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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023137455
(43)【公開日】2023-09-29
(54)【発明の名称】核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20230922BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022043676
(22)【出願日】2022-03-18
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行日：２０２１年８月３１日、刊行物：医療検査と自動化 日本医療検査科学会第５３回大会 抄録集、ＶＯＬ．４６、４号（通算第２５９号）、 （２）開催日：２０２１年１０月８日、集会名、開催場所：日本医療検査科学会第５３回大会、パシフィコ横浜・会議センター、（３）ウェブサイトの掲載日：２０２１年１０月２２日、ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｊｃｌｓ．ｏｒ．ｊｐ／２０２１／１０／１３／ｏｎｄｅｍａｎｄ／
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000006747
【氏名又は名称】株式会社リコー
(71)【出願人】
【識別番号】596175810
【氏名又は名称】公益財団法人かずさＤＮＡ研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001634
【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】米川 侑希
(72)【発明者】
【氏名】海野 洋敬
(72)【発明者】
【氏名】中澤 聡
(72)【発明者】
【氏名】季 雨農
(72)【発明者】
【氏名】糸賀 栄
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QS25
(57)【要約】
【課題】正確な検出限界及び定量限界を把握することができる核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法を提供する。
【解決手段】核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法では、特定の構成を有する容器を用いて、標的核酸を含まない陰性検体をポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬をネガティブコントロール群及びポジティブコントロール群に添加して、標的核酸の増幅を行う増幅工程と、ネガティブコントロール群では、標的核酸が検出されない場合に、ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、を含む。
［数１］
【選択図】なし
【解決手段】核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法では、特定の構成を有する容器を用いて、標的核酸を含まない陰性検体をポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬をネガティブコントロール群及びポジティブコントロール群に添加して、標的核酸の増幅を行う増幅工程と、ネガティブコントロール群では、標的核酸が検出されない場合に、ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、を含む。
［数１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法であって、
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む、決定方法。
（式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。）
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む、決定方法。
【数1】
【請求項2】
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも３つが１以上１００未満である、請求項１に記載の決定方法。
【請求項3】
前記ポジティブコントロール群は、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを５以上有する、請求項１又は２に記載の決定方法。
【請求項4】
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも５つが１以上１００未満である、請求項３に記載の決定方法。
【請求項5】
前記陰性検体が健常者の核酸抽出液である、請求項１～４のいずれか一項に記載の決定方法。
【請求項6】
前記容器は、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有する検量線作成用ウェル群を更に有し、
前記検量線作成用ウェル群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、請求項１～５のいずれか一項に記載の決定方法。
前記検量線作成用ウェル群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、請求項１～５のいずれか一項に記載の決定方法。
【請求項7】
前記標的核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれている、請求項１～６のいずれか一項に記載の決定方法。
【請求項8】
前記細胞が酵母である、請求項７に記載の決定方法。
【請求項9】
前記細胞が、インクジェット法により吐出されたものである、請求項７又は８に記載の決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の性能に関する国際標準化機構（ＩＳＯ）による規格が制定されている。ＩＳＯ１５１８９やＩＳＯ１７０２５では、測定に用いる設備の妥当性や性能を維持しているかを示すことや、その維持及び管理が求められている。この要求に対して、例えば、特許文献１及び２には、分析装置の精度管理方法が開示されている。
【0003】
また、ＩＳＯ２０３９５では、性能として検出限界の設定が要求されており、既存の遺伝子検査製品には、最低検出感度の記載が義務付けられている。
【0004】
ＰＣＲにおいて、特に１０００コピー以下等の低コピー数における性能は、ポアソン分布の影響で正確に評価することができない。それにもかかわらず、既存の遺伝子検査製品では、ポアソン分布の影響が顕著になる１００コピー以下のコピー数が最低検出感度として記載されている。これらの最低検出感度は、各機関の自己認証値を記載しており、客観的に正確な最低検出感度を評価することができていないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、正確な検出限界及び定量限界を把握することができる核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法は、
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む。
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む。
【0007】
【数1】
【0008】
（式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。）
【発明の効果】
【0009】
上記態様の決定方法によれば、正確な検出限界及び定量限界を把握することができる核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本実施形態の決定方法で用いられる容器の一例を示す図である。
【図2】ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数と変動係数ＣＶとの関係を示すグラフである。
【図3】電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図4】ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図6】（ａ）は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。（ｂ）は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。
【図7】（ａ）～（ｃ）は、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図8】ウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置の一例を示す概略図である。
【図9】ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。
【図10】液滴形成装置の一例を示す模式図である。
【図13】液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図14】液滴形成装置の変形例を示す模式図である。
【図15】液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図16】（ａ）及び（ｂ）は、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図17】粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。
【図18】液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図19】液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。
【図20】マイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法の一例を示す模式図である。
【図21】吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法の一例を示す模式図である。
【図22】確率Ｐ（≧２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。
【図23】実験例１における標的核酸及び内在性コントロール遺伝子の検量線を示すグラフである。
【図24】実験例１における標的核酸の検量線及び陰性検体存在下で測定したポジティブコントロール群の測定結果を示すグラフである。
【図25】実験例２における標的核酸及び内在性コントロール遺伝子の検量線を示すグラフである。
【図26】実験例２における標的核酸の検量線及び陰性検体存在下で測定したポジティブコントロール群の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の一実施形態に係る核酸検出検査における検出限界の決定方法（以下、単に「本実施形態の決定方法」と称する場合がある）について、必要に応じて特定の実施形態及び図面を参照して説明する。かかる実施形態及び図面は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれる。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
【0012】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【0013】
≪核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法≫
本実施形態の決定方法は、核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法であって、標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いる方法である。
本実施形態の決定方法は、核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法であって、標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いる方法である。
【0014】
本実施形態の決定方法は、以下の工程を含む。
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程；及び
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む。
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程；及び
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む。
【0015】
【数2】
【0016】
（式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。）
【0017】
従来の核酸検出検査では、当該核酸検出検査における検出限界及び定量限界が正確に把握されていなかったことから、陰性と判定された検体の中に偽陰性である検体が存在する虞があった。これに対して、本実施形態の決定方法によれば、当該核酸検出検査における検出限界及び定量限界を正確に把握することができる。そのため、当該核酸検出検査において検出限界より低い値が検出された場合、或いは、定量限界より低い値が検出された場合に、当該検体を陰性と判定せずに、当該核酸検出検査よりも検出限界又は定量限界が低く、より正確な判定を行うことができる核酸検出検査に回すことができ、偽陰性を見落とすリスクを低減することができる。
よって、本実施形態の決定方法は、核酸検出検査に供する検体における偽陰性発生の抑制方法ということもできる。
よって、本実施形態の決定方法は、核酸検出検査に供する検体における偽陰性発生の抑制方法ということもできる。
【0018】
なお、本明細書における「核酸検出検査」としては、標的核酸を検出する検査を対象としており、その検査手法は特に限定されない。標的核酸が特定の遺伝子である場合には、遺伝子検査ということもできる。核酸検出検査としては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（新型コロナウイルス）の検出検査等の感染症検査；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子変異の検出検査等のがん検査；ノロウイルス等の病原体遺伝子の検出検査、食品における組換え遺伝子の検出検査（すなわち、遺伝子組換え食品の検出検査）等の食品検査；マイコプラズマ等の病原体遺伝子の検出検査等の再生医療用製品における品質管理検査等が挙げられる。
【0019】
本明細書における「検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬＯＤ）」とは、特定の核酸検出検査において検出できる最小量（値）のことである。検出下限ともいう。
【0020】
また、本明細書における「定量限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ；ＬＯＱ）」とは、特定の核酸検出検査において定量が可能な最小量（値）のことである。定量下限ともいう。
【0021】
次いで、本実施形態の決定方法における各工程について以下に詳細を説明する。
【0022】
＜増幅工程＞
増幅工程では、前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う。
増幅工程では、前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う。
【0023】
ポジティブコントロール群に添加される陰性検体としては、標的核酸を含まないものであればよく、例えば、感染症検査やがん検査では、健常者の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）抽出液等が挙げられる。或いは、食品検査の場合には、病原体遺伝子を含まない食品からの核酸抽出液や、遺伝子組み換え体ではない食品からの核酸抽出液等が挙げられる。或いは、再生医療用製品における品質管理検査では、病原体遺伝子を含まない再生医療用製品（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の幹細胞やその細胞塊）からの核酸抽出液等が挙げられる。
【0024】
標的核酸の増幅方法としては、公知の核酸増幅方法を用いることができ、具体的には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。試薬としては、これら公知の増幅方法において一般的に用いられるものを適宜選択して使用する。
【0025】
ＰＣＲ法は、標的核酸にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」と称する場合がある）を用いて行う。ＰＣＲ法としては、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が好ましい。定量ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等が挙げられる。
【0026】
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによる増幅を経時的（リアルタイム）に測定することで、増幅効率に基づいて鋳型核酸を定量するものである。定量は蛍光色素を用いて行われ、主に、インターカレーション法とハイブリダイゼーション法が存在する。
【0027】
インターカレーション法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発するインターカレーターの存在下で鋳型核酸の増幅反応を行う。インターカレーターとしては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＣＡＳ番号：１６３７９５－７５－３）又はその誘導体が挙げられる。一方、ハイブリダイゼーション法ではＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる方法が最も一般的であり、対象核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光物質及び消光物質を結合させたプローブが用いられる。
【0028】
デジタルＰＣＲは、限界希釈（各微小区画にターゲットＤＮＡが１又は０となるような希釈）したサンプルＤＮＡを微小区画内に分散させてＰＣＲ増幅を行い、微小区画ごとに増幅産物の有無を検出し、コピー数の絶対量を定量するものである。
【0029】
ＵＣＡＮ法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるＩＣＡＮ法を応用した方法である。ＵＣＡＮ法では、プライマー前駆体としてＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド（ＤＲＤ）を用いる。このＤＲＤプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の複製が起こらないように、３’末端のＤＮＡが修飾されており、ＳＮＰサイトにＲＮＡ部分が結合するように設計されている。このＤＲＤプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、ＤＲＤプライマーと標的核酸が完全にマッチしている場合のみ、共存するＲＮａｓｅ Ｈが対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー３’末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと標的核酸がマッチしない場合、ＲＮａｓｅ ＨはＤＲＤプライマーを切断せず、標的核酸の増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたＤＲＤプライマー前駆体がＲＮａｓｅ Ｈによって切断された後の増幅反応は、ＩＣＡＮ反応メカニズムによって進行する。
【0030】
ＬＡＭＰ法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的核酸の６箇所の領域（３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を用いて増幅する。
【0031】
＜決定工程＞
決定工程では、ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合、ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定する。
決定工程では、ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合、ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定する。
【0032】
決定工程において、検出率は、各特定コピー数において、以下の式を用いて算出することができる。式中、「ＵＤ」とは、Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（非検出）を意味する。すなわち、「ＵＤ数」とは標的核酸が検出されなかったウェル数を意味する。
【0033】
式： （検出率（％））＝｛１－（ＵＤ数）÷（測定数）｝×１００
【0034】
例えば、ＲＮＡ１コピー、２コピー、及び３コピーからなるポジティブコントロール群において、ＲＮＡ１コピーでの検出率が９０％、ＲＮＡ２コピーでの検出率が１００％、ＲＮＡ３コピーでの検出率が１００％であった場合に、ＲＮＡ２コピーを検出限界と決定する。
【0035】
また、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する。なお、「ＣＶｌｎ」は、標的核酸の増幅反応において反復して測定された濃度により予測される、対数正規分布データの変動係数である。
【0036】
【数3】
【0037】
（式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。）
【0038】
例えば、ＲＮＡ１コピー、２コピー、及び３コピーからなるポジティブコントロール群において、ＲＮＡ１コピーでのＣＶｌｎが５０％、ＲＮＡ２コピーでのＣＶｌｎが３３％、ＲＮＡ３コピーでのＣＶｌｎが３０％であった場合に、ＲＮＡ２コピーを定量限界と決定する。
【0039】
なお、上記検出限界及び定量限界の算出方法は、参考文献１（Forootan A et al., “Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).”, Biomol Detect Quantif., Vol. 12, pp. 1-6, 2017.）に記載の方法を参照している。
【0040】
本実施形態の決定方法で用いられる容器について、以下に詳細を説明する。
【0041】
＜容器＞
図１は、本実施形態の決定方法で用いられる容器の一例を示す図である。
容器１は、標的核酸を含まない１以上のウェル２からなる、ネガティブコントロール群３と、特定コピー数の標的核酸を含むウェル４からなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群５と、を有する。
図１は、本実施形態の決定方法で用いられる容器の一例を示す図である。
容器１は、標的核酸を含まない１以上のウェル２からなる、ネガティブコントロール群３と、特定コピー数の標的核酸を含むウェル４からなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群５と、を有する。
【0042】
ネガティブコントロール群３において、標的核酸を含まない、すなわち、標的核酸のコピー数が０であるウェル数は、１以上であり、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上とすることができる。中でも、検出限界の決定工程における精度を高める観点から、標的核酸のコピー数が０であるウェルを４以上有することが好ましく、１０以上有することがより好ましい。一方で、標的核酸のコピー数が０であるウェル数の上限値は、特に限定されず、容器が有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
【0043】
図１において、標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを４種類有する場合（ウェル４ａ、４ｂ、４ｃ、及び４ｄ）を例示したが、ポジティブコントロール群５において、標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェル数は、３以上であり、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上とすることができる。一方で、標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェル数の上限値は、特に限定されず、容器が有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
【0044】
ポジティブコントロール群５において、標的核酸の特定コピー数が互いに同一であるウェルを、例えば、それぞれ１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上有することができる。中でも、決定工程における精度を高める観点から、特定コピー数が同一である標的核酸を含むウェルを４以上有することが好ましく、１０以上有することがより好ましい。
一方で、ポジティブコントロール群５において、特定コピー数が互いに同一である標的核酸を含むウェルの上限値は、特に限定されず、容器が有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
一方で、ポジティブコントロール群５において、特定コピー数が互いに同一である標的核酸を含むウェルの上限値は、特に限定されず、容器が有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
【0045】
標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも５つは、１以上１００未満であり、当該コピー数は、１以上１００未満の範囲内で適宜設定することができるが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０等とすることができる。
【0046】
図１において図示していないが、容器１は、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有する検量線作成用ウェル群を更に有することができる。なお、検量線作成用ウェル群は、上記陰性検体を含まない。これにより、標的核酸の正確な検量線を作成して、ポジティブコントロール群の標的核酸における陰性検体による阻害効果を評価することができ、定量下限をより正確に決定することができる。
【0047】
検量線作成用ウェル群において、標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェル数は、３以上であり、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上とすることができる。一方で、検量線作成用核酸の特定コピー数が互いに異なるウェル数の上限値は、特に限定されず、デバイスが有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
【0048】
検量線作成用ウェル群において、標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満であり、当該コピー数は、１以上１００未満の範囲内で適宜設定することができるが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０等とすることができる。
【0049】
ポジティブコントロール群における標的核酸の特定コピー数及び検量線作成用ウェル群における標的核酸の特定コピー数は互いに同一であってもよく、互いに異なっていてもよいが、中でも、互いに異なっていることが好ましい。
また、ポジティブコントロール群における標的核酸の特定コピー数及び検量線作成用ウェル群における標的核酸の特定コピー数は互いに異なっている場合に、ポジティブコントロール群における１つの標的核酸の特定コピー数をＸ１、互いに異なり、且つ、隣接するコピー数である検量線作成用ウェル群における２つの標的核酸の特定コピー数それぞれＹ１及びＹ２としたとき、Ｘ１、Ｙ１及びＹ２は、式：Ｙ１＜Ｘ１＜Ｙ２で表される関係であることがより好ましい。
ポジティブコントロール群における標的核酸の特定コピー数及び検量線作成用ウェル群における標的核酸の特定コピー数が上記関係であることで、ポジティブコントロール群の標的核酸における陰性検体による阻害効果をより正確に評価することができ、定量下限をより正確に決定することができる。
また、ポジティブコントロール群における標的核酸の特定コピー数及び検量線作成用ウェル群における標的核酸の特定コピー数は互いに異なっている場合に、ポジティブコントロール群における１つの標的核酸の特定コピー数をＸ１、互いに異なり、且つ、隣接するコピー数である検量線作成用ウェル群における２つの標的核酸の特定コピー数それぞれＹ１及びＹ２としたとき、Ｘ１、Ｙ１及びＹ２は、式：Ｙ１＜Ｘ１＜Ｙ２で表される関係であることがより好ましい。
ポジティブコントロール群における標的核酸の特定コピー数及び検量線作成用ウェル群における標的核酸の特定コピー数が上記関係であることで、ポジティブコントロール群の標的核酸における陰性検体による阻害効果をより正確に評価することができ、定量下限をより正確に決定することができる。
【0050】
検量線作成用ウェル群において、特定コピー数が同一である標的核酸を含むウェルを、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上有することができる。中でも、標的核酸の定量値の不確かさの精度を高める観点から、特定コピー数が同一である標的核酸を含むウェルを、以上有することが好ましい。
一方で、検量線作成用ウェル群において、特定コピー数が同一である標的核酸を含むウェル数の上限値は、特に限定されず、デバイスが有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
一方で、検量線作成用ウェル群において、特定コピー数が同一である標的核酸を含むウェル数の上限値は、特に限定されず、デバイスが有するウェル数に応じて適宜設定することができるが、例えば、２０、１５、１０等とすることができる。
【0051】
［特定コピー数］
本明細書において、ウェル内に存在する核酸のコピー数が特定されているとは、ウェル内に存在する核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際にウェル内に存在する核酸の数が既知であるということができる。
つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
本明細書において、ウェル内に存在する核酸のコピー数が特定されているとは、ウェル内に存在する核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際にウェル内に存在する核酸の数が既知であるということができる。
つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数（算出推定値）よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、１，０００以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
【0052】
制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数ＣＶが平均コピー数ｘに対し、ＣＶ＜１／√ｘ又はＣＶ≦２０％のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。
【0053】
ここで、核酸の「コピー数」と「分子数」が対応付けられる場合もある。具体的には、例えば、核酸（１本鎖）の塩基配列をゲノム上の２箇所に導入したＧ１期の酵母菌の場合、酵母菌数＝１なら核酸分子数（同一の染色体数）＝１、核酸のコピー数＝２となる。本明細書においては、核酸の特定コピー数を核酸の絶対数という場合がある。
【0054】
本実施形態の決定方法において、標的核酸を含む反応空間（以下、「ウェル」と称する場合もある）が複数存在する場合、各ウェル内に含まれる各核酸のコピー数が同一であるとは、各核酸を反応空間に充填する際に生じる、核酸の数のばらつきが許容範囲内であることを意味する。核酸の数のばらつきが許容範囲内にあるか否かについては、以下に示す不確かさの情報に基づいて判断することができる。
【0055】
核酸の特定コピー数に関する情報としては、例えば、不確かさの情報、核酸の情報等が挙げられる。
【0056】
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語－基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
【0057】
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。すなわち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器等に起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。不確かさは、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値であってもよい。
【0058】
不確かさは、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９８－３）及びＪａｐａｎ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏａｒｄ Ｎｏｔｅ １０試験における測定の不確かさに関するガイドライン等に基づいて算出することができる。
【0059】
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値等の統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報等から得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
【0060】
不確かさは、操作及び測定等の要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
【0061】
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。続いて、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
【0062】
不確かさの情報としては、ウェルに充填される核酸の変動係数を用いてもよい。変動係数とは、例えば、核酸をウェルに充填する際に生じる各ウェルに充填される核酸の数のばらつきの相対値を意味する。すなわち、変動係数とは、核酸に充填した核酸の数の充填精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値ｘで除した値である。ここでは、標準偏差σを平均コピー数（平均充填コピー数）ｘで除した値を変動係数ＣＶとすると、下記式１の関係式になる。
【0063】
【数4】
【0064】
一般的に、核酸は試料中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、すなわち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、平均コピー数ｘと下記式２の関係式を満たすとみなすことができる。これより、核酸を含む試料を段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと平均コピー数ｘとから平均コピー数ｘの変動係数ＣＶ（ＣＶ値）を、上記式１及び下記式２から導出された下記式３を用いて求めると、表１及び図２に示すようになる。ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数の変動係数のＣＶ値は図２から求めることができる。
【0065】
【数5】
【0066】
【数6】
【0067】
【表1】
【0068】
表１及び図２の結果から、例えば、ウェルに１００コピー数の核酸を段階希釈法により充填する場合には、最終的にウェルに充填される核酸のコピー数はその他の精度を無視しても、少なくとも１０％の変動係数（ＣＶ値）を持つことがわかる。
【0069】
核酸のコピー数は、変動係数のＣＶ値と、核酸の平均特定コピー数ｘとが、次式、ＣＶ＜１／√ｘを満たすことが好ましく、ＣＶ＜１／２√ｘを満たすことがより好ましい。
【0070】
不確かさの情報としては、核酸を含むウェルが複数存在する場合、ウェルに含まれる核酸の特定コピー数に基づく、ウェル全体としての不確かさの情報を用いることが好ましい。
【0071】
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、核酸を細胞に導入して当該細胞をウェルに計数及び分注する場合には、細胞内の核酸の数（例えば、細胞の細胞周期等）、細胞をウェルに配置する手段（インクジェット装置、インクジェット装置の動作のタイミングを制御する装置等の各部位の動作による結果を含む。例えば、細胞懸濁液を液滴化した時の液滴に含まれる細胞数等）、細胞がウェルの適切な位置に配置された頻度（例えば、ウェル内に配置された細胞数等）、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより核酸Ａが細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション（夾雑物の混入、以下、「コンタミ」という場合がある。）等が挙げられる。
【0072】
核酸の情報としては、例えば、核の特定コピー数に関する情報が挙げられる。核酸の特定コピー数に関する情報としては、例えば、ウェルに含まれる核酸の特定コピー数の不確かさの情報等が挙げられる。
【0073】
本実施形態の決定方法において、標的核酸の特定コピー数のばらつきは、標的核酸の特定コピー数のばらつきと同等以下であることが好ましい。これにより、より高い精度で、核酸検出検査における検出限界を把握することができる。
【0074】
［標的核酸］
一般に、核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。
一般に、核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【0075】
標的核酸は、核酸断片であってもよいし、細胞の核中に組み込まれていてもよいが、細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。よって、標的核酸は、細胞から抽出された状態で用いられる。すなわち、標的核酸は、それぞれ細胞から抽出された核酸であることが好ましい。
【0076】
標的核酸は、生物から得られる天然物であってもよく、その加工物であってもよく、遺伝子組換え技術を利用して製造されたものであってもよく、化学的に合成された人工合成核酸であってもよい。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0077】
標的核酸の配列は、真核生物、原核生物、多細胞生物、単細胞生物のいずれの生物に由来する配列であってもよい。真核生物としては、例えば、動物、昆虫、植物、真菌、藻類、原生動物等が挙げられる。動物としては、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類等の脊椎動物であることが好ましい。
脊椎動物の中でも、哺乳類であることがより好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
中でも、標的核酸としては、ヒトゲノムＤＮＡ又はその断片であることが好ましい。
脊椎動物の中でも、哺乳類であることがより好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
中でも、標的核酸としては、ヒトゲノムＤＮＡ又はその断片であることが好ましい。
【0078】
人工合成核酸とは、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと同様の構成成分（塩基、デオキシリボース、リン酸）からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸は、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸であってもよく、任意の塩基配列を有する核酸であってもよい。
【0079】
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸（例えば、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ等）が挙げられる。
【0080】
標的核酸の形態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸、一本鎖核酸、部分的に二本鎖又は一本鎖である核酸等が挙げられ、環状又は直鎖状のプラスミドであってもよい。また、標的核酸は修飾又は変異を有していてもよい。
【0081】
標的核酸は、塩基配列が明らかな特定の塩基配列を有することが好ましい。特定の塩基配列は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子疾患検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列、真菌細胞由来の塩基配列、細菌由来の塩基配列、ウイルス由来の塩基配列等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0082】
標的核酸は、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。標的核酸の種類は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。標的核酸として、細胞の核中に遺伝子導入により組み込まれた核酸を使用する場合には、１細胞に特定コピー数（例えば、１コピー）の標的核酸が導入されていることを確認することが好ましい。特定コピー数の標的核酸が導入されていることの確認方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンス、ＰＣＲ法、サザンブロット法等が挙げられる。
【0083】
細胞の核中に標的核酸を導入する場合、遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が目的の場所に目的のコピー数導入できれば特に限定されず、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ－ｉｎ、Ｊｕｍｐ－ｉｎ等が挙げられる。あるいは、プラスミド、人工染色体等の形態で細胞の核中に標的核酸を導入してもよい。例えば、細胞として酵母菌（酵母細胞）を用いる場合、これらの中でも効率の高さ及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【0084】
標的核酸は、微小領域や担体によって、試料中において微小区画化されていてもよい。このとき、微小領域や担体により微小区画化された標的核酸は１コピーであってもよく、２コピー以上であってもよい。また、２コピー以上の標的核酸が微小区画された場合に、複数存在する標的核酸は同じ配列からなるものであってもよく、異なる配列からなるものであってもよい。標的核酸が担体によって、試料中において微小区画化された場合に、標的核酸は担体に直接又はリンカー等を介して間接的に結合して存在する。
微小領域としては、例えば、細胞、リポソーム、マイクロカプセル、ウイルス、ドロップレット、エマルジョン等の形態が挙げられる。担体としては、例えば、金属粒子、磁性粒子、セラミックス粒子、高分子粒子、タンパク質粒子等の形態が挙げられる。
微小領域としては、例えば、細胞、リポソーム、マイクロカプセル、ウイルス、ドロップレット、エマルジョン等の形態が挙げられる。担体としては、例えば、金属粒子、磁性粒子、セラミックス粒子、高分子粒子、タンパク質粒子等の形態が挙げられる。
【0085】
［細胞］
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位である。標的核酸が含まれる細胞としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞等が挙げられる。細胞は、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位である。標的核酸が含まれる細胞としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞等が挙げられる。細胞は、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0086】
真核細胞としては、特に限定されず、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、藻類、原生動物等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、動物細胞又は真菌細胞が好ましい。
動物細胞の由来となる動物としては、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類等が挙げられるが、哺乳類であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
動物細胞の由来となる動物としては、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類等が挙げられるが、哺乳類であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【0087】
動物細胞は接着性細胞であってもよく、浮遊性細胞であってもよい。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞であってもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものであってもよく、分化した細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよい。
【0088】
分化した細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、星細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞、類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞、ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。
【0089】
未分化の細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の全能性幹細胞；間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞等が挙げられる。
【0090】
真菌細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【0091】
酵母菌は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｇ０／Ｇ１期に同調して同調培養され、Ｇ１期で固定されたものが好ましい。また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ１遺伝子欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ１遺伝子欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、細胞中の核酸のコピー数の増加等を防ぐことができる。
【0092】
原核細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の真正細菌、古細菌等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0093】
細胞は、死細胞であることが好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こり、細胞内核酸量が変化することを防ぐことができる。細胞は、光を受光したときに発光可能であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
【0094】
細胞は、光を受光した時に発光可能であることが好ましい。受光とは、光を受けることを意味する。細胞の発光は、光学センサで検出する。光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状等を画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【0095】
光を受光したときに発光可能な細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素で染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞等が挙げられる。細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜等が挙げられる。
【0096】
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、又はシアニン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、又はＣｙ３がより好ましい。
【0097】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）等が挙げられる。
【0098】
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ－ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲ等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0099】
蛍光標識抗体は、対象細胞に結合することができ、蛍光標識されていれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体等が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0100】
細胞の体積平均粒径は、遊離状態において、３０μｍ以下が好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、７μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、３０μｍ以下であれば、インクジェット法やセルソーター等の液滴吐出手段に好適に用いることができる。
【0101】
細胞の体積平均粒径は、例えば、次のような測定方法で測定することができる。細胞として酵母を用いた場合、作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いること等により体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
【0102】
細胞懸濁液における細胞の密度は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞密度が上記の範囲であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞密度は、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いて測定することができる。
【0103】
細胞に含まれる標的核酸のコピー数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００コピーとすることができる。また、ウェル内に細胞が２個以上の複数添加されている場合に、細胞に含まれる核酸のコピー数は同一であってもよく、異なっていてもよいが、効率よく本実施形態の決定方法に用いられる容器を製造できることから、同一であることが好ましい。
中でも、１個の細胞に１コピー又は１分子の標的核酸が含まれることが好ましい。この場合、「細胞の細胞数」＝「ウェル内に存在する標的核酸の合計コピー数又は合計分子数」とすることができ、より簡便にウェル内に存在する標的核酸の合計コピー数又は合計分子数を把握することができる。
中でも、１個の細胞に１コピー又は１分子の標的核酸が含まれることが好ましい。この場合、「細胞の細胞数」＝「ウェル内に存在する標的核酸の合計コピー数又は合計分子数」とすることができ、より簡便にウェル内に存在する標的核酸の合計コピー数又は合計分子数を把握することができる。
【0104】
また、本実施形態の決定方法において、標的核酸を含む細胞としては、細胞と同一条件を再現できるものであれば、上述した細胞の代わりに、細胞以外のものを利用することもできる。細胞以外のものとしては、例えば、リポソーム、マイクロカプセル、ウイルス、ドロップレット、エマルジョン等の形態が挙げられる。
【0105】
（リポソーム）
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
【0106】
リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ、ユニラメラ、二重層膜が一重）であっても、多層ラメラ（マルチラメラ、タマネギ状の構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている）であってもよい。
【0107】
リポソームは、核酸を内包することができるものであればよく、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して核酸が内水相又は膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に核酸を封入する形態、膜自体に核酸を内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
【0108】
リポソームの大きさ（平均粒子径）は、核酸を内包することができる大きさであれば特に限定されない。また、形態は球状又はそれに近い形態が好ましい。
【0109】
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質としては、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。具体的な脂質としては、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、それらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0110】
（マイクロカプセル）
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
【0111】
マイクロカプセルの壁材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素、ポリ尿素－ポリウレタン樹脂、尿素－ホルムアルデヒド樹脂、メラミン－ホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンアミド、ポリカーボネート、ポリスルフィネート、エポキシリ、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、ゼラチン等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0112】
マイクロカプセルの大きさは、核酸を内包することができる大きさであれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。マイクロカプセルの製造方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ－ｓｉｔｕ法、界面重合法、コアセルベーション法等が挙げられる。
【0113】
［その他成分］
ネガティブコントロール群の各ウェルは、核酸検出検査における処理及びその前処理で使用される試薬を含んでいてもよい。
また、ポジティブコントロール群の各ウェルについても同様に、標的核酸に加えて、核酸検出検査における処理及びその前処理で使用される試薬を含んでいてもよい。
ネガティブコントロール群の各ウェルは、核酸検出検査における処理及びその前処理で使用される試薬を含んでいてもよい。
また、ポジティブコントロール群の各ウェルについても同様に、標的核酸に加えて、核酸検出検査における処理及びその前処理で使用される試薬を含んでいてもよい。
【0114】
試薬としては、例えば、プライマー、増幅試薬等が挙げられる。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合には、鋳型ＤＮＡ（本実施形態においては、標的核酸）に特異的な１８～３０塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅対象領域を挟むようにフォワードプライマー（センスプライマー）とリバースプライマー（アンチセンスプライマー）の２か所（一対）設定される。
【0115】
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合には、例えば、酵素としてＤＮＡポリメラーゼ、基質として４種の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｍｇ２＋（終濃度約１ｍＭ以上２ｍＭ以下程度の塩化マグネシウム）、最適ｐＨ（ｐＨ７．５～９．５）を保持するバッファー等が挙げられる。
【0116】
反応空間内の標的核酸、並びに、存在する場合、プライマー及び増幅試薬の状態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、溶液又は固体のいずれかの状態であってもよい。
【0117】
使用性の観点からは、特に、溶液状態であることが好ましい。溶液状態であると、使用者はすぐに試験に用いることができる。輸送上の観点からは、特に、固体状態であることが好ましく、固体乾燥状態がより好ましい。固体乾燥状態であると、分解酵素等による試薬の分解速度を低減化することができ、試薬の保存性を向上させることができる。
【0118】
乾燥方法としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、蒸気乾燥、吸引乾燥、赤外線乾燥、バレル乾燥、スピン乾燥等が挙げられる。
【0119】
反応空間は、容器の使用直前に、固体乾燥状態の試薬をバッファーや水に溶解させることで、すぐに反応液として用いることができるよう、適正量の試薬を含んでいることが好ましい。
【0120】
容器は、複数の反応空間の全部に標的核酸又は上述したプライマー及び増幅試薬を含んでいてもよく、複数の反応空間の一部に標的核酸又は上述したプライマー及び増幅試薬を含んでいてもよい。後者の場合、残部の反応空間は、例えば空であってもよく、異なる組成の試薬を含んでいてもよい。
【0121】
容器において、反応空間の形態は特に限定されず、例えば、ウェル、液滴、基板上の区画等が挙げられる。例えば、反応空間がウェルである場合、容器はウェルプレートの形態であってもよい。
【0122】
［ウェル］
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、標的核酸、及び、存在する場合、試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部等が挙げられる。
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、標的核酸、及び、存在する場合、試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部等が挙げられる。
【0123】
ウェルの数は複数であり、５以上が好ましく、５０以上がより好ましい。ウェルの数が２以上であるマルチウェルプレートが好適に用いられる。マルチウェルプレートとしては、ウェル数が、例えば、２４、４８、９６、３８４、１,５３６等であるウェルプレートが挙げられる。
【0124】
ウェルの容積は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、一般的な定量ＰＣＲに用いられる試料量を考慮すると、１０μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
【0125】
ウェルの材質は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
【0126】
ウェルの色は、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光等であってよい。ウェルの濡れ性は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撥水性であってもよい。ウェルの濡れ性が、撥水性であると、ウェル内壁への試薬の吸着を低減化することができる。また、ウェルの濡れ性が撥水性であると、ウェル内の試薬を溶液状態で移動することが容易である。
【0127】
ウェル内壁の撥水化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フッ素系樹脂被膜を形成する方法、フッ素プラズマ処理、エンボス加工等が挙げられる。特に、接触角が１００°以上となる撥水化処理を施すことで、液体の取りこぼしによる試薬の減少、不確かさ、変動係数の増大を抑えることができる。
【0128】
［基材］
容器は、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
容器は、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【0129】
基材の材質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックス等が挙げられる。中でも、プラスチックスが好ましい。
【0130】
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
【0131】
基材の形状は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、プレート状等が挙げられる。基材の構造は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であってもよく、複数層構造であってもよい。
【0132】
［識別手段］
容器は、標的核酸の特定コピー数の情報（例えば、細胞の数）を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷等が挙げられる。
容器は、標的核酸の特定コピー数の情報（例えば、細胞の数）を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷等が挙げられる。
【0133】
識別手段を設ける位置及び識別手段の数は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【0134】
識別手段に記憶させる情報としては、標的核酸の特定コピー数の情報以外にも、例えば、分析結果（例えば、ＰＭ値、ＰＭ値のばらつき等）、細胞の生死、複数のウェルのうちどのウェルに標的核酸が充填されているのか、標的核酸の種類、測定日時、測定者の氏名等が挙げられる。
【0135】
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
【0136】
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、ウェルに標的核酸を分注する際に標的核酸の特定コピー数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送等が挙げられる。
【0137】
［その他の部材］
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
【0138】
容器は、ウェルへの異物混入又は充填物の流出等を防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。密閉部材としては、少なくとも１つのウェルを密閉可能であり、１つ１つのウェルを個別に密閉又は開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成してもよい。
【0139】
密閉部材の形状としては、ウェル内壁径と一致するキャップ状、ウェル開口部を被覆するフィルム状等が挙げられる。
【0140】
密閉部材の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂等が挙げられる。密閉部材としては、全てのウェルを一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要なウェルと不必要なウェルとの接着強度が異なるように構成されていてもよい。
【0141】
＜デバイスの製造方法＞
デバイスの製造方法は、特定コピー数の標的核酸を細胞の核中の核酸に組み込む組み込み工程と、特定コピー数の標的核酸が核中の核酸に組み込まれた細胞を１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより特定の個数の細胞を充填する標的核酸充填工程と、を含む。
デバイスの製造方法は、細胞懸濁液精製工程及び細胞数計数工程を更に含むことが好ましく、細胞懸濁液生成工程、標的核酸充填工程、及び細胞数計数工程において推定したウェル内に存在する標的核酸のコピー数の確からしさを算出する工程、出力工程及び記録工程を更に含むことがより好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
デバイスの製造方法は、特定コピー数の標的核酸を細胞の核中の核酸に組み込む組み込み工程と、特定コピー数の標的核酸が核中の核酸に組み込まれた細胞を１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより特定の個数の細胞を充填する標的核酸充填工程と、を含む。
デバイスの製造方法は、細胞懸濁液精製工程及び細胞数計数工程を更に含むことが好ましく、細胞懸濁液生成工程、標的核酸充填工程、及び細胞数計数工程において推定したウェル内に存在する標的核酸のコピー数の確からしさを算出する工程、出力工程及び記録工程を更に含むことがより好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【0142】
［組み込み工程］
組み込み工程では、特定コピー数の標的核酸を細胞の核中の核酸に組み込む。
細胞の核中の核酸に組み込まれる標的核酸のコピー数は、特定のコピー数であれば、特に限定はないが、導入効率の観点から、１コピーであることが好ましい。
組み込み工程では、特定コピー数の標的核酸を細胞の核中の核酸に組み込む。
細胞の核中の核酸に組み込まれる標的核酸のコピー数は、特定のコピー数であれば、特に限定はないが、導入効率の観点から、１コピーであることが好ましい。
【0143】
標的核酸の細胞の核中の核酸への組み込み方法としては、上記「標的核酸」において「遺伝子導入の方法」として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【0144】
［標的核酸充填工程］
標的核酸充填工程では、特定コピー数の標的核酸が核中の核酸に組み込まれた細胞を１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより特定の個数の細胞を充填する。
標的核酸充填工程では、特定コピー数の標的核酸が核中の核酸に組み込まれた細胞を１つ含む液滴を作製し、当該液滴の個数を制御することにより特定の個数の細胞を充填する。
【0145】
液滴の作製及び充填は、例えば、核中の核酸に標的核酸が組み込まれた細胞を含む細胞懸濁液を液滴として吐出することにより容器内に液滴を順次着弾させることで達成できる。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
【0146】
容器としては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレート等を用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数の細胞を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。
【0147】
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
【0148】
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、インクジェット法におけるオンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本実施形態では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため、上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
【0149】
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【0150】
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。デバイスの製造方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いことが好ましい。サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【0151】
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等が挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図３～５に示す。
【0152】
図３は、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ及びノズル１１１ａを有する。電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサ等を好適に用いることができる。
【0153】
図４は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ及びノズル１１１ｂを有する。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンター等を好適に用いることができる。
【0154】
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生すること
や、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
や、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
【0155】
このため、より好ましい構成として図５に示した構成等が挙げられる。図５は、図４における圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図５の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ及びノズル１１１ｃを有する。
【0156】
図５の吐出ヘッドでは、図示していない制御装置から圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１２ｃを紙面上下方向に変形させることができる。
【0157】
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式等が挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。
【0158】
図６（ａ）は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図６（ｂ）は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図６（ａ）は、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図６（ｂ）は、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
【0159】
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
【0160】
本実施形態において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図７（ａ）～（ｃ）は、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
【0161】
まず、図７（ａ）に示すように、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形し、それにより、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
【0162】
次に、図７（ｂ）に示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図７（ｃ）に示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
【0163】
デバイスの製造方法では、ウェルが形成されたプレートからなる容器を移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、ウェルに順次液滴を着弾させてもよい。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
【0164】
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたものを用いることができる。プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。プレートとして具体的には、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレート等を用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であり、異なる水準の個数の細胞を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。
【0165】
図８は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置４００の一例を示す概略図である。図８に示すように、液滴を着弾させるための分注装置４００は、液滴形成装置４０１と、プレート７００と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
【0166】
分注装置４００において、プレート７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。プレート７００には液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着滴する複数のウェル７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドとそれぞれのウェル７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドからそれぞれのウェル７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【0167】
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【0168】
吐出する液滴としては、ウェル内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴をウェル内に着弾させることが好ましい。複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。複数の水準としては、例えば、ウェル内に核酸Ａを有する複数の細胞が所定の濃度勾配が挙げられる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
【0169】
［細胞懸濁液生成工程］
細胞懸濁液生成工程は、核中の核酸に上記核酸が導入された複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
細胞懸濁液生成工程は、核中の核酸に上記核酸が導入された複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
【0170】
（細胞懸濁液）
細胞懸濁液は、核中の核酸に上記標的核酸が導入された複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中の核酸に上記標的核酸が導入された複数の細胞については、上記「細胞」において説明したとおりである。
細胞懸濁液は、核中の核酸に上記標的核酸が導入された複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中の核酸に上記標的核酸が導入された複数の細胞については、上記「細胞」において説明したとおりである。
【0171】
（溶剤）
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
【0172】
（添加剤）
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0173】
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【0174】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【0175】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズ等）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【0176】
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
【0177】
核酸としては、細胞に含まれる標的核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ等が挙げられる。核酸を添加すると、細胞に含まれる標的核酸の抽出及び検出を行う際に用いられるウェルの壁面等に付着することを防ぐことができる。
【0178】
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミド等が挙げられる。
【0179】
（その他の成分）
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
【0180】
細胞を分散する方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式が好ましい。メディア方式では、解砕能力が強いため、細胞膜や細胞壁を破壊することや、メディアがコンタミとして混入することがある。
【0181】
細胞のスクリーニング方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニング等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
【0182】
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から核酸のコピー数又は分子数を推定することが好ましい。細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。核酸のコピー数又は分子数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数又は分子数を求めることを意味する。
【0183】
計数対象が細胞数ではなく核酸が何個入っているかであってもよい。通常は、細胞１個につき標的核酸が１コピー若しくは１分子導入されたものを選択するか、又は、遺伝子組換えにより核酸を細胞に導入するため、核酸の分子数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすため、細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる核酸の分子数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
【0184】
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある場合に、特定の１つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
【0185】
図９は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図９に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的な核酸のコピー数又は分子数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定コピー数又は分子数を算出することが可能である。
【0186】
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、上述したような複製が起きる前又は後の状態に揃えることによって、核酸のコピー数又は分子数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
【0187】
推定する特定のコピー数又は分子数は、確からしさ（確率）を算出することが好ましい。確からしさ（確率）を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率等を用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
【0188】
［細胞数計数工程］
細胞数計数工程は、液滴の作製後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報及び時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程は、液滴の作製後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報及び時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
【0189】
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでいてもよい。
【0190】
液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴がプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
【0191】
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的又は磁気的に検出方法等が挙げられる。
【0192】
（光学的に検出する方法）
図１０、図１４及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図１０は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１４及び図１５は、液滴形成装置の他の一例（４０１Ａ、４０１Ｂ）を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
図１０、図１４及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図１０は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１４及び図１５は、液滴形成装置の他の一例（４０１Ａ、４０１Ｂ）を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
【0193】
図１０では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））をコードする遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。光を照射するとは、光をあてることを意味する。
【0194】
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
【0195】
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミックス等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子等が挙げられる。
【0196】
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【0197】
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
【0198】
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
【0199】
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【0200】
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【0201】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍～１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【0202】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【0203】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【0204】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【0205】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【0206】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【0207】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【0208】
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１１～図１３を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置４０１の動作について説明する。
【0209】
図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１２は、図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１３は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【0210】
図１１に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、通信インターフェイス（通信Ｉ／Ｆ）７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【0211】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置４０１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置４０１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【0212】
図１２に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【0213】
図１２及び図１３を参照しながら、液滴形成装置４０１の細胞数計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【0214】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【0215】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【0216】
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【0217】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【0218】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【0219】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【0220】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。染色細胞において、蛍光色素としては、上述したものを用いることができる。また、蛍光タンパク質としては、上述したものを用いることができる。
【0221】
このように、液滴形成装置４０１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【0222】
つまり、液滴形成装置４０１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【0223】
図１４は、図１０の液滴形成装置４０１の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置４０１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0224】
このように、液滴形成装置４０１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【0225】
例えば、ノズル１１１と着滴対象物を近づけた際に、図１０のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置４０１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１４のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
【0226】
図１４に示すように、受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【0227】
図１５は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１５に示すように、液滴形成装置４０１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0228】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【0229】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【0230】
図１６（ａ）及び図１６」（ｂ）は、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１６（ａ）に示すように、蛍光染色細胞３５０ａと３５０ｂとに重なりが発生する場合や、図１６（ｂ）に示すように、蛍光染色細胞３５０ａと３５０ｂとに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【0231】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【0232】
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１７を参照して、より詳しく説明する。
【0233】
図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１７に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴＝１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、細胞数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【0234】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１６の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば、閾値を（ｎＬｕ－Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【0235】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより細胞数を決定づけてもよい。このように、液滴形成装置４０１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【0236】
図１８は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１８に示すように、液滴形成装置４０１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0237】
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
【0238】
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【0239】
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【0240】
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があるといわれており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【0241】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【0242】
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ～５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
【0243】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ以上２００μｍ以下の範囲となる。
【0244】
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
【0245】
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【0246】
例えば、吐出波形及び撹拌波形をいずれも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【0247】
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【0248】
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
【0249】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
【0250】
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
【0251】
また、液滴形成装置４０１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置４０１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【0252】
即ち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【0253】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
【0254】
（電気的又は磁気的に検出する方法）
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図１９に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図１９に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
【0255】
（吐出前に細胞を観測する処理）
吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
【0256】
図２０に示す方法は、セルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００Ｚを用いることができる。図２０では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
【0257】
また、図２１に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２１では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図２０に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２１は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
【0258】
（着弾後の細胞をカウントする処理）
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、参考文献１（Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation andtotal RNA analysis, PLoS One, Vol. 6, Issue 3, e17455, 2011）等に記載されている。
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、参考文献１（Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation andtotal RNA analysis, PLoS One, Vol. 6, Issue 3, e17455, 2011）等に記載されている。
【0259】
液滴の吐出前及び着弾後に細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があり、生成するプレートの種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することが最も好ましい。
【0260】
吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（及び吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。
【0261】
また、着弾後のウェル内の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的なウェルを使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個等多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。
【0262】
そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び細胞数計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
【0263】
受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｐｕｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等二次元センサを用いることも可能である。
【0264】
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個又は０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。
【0265】
細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布にしたがうと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（≧２）は下記式４で表される。
【0266】
【数7】
【0267】
図２２は、確率Ｐ（≧２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
【0268】
二値的な検出で細胞数計数を行う場合には、確率Ｐ（≧２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（≧２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプ等の一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、レーザー等を用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザー等一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
【0269】
［細胞懸濁液生成工程、核酸充填工程及び細胞数計数工程において推定した核酸のコピー数の確からしさを算出する工程］
本工程は、細胞懸濁液生成工程、標的核酸充填工程、及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する標的核酸のコピー数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
本工程は、細胞懸濁液生成工程、標的核酸充填工程、及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する標的核酸のコピー数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
【0270】
なお、確からしさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、まとめて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、標的核酸充填工程及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。いいかえれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【0271】
［出力工程］
出力工程は、容器内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該容器に含まれる細胞数を意味する。
出力工程は、容器内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該容器に含まれる細胞数を意味する。
【0272】
出力とは、原動機、通信機、計算機等の装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【0273】
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各ウェルの細胞数又は標的核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値を外部の記憶部に出力する。出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【0274】
［記録工程］
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。この場合、記録部は記憶部ともいえる。
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。この場合、記録部は記憶部ともいえる。
【0275】
［その他工程］
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程等が挙げられる。
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程等が挙げられる。
【0276】
酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等が挙げられる。酵素を失活させる方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
【実施例0277】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0278】
［実験例１］
市販の標的核酸及び試薬を用いて、当該試薬の検出限界を検討した。
まず、以下に示す方法を用いて標的核酸を組み込んだ酵母を調製した。標的核酸として、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母と、内在性コントロール遺伝子として、ＡＢＬ１ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母を調製した。
市販の標的核酸及び試薬を用いて、当該試薬の検出限界を検討した。
まず、以下に示す方法を用いて標的核酸を組み込んだ酵母を調製した。標的核酸として、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母と、内在性コントロール遺伝子として、ＡＢＬ１ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母を調製した。
【0279】
（遺伝子組換え酵母の調製）
まず、出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ製、ＡＴＣＣ４００１４０８）を、１分子の標的核酸のキャリア細胞として使用し、組換え体を作製した。標的ＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子と選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子とがタンデムに並ぶように導入されたプラスミドを予め作出し、当該プラスミドを用いて相同組換えによって、キャリア細胞のゲノムＤＮＡのＢａｒ１遺伝子領域に１分子の標的ｄｓＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子を導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
まず、出芽酵母ＹＩＬ０１５Ｗ ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ製、ＡＴＣＣ４００１４０８）を、１分子の標的核酸のキャリア細胞として使用し、組換え体を作製した。標的ＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子と選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子とがタンデムに並ぶように導入されたプラスミドを予め作出し、当該プラスミドを用いて相同組換えによって、キャリア細胞のゲノムＤＮＡのＢａｒ１遺伝子領域に１分子の標的ｄｓＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子を導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
【0280】
（遺伝子組換え酵母の培養及び細胞周期の制御）
次いで、５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ－６３０４０９）で培養した遺伝子組換え酵母９０ｍＬを分取した三角フラスコに、５００μｇ／ｍＬのα１－Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１－５ＭＧ、以下、「αファクター」と称する場合がある）を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０－１４４、以下、「ＤＰＢＳ」とも称する場合とがある）９００μＬを添加し、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ－２３ＦＨ）を用いて、振盪速度２５０ｒｐｍ、温度２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調させた酵母懸濁液を得た。
次いで、５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ－６３０４０９）で培養した遺伝子組換え酵母９０ｍＬを分取した三角フラスコに、５００μｇ／ｍＬのα１－Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１－５ＭＧ、以下、「αファクター」と称する場合がある）を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０－１４４、以下、「ＤＰＢＳ」とも称する場合とがある）９００μＬを添加し、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ－２３ＦＨ）を用いて、振盪速度２５０ｒｐｍ、温度２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調させた酵母懸濁液を得た。
【0281】
（遺伝子組換え酵母の固定化）
遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ－５０Ｒ）に、Ｇ０／Ｇ１期で同調されていることを確認した酵母懸濁液４５ｍＬを移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２－０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。次いで、得られた酵母ペレットにエタノール１０ｍＬを添加して懸濁させることにより、固定化済みの酵母懸濁液を得た。
遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ－５０Ｒ）に、Ｇ０／Ｇ１期で同調されていることを確認した酵母懸濁液４５ｍＬを移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２－０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。次いで、得られた酵母ペレットにエタノール１０ｍＬを添加して懸濁させることにより、固定化済みの酵母懸濁液を得た。
【0282】
（遺伝子組換え酵母の核染色）
固定化済み酵母懸濁液２００μＬを分取し、ＤＰＢＳで一回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。２０ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８－０６３９１）２０μＬを添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。その後、２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社製、ＴＫＲ－９０３４）２５μＬを添加し、プチクール（ワケンビーテック株式会社製、プチクール ＭｉｎｉＴ－Ｃ）を用いて５０℃で２時間インキュベートした。最後に、５ｍＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、Ｓ７０２０）６μＬを加えて、遮光下で３０分間染色した。
固定化済み酵母懸濁液２００μＬを分取し、ＤＰＢＳで一回洗浄した後、４８０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。２０ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（株式会社ニッポンジーン製、３１８－０６３９１）２０μＬを添加後、バイオシェイカーを用いて３７℃で２時間インキュベートした。その後、２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社製、ＴＫＲ－９０３４）２５μＬを添加し、プチクール（ワケンビーテック株式会社製、プチクール ＭｉｎｉＴ－Ｃ）を用いて５０℃で２時間インキュベートした。最後に、５ｍＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、Ｓ７０２０）６μＬを加えて、遮光下で３０分間染色した。
【0283】
（遺伝子組換え酵母の分散）
核染色を行なった酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％、１０秒間分散処理して酵母懸濁インクを得た。
核染色を行なった酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力３０％、１０秒間分散処理して酵母懸濁インクを得た。
【0284】
（酵母懸濁液の個数計測分注）
以下の方法を用いて、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）して、各ウェルに１細胞ずつ吐出した。
以下の方法を用いて、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）して、各ウェルに１細胞ずつ吐出した。
【0285】
具体的には、液滴形成装置（リコー製）を用いて、９６プレート（「ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ， ０．１ ｍＬ」（商品名）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（リコー製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出した。
【0286】
吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ（浜松ホトニクス株式会社製、Ｃ１３４４０－２０ＣＵ）を用いて撮影した。光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＯＮＥ－５３２－２００－ＫＥ）を用い、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数した。９６プレート（行：Ａ～Ｈ、列：１～１２）の各ウェルに以下の表２－１（ＡＢＬ１）及び表２－２（ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０）に示すｄｓＤＮＡ分子数となるように、１分子の標的ＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子を含む酵母を配置した。なお、表２－１及び表２－２に示す９６プレートは、同一のプレートであり、標的ＤＮＡ及び内在性コントロール遺伝子の配置がわかりやすいように分けて記載したものである。なお、表２－１において「Ｓ」は、陰性検体として用いた、健常者のＲＮＡ抽出液であり、５μＬ／ウェルずつ配置した。また、以下の配置のプレートを２プレート準備してそれぞれ測定に供した。
【0287】
【表2-1】
【0288】
【表2-2】
【0289】
（核酸抽出）
５ｎｇ／μＬのＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２－００４３４）を含有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「ＣｏｌＥ１／ＴＥ」と称する場合がある）に、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５－５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
５ｎｇ／μＬのＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２－００４３４）を含有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「ＣｏｌＥ１／ＴＥ」と称する場合がある）に、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５－５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
【0290】
酵母を配置した９６プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解（核酸抽出）後、９５℃で２分間熱処理して、酵母細胞内の核酸を抽出した。
【0291】
（ＰＣＲによる標的核酸の増幅）
次いで、以下に示す条件にて、各ウェル内の標的核酸の増幅を行った。
次いで、以下に示す条件にて、各ウェル内の標的核酸の増幅を行った。
【0292】
（試験の諸条件）
・試薬の組成：以下の表３に示す。なお、表３中の「Ｔｅｍｐｌａｔｅ」とは陰性検体を示す。陰性検体を含まないウェルＡ行の１～１２列については、表３の組成において、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。
・ＰＣＲ装置：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム
・増幅条件：以下の表４に示す。
・試薬の組成：以下の表３に示す。なお、表３中の「Ｔｅｍｐｌａｔｅ」とは陰性検体を示す。陰性検体を含まないウェルＡ行の１～１２列については、表３の組成において、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。
・ＰＣＲ装置：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム
・増幅条件：以下の表４に示す。
【0293】
【表3】
【0294】
【表4】
【0295】
増幅後の解析結果を以下の表５－１及び表５－２に、標的核酸及び内在性コントロール遺伝子の検量線のグラフを図２３に、標的核酸の検量線及び陰性検体存在下で測定したポジティブコントロール群の測定結果のグラフを図２４に示す。なお、表５－１及び表５－２において、検出率は、各コピー数において、式：｛１－（ＵＤ数）÷（測定数）｝×１００を用いて、算出した。なお、「ＵＤ」とは、Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（非検出）を略した記載である。また、ＣＶｌｎは、以下の式（Ｉ）を用いて算出した。式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。
【0296】
【数8】
【0297】
【表5-1】
【0298】
【表5-2】
【0299】
図２４に示すように、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０はコピー数が低くなるほど、陰性検体に含まれる成分による阻害効果でＣｑ値が検量線から外れる傾向がみられた。
【0300】
表５－１及び表５－２に示すように、検出限界（ＬＯＤ）はＲＮＡ数で４コピーであり、定量限界（ＬＯＱ）はＲＮＡ数で８コピーであった。
【0301】
［実験例２］
市販の標的核酸及び試薬を用いて、当該試薬の検出限界を検討した。
まず、実験例１と同様の方法を用いて標的核酸を組み込んだ酵母を調製した。標的核酸として、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母と、内在性コントロール遺伝子として、ＡＢＬ１ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母を調製した。
市販の標的核酸及び試薬を用いて、当該試薬の検出限界を検討した。
まず、実験例１と同様の方法を用いて標的核酸を組み込んだ酵母を調製した。標的核酸として、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母と、内在性コントロール遺伝子として、ＡＢＬ１ ｄｓＤＮＡを組み込んだ酵母を調製した。
【0302】
また、「遺伝子組換え酵母の培養及び細胞周期の制御」から「酵母懸濁液の個数計測分注」まで、実験例１と同様の方法を用いて行った。
【0303】
９６プレート（行：Ａ～Ｈ、列：１～１２）の各ウェルに以下の表６－１（ＡＢＬ１）及び表６－２（ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０）に示すＤＮＡ分子数となるように、１分子の標的ＤＮＡ又は内在性コントロール遺伝子を含む酵母を配置した。なお、表６－１及び表６－２に示す９６プレートは、同一のプレートであり、標的ＤＮＡ及び内在性コントロール遺伝子の配置がわかりやすいように分けて記載したものである。なお、表６－１において「Ｓ」は、陰性検体として用いた、健常者のｃＤＮＡ溶液であり、健常者のＲＮＡ抽出液１０μＬを逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｃＤＮＡに合成したものである。この健常者のｃＤＮＡ溶液を５μＬ／ウェルずつ配置した。また、以下の配置のプレートを２プレート準備してそれぞれ測定に供した。
【0304】
【表6-1】
【0305】
【表6-2】
【0306】
（核酸抽出）
５ｎｇ／μＬのＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２－００４３４）を含有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「ＣｏｌＥ１／ＴＥ」と称する場合がある）に、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５－５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
５ｎｇ／μＬのＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２－００４３４）を含有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒ（以下、「ＣｏｌＥ１／ＴＥ」と称する場合がある）に、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５－５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
【0307】
酵母を配置した９６プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解（核酸抽出）後、９５℃で２分間熱処理して、酵母細胞内の核酸を抽出した。
【0308】
（ＰＣＲによる標的核酸の増幅）
次いで、以下に示す条件にて、各ウェル内の標的核酸の増幅を行った。
次いで、以下に示す条件にて、各ウェル内の標的核酸の増幅を行った。
【0309】
（試験の諸条件）
・試薬の組成：以下の表７－１（ＡＢＬ１用）及び表７－２（ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０）に示す。なお、表７－１及び表７－２中の「Ｔｅｍｐｌａｔｅ」とは陰性検体を示す。表７－１に示す試薬を表６－１のＢ行の１～１０列に配置し、表７－２に示す試薬を表６－２のＣ～Ｇ行の１～１２列に配置した。陰性検体を含まないウェルＢ行の１～８列については、また、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。陰性検体を含まないウェルＡ行の１～１２列については、表７－２の組成において、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。
・ＰＣＲ装置：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム
・増幅条件：以下の表８に示す。
・試薬の組成：以下の表７－１（ＡＢＬ１用）及び表７－２（ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０）に示す。なお、表７－１及び表７－２中の「Ｔｅｍｐｌａｔｅ」とは陰性検体を示す。表７－１に示す試薬を表６－１のＢ行の１～１０列に配置し、表７－２に示す試薬を表６－２のＣ～Ｇ行の１～１２列に配置した。陰性検体を含まないウェルＢ行の１～８列については、また、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。陰性検体を含まないウェルＡ行の１～１２列については、表７－２の組成において、Ｔｅｍｐｌａｔｅの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを更に５．００μＬ添加したものを用いた。
・ＰＣＲ装置：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム
・増幅条件：以下の表８に示す。
【0310】
【表7-1】
【0311】
【表7-2】
【0312】
【表8】
【0313】
増幅後の解析結果を以下の表９－１及び表９－２に、標的核酸及び内在性コントロール遺伝子の検量線のグラフを図２５に、標的核酸の検量線及び陰性検体存在下で測定したポジティブコントロール群の測定結果のグラフを図２６に示す。なお、表９－１及び表９－２において、検出率は、各コピー数において、式：｛１－（ＵＤ数）÷（測定数）｝×１００を用いて、算出した。なお、「ＵＤ」とは、Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ（非検出）を略した記載である。また、ＣＶｌｎは、実験例１と同様に、上記式（Ｉ）を用いて算出した。
【0314】
【表9-1】
【0315】
【表9-2】
【0316】
図２６に示すように、実験例１の結果（図２４）に比べると、陰性検体に含まれる成分による阻害効果が少なかったが、ＢＣＲ－ＡＢＬ１ Ｐ２１０はコピー数が低くなるほど、陰性検体に含まれる成分による阻害効果でＣｑ値が検量線から外れる傾向がみられた。
【0317】
表９－１及び表９－２に示すように、検出限界（ＬＯＤ）はＲＮＡ数で４コピーであり、定量限界（ＬＯＱ）はＲＮＡ数で４コピーであった。
【0318】
本発明は以下の態様を含む。
（１） 核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法であって、
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む、決定方法。
（１） 核酸検出検査における検出限界及び定量限界の決定方法であって、
標的核酸を含まない１以上のウェルからなる、ネガティブコントロール群と、
特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有するポジティブコントロール群と、を有し、且つ、
前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、容器を用いて、
前記標的核酸を含まない陰性検体を前記ポジティブコントロール群に添加した後、核酸検出検査で用いられる試薬を前記ネガティブコントロール群及び前記ポジティブコントロール群に添加して、前記標的核酸の増幅を行う増幅工程と、
前記ネガティブコントロール群では、前記標的核酸が検出されない場合に、前記ポジティブコントロール群において、検出率が９５％以上である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における検出限界と決定し、且つ、以下の式（Ｉ）で表されるＣＶｌｎが３５％以下である特定コピー数のうち最も小さい特定コピー数を、核酸検出検査における定量限界と決定する決定工程と、
を含む、決定方法。
【0319】
【数9】
【0320】
（式（Ｉ）中、Ｅは、核酸増幅反応の効率を、ＳＤ（Ｃｑ）は、Ｃｑの標準偏差を、Ｃｑは、核酸増幅反応における増幅曲線と閾値が交差するサイクル数を示す。）
【0321】
（２） 前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも３つが１以上１００未満である、（１）に記載の決定方法。
（３） 前記ポジティブコントロール群は、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを５以上有する、（１）又は（２）に記載の決定方法。
（４） 前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも５つが１以上１００未満である、（３）に記載の決定方法。
（５） 前記陰性検体が健常者の核酸抽出液である、（１）～（４）のいずれか一つに記載の決定方法。
（６） 前記容器は、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有する検量線作成用ウェル群を更に有し、
前記検量線作成用ウェル群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、（１）～（５）のいずれか一つに記載の決定方法。
（７） 前記標的核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれている、（１）～（６）のいずれか一つに記載の決定方法。
（８） 前記細胞が酵母である、（７）に記載の決定方法。
（９） 前記細胞が、インクジェット法により吐出されたものである、（７）又は（８）に記載の決定方法。
（３） 前記ポジティブコントロール群は、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを５以上有する、（１）又は（２）に記載の決定方法。
（４） 前記ポジティブコントロール群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも５つが１以上１００未満である、（３）に記載の決定方法。
（５） 前記陰性検体が健常者の核酸抽出液である、（１）～（４）のいずれか一つに記載の決定方法。
（６） 前記容器は、特定コピー数の標的核酸を含むウェルからなり、且つ、前記標的核酸の特定コピー数が互いに異なるウェルを３以上有する検量線作成用ウェル群を更に有し、
前記検量線作成用ウェル群の前記標的核酸の特定コピー数のうち少なくとも１つが１以上１００未満である、（１）～（５）のいずれか一つに記載の決定方法。
（７） 前記標的核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれている、（１）～（６）のいずれか一つに記載の決定方法。
（８） 前記細胞が酵母である、（７）に記載の決定方法。
（９） 前記細胞が、インクジェット法により吐出されたものである、（７）又は（８）に記載の決定方法。
【符号の説明】
【0322】
１…容器、２…標的核酸を含まないウェル、３…ネガティブコントロール群、４，４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄ…標的核酸を含むウェル、５…ポジティブコントロール群、１０，１０’，１０Ｃ…吐出ヘッド（液滴吐出手段）、１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１Ｃ，１１’…液室、１２，１２Ｃ…メンブレン、１３，１３Ｃ…駆動素子、１３ａ…電動機、１３ｂ，１３ｃ…圧電素子、２０…駆動手段、３０，２６０…光源、４０…ミラー、６０，６１…受光素子、７０…制御手段、７１，１０１…ＣＰＵ、７２…ＲＯＭ、７３…ＲＡＭ、７４，１０６…Ｉ／Ｆ、７５…バスライン、１００…性能評価装置、１０２…主記憶装置、１０３…補助記憶装置、１０４…出力装置、１０５…入力装置、１０７…バス、１１１，１１１ａ，１１１ｂ，１１１ｃ，１２１…ノズル、１１２…電磁弁、１１５…大気開放部、２００…コイル、２５０…マイクロ流路、２５５…検出器、２５５’…画像取得部、２６５，２６５’…レンズ、３００，３００ａ，３００ｂ，３００ｃ…細胞懸濁液、３１０，３１０’…液滴、３５０，３５０ａ，３５０ｂ，３５０’，３５０”…細胞、４００…分注装置、４０１，４０１Ａ，４０１Ｂ，４０１Ｃ…液滴形成装置、７００，７００’…プレート、７１０…ウェル、８００…ステージ、９００…制御装置、Ｌ…光、Ｌｆ，Ｌｆ１，Ｌｆ２…蛍光
【先行技術文献】
【特許文献】
【0323】
【特許文献1】特開２０１８－１２４１７１号公報
【特許文献2】特開２０１７－１８７４７３号公報
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
