特開 2023-140135 ミクログリアの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023140135

(43)【公開日】2023-10-04

(54)【発明の名称】ミクログリアの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230927BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20230927BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230927BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/077

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022046010

(22)【出願日】2022-03-22

(71)【出願人】

【識別番号】000006747

【氏名又は名称】株式会社リコー

(71)【出願人】

【識別番号】519309658

【氏名又は名称】エリクサジェン サイエンティフィック，インク

(74)【代理人】

【識別番号】110001634

【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】湯本 真之

(72)【発明者】

【氏名】川島 優大

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 日佳流

(72)【発明者】

【氏名】細谷 俊彦

(72)【発明者】

【氏名】洪 実

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BD50

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】多能性幹細胞から短時間でミクログリアを製造する技術を提供する。
【解決手段】ミクログリアの製造方法であって、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）遺伝子の発現を増加させる転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入する工程を含む、製造方法；前記転写因子が、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡ、ＰＴＡＦＲ、ＦＬＩ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＥＧＲ２、ＲＵＮＸ１、ＴＮＦ、ＣＥＢＰＢ、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ、ＥＬＦ４、ＰＡＸ８、ＰＲＤＭ１、ＭＥＦ２Ａ及びＮＲ４Ａ３からなる群より選択される、上記製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミクログリアの製造方法であって、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）遺伝子の発現を増加させる転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入する工程を含む、製造方法。

【請求項2】

前記転写因子が、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡ、ＰＴＡＦＲ、ＦＬＩ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＥＧＲ２、ＲＵＮＸ１、ＴＮＦ、ＣＥＢＰＢ、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ、ＥＬＦ４、ＰＡＸ８、ＰＲＤＭ１、ＭＥＦ２Ａ及びＮＲ４Ａ３からなる群より選択される、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記転写因子が、少なくともＣＥＢＰＡを含む、請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記転写因子が、少なくともＣＥＢＰＡを含む２種以上である、請求項２又は３に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミクログリアの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

中枢神経系の細胞は入手が困難である。これに対し、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の多能性幹細胞から目的の細胞に分化させることにより、中枢神経系の細胞を含む様々な細胞が入手可能になってきている。また、患者由来の多能性幹細胞を目的の細胞に分化させることにより、疾患モデル細胞を作製することもできる。

【0003】

ところで、ミクログリアは、中枢神経系グリア細胞の１種である。グリア細胞とは、神経系を構成する神経細胞ではない細胞の総称である。ミクログリアは、中枢の免疫担当細胞として知られる。またミクログリアは中枢神経系細胞とは異なり、中胚葉由来であると考えられており、脳内の免疫細胞としての役割を持つ。ミクログリアは、病態時には、細胞体の肥大化や細胞増殖を伴い活性化状態となる。活性化したミクログリアは、細胞膜受容体を含む様々な分子の発現を変化させ、病巣部への移動、ダメージを受けた細胞やアミロイドβタンパク質等の細胞外タンパク質の貪食、液性因子（炎症性因子、細胞障害性因子、栄養因子等）の産生等を行うことが知られている。ミクログリアは、中枢神経系疾患のメカニズムに大きな役割を有しており、アルツハイマーに関連することが示唆され注目されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、多能性幹細胞からミクログリアを作製する従来の方法では、ミクログリアを得るために３０日以上の培養日数を要する。そこで、本発明は、多能性幹細胞から短時間でミクログリアを製造する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明に係るミクログリアの製造方法は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）遺伝子の発現を増加させる転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入する工程を含む。

【発明の効果】

【0006】

本発明によれば、多能性幹細胞から短時間でミクログリアを製造する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、実験例３における、ミクログリアのマーカー遺伝子の発現状態を示すヒートマップである。

【図2】図２は、実験例３において、ｉＰＳ細胞に導入した転写因子の組み合わせを、ミクログリアのマーカー遺伝子の発現量が多い順に左から並べたヒートマップである。

【図3】図３（ａ）は、実験例３における、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得したトランスクリプトームデータの主成分分析の結果である。図３（ｂ）は、実験例３における、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得したトランスクリプトームデータの因子分析の結果である。

【図4】図４は、実験例４におけるＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果をまとめた図である。

【図5】図５は、実験例４において、ＵＭＡＰによるクラスタリングを行った結果を示す図である。

【図6】図６は、実験例４において、ＵＭＡＰによるクラスタリングを行った結果を示す図である。

【図7】図７は、実験例５において、ミクログリアの各マーカー遺伝子の発現量を示す図である。

【図8】図８は、実験例５において、ミクログリアの代表的な貪食シーンを撮影したタイムラプス動画の一部を示す顕微鏡画像である。

【図9】図９は、実験例５において、ミクログリアの代表的な貪食シーンを撮影したタイムラプス動画の一部を示す顕微鏡画像である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

［ミクログリアの製造方法］
一実施形態において、本発明は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）遺伝子の発現を増加させる転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入する工程を含む、ミクログリアの製造方法を提供する。

【0009】

実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の製造方法により、従来３０日間以上かかっていたミクログリアの製造を１４日間以内で行うことができることを明らかにした。また、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法で製造したミクログリアは貪食能を有しており、ミクログリアの機能を有している。

【0010】

ミクログリアは、ミクログリアのマーカー遺伝子を発現し、貪食能等のミクログリアの機能を示す。ミクログリアのマーカー遺伝子としては、実施例において後述する、Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐ２Ｙ１２（Ｐ２ＲＹ１２）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）、Ｃ－Ｘ３－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＣＸ３ＣＲ１）、Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＳＦ１Ｒ）、Ａｌｐｈａ－２－Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ａ２Ｍ）、ＡＤＡＭ Ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ２８（ＡＤＡＭ２８）、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２（ＰＬＸＤＣ２）、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ５（ＬＡＰＴＭ５）、Ｓｏｌｕｔｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎｉｏｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ２Ｂ１（ＳＬＣＯ２Ｂ１）、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ８６（ＬＹ８６）等が挙げられる。

【0011】

ヒトＰ２ＲＹ１２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿０２２７８８．５、ＮＭ＿１７６８７６．３等である。ヒトＣ３遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００００６４．４である。ヒトＣＸ３ＣＲ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１７１１７１．２、ＮＭ＿００１１７１１７２．２、ＮＭ＿００１１７１１７４．１等である。ヒトＣＳＦ１Ｒ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２８８７０５．３、ＮＭ＿００１３４９７３６．２、ＮＭ＿００１３７５３２０．１等である。ヒトＡ２Ｍ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００００１４．６、ＮＭ＿００１３４７４２３．２、ＮＭ＿００１３４７４２４．２等である。ヒトＡＤＡＭ２８遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１３０４３５１．２、ＮＭ＿０１４２６５．６、ＮＭ＿０２１７７７．５等である。ヒトＰＬＸＤＣ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２８２７３６．２、ＮＭ＿０３２８１２．９等である。ヒトＬＡＰＴＭ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００６７６２．３である。ヒトＳＬＣＯ２Ｂ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１４５２１１．３、ＮＭ＿００１１４５２１２．３、ＮＭ＿００７２５６．５等である。ヒトＬＹ８６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００４２７１．４である。

【0012】

本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞はヒトの細胞であることが好ましい。

【0013】

Ｃ３遺伝子の発現を増加させる転写因子としては、Ｓｐｉ－１ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＳＰＩ１）、ＣＣＡＡＴ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｐｈａ（ＣＥＢＰＡ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＴＡＦＲ）、Ｆｌｉ－１ Ｐｒｏｔｏ－Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ＥＴＳ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＦＬＩ１）、Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｏｒ ２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）、Ｅａｒｌｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ２（ＥＧＲ２）、ＲＵＮＸ Ｆａｍｉｌｙ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＲＵＮＸ１）、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、ＣＣＡＡＴ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｅｔａ（ＣＥＢＰＢ）、ＩＫＡＲＯＳ Ｆａｍｉｌｙ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ １（ＩＫＺＦ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ Ｌｉｋｅ Ｆａｃｔｏｒ ６（ＫＬＦ６）、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｉ Ｃ（ＮＦＩＣ）、Ｅ７４ Ｌｉｋｅ ＥＴＳ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ４（ＥＬＦ４）、Ｐａｉｒｅｄ Ｂｏｘ ８（ＰＡＸ８）、ＰＲ／ＳＥＴ Ｄｏｍａｉｎ １（ＰＲＤＭ１）、Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｏｒ ２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ４ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｍｅｍｂｅｒ ３（ＮＲ４Ａ３）等が挙げられる。

【0014】

ヒトＳＰＩ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１０８０５４７．２、ＮＭ＿００３１２０．３等である。ヒトＣＥＢＰＡ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２８５８２９．１、ＮＭ＿００１２８７４２４．２、ＮＭ＿００１２８７４３５．１等である。ヒトＰＴＡＦＲ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿０００９５２．５、ＮＭ＿００１１６４７２１．２、ＮＭ＿００１１６４７２２．３等である。ヒトＦＬＩ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１６７６８１．３、ＮＭ＿００１２７１０１０．２、ＮＭ＿００１２７１０１２．２等である。ヒトＭＥＦ２Ｃ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１３１００５．２、ＮＭ＿００１１９３３４７．１、ＮＭ＿００１１９３３４８．１等である。ヒトＥＧＲ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿０００３９９．５、ＮＭ＿００１１３６１７７．３、ＮＭ＿００１１３６１７８．２等である。ヒトＲＵＮＸ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１００１８９０．３、ＮＭ＿００１１２２６０７．２、ＮＭ＿００１７５４．５等である。ヒトＴＮＦ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００５９４．４である。ヒトＣＥＢＰＢ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２８５８７８．１、ＮＭ＿００１２８５８７９．１、ＮＭ＿００５１９４．４等である。ヒトＩＫＺＦ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２２０７６５．３、ＮＭ＿００１２２０７６７．２、ＮＭ＿００１２２０７６８．２等である。ヒトＫＬＦ６遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１６０１２４．２、ＮＭ＿００１１６０１２５．２、ＮＭ＿００１３００．６等である。ヒトＮＦＩＣ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２４５００２．２、ＮＭ＿００１２４５００４．２、ＮＭ＿００１２４５００５．２等である。ヒトＥＬＦ４遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１２７１９７．２、ＮＭ＿００１４２１．４等である。ヒトＰＡＸ８遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００３４６６．４、ＮＭ＿０１３９５１．３、ＮＭ＿０１３９５２．４等である。ヒトＰＲＤＭ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１９８．４、ＮＭ＿１８２９０７．３等である。ヒトＭＥＦ２Ａ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１３０９２６．５、ＮＭ＿００１１３０９２７．５、ＮＭ＿００１１３０９２８．４等である。ヒトＮＲ４Ａ３遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００６９８１．４、ＮＭ＿１７３１９９．４等である。

【0015】

実施例において後述するように、これらの転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入することにより、ミクログリアに分化誘導することができる。なお、多能性幹細胞に転写因子をトランスフェクションして分化誘導する手法はフォワードプログラミングとも呼ばれる。これらの転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0016】

これらの転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸は、ｍＲＮＡであってもよいし、発現ベクターであってもよい。また、発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよいし、プラスミドベクターであってもよい。

【0017】

本実施形態の製造方法において、Ｃ３遺伝子の発現を増加させる転写因子は、少なくともＣＥＢＰＡを含むことが好ましく、少なくともＣＥＢＰＡを含む２種以上であることが好ましい。

【0018】

Ｃ３遺伝子の発現を増加させる転写因子のより具体的な組み合わせとしては、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡ、ＰＴＡＦＲ、ＦＬＩ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＥＧＲ２、ＲＵＮＸ１、ＴＮＦ、ＣＥＢＰＢ、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ、ＥＬＦ４、ＰＡＸ８、ＰＲＤＭ１、ＭＥＦ２Ａ、ＮＲ４Ａ３のうち、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ又はＰＡＸ８を含む、２種～５種の転写因子の組み合わせが挙げられる。

【0019】

Ｃ３遺伝子の発現を増加させる転写因子の更に具体的な組み合わせとしては、ＣＥＢＰＡ、ＭＥＦ２Ｃ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＣＥＢＰＡ、ＮＦＩＣ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＣＥＢＰＡ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＣＥＢＰＢ、ＫＬＦ６、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＰＴＡＦＲ、ＣＥＢＰＢ、ＰＡＸ８の組み合わせ、ＣＥＢＰＡ、ＫＬＦ６、ＰＡＸ８の組み合わせ等が挙げられる。

【0020】

実施例において後述するように、本実施形態の製造方法において、転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を導入した多能性幹細胞を培養する培地は特に限定されない。

【0021】

［ミクログリア］
一実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造されたミクログリアを提供する。本実施形態のミクログリアは、製造方法が特徴的であるため、他の方法で分化誘導されたミクログリア、又は、生体内のミクログリアと比較して、遺伝子発現プロファイル等に相違があるものと考えられる。しかしながら、そのような相違を特定し、遺伝子発現プロファイルの相違等により、本実施形態のミクログリアであるか否かを特定することは非常に困難であり、実際的ではない。このため、製造方法により特定することが現実的である。

【実施例0022】

［実験例１］
（ミクログリアのマーカー遺伝子の選択）
公開された論文を参照し、独自の重み付けを行って、ミクログリアのマーカーとなり得る遺伝子セットを選択した。表１に、発明者らが選択したミクログリアのマーカー遺伝子のセットを示す。

【0023】

【表1】

【0024】

［実験例２］
（ミクログリア分化用転写因子の選択）
公開された論文を参照し、ミクログリアを分化誘導するために適していると考えられる、ミクログリア分化用転写因子を選択した。より具体的には、多能性幹細胞に導入することにより、上記表１に示すミクログリアのマーカー遺伝子の発現を促進すると考えられる転写因子を選択した。下記表２に、発明者らが選択したミクログリア分化用転写因子のリストを示す。以下、簡略化のため、それぞれの遺伝子を「Ａ」～「Ｑ」のアルファベット一文字で示す。

【0025】

【表2】

【0026】

［実験例３］
（分化誘導１次評価）
表２に示す１７種類の転写因子を用いて、ｉＰＳ細胞に転写因子をトランスフェクションするフォワードプログラミングによって、ｉＰＳ細胞をミクログリアに分化誘導できるか否かを確認した。まず、１次評価として、上記表２に示す転写因子を、下記表３に示す、３８４通りの組み合わせでｉＰＳ細胞にトランスフェクションし、遺伝子発現解析を行った。

【0027】

【表3】

【0028】

《ｉＰＳ細胞培養》
ｉＰＳ細胞としては、ＨＰＳ１００５ １３８３Ｄ２（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を用いた。ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（味の素、ＡＪ１００、以下、「ＳｔｅｍｉＦｉｔ」という場合がある。）をメーカーの指示にしたがって調製した。ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ｙ－２７６３２（富士フイルム和光純薬、０３６－２４０２３）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１０ｍＭに調製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（－）でｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（タカラバイオ、８９２０２１）を０．５μｇ／ｃｍ^２に希釈したコーティング溶液を調製し、１５０ｍｍのディッシュ４枚に２０ｍＬずつ添加して３７℃で１時間プレコートした。

【0029】

１時間後にコーティング溶液をアスピレートし、ＳｔｅｍＦｉｔに１０ｍＭのＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ Ｙ－２７６３２を１／１，０００量添加した培養液（以下、「Ｍｅｄｉｕｍ ＳＹ」という場合がある。）を用いて１ディッシュあたり５．０×１０^５個の細胞を播種し、適切な細胞数に増殖するまで３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。播種翌日からはＳｔｅｍＦｉｔを用いて培地交換を行った。

【0030】

《ｉＰＳ細胞の播種》
ｉＰＳ細胞の培養には９６ウェルプレートを用いた。１２枚の９６ウェルプレートの全ウェルにｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（タカラバイオ、８９２０２１）を０．５μｇ／ｃｍ^２の濃度でプレコートし、ｉＰＳ細胞を播種する直前にアスピレートした。

【0031】

１５０ｍｍディッシュで培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１Ｘ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５６３－０２９）と０．５ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液（ナカライテスク、１３５６７－８４）を等量混合した溶液を添加して３７℃で５分インキュベートした後、１，０００μＬのマイクロピペットで注意深く撹拌して細胞をディッシュから剥離し、遠沈管に回収した。

【0032】

細胞懸濁液を回収した遠沈管に、Ｍｅｄｉｕｍ ＳＹを細胞懸濁液と等量だけ添加してＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔの反応を停止させた。２００×ｇで３分間遠心した後、上清をアスピレートしてソフトペレットを作製し、タッピングでペレットをほぐした後にＭｅｄｉｕｍ ＳＹを添加して細胞を再懸濁した。

【0033】

生存率と細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で計測し、トランスフェクションに適切なコンフルエンシーの条件を用意するため、１．７９×１０^５、３．０４×１０^５、４．３０×１０^５個／ｍＬの３濃度水準の細胞懸濁液をＭｅｄｉｕｍ ＳＹで調製した。

【0034】

それぞれの濃度の細胞懸濁液を、コーティングした４枚ずつの９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注して、３濃度水準で１濃度水準あたり４枚の９６ウェルプレートを作製し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。

【0035】

《トランスフェクション》
転写因子はｍＲＮＡの形態でトランスフェクションした。ｍＲＮＡは、氷上で融解し、０．１μｇ／μＬの濃度に調製し、上記表３に示す組み合わせに０．５μＬずつ混合して１．５μＬにしたｍＲＮＡミックスのストックを４セット調製し、トランスフェクションで使用するまで－８０℃で冷凍保存した。

【0036】

ｉＰＳ細胞播種の１日後（Ｄａｙ１）、７０～９０％のコンフルエンシーとなっている濃度水準の４プレートを選択し、ＳｔｅｍＦｉｔに培地交換してトランスフェクションを実施するまで３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。

【0037】

Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、３１９８５０６２、以下、「Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ」という場合がある。）を常温に戻し、ｍＲＮＡミックスのストックを氷上で３０分かけて解凍した。

【0038】

９６ウェルプレートの１ウェルあたり、３６．７μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＬＭＲＮＡ００１）を混合してＭｉｘ１溶液を調製し、１０分間室温でインキュベートした。次に、３６．７μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに１．５μＬのｍＲＮＡミックスを添加してタッピングによって混合したＭｉｘ２溶液を調製した。

【0039】

続いて、１２μＬのＭｉｘ２溶液を、インキュベートしたＭｉｘ１溶液１２μＬとピペッティングにより混合してトランスフェクション溶液を調製し、５分間室温でインキュベートした。続いて、ｉＰＳ細胞が播種された４枚の９６ウェルプレートの全ウェルに、上記表３のｍＲＮＡの組み合わせで調製したトランスフェクション溶液を２０．８μＬずつ滴下し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で３時間インキュベートした。３時間後、ＳｔｅｍＦｉｔを全量交換し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２時間インキュベートした。

【0040】

２時間後、同様のトランスフェクション操作をもう一度実施し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で一晩インキュベートし、Ｄａｙ２も２回、合計４回のトランスフェクションを実施した。

【0041】

《１次評価のＲＮＡ－ｓｅｑ解析》
Ｄａｙ３で、分化誘導した４枚の９６ウェルプレートの全３８４ウェルに対してＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。ＲＮＡ－ｓｅｑは、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法（Picelli S., et al., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2, Nat Protoc., 9 (1), 171-181, 2014.）及びＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法（Sasagawa Y., et al., Quartz-Seq2: a high-throughput single-cell RNA-sequencing method that effectively uses limited sequence reads, Genome Biol., 19 (1), 29, 2018.）により行った。

【0042】

３８４サンプルのうち、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法では３５４サンプル、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法では２９７サンプル、両者のデータを合わせると３７９サンプルについて解析に値するトランスクリプトームデータが得られた。

【0043】

得られたトランスクリプトームデータから、上記表１に示すミクログリアのマーカー遺伝子のセットのうち、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＡＤＡＭ２８、Ａ２Ｍ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｃ３、Ｐ２ＲＹ１２の７つの遺伝子の発現量を、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２ではＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２ではＣＰＭ（Ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ、ＵＭＩカウント数を１００万で正規化した値）をｌｏｇ_２でヒートマップ化して確認した。

【0044】

図１は、ミクログリアのマーカー遺伝子の発現状態を示すヒートマップである。図１中、横軸がｉＰＳ細胞に導入した転写因子の組み合わせを表し、縦軸が７つのミクログリアのマーカー遺伝子を示す。また、上段にＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法で取得した遺伝子発現量のｌｏｇ_２（ＣＰＭ＋１）のヒートマップを示し、下段にＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得した遺伝子発現量のｌｏｇ_２（ＴＰＭ＋１）のヒートマップを表す。カラースケールの上限は６である。

【0045】

その結果、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法の結果では、ほぼ全サンプルに渡ってＣ３が発現し、それに次いでＡＤＡＭ２８が多くのサンプルで発現している様子が確認された。また、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法の結果では、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法よりも観測されたＴＰＭ値が小さいものの、Ｃ３を発現しているサンプルが多く確認された。以上の結果から、上記表３に示すほぼ全ての転写因子の組み合わせにおいて、ｉＰＳ細胞がミクログリア様の細胞へと分化したことが示唆された。

【0046】

図２は、ｉＰＳ細胞に導入した転写因子の組み合わせを、上記の７遺伝子の発現量が多い順に左から並べたヒートマップである。図２中、横軸が転写因子の組み合わせを表し、縦軸が７つのミクログリアマーカー遺伝子を示す。また、上段にＱｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法で取得した遺伝子発現量のｌｏｇ_２（ＣＰＭ＋１）のヒートマップ（カラースケールの上限６）を示し、下段にＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得した遺伝子発現量のｌｏｇ_２（ＴＰＭ＋１）のヒートマップ（カラースケールの上限２）を表す。

【0047】

その結果、３８４種の組み合わせの中でも、シンボルがＢ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｎ等の転写因子を含む組み合わせにおいてミクログリアマーカー遺伝子の発現量が高いことが確認された。

【0048】

続いて、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法で取得したトランスクリプトームデータについて、それぞれ主成分分析と因子分析を行った。図３（ａ）は、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得したトランスクリプトームデータの主成分分析の結果である。横軸がＰＣ１を表し、縦軸がＰＣ２を表す。図３（ｂ）は、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法で取得したトランスクリプトームデータの因子分析の結果である。横軸がＦａｃｔｏｒ １を表し、縦軸がＦａｃｔｏｒ ２を表す。Ｆａｃｔｏｒ ２の正方向にミクログリアマーカー遺伝子の発現量が寄与している。

【0049】

その結果、主成分分析では、ＰＣ１の正側、因子分析ではＦａｃｔｏｒ ２の正側に、ミクログリアマーカー遺伝子が高発現している転写因子の組み合わせが分布していることが確認された。

【0050】

Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法それぞれの主成分分析及び因子分析の結果、及び、図２におけるマーカー遺伝子の発現量に基づいて、ミクログリアへの分化誘導により適している転写因子の組み合わせを選択した。表４に、選択したミクログリアへの分化誘導能が高い転写因子の組み合わせを示す。

【0051】

【表4】

【0052】

［実験例４］
（分化誘導２次評価）
転写因子の組み合わせ条件について、更に分化培養条件を検討した。表４に示すミクログリアへの分化誘導能が高いと判断された転写因子の組み合わせについて、転写因子のトランスフェクションによるフォワードプログラミングに加え、分化培地による分化誘導を行って、ｉＰＳ細胞をミクログリアへと分化させ、ＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトーム解析を実施した。

【0053】

《分化培地》
ｉＰＳ細胞に転写因子の組み合わせをトランスフェクションした後、分化培地で４日間分化誘導してミクログリアへと分化させた。分化培地には、基礎培地として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２の３種類を用いた。それぞれの基礎培地に、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｐを加えた培地をＭ１、Ｍ２、Ｍ３とした。また、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３に、更にＣＤ２００、ＣＸ３ＣＬ１、ＴＧＦ－ｂｅｔａを加えた培地を、それぞれＭ４、Ｍ５、Ｍ６とした。下記表５に、Ｍ１～Ｍ６の６種類の培地の組成を示す。

【0054】

【表5】

【0055】

《分化培養》
トランスフェクションまでは、上記表４の３１種類の転写因子の組み合わせと、分化培地のみの分化誘導を確認するためにｍＲＮＡミックスの代わりにＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを用いたｎｔｆｃ（ｎｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）を加えた３２条件について、分化培地６種類に対し、トリプリケートで分化培養した。

【0056】

トランスフェクションは、実験例３と同様のプロトコールにより行った。２種類の転写因子の組み合わせによるｍＲＮＡミックスは、０．１μｇ／μＬの濃度で０．７５μＬずつ混合して１．５μＬとした。また、１種類のみの転写因子をトランスフェクションした場合について調査するため、上記表２のｍＲＮＡを０．１μｇ／μＬの濃度で１．５μＬとしてトランスフェクションした。全ての１回目のトランスフェクション溶液作製時に、ｓｉＰＯＵ５Ｆ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ｓ１０８７３）を２０ｎＭで添加した。

【0057】

Ｄａｙ２の４回目のトランスフェクション後の培地交換時に、培地をＳｔｅｍＦｉｔから上記表５に示す分化培地に変更した。分化培地の交換は１日置きに実施し、Ｄａｙ７で全てのサンプルに対しＲＮＡ抽出を行った。

【0058】

１種類のみの転写因子をトランスフェクションしたサンプルは、ＳｔｅｍＦｉｔに培地交換し、Ｄａｙ３にＲＮＡ抽出を行った。

【0059】

続いて、Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法でＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。また、ＲＮＡ－ｓｅｑの際に、コントロールとして、Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ：５０μｇ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、３７０８９ＲＮＡ）、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、１μｇ（３Ｈバイオメディカル、３Ｈ１００－３０－１０）、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ（ＭｏＤＣｓ）、１μｇ（３Ｈバイオメディカル、３Ｈ１００－７０－１０）と、Ｈｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｆｒｏｚｅｎ Ｖｉａｌ（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、３６０７０－０１）を培養後に抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡ、播種する際に採取したｉＰＳ細胞から抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン、７４００４）を用いた。

【0060】

《２次評価のＲＮＡ－ｓｅｑ解析》
Ｑｕａｒｔｚ－ｓｅｑ２法により得られたＵＭＩカウント数について、Ｃ３及びＰ２ＲＹ１２の発現量を確認した。図４は、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果をまとめた図である。図４中、セル内の数字がＵＭＩカウント数を表し、サンプル間のＵＭＩカウント数ばらつきを１００万で正規化し、Ｃ３とＰ２ＲＹ１２の発現量が多い順に上から並べた上位５０サンプルを示している。また、ミクログリアコントロールは１３番目に位置している。ミクログリアコントロールでは、Ｐ２ＲＹ１２の発現は確認されなかった。

【0061】

また、ＢＬＮ、ＫＬＮ、ＩＫＮ等の、Ｂ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎが含まれる転写因子の組み合わせを導入したｉＰＳ細胞において、Ｃ３が高発現しており、ＢＬＮについては分化培地の種類によらず上位５０サンプルに含まれていた。

【0062】

図５は、ＵＭＡＰによるクラスタリングを行った結果を示す図である。その結果、１３のクラスタが確認された。図６は、１種類のみの転写因子を導入し、Ｄａｙ３においてＲＮＡ抽出したサンプルであるＭ０、分化培地Ｍ１からＭ６、各種コントロールであるＭｚについて、ＵＭＡＰクラスタリングを分類した結果を示す図である。

【0063】

その結果、図５におけるクラスタ９及び１２は、１種類のみの転写因子を導入し、Ｄａｙ３でＲＮＡ抽出したサンプルであることが明らかとなった。コントロールについては、ミクログリアはクラスタ１に分布しており、単球、樹状細胞、マクロファージはクラスタ１０に分布することが明らかとなった。

【0064】

分化培地について比較すると、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌベースのＭ１、Ｍ４ではクラスタ７及び１０は存在しなかった。このことから、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌベースで分化誘導したサンプルは、単球、樹状細胞、マクロファージに近似したトランスクリプトーム状態ではないであろうことが示唆された。

【0065】

ミクログリアのコントロールに近い位置に分布しているサンプルを確認すると、ＢＩＮ、ＣＩＮ、ＢＮ、ＢＫＮが多く分布していた。

【0066】

また、単球、樹状細胞、マクロファージに近い位置に分布しているサンプルはＡＢＤ、ＡＥＩ、ＢＤＦ、ＤＩＪ、ＤＩＰであった。

【0067】

以上の結果から、分化培地を用いた２次評価により、上記表２の転写因子候補からＢＬＮ、ＫＬＮ、ＩＫＮ等の、Ｂ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎが含まれる組み合わせを選択することがミクログリアへの分化方法として適していることが明らかとなった。

【0068】

［実験例５］
（機能評価）
２次評価でミクログリア分化能が高いと示唆された転写因子の組み合わせについて、ミクログリアの機能である貪食能が表現されているかを確認した。

【0069】

《分化誘導条件》
１次評価、２次評価の結果に基づいて、ＢＮ、ＢＥＮ、ＢＩＮ、ＢＬＮ、ＩＫＮ、ＫＬＮの転写因子の組み合わせによる、ｉＰＳ細胞のミクログリアへの分化誘導を評価した。また、比較のために、コントロールにした血球系細胞に近しいトランスクリプトーム状態であった転写因子の組み合わせである、ＡＢ、ＡＢＤ、ＡＥＩ、ＤＩＪ、ＤＩＰについても分化誘導を行った。

【0070】

分化誘導では、実験例４の分化誘導条件を２４ウェルプレートにスケールアップし、各転写因子の組み合わせについてＮ４で実施した。分化培地にはＭ６を用いた。実験例４と同様、４回のトランスフェクション後に分化培地Ｍ６で分化誘導した。続いて、Ｄａｙ７でＮ３サンプル分についてＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔでＲＮＡを抽出し、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法によりＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。

【0071】

また、コントロールには、播種時のｉＰＳ細胞、ｎｔｆｃ、実験例４で用いたものと同様のミクログリア、単球、樹状細胞に加え、ｉＣｅｌｌミクログリア（富士フイルム和光純薬、Ｃ１１１０）を培養してＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔでＲＮＡ抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。残りのＮ１は、Ｄａｙ７から引き続き分化培地Ｍ６で培養を続け、Ｄａｙ１１で継代し、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｐを添加しないＭ６培地で培養した。続いて、Ｄａｙ１４にオーバーナイトで１３時間のタイムラプス動画を撮影し、分化させた細胞の貪食能を確認した。

【0072】

《Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法によるＲＮＡ－ｓｅｑ》
Ｄａｙ７におけるＲＮＡ抽出時において、ＡＢ、ＡＢＤ、ＡＥＩ、ＤＩＪ、ＤＩＰ、ｎｔｆｃでは接着細胞が少なかった。そこで、浮遊している細胞については遠心して細胞を沈降させて接着している細胞とともにＲＮＡ抽出を行った。

【0073】

Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２法におけるｃＤＮＡのクオリティチェックにおいて、前述した転写因子の組み合わせ及びミクログリアのコントロール（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）についてはｃＤＮＡの鎖長が短く、ＲＮＡのクオリティが良好ではないことが確認された。

【0074】

上記表１に示すミクログリアのマーカーのうち、重要マーカーと考えられる、Ｃ３、Ｐ２ＲＹ１２に加え、ミクログリア特異的に発現している遺伝子と確認されている、ＡＰＯＥ、ＢＨＬＨＥ４１、ＣＡＢＬＥＳ１、ＯＬＦＭＬ３、ＰＲＯＳ１、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＴＭＥＭ１１９、ＴＲＥＭ２について発現量を確認した。

【0075】

図７は、ミクログリアの各マーカー遺伝子の発現量を示す図である。図７中、横軸は発現量を示す。その結果、ｉｃｅｌｌミクログリアではほぼ全てのマーカー遺伝子の発現が確認された。重要マーカーと考えられるＰ２ＲＹ１２については、ｉＣｅｌｌミクログリアにおいても発現はわずかであり、分化誘導したサンプルでもＡＢ、ＡＥＩ、ＤＩＪ、ＤＩＰ、ＫＬＮでＮ１ずつ確認されたのみであった。

【0076】

Ｃ３については、ミクログリア（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）、ｉＣｅｌｌミクログリアで高発現していた。また、実験例３、実験例４でミクログリアへの分化誘導能が高いことが示唆された、ＢＮ、ＢＥＮ、ＢＩＮ、ＢＬＮ、ＩＫＮ、ＫＬＮの組み合わせで発現量が高いことが再現された。

【0077】

また、図７に示すミクログリアマーカーにおいては、ＢＮ、ＢＥＮ、ＢＩＮ、ＢＬＮ、ＩＫＮ、ＫＬＮ、ＤＩＰの組み合わせで発現量の総量が多いことが確認された。

【0078】

《機能評価》
Ｄａｙ１１の継代時において、ＡＢ、ＡＢＤ、ＡＥＩ、ＤＩＪ、ＤＩＰ、ｎｔｆｃにおいては接着細胞が少なかったため、ＢＥＮ、ＢＩＮ、ＢＬＮ、ＢＮ、ＩＫＮ、ＫＬＮのみ継代を実施した。Ｄａｙ１４において、ＣＱ１（横河電気）を用いてオーバーナイトで１３時間のタイムラプス撮影を実施した。

【0079】

図８にＢＮのタイムラプス動画の代表的な貪食シーンを、図９にＢＬＮの代表的な貪食シーンを示す。図８、図９中、左から右へ時間が経過している。また、矢印は貪食能を有する細胞を示す。その結果、貪食能を有する細胞は活発に遊走し、細胞のサイズが３０μｍ～１００μｍ程度と比較的大きく、次々に細胞を貪食していた。継代を実施できた、ＢＥＮ、ＢＩＮ、ＢＬＮ、ＢＮ、ＩＫＮ、ＫＬＮにおいて、タイムラプス動画で貪食能を有していることが確認された。

【0080】

以上の結果から、Ｃ３及びその他ミクログリア特異的なマーカー遺伝子の発現が高くなる転写因子の組み合わせをトランスフェクションすることにより、１４日間でｉＰＳ細胞からミクログリアへと分化誘導できることが確認された。

【0081】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］ミクログリアの製造方法であって、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３（Ｃ３）遺伝子の発現を増加させる転写因子のオープンリーディングフレームを含む核酸を、多能性幹細胞に導入する工程を含む、製造方法。
［２］前記転写因子が、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡ、ＰＴＡＦＲ、ＦＬＩ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＥＧＲ２、ＲＵＮＸ１、ＴＮＦ、ＣＥＢＰＢ、ＩＫＺＦ１、ＫＬＦ６、ＮＦＩＣ、ＥＬＦ４、ＰＡＸ８、ＰＲＤＭ１、ＭＥＦ２Ａ及びＮＲ４Ａ３からなる群より選択される、［１］に記載の製造方法。
［３］前記転写因子が、少なくともＣＥＢＰＡを含む、［２］に記載の製造方法。
［４］前記転写因子が、少なくともＣＥＢＰＡを含む２種以上である、［２］又は［３］に記載の製造方法。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0082】

【特許文献1】国際公開第２０２０／２５２４７７号

【特許文献2】米国特許出願公開第２０２０／００６３１０５号明細書

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】