutes of Health）、ＣｈＥＡ ２０１６）と比較した。
【0112】
（２）結果
結果は、図２～５に示す通りであった。着床障害群において、対照群と比較して、ＰＲＣ２関連遺伝子の発現については、ＯＳＲ１、ＳＣＵＢＥ１、ＨＯＸＡ１３、ＭＥＧＦ１０およびＴＲＰＭ６の発現量の減少が確認されるとともに、ＰＲＣ２関連遺伝子以外の遺伝子の発現については、ＳＬＣ４６Ａ２およびＡＺＧＰ１の発現量の減少が確認された（図２）。一方で、着床障害群において、対照群と比較して、ＰＲＣ２関連遺伝子の発現については、ＳＰＩＮＫ２、ＲＳＰＯ３、ＬＧＩ２およびＭＡＬの発現量の増加が確認されるとともに、ＰＲＣ２関連遺伝子以外の遺伝子の発現については、ＢＲＩＮＰ２、ＲＤＨ１２、ＳＳＴ、ＰＥＮＫおよびＣＨＩ３Ｌ２の発現量の増加が確認された（図３）。また、着床障害群において、対照群と比較して、ＥＺＨ２関連遺伝子の発現については、ＥＺＨ２の発現量の減少およびＣＣＮＤ２の発現量の増加が確認された（図４Ａおよび図５）。さらに、着床障害群において、対照群と比較して、ＳＵＺ２遺伝子の発現については、ＳＵＺ１２の発現量の減少が確認された（図４Ｂ）。これらの結果から、いずれの遺伝子も、対照群と着床障害群との間で発現量に差異が認められ（ｐ＜０．５）、着床障害の指標となることが示された。
結果は、図２～５に示す通りであった。着床障害群において、対照群と比較して、ＰＲＣ２関連遺伝子の発現については、ＯＳＲ１、ＳＣＵＢＥ１、ＨＯＸＡ１３、ＭＥＧＦ１０およびＴＲＰＭ６の発現量の減少が確認されるとともに、ＰＲＣ２関連遺伝子以外の遺伝子の発現については、ＳＬＣ４６Ａ２およびＡＺＧＰ１の発現量の減少が確認された（図２）。一方で、着床障害群において、対照群と比較して、ＰＲＣ２関連遺伝子の発現については、ＳＰＩＮＫ２、ＲＳＰＯ３、ＬＧＩ２およびＭＡＬの発現量の増加が確認されるとともに、ＰＲＣ２関連遺伝子以外の遺伝子の発現については、ＢＲＩＮＰ２、ＲＤＨ１２、ＳＳＴ、ＰＥＮＫおよびＣＨＩ３Ｌ２の発現量の増加が確認された（図３）。また、着床障害群において、対照群と比較して、ＥＺＨ２関連遺伝子の発現については、ＥＺＨ２の発現量の減少およびＣＣＮＤ２の発現量の増加が確認された（図４Ａおよび図５）。さらに、着床障害群において、対照群と比較して、ＳＵＺ２遺伝子の発現については、ＳＵＺ１２の発現量の減少が確認された（図４Ｂ）。これらの結果から、いずれの遺伝子も、対照群と着床障害群との間で発現量に差異が認められ（ｐ＜０．５）、着床障害の指標となることが示された。
【0113】
例２：ヒトの子宮内膜組織を用いた検討（２）
例２では、着床期のヒト子宮内膜組織において、ＰＲＣ２の構成分子の一つであるＥＺＨ２の発現レベルについて検討した。
例２では、着床期のヒト子宮内膜組織において、ＰＲＣ２の構成分子の一つであるＥＺＨ２の発現レベルについて検討した。
【0114】
着床期のヒト子宮内膜に対してＥＺＨ２抗体を用いて免疫染色した結果、主に子宮内膜腺上皮でＥＺＨ２の発現が確認され、子宮内膜管腔上皮や間質でも弱い発現が認められた（図６）。
【0115】
例３：遺伝子改変マウスを用いた検討（１）
例３では、着床期の女性ホルモン動態がヒトと類似しているマウスを使用して、着床期子宮におけるＥｚｈ２の発現パターンを検討した。
例３では、着床期の女性ホルモン動態がヒトと類似しているマウスを使用して、着床期子宮におけるＥｚｈ２の発現パターンを検討した。
【0116】
ヒトの子宮は単角であるのに対しマウスの子宮は双角であるという構造的な違いがあるものの、着床時期において重要な性ステロイドホルモンのエストラジオール－１７β（Ｅ２）、プロゲステロン（Ｐ４）の動態はヒトとマウスで類似している（図７）。また、ヒトとマウスでは、排卵から着床までの期間が近いことや、胎盤を構成する主たる細胞である栄養膜細胞（トロホブラスト）が子宮内膜に激しく浸潤することが両者で共通した特徴といえる。
【0117】
図８にマウスの着床過程の概要を示す。妊娠４日目に胚盤胞の活性化が起こり、深夜には子宮への胚接着反応が始まり、その刺激が子宮内膜管腔上皮から間質へと伝わり、子宮内膜間質では脱落膜化が始まる。同時期に、子宮内膜のくぼみ状の構造（クリプト（crypt））の形成が始まり、その底付近に胚が見られる。妊娠５日目以降に管腔上皮が消失し、栄養膜細胞（トロホブラスト）が間質内に浸潤する。その後、トロホブラストによる胎盤形成が進む段階で、子宮内膜間質細胞の脱落膜化が進む。妊娠８日目には脱落膜化が完成し、胎盤形成へとつながる。本明細書中のマウスを用いた実施例では、主に着床期（妊娠６日目）に着目し検討を進めた。
【0118】
野生型マウス（ＷＴ）としてＣ５７ＢＬ／６マウスの雌（７～１２週齢）を妊孕性のある雄（ＷＴ）と交配させて妊娠させた。ここで、腟栓を認めた日（妊娠した日）を「１日目」とした（本明細書の実施例において「Ｘ日目」と記載する場合は腟栓を認めた日以降のＸ日目を指す。また、「Ｘ日目」は「妊娠Ｘ日目」と同義である。）。そして、ＷＴの「１日目」、「４日目」、「６日目」および「８日目」における着床部位の子宮のＥｚｈ２の発現解析を免疫染色により行った。
【0119】
「１日目」では子宮内膜上皮（図９Ａ）、「４日目」では子宮内膜上皮・間質いずれでも発現し（図９Ｂ）、「６日目」では子宮内膜間質（脱落膜）および胚で発現し（図９Ｃ）、「８日目」では血管側の子宮内膜間質（脱落膜）に発現していることがそれぞれ確認された（図９Ｄ）。この結果から、Ｅｚｈ２はマウス着床期子宮に発現するとともに、妊娠時期により発現部位が変化することが示された。
【0120】
例４：遺伝子改変マウスを用いた検討（２）
例４以降では、Ｅｚｈ２を子宮選択的にノックアウトしたマウスを用いて、子宮で発現しているＥｚｈ２が妊娠に及ぼす影響を検討した。
例４以降では、Ｅｚｈ２を子宮選択的にノックアウトしたマウスを用いて、子宮で発現しているＥｚｈ２が妊娠に及ぼす影響を検討した。
【0121】
子宮のＥｚｈ２を選択的にノックアウトしたマウスをＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムを用いて次の手順で作製した。Ｅｚｈ２－ｌｏｘＰマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）とＰｇｒ－Ｃｒｅマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９ＳＶ）を交配させて、子宮のＥｚｈ２を選択的にノックアウトしたマウス（Ｅｚｈ２ ｕＫＯ）を作製した。Ｅｚｈ２ ｕＫＯに対するＣｒｅ陰性の同腹仔を対照マウス（Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌ）として使用した。また、野生型マウス（ＷＴ）としてＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを使用した（交配用の雄マウスとＥｚｈ２発現解析用の雌マウス）。
【0122】
Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌと比較して、４日目の子宮では子宮内膜上皮および間質のいずれにおいても明らかにＥｚｈ２の発現が低下しており（図１０Ａ）、５日目の子宮着床部位のウエスタンブロットにおいてもＥｚｈ２の発現が顕著に低下してることが確認された（図１０Ｂ）。また、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは完全不妊とはならないものの、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌと比較して、産仔数が減少することも確認された（図１１Ａ）。さらに、「１９日目」において帝王切開を行うと、妊娠後期においてＥｚｈ２ ｕＫＯの胚成長に異常は認められなかったが、「１９日目」の胎仔数は産仔数と同様に減少したが（図１１Ｂ）、Ｅｚｈ２ ｕＫＯにおける子宮内胎児死亡の増加は認められなかった（図１１Ｃ）。また、Ｅｚｈ２ ｕＫＯの胚盤胞の形態、数にも異常は認められなかった（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果から、Ｅｚｈ２ ｕＫＯにおいて、排卵、着床前の胚発生は正常であることが示された。
【0123】
一方で、ＷＴマウスの「４日目」の子宮内膜では、通常、管腔上皮の細胞増殖が止まり、間質の細胞増殖が亢進する増殖分化スイッチング（ＰＤＳ：proliferation-differentiation switching）が起こる。しかしながら、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７の免疫染色の結果、Ｅｚｈ２ ｕＫＯの子宮では子宮内膜管腔上皮の細胞増殖が抑制されず持続していることが確認された（図１２Ｃ）。
【0124】
例５：遺伝子改変マウスを用いた検討（３）
子宮と胚との接着反応が起こる「５日目」において、シカゴブルー色素を尾静脈注射すると着床部位が青く染まることを利用し、胚接着部位の数を調べた。青染部分の数はＥｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯとで差は確認されなかった（図１３）。
子宮と胚との接着反応が起こる「５日目」において、シカゴブルー色素を尾静脈注射すると着床部位が青く染まることを利用し、胚接着部位の数を調べた。青染部分の数はＥｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯとで差は確認されなかった（図１３）。
【0125】
次に胚の子宮内膜間質への浸潤や、子宮内膜間質の脱落膜化が認められる「６日目」において、「５日目」と同様にシカゴブルー色素を投与したが、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯでは着床部位数の差は確認されなかった（図１４）。
【0126】
一方で、通常、「６日目」では胚周囲の子宮内膜管腔上皮が消失し、トロホブラストの浸潤が認められるが、ＨＥ染色およびＣＫ８免疫染色の結果から、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは、胚周囲の子宮内膜管腔上皮が残存し、上皮の形態が鋸歯状を示し、トロホブラストの浸潤が認められない（あるいは乏しい）ことが確認された（図１５ＡおよびＢ）。また、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯの着床部位において胚周囲の子宮内膜管腔上皮が消失している割合を調べると、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは約８０％で子宮内膜管腔上皮が残存していた（図１５Ｃ）。Ｅｚｈ２ ｕＫＯにおいて「６日目」における子宮内膜管腔上皮の残存の割合と分娩時の産仔数減少の割合がほぼ一致しており、「６日目」において子宮内膜管腔上皮が残存し胚浸潤障害が起こることが妊孕能低下の主な要因であることが示唆された。
【0127】
また、着床部位の凍結切片をＨＥ染色し、着床後の胚の発育を評価したところ、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは約８０％の着床部位で胚発育が障害され着床障害が起こっており（図１６ＡおよびＢ）、その頻度は「６日目」における胚浸潤障害、産仔数減少の表現型と同等と考えられた。
【0128】
例６：遺伝子改変マウスを用いた検討（４）
「６日目」の着床部位について、組織透明化・３次元画像構築技術を用いて可視化した。通常、「６日目」の着床部位では、胚、子宮内膜管腔の陥凹（クリプト（crypt））、クリプトへ通じる子宮内膜腺から成る着床チャンバー（implantation chamber）が形成される。Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌではクリプトが深く形成され、クリプトの胚付近の領域へ向けて腺管構造が伸びており、正常な所見であった。一方、Ｅｚｈ２ ｕＫＯではクリプトの形成やそれを取り囲む脱落膜化した子宮内膜間質、クリプトへ向かう腺管構造の形成が乏しく、着床チャンバーの形成が不十分であることが確認された（図１７）。
「６日目」の着床部位について、組織透明化・３次元画像構築技術を用いて可視化した。通常、「６日目」の着床部位では、胚、子宮内膜管腔の陥凹（クリプト（crypt））、クリプトへ通じる子宮内膜腺から成る着床チャンバー（implantation chamber）が形成される。Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌではクリプトが深く形成され、クリプトの胚付近の領域へ向けて腺管構造が伸びており、正常な所見であった。一方、Ｅｚｈ２ ｕＫＯではクリプトの形成やそれを取り囲む脱落膜化した子宮内膜間質、クリプトへ向かう腺管構造の形成が乏しく、着床チャンバーの形成が不十分であることが確認された（図１７）。
【0129】
例７：遺伝子改変マウスを用いた検討（５）
「６日目」において、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌおよびＥｚｈ２ ｕＫＯ子宮の着床部位を使用し、抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）し、抽出したＤＮＡに対し、ＣｈＩＰ－ｓｅｑを行った。そして、「６日目」の子宮着床部位のＲＮＡ－ｓｅｑでＥｚｈ２ ｕＫＯにおいて発現量が増加している遺伝子におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の状態をＥｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯとで比較した。
「６日目」において、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌおよびＥｚｈ２ ｕＫＯ子宮の着床部位を使用し、抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）し、抽出したＤＮＡに対し、ＣｈＩＰ－ｓｅｑを行った。そして、「６日目」の子宮着床部位のＲＮＡ－ｓｅｑでＥｚｈ２ ｕＫＯにおいて発現量が増加している遺伝子におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の状態をＥｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌとＥｚｈ２ ｕＫＯとで比較した。
【0130】
ＲＮＡ－ｓｅｑにおいて発現量が増加した遺伝子群についてＨ３Ｋ２７ｍｅ３の状態を比較すると、Ｅｚｈ２ ｕＫＯではＥｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌと比較して、各遺伝子の５’側上流におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾が有意に低下していることが確認された（図１８Ａ：Ｔａｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｌｏｔ、図１８Ｂ：Ｈｅａｔｍａｐ）。また、ＲＮＡ－ｓｅｑにおいてＥｚｈ２ ｕＫＯで細胞周期に関与するＣｃｎｄ２、Ｃｄｋｎ２ｂの発現が増加していたことから、特にＣｃｎｄ２、Ｃｄｋｎ２ｂの遺伝子領域におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の状態を解析すると、各遺伝子の転写開始点付近の領域においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３の低下が確認された（図１８Ｃ）。これらの結果から、Ｅｚｈ２がＨ３Ｋ２７ｍｅ３を制御し、細胞周期に関わる遺伝子発現を調節していることが示された。
【0131】
また、「６日目」の子宮におけるＣｃｎｄ２およびＣｄｋｎ２ｂのｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより比較検討すると、ＲＮＡ－Ｓｅｑの結果と一致し、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは、Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌと比較して、細胞周期に関連するＣｃｎｄ２およびＣｄｋｎ２ｂのｍＲＮＡ発現量が増加していることが確認された（図１９Ａ）。一方、これらの遺伝子との関連が強いＣｄｋ４、Ｃｄｋ６およびＣｄｋｎ１ａのｍＲＮＡ発現量はＣｄｋ４がやや増加するのみであった（図１９Ｂ）。
【0132】
これらの結果および例１の結果（図５）から、子宮内膜組織におけるＣｃｎｄ２の発現量の増加が着床能の検出や着床障害の予測指標となり得ることが示された。
【0133】
例８：遺伝子改変マウスを用いた検討（６）
Ｅｚｈ２ ｕＫＯ子宮における細胞周期の状態について、Ｓ期を検出するためのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み能の解析、および、Ｇ２からＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）の免疫染色を行った。
Ｅｚｈ２ ｕＫＯ子宮における細胞周期の状態について、Ｓ期を検出するためのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み能の解析、および、Ｇ２からＭ期のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）の免疫染色を行った。
【0134】
Ｅｚｈ２ ｕＣｏｎｔｒｏｌでは脱落膜化した子宮内膜間質に一致する範囲においてｐＨＨ３の発現が認められず、Ｅｚｈ２ ｕＫＯではｐＨＨ３が発現していない領域が明らかに小さいことが確認された一方で（図２０上）、ＢｒｄＵの発現領域は両者で差は認められなかった（図２０下）。これらの結果から、脱落膜化した子宮内膜間質では、通常はＧ２からＭ期の移行が停止することにより、細胞分裂せず分化へと向かうが、これらの結果からＥｚｈ２ ｕＫＯでは細胞分裂が止まらず、細胞分化が起こりにくい状態にあると推察された。
【0135】
子宮内膜間質細胞が妊娠によって分化してできた脱落膜細胞ではサイズの大きい倍数体の細胞が多くみられ、細胞増殖が停止して生理的な機能は低下しながらも維持されている終末分化の状態（細胞老化という状態）となることが知られている。そこで、「８日目」において細胞老化のマーカーであるＳＡ－β－ｇａｌ（senescence-associated beta-galactosidase）染色を行ったところ、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは脱落膜化した子宮内膜間質における細胞老化が減弱していることが確認された（図２１）。これらの結果から、Ｅｚｈ２ ｕＫＯでは子宮内膜間質の細胞周期の異常により終末分化が進まず、最終的に脱落膜化不全による機能不全が起こっていると推察された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】