特開 2023-141297 高熱安定性フコース結合性タンパク質、およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023141297

(43)【公開日】2023-10-05

(54)【発明の名称】高熱安定性フコース結合性タンパク質、およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20230928BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230928BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230928BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230928BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20230928BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12P21/02 Z

C07K14/195

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022047535

(22)【出願日】2022-03-23

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000173762

【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】相原 秀典

(72)【発明者】

【氏名】穂谷 恵

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 博之

(72)【発明者】

【氏名】井出 輝彦

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG28

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA50

4H045CA11

4H045DA80

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

【課題】 Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇ
ａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－
３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）Ｇａ
ｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有し、熱に対する安定
性が向上したフコース結合性タンパク質およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】 配列番号１で示されるフコース結合性タンパク質を構成するアミノ酸配列
において、配列番号１における８３番目として特定されるスレオニン残基をフェニルアラニン残基に置換すること、加えて、大腸菌を用いて当該フコース結合性タンパク質を製造することにより、前記課題を解決する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、フェニルアラニン残基への置換；
（ｂ）前記（ａ）に記載のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の８３番目のアミノ酸残基以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれかのアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質、
のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。

【請求項2】

配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質。

【請求項3】

Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載のフコース結合性タンパク質。

【請求項4】

Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項３に記載のフコース結合性タンパク質。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項6】

請求項５に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。

【請求項7】

請求項６に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、請求項１から４のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。

【請求項8】

宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の形質転換体。

【請求項9】

請求項７または８に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高い熱安定性をもつフコース結合性タンパク質、およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ－ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来するＢＣ２ＬＣＮは、フコース残基を含む糖鎖への結合親和性を有するレクチンであり、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）、ルイスｂ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃ）およびルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース残基を含む複数種の糖鎖に高い結合親和性を有することが知られている（非特許文献１）。これらの糖鎖への結合親和性をもつことから、ＢＣ２ＬＣＮはこれらの糖鎖が高発現している細胞やタンパク質の検出や分離に使用することが可能である。例えば、非特許文献２、特許文献１および特許文献２には、未分化状態のヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞はＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）を高発現していることから、ＢＣ２ＬＣＮを用いてヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の未分化細胞を検出する方法が開示されている。また、Ｈタイプ１型糖鎖やルイスＹ糖鎖は特定のがん細胞に高発現していることが知られている（Ｈ１：非特許文献３、ＬｅｗｉｓＹ：非特許文献４）。ルイスｂ型糖鎖は赤血球で血液型抗原であるほか、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）が宿主細胞のルイスｂ型糖鎖を感染に用いていることが知られている（非特許文献５）。

【0003】

タンパク質の機能を向上させる方法として、タンパク質工学的手法によりタンパク質にアミノ酸変異を導入し、目的とする機能を向上させる方法が知られており、特許文献３にはＢＣ２ＬＣＮの特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱に対する安定性が向上する旨、開示されているが、より高い熱安定性をもち、かつ、高い糖鎖親和性を保持したＢＣ２ＬＣＮが求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１３／０６５３０２号

【特許文献2】国際公開第２０１３／１２８９１４号

【特許文献3】特開２０２０－０２５５３５号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｕｌａｋ，Ｏ．等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０年，１８巻：５９－７２頁

【非特許文献2】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ．等，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２０１３年，２巻：２６５－２７３頁

【非特許文献3】Ｔａｎｇ，Ｃ．等，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１年，２９巻：８２９－８３５頁

【非特許文献4】Ｗｅｓｔｗｏｏｄ Ｊ．Ａ．等，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９年，３２巻：２９２－３０１頁

【非特許文献5】Ｈａｇｅ，Ｎ．等，Ｓｃｉ． Ａｄｖ．２０１５年，１巻：ｅ１５００３１５頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、ＢＣ２ＬＣＮによる細胞検出技術等の工業利用を発展させるにあたり、熱安定性が高く製造や加工、保管が容易で、かつ、糖鎖結合親和性を保持したＢＣ２ＬＣＮを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１に示される１５５アミノ酸残基からなるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列において、８３番目のスレオニン残基をフェニルアラニン残基に置換することにより、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を維持しつつ、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち本発明は、以下の［１］から［９］に記載した発明を包含する。

【0009】

［１］
以下の（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、フェニルアラニン残基への置換；
（ｂ）前記（ａ）に記載のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号 １の８３番目のアミノ酸残基以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質；及び
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれかのアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［２］
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む、前記［１］に記載のフコース結合性タンパク質。
［３］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する前記［１］または［２］に記載のフコース結合性タンパク質。
［４］
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、前記［３］に記載のフコース結合性タンパク質。
［５］
前記［１］から［４］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
［６］
前記［５］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［７］
前記［６］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、前記［１］から［４］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
［８］
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［７］に記載の形質転換体。
［９］
前記［７］または［８］に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、前記［１］から［４］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、アミノ酸残基置換前のフコース結合性タンパク質に比べて熱に対する安定性が向上し、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つルイスｂ型糖鎖への結合親和性を維持したフコース結合性タンパク質、およびそれらの製造方法が提供される。本発明のフコース結合性タンパク質を用いることにより、温度変化による糖鎖への結合親和性の低下や失活などの活性の変化を抑え、安定な活性を発揮することができる。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

【0012】

本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つルイスｂ型糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性を有するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列（配列番号１で示される１５５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。）において、特定の位置にあるアミノ酸残基に変異を導入し、形質転換した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で組換えタンパク質として発現させたものである。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列における８３番目のスレオニン残基のフェニルアラニン残基への置換を行い、形質転換大腸菌で組換えタンパク質として発現させたものである。配列番号１で示されるアミノ酸配列における８３番目のスレオニン残基をフェニルアラニン残基で置換することにより、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を維持しながら、熱に対する安定性を向上させることができる。後述する実施例および比較例で示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換するのではなく、特定の位置のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を維持しながら、熱に対する安定性を向上させることができる。
本発明のフコース結合性タンパク質の具体例としては、配列番号２（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をフェニルアラニン残基に置換したアミノ酸配列）で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質を挙げることができる。

【0013】

本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）および（ｉｉ）のバリアント配列を有するタンパク質であってもよい。

【0014】

（ｉ）８３番目のスレオニン残基以外のアミノ酸残基のいずれか１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、任意のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質。

【0015】

（ｉｉ）（ｉ）に記載のタンパク質のうち、アミノ酸配列全体に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質。

【0016】

前記（ｉ）において「１個若しくは複数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１個以上１５個以下、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上３個以下のいずれかを意味する。また、「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。

【0017】

前記（ｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は９０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、９５％以上）を有してもよい。なお本発明において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の同一性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の類似性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。得られるフコース結合性タンパク質の熱安定性が高い点で９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。

【0018】

また、本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることが好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数に特に制限はないが、ヒスチジンの繰返し配列が短い場合はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が困難となり、長い場合は、本発明のフコース結合性タンパク質の前記糖鎖への結合親和性が損なわれる可能性がある。従って、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数はヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から８個からなる繰返し配列であることがより好しい。また、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドの長さは、前記ヒスチジンの繰返し配列が含まれていれば特に制限はなく、ヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列を含む２０個以下のオリゴペプチドであることが好ましく、ヒスチジン残基が５個から８個からなる繰返し配列を含む１５個以下のオリゴペプチドであることがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよい。

【0019】

さらに、本発明のフコース結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。

【0020】

次に、本発明のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡとする。）および本発明のＤＮＡを含有する発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする。）について説明する。

【0021】

本発明のＤＮＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法や化学合成法など当業者が通常行う方法で得ればよい。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本発明のフコース結合性タンパク質の生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。

【0022】

本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。

【0023】

本発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法でよく、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に前記タンパク質をコードするＤＮＡを挿入して当該タンパク質の発現ベクターを作製すればよい。発現ベクターに特に制限はないが、実験が容易である点で、大腸菌宿主で使用可能な発現ベクターが好ましく、具体的には、ｐＥＴベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＵＣベクターおよびｐＢＢＲベクター等のプラスミドベクターが挙げられる。

【0024】

また、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で得ればよい。前記宿主は特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましく、例えば、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株が挙げられる。

【0025】

次に、本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）について説明する。本発明の製造方法は、当業者が通常行う方法でよく、前記形質転換体を用いて発現培養を行い、培養物から目的の組換えタンパク質を回収・精製すればよい。なお、本発明の培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。

【0026】

本発明のフコース結合性タンパク質の糖鎖への結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法、等温滴定型カロリメータ―等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器（サイティバ製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相を糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ、サイティバ製）や、デキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、サイティバ製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。また、結合親和性評価は当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。

【0027】

本発明のフコース結合性タンパク質の熱に対する安定性の評価は、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ法や示差走査熱量計による測定法で、加熱処理前後の糖鎖への結合親和性は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法で比較することにより評価することができる。一例として、示差走査熱量計による方法について説明する。タンパク質溶液の温度を一定速度で上昇させ、タンパク質が熱変性を起こす際の熱容量を測定することにより、天然状態のタンパク質分子の半分が変性する変性中点温度を測定することができる。

【実施例0028】

以下、実施例、比較例および実験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0029】

比較例１ 組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（配列番号４）の作製

【0030】

＜１＞組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列は配列番号４であり、具体的には、配列番号４の５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列）に相当する。組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮを発現させるための発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで作製した。なお、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮは、特開２０１８－００００３８号公報で開示されている発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの１７０番目以降のシステイン残基を含むオリゴペプチド配列を除去したものと同一の塩基配列である。次いで、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮを発現可能な組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0031】

＜２＞＜１＞で得られた形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（１０ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／ＬＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで組換えタンパク質６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮを発現させた。培養液より遠心分離により菌体を回収した。

【0032】

＜３＞＜２＞で得られた菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮの精製を、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行ない、限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に置換した。

【0033】

実施例１ 組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）（配列番号５）の作製

【0034】

＜１＞組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）のアミノ酸配列は配列番号５であり、具体的には、配列番号５の５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号２のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列である配列番号１のうち、８３番目のスレオニン残基がフェニルアラニン残基に置換された配列）に相当する。組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）を発現させるための発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）を含むＤＮＡを、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）を発現可能な組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0035】

＜２＞比較例１＜２＞＜３＞に記載と同様の方法で組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）溶液を得た。

【0036】

実験例１ 糖鎖結合親和性評価

【0037】

比較例１および実施例１で作製した組換えタンパク質６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮおよび６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）の糖鎖結合親和性評価のため、表面プラズモン共鳴法を用いてＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する解離定数の測定を行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（サイティバ製）を用い、アナライトを各組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（サイティバ製）を使用し、デキストランにストレプトアビジンをアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、ルイスＹ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）またはルイスｂ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。ストレプトアビジンの固定量は約４００ＲＵ、糖鎖の固定量は約３５ＲＵとした。

【0038】

糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）を用い、測定条件は流速を３０μＬ／分、結合時間を３分間、解離時間を６分間とした。センサーチップの再生は５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１０秒で行った。糖鎖固定量が多いセンサーチップを使用する場合は、２０ｍＭの水酸化ナトリウムを用いた。解析はＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を算出した。

【0039】

表１に、実施例１および比較例１の各糖鎖に対する解離定数を示す。解離定数の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。なお、実施例１の６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）のルイスＹ型糖鎖に対する解離定数の「低下」とはルイスＹ型糖鎖に対する結合親和性が顕著に低下したことを示す。センサグラム形状より結合は確認できるが、ルイスＹ型糖鎖に対する結合量が低く（おおよそ５ＲＵ以下）、正確な解離定数を算出することができなかった。以上の結果から、比較例１の組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮと実施例１の６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）の解離定数はルイスＹ型糖鎖以外大差なかった。配列番号１の８３番目のスレオニン残基をフェニルアラニン残基に置換することによりルイスＹ型糖鎖への結合親和性は低下したものの、未分化状態のヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞表面に存在するＨタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖、一部のがん細胞や細菌で高発現しているルイスｂ型糖鎖への結合親和性は維持したことがわかる。なお、表１における変性中点温度の測定は、後述する実験例２に記載した。

【0040】

【表1】

【0041】

実験例２ 熱安定性評価

【0042】

比較例１および実施例１で作製した組換えタンパク質６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮおよび６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）の熱安定性評価のため、示差走査熱量計による変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記比較例１＜３＞および実施例１＜２＞で製造した組換えタンパク質６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮおよび６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）の溶液を紫外線吸収法により濃度を測定し、透析膜を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質の濃度を紫外吸収法（Ａ２８０＝１．０を１．０ｍｇ／ｍＬとして換算）により測定し、２．４～４．５ｍｇ／ｍＬになるようタンパク質溶液調製時と同じ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で希釈し、示差走査熱量計（マルバーン製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。変性中点温度の測定条件は、各組換えタンパク質の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４５℃－１１５℃とした。

【0043】

表１に、実施例１および比較例１の変性中点温度を示す。比較例１の組換え６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮに比べて実施例１の６Ｈ－ＢＣ２ＬＣＮ（Ｔ８３Ｆ）は変性中点温度が約１０℃高く、配列番号１の８３番目のスレオニン残基をフェニルアラニン残基に置換することにより、熱安定性が向上したことがわかる。

【配列表】

2023141297000001.app