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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023140980
(43)【公開日】2023-10-05
(54)【発明の名称】標識抗体の製造方法、標識抗体及び免疫学的測定法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/553 20060101AFI20230928BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
G01N33/553
G01N33/543 521
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022047077
(22)【出願日】2022-03-23
(71)【出願人】
【識別番号】000006644
【氏名又は名称】日鉄ケミカル＆マテリアル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100115118
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 和浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095588
【弁理士】
【氏名又は名称】田治米 登
(74)【代理人】
【識別番号】100094422
【弁理士】
【氏名又は名称】田治米 惠子
(74)【代理人】
【識別番号】110000224
【氏名又は名称】弁理士法人田治米国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】榎本 靖
(72)【発明者】
【氏名】松村 康史
(72)【発明者】
【氏名】新田 龍三
(57)【要約】
【課題】 金属－樹脂複合体に結合している抗体量が十分に多く、高感度な免疫学的測定が可能な標識抗体を提供する。
【解決手段】 抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって前記抗体を前記金属－樹脂複合体に付着させる結合工程を含む標識抗体の製造方法。グッド緩衝剤は、２－［４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－トリス(ヒドロキシメチル)メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロへヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２－シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）及びＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）から選ばれる１種以上が好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】 抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって前記抗体を前記金属－樹脂複合体に付着させる結合工程を含む標識抗体の製造方法。グッド緩衝剤は、２－［４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－トリス(ヒドロキシメチル)メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロへヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２－シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）及びＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）から選ばれる１種以上が好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標識された抗体を製造する標識抗体の製造方法であって、
抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって前記抗体を前記金属－樹脂複合体に付着させる結合工程、
を含むことを特徴とする標識抗体の製造方法。
抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって前記抗体を前記金属－樹脂複合体に付着させる結合工程、
を含むことを特徴とする標識抗体の製造方法。
【請求項2】
前記グッド緩衝剤が、２－［４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－トリス(ヒドロキシメチル)メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロへヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２－シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）及びＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）から選ばれる１種以上である請求項１に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項3】
前記結合工程において、使用した全抗体量に対して付着した抗体の割合が５０重量％以上である請求項１又は２に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項4】
前記金属粒子が、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム又はこれらのいずれかを含む合金である請求項１から３のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項5】
前記金属粒子が、前記樹脂粒子内に埋包された部位及び前記樹脂粒子外に露出した部位を有する金属粒子を含んでいる請求項１から４のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項6】
前記金属粒子の少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布している請求項１から５のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項7】
前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子である請求項１から６のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項8】
前記金属粒子の平均粒子径が１～８０ｎｍの範囲内である請求項１から７のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項9】
前記金属－樹脂複合体の平均粒子径が１００～１０００ｎｍの範囲内である請求項１から８のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法によって製造された標識抗体。
【請求項11】
請求項１０に記載の標識抗体を用いることを特徴とする免疫学的測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、例えば免疫学的測定に使用可能な標識抗体の製造方法、標識抗体及び免疫学的測定法に関する。
【背景技術】
【0002】
イムノアッセイは、免疫学的測定法とも呼ばれ、抗原－抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。抗原－抗体反応は感度や反応の選択性が高いため、医薬等の分野で広く用いられている。イムノアッセイは、その測定原理により、様々な測定法が知られており、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。
【0003】
イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体または複合体の濃度変化）から、抗原または抗体を定性的または定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原または複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。
【0004】
そこで、高感度な免疫学的測定を可能にする標識物質として、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体が提案されている（例えば特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１６／００２７４２
【特許文献2】ＷＯ２０１６／００２７４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
金属－樹脂複合体を免疫学的測定法における標識物質として使用するためには、抗体などのリガンドを十分な量で結合させることが必要である。金属－樹脂複合体への抗体の結合量が少ないと、優れた検出感度が得られない。しかし、緩衝液中に分散させた金属－樹脂複合体は、凝集状態のものが多くなる傾向があり、抗体の結合量が減少して検出感度が大きく低下する場合がある。
【0007】
従って、本発明は、金属－樹脂複合体に結合している抗体量が十分に多く、高感度な免疫学的測定が可能な標識抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体を特定の結合用緩衝剤の下で抗体と結合させることによって、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明の標識抗体の製造方法は、標識された抗体を製造する方法であって、抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって前記抗体を前記金属－樹脂複合体に付着させる結合工程、
を含むものである。
を含むものである。
【0010】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記グッド緩衝剤が、２－［４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－トリス(ヒドロキシメチル)メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロへヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２－シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）及びＮ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）から選ばれる１種以上であってもよい。
【0011】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記結合工程において、使用した全抗体量に対して付着した抗体の割合が５０重量％以上であってもよい。
【0012】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子が、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム又はこれらのいずれかを含む合金であってもよい。
【0013】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子が、前記樹脂粒子内に埋包された部位及び前記樹脂粒子外に露出した部位を有する金属粒子を含んでいてもよい。
【0014】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子の少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していてもよい。
【0015】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であってもよい。
【0016】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子の平均粒子径が１～８０ｎｍの範囲内であってもよい。
【0017】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属－樹脂複合体の平均粒子径が１００～１０００ｎｍの範囲内であってもよい。
【0018】
本発明の標識抗体は、上記のいずれかの標識抗体の製造方法によって製造されたものである。
【0019】
本発明の免疫学的測定法は、上記標識抗体を用いるものである。
【発明の効果】
【0020】
本発明の標識抗体の製造方法によれば、特定の結合用緩衝液を用いることによって、金属－樹脂複合体の凝集が抑制され、抗体付着量が多く、高感度な免疫学的測定が可能な標識抗体を製造できる。本発明方法により得られる標識抗体は、耐久性、視認性、目視判定性、検出感度に優れた材料として、各種の免疫学的測定において有利に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【0023】
［標識抗体の製造方法］
本実施の形態の標識抗体の製造方法は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤（以下、「特定グッド緩衝剤」と記すことがある）を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって抗体を金属－樹脂複合体に付着させる結合工程、
を含むことができる。
本実施の形態の標識抗体の製造方法は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）抗体と、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する金属－樹脂複合体とを、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤（以下、「特定グッド緩衝剤」と記すことがある）を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって抗体を金属－樹脂複合体に付着させる結合工程、
を含むことができる。
【0024】
（抗体）
本実施の形態において、抗体としては、特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＣＲＰ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、抗ヒト心筋トロポニンI抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗体等が挙げられる。
本実施の形態において、抗体としては、特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＣＲＰ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、抗ヒト心筋トロポニンI抗体、抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）抗体等が挙げられる。
【0025】
（金属－樹脂複合体）
本実施の形態において、標識として使用される金属－樹脂複合体は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有するものである。この金属－樹脂複合体の詳細については後述する。
本実施の形態において、標識として使用される金属－樹脂複合体は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有するものである。この金属－樹脂複合体の詳細については後述する。
【0026】
＜工程Ａ：結合工程＞
工程Ａでは、抗体と金属－樹脂複合体とをｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって、抗体を金属－樹脂複合体に付着させる。本工程での金属－樹脂複合体と抗体との結合は、いわゆる物理的結合であり、金属－樹脂複合体における金属粒子の表面及び／又は樹脂粒子の表面に物理的な相互作用によって抗体を結合させる。ここで、物理的な相互作用による結合とは、例えば、静電気的結合、水素結合、親－疎水性相互作用、ファンデルワールス力を挙げることができる。
工程Ａでは、抗体と金属－樹脂複合体とをｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液の存在下で混合することによって、抗体を金属－樹脂複合体に付着させる。本工程での金属－樹脂複合体と抗体との結合は、いわゆる物理的結合であり、金属－樹脂複合体における金属粒子の表面及び／又は樹脂粒子の表面に物理的な相互作用によって抗体を結合させる。ここで、物理的な相互作用による結合とは、例えば、静電気的結合、水素結合、親－疎水性相互作用、ファンデルワールス力を挙げることができる。
【0027】
（結合用緩衝液）
本工程では、特定グッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液を用いる。グッド緩衝剤は、酸性の官能基と塩基性の官能基を持つ生化学的に有用な緩衝剤であり、これまで数十種類が知られている。その中でも、特定グッド緩衝剤は、一般的なグッド緩衝剤について知られている特性に加え、イオン強度が低いために緩衝液中で金属－樹脂複合体の凝集を効果的に抑制できるという顕著な作用を奏する。つまり、特定グッド緩衝剤は、金属－樹脂複合体に対して、他の標識物質に対する作用とは異質な作用である凝集抑制作用を奏することが確認された。そのため、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いて抗体と金属－樹脂複合体とを結合させることによって、金属－樹脂複合体の凝集が抑制された状態で抗体を作用させることが可能になり、例えば無機系の緩衝剤を用いる結合用緩衝液に比べて、金属－樹脂複合体への抗体の付着量を大幅に増加させることができる。
本工程では、特定グッド緩衝剤を含むｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液を用いる。グッド緩衝剤は、酸性の官能基と塩基性の官能基を持つ生化学的に有用な緩衝剤であり、これまで数十種類が知られている。その中でも、特定グッド緩衝剤は、一般的なグッド緩衝剤について知られている特性に加え、イオン強度が低いために緩衝液中で金属－樹脂複合体の凝集を効果的に抑制できるという顕著な作用を奏する。つまり、特定グッド緩衝剤は、金属－樹脂複合体に対して、他の標識物質に対する作用とは異質な作用である凝集抑制作用を奏することが確認された。そのため、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いて抗体と金属－樹脂複合体とを結合させることによって、金属－樹脂複合体の凝集が抑制された状態で抗体を作用させることが可能になり、例えば無機系の緩衝剤を用いる結合用緩衝液に比べて、金属－樹脂複合体への抗体の付着量を大幅に増加させることができる。
【0028】
特定グッド緩衝剤としては、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であればよいが、抗体の付着量を十分に確保する観点から、例えば、２－［４－（２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ；ｐＫａ（２０℃）７．５５］、Ｎ－トリス(ヒドロキシメチル)メチル－３－アミノプロパンスルホン酸［ＴＡＰＳ；ｐＫａ（２０℃）８．４０］、Ｎ－シクロへヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸［ＣＡＰＳ；ｐＫａ（２０℃）１０．４０］、２－シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸［ＣＨＥＳ；ｐＫａ（２０℃）９．５］、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸［ＴＡＰＳＯ；ｐＫａ（２０℃）７．７］等が好ましい。
グッド緩衝剤として知られる化合物群の中でも、２０℃におけるｐＫａが７．５未満のものは、金属－樹脂複合体の凝集を抑える効果は得られるが、抗体の結合に適したｐＨ範囲から外れてしまう場合が多いため抗体の十分な付着量を確保できない。
グッド緩衝剤として知られる化合物群の中でも、２０℃におけるｐＫａが７．５未満のものは、金属－樹脂複合体の凝集を抑える効果は得られるが、抗体の結合に適したｐＨ範囲から外れてしまう場合が多いため抗体の十分な付着量を確保できない。
【0029】
また、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いることによって、抗体の種類を問わず、金属－樹脂複合体によるテストストリップにおける目詰まりを防ぐことができるため、イムノクロマトグラフィーの陰性検体による偽陽性を抑制できる。
【0030】
本工程Ａでは、ｐＨ６～１０の範囲内の結合用緩衝液を用いることが好ましく、より好ましくはｐＨ６～８の範囲内である。結合用緩衝液のｐＨが６未満では抗体の付着量が減少する場合があり、ｐＨが１０を超えるとｐＨ調整のために添加するイオン成分が多くなり、緩衝液のイオン強度が大きくなるため金属－樹脂複合体の凝集を抑制する作用が乏しくなってしまう。ｐＨ６～１０の範囲内であれば、金属－樹脂複合体の凝集を抑制した状態で十分な量の抗体を結合させることが可能になり、免疫測定において優れた検出感度が得られる。
【0031】
工程Ａで使用する結合用緩衝液は、常法に従い調製できる。例えば、結合用緩衝液は、ｐＨが上記範囲内になるように、特定グッド緩衝剤の水溶液を所定濃度のアルカリ溶液と混合することによって調製できる。アルカリ溶液としては、例えば水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウムなどが好ましい。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば、塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
【0032】
（結合操作）
工程Ａでは、抗体と金属－樹脂複合体とを結合用緩衝液の存在下で混合し、十分に攪拌することによって、標識抗体分散液を得ることができる。本工程では、抗体と金属－樹脂複合体とを結合用緩衝液中で結合させればよいため、結合用緩衝液に予め金属－樹脂複合体を分散させておき、そこに抗体を添加してもよいし、結合用緩衝液に予め抗体を分散させておき、そこに金属－樹脂複合体を添加してもよい。分散は、公知の方法で行うことができるが、例えば超音波処理、ローテーターによる撹拌、ボルテックスミキサーなどの分散手段を用いることが好ましい。このようにして得られた標識抗体分散液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体のみを分取できる。
工程Ａでは、抗体と金属－樹脂複合体とを結合用緩衝液の存在下で混合し、十分に攪拌することによって、標識抗体分散液を得ることができる。本工程では、抗体と金属－樹脂複合体とを結合用緩衝液中で結合させればよいため、結合用緩衝液に予め金属－樹脂複合体を分散させておき、そこに抗体を添加してもよいし、結合用緩衝液に予め抗体を分散させておき、そこに金属－樹脂複合体を添加してもよい。分散は、公知の方法で行うことができるが、例えば超音波処理、ローテーターによる撹拌、ボルテックスミキサーなどの分散手段を用いることが好ましい。このようにして得られた標識抗体分散液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体のみを分取できる。
【0033】
（抗体結合収率）
本結合工程では、使用した全抗体量に対して金属－樹脂複合体に付着した抗体の割合（「抗体結合収率」ともいう。）が５０重量％以上であることが好ましく、７０重量％以上であることがより好ましい。付着した抗体の割合が５０重量％未満では、高価な抗体が有効利用されず無駄になることから好ましくない。本発明では、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いることによって、抗体の結合収率を５０重量％以上に高めることができるため、抗体を有効利用しながら標識抗体を用いる免疫測定において優れた検出感度を得ることができる。
本結合工程では、使用した全抗体量に対して金属－樹脂複合体に付着した抗体の割合（「抗体結合収率」ともいう。）が５０重量％以上であることが好ましく、７０重量％以上であることがより好ましい。付着した抗体の割合が５０重量％未満では、高価な抗体が有効利用されず無駄になることから好ましくない。本発明では、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いることによって、抗体の結合収率を５０重量％以上に高めることができるため、抗体を有効利用しながら標識抗体を用いる免疫測定において優れた検出感度を得ることができる。
【0034】
また、金属－樹脂複合体を結合用緩衝液中に分散させて得られる試薬組成物は、金属－樹脂複合体の非凝集比率が５０％以上であることが好ましい。ここで、非凝集比率とは、金属－樹脂複合体が凝集せずに単一粒子として分散している比率を意味し、体積・質量基準の粒度分布の測定結果から求めることができる。
【0035】
非凝集比率が５０％以上であることによって、標識抗体を製造する場合の抗体結合収率を高め、金属－樹脂複合体への抗体付着量を増加させることが可能になり、標識抗体を用いて免疫測定を行う場合に優れた検出感度を得ることができる。このように高い非凝集比率は、金属－樹脂複合体に対して、特定グッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を用いることによって実現される。それに対して、非凝集比率が５０％未満である場合は、金属－樹脂複合体の凝集粒子の割合が相対的に大きいことを意味するため、標識抗体を製造する場合の抗体結合収率及び金属－樹脂複合体への抗体付着量が共に低下するとともに、標識抗体を用いて免疫測定を行う場合の検出感度が劣るものとなる。
【0036】
本実施の形態の標識抗体の製造方法は、さらに、次の工程Ｂを含むことができる。
【0037】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、標識抗体をｐＨ２～９の範囲内のブロック用緩衝液中に分散させる工程である。工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体をｐＨ２～９の範囲内のブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）中に分散させることによって、標識抗体への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、例えば固液分離手段によって分取しておいた標識抗体を、ｐＨ２～９の範囲内の条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、抗体の活性を保ち、かつ、標識抗体の凝集を抑制する観点から、好ましくはｐＨ４～９の範囲内であり、標識抗体の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５～９の範囲内が好ましい。ブロック用緩衝液がｐＨ２未満では、強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９を超えると、標識抗体が凝集してしまい分散が困難となる場合がある。
工程Ｂは、標識抗体をｐＨ２～９の範囲内のブロック用緩衝液中に分散させる工程である。工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体をｐＨ２～９の範囲内のブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）中に分散させることによって、標識抗体への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、例えば固液分離手段によって分取しておいた標識抗体を、ｐＨ２～９の範囲内の条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、抗体の活性を保ち、かつ、標識抗体の凝集を抑制する観点から、好ましくはｐＨ４～９の範囲内であり、標識抗体の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５～９の範囲内が好ましい。ブロック用緩衝液がｐＨ２未満では、強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９を超えると、標識抗体が凝集してしまい分散が困難となる場合がある。
【0038】
工程Ｂは、例えば、工程Ａで得られた所定量の標識抗体に上記ｐＨ範囲に調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能な蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体の分散には、公知の方法が使用できるが、例えば超音波処理、ローテーターによる撹拌などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体が均一分散した標識抗体分散液が得られる。この標識抗体分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理工程、保存処理工程など任意の工程を実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
【0039】
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる処理である。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８～９の範囲内に調整した所定濃度のトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液）、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる処理である。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８～９の範囲内に調整した所定濃度のトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液）、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
【0040】
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる処理である。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、上記洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液を用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体の保存処理を行うことができる。
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる処理である。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、上記洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液を用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体の保存処理を行うことができる。
【0041】
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
【0042】
［標識抗体］
以上のようにして標識抗体を製造することができる。本発明方法で得られる標識抗体は、従来の標識抗体と同様に、各種の免疫学的測定に利用できる。例えば、アナライトを含む試料と標識抗体とを混合し、反応させ、それによって生じる発色を、肉眼的に、あるいは分析機器を用いて測定することによって免疫学的測定が可能になる。
以上のようにして標識抗体を製造することができる。本発明方法で得られる標識抗体は、従来の標識抗体と同様に、各種の免疫学的測定に利用できる。例えば、アナライトを含む試料と標識抗体とを混合し、反応させ、それによって生じる発色を、肉眼的に、あるいは分析機器を用いて測定することによって免疫学的測定が可能になる。
【0043】
＜金属－樹脂複合体＞
次に、本実施の形態の標識抗体の製造方法において標識として使用される金属－樹脂複合体の一例について詳細に説明する。金属－樹脂複合体は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する。
次に、本実施の形態の標識抗体の製造方法において標識として使用される金属－樹脂複合体の一例について詳細に説明する。金属－樹脂複合体は、樹脂粒子に金属粒子が固定化された構造を有する。
【0044】
図１は、本実施の形態において標識として使用可能な金属－樹脂複合体１００の断面模式図である。金属－樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０と、金属粒子２０と、を備えている。
【0045】
（金属－樹脂複合体の構造）
金属－樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散または固定化されている。また、金属－樹脂複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において三次元的に分布し、かつ三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されていることが好ましい。ここで、「表層部」とは、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。
金属－樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散または固定化されている。また、金属－樹脂複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において三次元的に分布し、かつ三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されていることが好ましい。ここで、「表層部」とは、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。
【0046】
ここで、金属粒子２０は、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子（以下、「内包金属粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子（以下、「一部露出金属粒子４０」ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子（以下、「表面吸着金属粒子５０」ともいう。）から選ばれる１種以上を含んでいてもよい。
【0047】
内包金属粒子３０は、その表面の全てが、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。免疫学的測定用標識としての耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。
表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。免疫学的測定用標識としての耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。
表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
【0048】
例えば、金属－樹脂複合体１００を免疫学的測定に使用する場合、樹脂粒子１０の表面、一部露出金属粒子４０の表面または表面吸着金属粒子５０の表面に、抗体を固定化して使用する。その際、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０には、抗体が固定化される一方で、内包金属粒子３０には固定化されない。しかし、内包金属粒子３０を含む金属粒子２０の全てが局在型表面プラズモン吸収を発現することから、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０のみならず、内包金属粒子３０も、免疫学的測定用標識としての視認性向上に寄与する。さらに、一部露出金属粒子４０及び内包金属粒子３０は、表面吸着金属粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等の物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、金属－樹脂複合体１００を使用した免疫学的測定用標識としての耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
【0049】
また、金属－樹脂複合体１００への金属粒子２０（内包金属粒子３０、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０の合計）の担持量は、金属－樹脂複合体１００の重量に対して、５重量％～７０重量％の範囲内であることが好ましい。この範囲内であれば、金属－樹脂複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属粒子２０の担持量が５重量％未満では、抗体の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の担持量は、より好ましくは、１５重量％～７０重量％の範囲内である。
【0050】
また、金属粒子２０の１０重量％～９０重量％の範囲内が、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることが好ましい。この範囲内であれば、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。金属粒子２０の２０重量％～８０重量％の範囲内が一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることがより好ましい。
【0051】
また、金属粒子２０の６０重量％～１００重量％の範囲内が、表層部６０に存在していることが好ましく、表層部６０に存在する金属粒子２０の５重量％～９０重量％の範囲内が、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０であることが、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属粒子２０の１０重量％～９５重量％の範囲内が内包金属粒子３０であることがよい。
【0052】
（樹脂粒子）
樹脂粒子１０は、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるアニオン性金属イオンを化学吸着しやすいために好ましい。含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する場合、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０または一部露出金属粒子４０となる。
また、例えばアクリル酸重合体のようにカルボン酸等の官能基を有するポリマーは、カチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすいため、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記のいずれかの金属との合金を作ることも可能である。
樹脂粒子１０は、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるアニオン性金属イオンを化学吸着しやすいために好ましい。含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する場合、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０または一部露出金属粒子４０となる。
また、例えばアクリル酸重合体のようにカルボン酸等の官能基を有するポリマーは、カチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすいため、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムなどの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記のいずれかの金属との合金を作ることも可能である。
【0053】
上記含窒素ポリマーは、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。好ましくは、ポリ－２－ビニルピリジン、ポリ－３－ビニルピリジン、ポリ－４－ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、セルロース樹脂、メラミン樹脂等幅広く利用することが可能である。
【0054】
なお、無置換のポリスチレン粒子等の金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有さない樹脂粒子の場合、粒子表面への超音波又は電離放射線の照射、樹脂粒子表面の金属めっき等により、粒子表面に金属粒子を固定化することができる。
【0055】
（金属粒子）
金属粒子２０の構造は特に限定されないが、樹脂粒子１０に固定化された金属－樹脂複合体１００の状態で発色を呈するものは、免疫学的測定で目視判定が容易になるので好ましい。金属粒子２０の材質としては、例えば、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムが適用できる。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。好ましくは、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金、白金、パラジウムであり、これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収によって発色する。より好ましくは、保存安定性がよい金及び白金である。また、抗体と結合させた場合に優れた発色性が得られるという観点でも、金、白金、金合金又は白金合金が最も好ましい金属種である。ここで、金合金とは、例えば金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。また、白金合金とは、例えば白金と白金以外の金属種からなり、白金を１０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。
金属粒子２０の構造は特に限定されないが、樹脂粒子１０に固定化された金属－樹脂複合体１００の状態で発色を呈するものは、免疫学的測定で目視判定が容易になるので好ましい。金属粒子２０の材質としては、例えば、銀、ニッケル、銅、金、白金、パラジウムが適用できる。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。好ましくは、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金、白金、パラジウムであり、これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収によって発色する。より好ましくは、保存安定性がよい金及び白金である。また、抗体と結合させた場合に優れた発色性が得られるという観点でも、金、白金、金合金又は白金合金が最も好ましい金属種である。ここで、金合金とは、例えば金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。また、白金合金とは、例えば白金と白金以外の金属種からなり、白金を１０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上含有する合金を意味する。
【0056】
また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の平均粒子径は、例えば１～８０ｎｍの範囲内であることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や８０ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモンが発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、好ましくは、１ｎｍ以上７０ｎｍ未満の範囲内であり、より好ましくは、１ｎｍ以上５０ｎｍ未満の範囲内である。
【0057】
また、金属－樹脂複合体１００の平均粒子径は、例えば１００～１０００ｎｍの範囲内である。平均粒子径が１００ｎｍ未満では、例えば、金属粒子２０として金粒子又は白金粒子を使用する場合に、金属粒子２０の担持量が少なくなる傾向がある為、同サイズの金粒子より着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、標識抗体又は試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。金属－樹脂複合体１００の平均粒子径は、好ましくは、１００ｎｍ以上７００ｎｍ未満の範囲内であり、より好ましくは、１００ｎｍ以上６５０ｎｍ未満の範囲内である。ここで、金属－樹脂複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、または遠心沈降法により測定することができる。
【0058】
金属－樹脂複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子１０の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。次に、金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させることによって、金属－樹脂複合体１００を得ることができる。ここで、金属粒子２０として金粒子を使用する場合、金属イオンを含有する溶液として、例えば塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）水溶液等を用いることが好ましい。また、金属粒子２０として白金粒子を使用する場合、金属イオンを含有する溶液として、例えば塩化白金酸（Ｈ２ＰｔＣｌ６）水溶液等を用いることが好ましい。なお、金属イオンの代わりに金属錯体を用いてもよい。
【0059】
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等の含水アルコールもしくはアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いてもよい。
【0060】
また、金属イオンを含有する溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また、生成される金属粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
【0061】
また、還元剤としては、特に制限はないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ロッシェル塩等を使用することが好ましい。これらの中でも、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸がより好ましい。還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整したりすることが出来る。ｐＨ調整にはホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリにより調整することが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することによって、形成する金属粒子２０の粒径をコントロールすることが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することによって、形成する金属粒子２０の粒径をコントロールすることが出来る。
【0062】
また、金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させる際、金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加してもよいし、還元剤を金属イオン吸着樹脂粒子に添加してもよいが、内包金属粒子３０及び一部露出金属粒子４０の生成しやすさの観点から、前者が好ましい。
【0063】
また、金属－樹脂複合体１００の水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ－Ｌ－リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４（ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を添加してもよい。さらに、ホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することが出来る。
【0064】
以上の構成を有する金属－樹脂複合体１００は、樹脂粒子１０及び／又は金属粒子２０の表面に抗体を吸着させることにより、各種の免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、特に、低濃度域（高感度領域）での目視判定性に優れた免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。また、免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の形態に特に限定はないが、例えば、金属－樹脂複合体１００を水もしくはｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用することもできる。
【実施例0065】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。
【0066】
＜金属－樹脂複合体粒子の吸光度測定＞
金属－樹脂複合体粒子の吸光度は、石英ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した金属－樹脂複合体粒子分散液（分散媒：水）を入れ、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ３６００）を用いて、金－樹脂複合体の場合５７０ｎｍ、白金－樹脂複合体の場合４００ｎｍの吸光度を測定した。
金属－樹脂複合体粒子の吸光度は、石英ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した金属－樹脂複合体粒子分散液（分散媒：水）を入れ、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ３６００）を用いて、金－樹脂複合体の場合５７０ｎｍ、白金－樹脂複合体の場合４００ｎｍの吸光度を測定した。
【0067】
＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間乾燥を行った。乾燥前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
固形分濃度（ｗｔ％）＝
［乾燥後の重量（ｇ）／ 乾燥前の重量（ｇ）］× １００
また、上記乾燥処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間熱処理を行い、熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［熱処理後の重量（ｇ）／熱処理前の重量（ｇ）］×１００
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間乾燥を行った。乾燥前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
固形分濃度（ｗｔ％）＝
［乾燥後の重量（ｇ）／ 乾燥前の重量（ｇ）］× １００
また、上記乾燥処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間熱処理を行い、熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［熱処理後の重量（ｇ）／熱処理前の重量（ｇ）］×１００
【0068】
＜樹脂粒子および金属－樹脂複合体粒子の平均粒子径、粒度分布の測定＞
遠心沈降式粒度分布測定装置（ＬＵＭ ＧｍｂＨ社製 ＬＵＭｉＳｉｚｅｒ６１０）を用いて測定した。測定は、粒子を水又は溶液中に分散させた状態で行った。
遠心沈降式粒度分布測定装置（ＬＵＭ ＧｍｂＨ社製 ＬＵＭｉＳｉｚｅｒ６１０）を用いて測定した。測定は、粒子を水又は溶液中に分散させた状態で行った。
【0069】
＜金属粒子の平均粒子径の測定＞
金属－樹脂複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の金属粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
金属－樹脂複合体粒子分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ－９０００）により観測した画像から、任意の１００個の金属粒子の面積平均径を測定し平均粒子径とした。
【0070】
［作製例１］
＜樹脂粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（１．３ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３４９ｎｍの樹脂粒子Ａ－１を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ－１を得た。
＜樹脂粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（１．３ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３４９ｎｍの樹脂粒子Ａ－１を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ－１を得た。
【0071】
［作製例２］
＜樹脂粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（０．８ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３０ｎｍの樹脂粒子Ａ－２を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ－２を得た。
＜樹脂粒子の合成＞
トリオクチルアンモニウムクロリド（０．８ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエチルエーテルメタクリレート（１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２－ビニルピリジン（４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（２．００ｇ）を加え、窒素気流下において３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（０．２５ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３０ｎｍの樹脂粒子Ａ－２を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させた後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ－２を得た。
【0072】
［作製例３］
＜金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－１ ３０．０ｇに純水７８．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化金酸水溶液４２．９ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－３を得た。
＜金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－１ ３０．０ｇに純水７８．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化金酸水溶液４２．９ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－３を得た。
【0073】
次に、純水４７２５ｇにＣ－３を６５ｇ加え、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液１５ｇを２分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３５７ｎｍの金－樹脂複合体粒子Ｄ－３を得た。Ｄ－３を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３を得た。Ｅ－３中の金－樹脂複合体粒子Ｆ－３の吸光度は、１．３８であった。また、Ｆ－３における金粒子の平均粒子径は２１ｎｍ、金の担持量は４８．０ｗｔ％であった。
【0074】
［作製例４］
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－１ ３０．０ｇに純水８５．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化白金酸水溶液３１．０ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－４を得た。
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－１ ３０．０ｇに純水８５．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化白金酸水溶液３１．０ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－４を得た。
【0075】
次に、純水４７２５ｇにＣ－４を７０．５ｇ加え、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液１３７ｇを２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径３６０ｎｍの白金－樹脂複合体粒子Ｄ－４を得た。Ｄ－４を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－４を得た。Ｅ－４中の白金－樹脂複合体粒子Ｆ－４の吸光度は、１．７５であった。また、Ｆ－４における白金粒子の平均粒子径は３．５ｎｍ、白金の担持量は３９．１ｗｔ％であった。
【0076】
［作製例５］
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－２ ３０．０ｇに純水８５．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化白金酸水溶液３１．０ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－５を得た。
＜白金－樹脂複合体粒子の合成＞
樹脂粒子分散液Ｂ－２ ３０．０ｇに純水８５．０ｇを加えた後、７ｗｔ％塩化白金酸水溶液３１．０ｇを加え、室温で３時間撹拌した。この混合液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度を調整して、５ｗｔ％の白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ－５を得た。
【0077】
次に、純水４７２５ｇにＣ－５を７０．５ｇ加え、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液１３７ｇを２０分かけて滴下した後、３℃で１時間、室温で３時間撹拌することで、平均粒子径４４５ｎｍの白金－樹脂複合体粒子Ｄ－５を得た。Ｄ－５を遠心分離により濃縮した後、透析処理により精製し、濃度を調整して、１ｗｔ％の白金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－５を得た。Ｅ－５中の白金－樹脂複合体粒子Ｆ－５の吸光度は、１．７５であった。また、Ｆ－５における白金粒子の平均粒子径は３．７ｎｍ、白金の担持量は３９．４ｗｔ％であった。
【0078】
［作製例６］
＜結合用緩衝液の調製＞
ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、２－モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ；ｐＫａ（２０℃）６．１５］又は３－モルホリノプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ；ｐＫａ（２０℃）７．２０］の０．１ｍｏｌ／Ｌの遊離酸溶液を調製し、それぞれに純水および０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を混合して表１に示す緩衝剤濃度およびｐＨに調整することによって、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液を調製した。
＜結合用緩衝液の調製＞
ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、２－モルホリノエタンスルホン酸［ＭＥＳ；ｐＫａ（２０℃）６．１５］又は３－モルホリノプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ；ｐＫａ（２０℃）７．２０］の０．１ｍｏｌ／Ｌの遊離酸溶液を調製し、それぞれに純水および０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を混合して表１に示す緩衝剤濃度およびｐＨに調整することによって、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液を調製した。
【0079】
［実施例１］
（結合工程）
抗ＣＲＰ抗体２５μｇと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．４５ｍＬを混合した後、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３を０．０５ｍＬ添加し、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３で標識した抗ＣＲＰ抗体を含む標識抗体分散液Ｊ－１を得た。
（結合工程）
抗ＣＲＰ抗体２５μｇと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．４５ｍＬを混合した後、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３を０．０５ｍＬ添加し、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３で標識した抗ＣＲＰ抗体を含む標識抗体分散液Ｊ－１を得た。
【0080】
（ブロック工程）
次に、標識抗体分散液Ｊ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄み液を除去した後、沈降堆積物に１ｗｔ％ＢＳＡを含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散した後、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体分散液Ｋ－１を得た。
次に、標識抗体分散液Ｊ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄み液を除去した後、沈降堆積物に１ｗｔ％ＢＳＡを含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散した後、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体分散液Ｋ－１を得た。
【0081】
（洗浄処理）
次に、標識抗体分散液Ｋ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤を含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散した。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。
次に、標識抗体分散液Ｋ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤を含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散した。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。
【0082】
（保存処理）
次に、氷冷後、３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤および、１０ｗｔ％のスクロースを含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散して、標識抗体分散液Ｌ－１を得た。
次に、氷冷後、３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に０．１ｗｔ％未満の界面活性剤および、１０ｗｔ％のスクロースを含む５ｍＭのＴｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．５）０．５ｍＬを添加し、超音波分散して、標識抗体分散液Ｌ－１を得た。
【0083】
（コンジュゲートパッド作製）
０．１２ｍｌの標識抗体分散液Ｌ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に５ｗｔ％のスクロースと２．５ｗｔ％のＢＳＡを含む水溶液（ｐＨ８．０）０．３３３ｍｌを添加し、超音波分散して、標識抗体分散液Ｍ－１を得た。ガラスファイバー不織布に標識抗体分散液Ｍ－１を均一に含浸させた後、５０℃１時間で乾燥を行い、コンジュゲートパッドＮ－１を作製した。この時、コンジュゲートパッドＮ－１における金－樹脂複合体粒子Ｆ－３の含有量が、後述のイムノクロマト法による評価１テスト当たり３μｇとなるように標識抗体分散液Ｍ－１の液量を調節した。
０．１２ｍｌの標識抗体分散液Ｌ－１を３０００ｒｐｍ５分間で遠心分離を行い、上澄みを除去した後、沈降堆積物に５ｗｔ％のスクロースと２．５ｗｔ％のＢＳＡを含む水溶液（ｐＨ８．０）０．３３３ｍｌを添加し、超音波分散して、標識抗体分散液Ｍ－１を得た。ガラスファイバー不織布に標識抗体分散液Ｍ－１を均一に含浸させた後、５０℃１時間で乾燥を行い、コンジュゲートパッドＮ－１を作製した。この時、コンジュゲートパッドＮ－１における金－樹脂複合体粒子Ｆ－３の含有量が、後述のイムノクロマト法による評価１テスト当たり３μｇとなるように標識抗体分散液Ｍ－１の液量を調節した。
【0084】
（イムノクロマトストリップの作製）
図２に示す構造のイムノクロマトストリップを作製した。まず、幅２５ｍｍのニトロセルロースメンブレン４に、抗ＣＲＰ抗体を塗布してテストライン５を描画した。また、テストライン５の下流側に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布してコントロールライン６を描画した。このニトロセルロースメンブレン４を５０℃で１時間かけて乾燥した後、図２に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、ラミネートフィルム１、コンジュゲートパッド３としてのコンジュゲートパッドＮ－１、サンプルパッド２（ガラスファイバー不織布）および吸収パッド７（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップＰ－１を作成した。
図２に示す構造のイムノクロマトストリップを作製した。まず、幅２５ｍｍのニトロセルロースメンブレン４に、抗ＣＲＰ抗体を塗布してテストライン５を描画した。また、テストライン５の下流側に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布してコントロールライン６を描画した。このニトロセルロースメンブレン４を５０℃で１時間かけて乾燥した後、図２に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、ラミネートフィルム１、コンジュゲートパッド３としてのコンジュゲートパッドＮ－１、サンプルパッド２（ガラスファイバー不織布）および吸収パッド７（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップＰ－１を作成した。
【0085】
（展開液の調製）
５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、１．０ｗｔ％のＰＥＧセチルエーテルを含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液Ｑ－１とした。
５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、１．０ｗｔ％のＰＥＧセチルエーテルを含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液Ｑ－１とした。
【0086】
（イムノクロマト法による評価）
展開液Ｑ－１を用いてＣＲＰ抗原を希釈することにより、陽性コントロール（抗原濃度３１２ｎｇ／ｍｌ、３．１２ｎｇ／ｍｌ）及び陰性コントロール（抗原非含有）の検体液を調製した。検体液５０μｌをイムノクロマトストリップＰ－１のサンプルパッド２に滴下した。その後、３０分経過後のテストライン５の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス Ｃ１００６６－１０）で測定した。また、コンジュゲートパッド３とメンブレン４の界面およびその下流側に金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が目詰まりしているかを目視で判定した。イムノクロマト法による評価結果を表１に示す。
展開液Ｑ－１を用いてＣＲＰ抗原を希釈することにより、陽性コントロール（抗原濃度３１２ｎｇ／ｍｌ、３．１２ｎｇ／ｍｌ）及び陰性コントロール（抗原非含有）の検体液を調製した。検体液５０μｌをイムノクロマトストリップＰ－１のサンプルパッド２に滴下した。その後、３０分経過後のテストライン５の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス Ｃ１００６６－１０）で測定した。また、コンジュゲートパッド３とメンブレン４の界面およびその下流側に金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が目詰まりしているかを目視で判定した。イムノクロマト法による評価結果を表１に示す。
【0087】
（結合抗体量の算出）
上記ブロック工程の遠心分離で除去した上澄み液を用いて、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３に結合した抗体量を算出した。結合抗体量の算出は、分光光度計を用いて上澄み液を測定し、波長２８０ｎｍにおける吸光度から上澄み液に含まれる抗体量を求め、結合工程で使用した抗体量２５μｇから上澄み液の抗体量を差し引くことで算出した。算出した結合抗体量及び抗体結合収率を表１に示す。なお、結合収率は、使用した全抗体量に対する付着した抗体の重量割合（％）を意味する。
上記ブロック工程の遠心分離で除去した上澄み液を用いて、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３に結合した抗体量を算出した。結合抗体量の算出は、分光光度計を用いて上澄み液を測定し、波長２８０ｎｍにおける吸光度から上澄み液に含まれる抗体量を求め、結合工程で使用した抗体量２５μｇから上澄み液の抗体量を差し引くことで算出した。算出した結合抗体量及び抗体結合収率を表１に示す。なお、結合収率は、使用した全抗体量に対する付着した抗体の重量割合（％）を意味する。
【0088】
［実施例２～５、比較例１～５］
表１に示す金属―樹脂複合体粒子分散液および結合用緩衝液を使用すること以外は実施例１と同様にして、結合工程、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製、イムノクロマトストリップ作製、イムノクロマト評価、結合抗体量及び抗体結合収率の算出を行った。表１に結合抗体量及び抗体結合収率の算出結果、およびイムノクロマト評価結果を示す。
表１に示す金属―樹脂複合体粒子分散液および結合用緩衝液を使用すること以外は実施例１と同様にして、結合工程、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製、イムノクロマトストリップ作製、イムノクロマト評価、結合抗体量及び抗体結合収率の算出を行った。表１に結合抗体量及び抗体結合収率の算出結果、およびイムノクロマト評価結果を示す。
【0089】
実施例１～５、比較例１～５の試験結果から、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を使用することにより、結合抗体量が増大し、イムノクロマト評価結果の目詰まりが抑制され、テストラインの発色強度が増大し、イムノクロマトの感度が向上していることが判る。
【0090】
【表1】
【0091】
［実施例６］
（結合工程）
抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体２５μｇと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．４５ｍＬを混合した後、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３を０．０５ｍＬ添加し、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３で標識した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を含む標識抗体分散液Ｊ－６を得た。
（結合工程）
抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体２５μｇと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）０．４５ｍＬを混合した後、１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３を０．０５ｍＬ添加し、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３で標識した抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を含む標識抗体分散液Ｊ－６を得た。
【0092】
（ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製）
標識抗体分散液Ｊ－６を用いること以外は実施例１と同様にして、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製を行い、コンジュゲートパッドＮ－６を作製した。
標識抗体分散液Ｊ－６を用いること以外は実施例１と同様にして、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製を行い、コンジュゲートパッドＮ－６を作製した。
【0093】
（イムノクロマトストリップの作製）
図２に示す構造のイムノクロマトストリップを作製した。まず、幅２５ｍｍのニトロセルロースメンブレン４に、抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を塗布してテストライン５を描画した。また、テストライン５の下流側に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布してコントロールライン６を描画した。このニトロセルロースメンブレン４を５０℃で１時間かけて乾燥した後、図２に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、ラミネートフィルム１、コンジュゲートパッド３としてのコンジュゲートパッドＮ－６、サンプルパッド２（ガラスファイバー不織布）および吸収パッド７（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップＰ－６を作成した。
図２に示す構造のイムノクロマトストリップを作製した。まず、幅２５ｍｍのニトロセルロースメンブレン４に、抗インフルエンザＡ型ウイルス抗体を塗布してテストライン５を描画した。また、テストライン５の下流側に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布してコントロールライン６を描画した。このニトロセルロースメンブレン４を５０℃で１時間かけて乾燥した後、図２に示すイムノクロマトストリップの断面図の通りに、ラミネートフィルム１、コンジュゲートパッド３としてのコンジュゲートパッドＮ－６、サンプルパッド２（ガラスファイバー不織布）および吸収パッド７（コットン不織布）を積層した。最後に、３．５ｍｍ幅にカットしてイムノクロマトストリップＰ－６を作成した。
【0094】
（展開液の調製）
５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、１．０ｗｔ％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液Ｑ－６とした。
５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、１．０ｗｔ％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する水溶液（ｐＨ７．１）を調製し、展開液Ｑ－６とした。
【0095】
（イムノクロマト法による評価）
展開液Ｑ－６を用いてインフルエンザＡ型ウイルス不活化抗原を希釈することにより、陽性コントロール（抗原濃度１２５０ＦＦＵ／ｍｌ、２０ＦＦＵ／ｍｌ相当）及び陰性コントロール（抗原非含有）の検体液を調製した。検体液５０μｌをイムノクロマトストリップＰ－６のサンプルパッド２に滴下した。その後、３０分経過後のテストライン５の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス Ｃ１００６６－１０）で測定した。また、コンジュゲートパッド３とメンブレン４の界面およびその下流側に金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が目詰まりしているかを目視で判定した。イムノクロマト法による評価結果を表２に示す。
展開液Ｑ－６を用いてインフルエンザＡ型ウイルス不活化抗原を希釈することにより、陽性コントロール（抗原濃度１２５０ＦＦＵ／ｍｌ、２０ＦＦＵ／ｍｌ相当）及び陰性コントロール（抗原非含有）の検体液を調製した。検体液５０μｌをイムノクロマトストリップＰ－６のサンプルパッド２に滴下した。その後、３０分経過後のテストライン５の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス Ｃ１００６６－１０）で測定した。また、コンジュゲートパッド３とメンブレン４の界面およびその下流側に金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が目詰まりしているかを目視で判定した。イムノクロマト法による評価結果を表２に示す。
【0096】
［比較例６］
実施例６の結合工程において２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）の代わりに２０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ７）を用いること以外は実施例６と同様にして、結合工程、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製、イムノクロマトストリップ作製、イムノクロマト評価を行った。表２にイムノクロマト評価結果を示す。
実施例６の結合工程において２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）の代わりに２０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ７）を用いること以外は実施例６と同様にして、結合工程、ブロック工程、洗浄処理、保存処理、コンジュゲートパッド作製、イムノクロマトストリップ作製、イムノクロマト評価を行った。表２にイムノクロマト評価結果を示す。
【0097】
実施例６、比較例６の試験結果から、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を使用することにより、イムノクロマト評価結果では目詰まりが抑制され、テストラインの発色強度が増大し、抗原非含有の陰性コントロール検体での偽陽性が抑制され、イムノクロマトの感度が向上していることが判る。
【0098】
【表2】
【0099】
［参考試験例１～４］
（結合用緩衝液と金属－樹脂複合体粒子の混合による凝集度合いの評価）
表３に示す結合用緩衝液０．４５ｍｌと１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３の０．０５ｍＬを混合した後、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、粒度分布の測定を行った。粒度分布の測定結果から金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が凝集せずに単一粒子として分散している比率（非凝集比率）を求めた。結果を表３に示す。
（結合用緩衝液と金属－樹脂複合体粒子の混合による凝集度合いの評価）
表３に示す結合用緩衝液０．４５ｍｌと１ｗｔ％の金－樹脂複合体粒子分散液Ｅ－３の０．０５ｍＬを混合した後、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、粒度分布の測定を行った。粒度分布の測定結果から金－樹脂複合体粒子Ｆ－３が凝集せずに単一粒子として分散している比率（非凝集比率）を求めた。結果を表３に示す。
【0100】
参考試験例１～４の試験結果から、２０℃におけるｐＫａが７．５以上であるグッド緩衝剤を含む結合用緩衝液を使用した参考試験例１～３では、ホウ酸緩衝液を用いた参考試験例４に比べて、金－樹脂複合体粒子Ｆ－３の凝集が抑制されていることが判る。このような凝集抑制作用が、抗体付着量の増加につながり、また、イムノクロマトストリップにおける目詰まりを抑制して、良好なイムノクロマト評価結果に寄与していると推察される。
【0101】
【表3】
【0102】
以上、本発明の実施の形態を例示の目的で詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態に制約されることはない。
【符号の説明】
【0103】
１…ラミネートフィルム、２…サンプルパッド、３…コンジュゲートパッド、４…ニトロセルロースメンブレン、５…テストライン、６…コントロールライン、７…吸収パッド、１０…樹脂粒子、２０…金属粒子、３０…内包金属粒子、４０…一部露出金属粒子、５０…表面吸着金属粒子、６０…表層部、１００…金属－樹脂複合体
【図1】
【図2】