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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023142218
(43)【公開日】2023-10-05
(54)【発明の名称】アフィボディと光受容体タンパク質とのセット
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20230928BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K14/195
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022048984
(22)【出願日】2022-03-24
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、研究タイプ「チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）、研究領域「光の特性を活用した生命機能の時空間制御技術の開発と応用」、研究課題「ゲノムの光操作技術の開発と生命現象解明への応用」、研究課題「ゲノムの光操作技術の開発と生命現象解明への応用」、研究題目「ゲノムの光操作技術の開発と生命現象解明への応用」、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(71)【出願人】
【識別番号】317006683
【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 守俊
(72)【発明者】
【氏名】桑▲崎▼ 勇人
(72)【発明者】
【氏名】中嶋 隆浩
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA11
4H045EA65
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】青色光を用いずに、二つの異なる長波長の光で、精密かつ高効率に様々なタンパク質の働きを光操作できる光スイッチタンパク質を開発すること。
【解決手段】アフィボディと光受容体タンパク質とのセットであって、波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
【選択図】なし
【解決手段】アフィボディと光受容体タンパク質とのセットであって、波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アフィボディと光受容体タンパク質とのセットであって、
波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
【請求項2】
アフィボディが、以下の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセット；
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項3】
アフィボディが、以下の（５）又は（６）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセット；
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項4】
アフィボディが、以下の（７）又は（８）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセット；
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【請求項5】
アフィボディが、以下の（９）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のセット；
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列。
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列。
【請求項6】
光受容体タンパク質が、ＤｒＢｐｈＰである、請求項１～５のいずれか１項に記載のセット。
【請求項7】
光受容体タンパク質が、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のセット。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のセット。
【請求項8】
アフィボディと光受容体タンパク質の一方に、遺伝子の転写活性に関連するドメインが結合し、他方に、核酸の認識ドメインが結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載のセット。
【請求項9】
アフィボディに、所定の作用を有するタンパク質の二分割した一方のフラグメントが結合し、
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載のセット。
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アフィボディと光受容体タンパク質とのセットに関する。また、本発明は、アフィボディと光受容体タンパク質とのセットを用いた遺伝子改変技術に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の光活性化を利用する分子制御アプローチが出現し、オプトジェネティクスと呼ばれている。光は、化学物質に比較して空間的・時間的に制御しやすく、光依存的に二量体を形成する光感受性タンパク質や、光受容体とその結合パートナーを利用した、光依存性のタンパク質－タンパク質相互作用システムが知られている。
【0003】
特許文献１には、青色光で光操作する技術として、光の照射で二量体の形成と解離を制御することができる、オプトジェネティクスのツールとして有用なタンパク質のセットが開示されている。
【0004】
赤色光で操作する技術として、非特許文献１～３も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１５－１６５７７６号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００２， ２０， １０４１－１０４４
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１６， １３， ５９１－５９７
【非特許文献3】ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ． ２０２０， ９， ３３２２－３３３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
赤色光で光操作する技術が知られてはいるものの、補因子を添加する必要があったり、二つの異なる長波長の光での操作が困難であったり、精密な操作が困難であったり、と多くの問題の存在が知られている。また、様々なタンパク質の光操作に応用できないなどの課題も存在していた。
本発明は、青色光を用いずに、二つの異なる長波長の光で、精密かつ高効率に様々なタンパク質の働きを光操作できる光スイッチタンパク質を開発することを目的とする。
本発明は、青色光を用いずに、二つの異なる長波長の光で、精密かつ高効率に様々なタンパク質の働きを光操作できる光スイッチタンパク質を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らが、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アフィボディと光受容体タンパク質とのセットが、赤色光により光制御可能であることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のとおりである。
［１］
アフィボディと光受容体タンパク質とのセットであって、
波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
［２］
アフィボディが、以下の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［３］
アフィボディが、以下の（５）又は（６）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［４］
アフィボディが、以下の（７）又は（８）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［５］
アフィボディが、以下の（９）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列。
［６］
光受容体タンパク質が、ＤｒＢｐｈＰである、［１］～［５］のいずれかに記載のセット。
［７］
光受容体タンパク質が、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のセット。
［８］
アフィボディと光受容体タンパク質の一方に、遺伝子の転写活性に関連するドメインが結合し、他方に、核酸の認識ドメインが結合する、［１］～［７］のいずれかに記載のセット。
［９］
アフィボディに、所定の作用を有するタンパク質の二分割した一方のフラグメントが結合し、
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、［１］～［８］のいずれかに記載のセット。
本発明は、以下のとおりである。
［１］
アフィボディと光受容体タンパク質とのセットであって、
波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セット。
［２］
アフィボディが、以下の（１）～（４）のいずれかのアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［３］
アフィボディが、以下の（５）又は（６）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［４］
アフィボディが、以下の（７）又は（８）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［５］
アフィボディが、以下の（９）のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のセット；
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列。
［６］
光受容体タンパク質が、ＤｒＢｐｈＰである、［１］～［５］のいずれかに記載のセット。
［７］
光受容体タンパク質が、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のセット。
［８］
アフィボディと光受容体タンパク質の一方に、遺伝子の転写活性に関連するドメインが結合し、他方に、核酸の認識ドメインが結合する、［１］～［７］のいずれかに記載のセット。
［９］
アフィボディに、所定の作用を有するタンパク質の二分割した一方のフラグメントが結合し、
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、［１］～［８］のいずれかに記載のセット。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、青色光を用いずに、二つの異なる長波長の光で、精密かつ高効率に様々なタンパク質の働きを光操作できる光スイッチタンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図１は、MagRedを説明する。MagRedとは、DrBphP等の光受容体タンパク質とアフィボディの組み合わせのことを意味する。図中、光受容体タンパク質の例としてDrBphPを用いた場合を説明する。また、図中、アフィボディは、Pfr specificbiding partner（Pfr特異的結合パートナー）として記載している。（a）DrBphPとその明状態（Pfr）フォームに特異的なアフィボディの模式図を示す。（b）アフィボディの結晶構造（PDB: 2M5A）にランダム化が可能な残基をボールフィリングモードで描画した図を示す。（c）DrBphPとその明状態（Pfr）フォームに特異的なアフィボディを用いたtetR-tetOシステムに基づく遺伝子発現システムの模式図を示す。660nmの光を照射すると、VP16と核内局在化配列（NLS）を連結したアフィボディが、tetO配列に結合したtetR-DrBphPと結合し、レポーター（fluc：ホタルルシフェラーゼ）の転写を活性化する（Pmin：最小サイトメガロウイルスプロモーター）。（d）スクリーニングで獲得したアフィボディ（Aff6）とその変異体Aff6_V18F及びAff6_V18FΔN）のN末端側のアミノ酸配列のアライメントを示す。なお、Aff6、Aff6_V18F及びAff6_V18FΔNとして示す、アフィボディのアミノ酸配列の部分配列を示す（配列番号６３～６５）。（e）スクリーニングで獲得したアフィボディ（Aff6）とその変異体（Aff6_V18F及びAff6_V18FΔN）をそれぞれ導入した転写活性化因子（Aff6-VP16-NLS）をDrBphPの全長体（FL）と組み合わせて生物発光レポータープラスミドを導入したHeLa細胞で比較した結果を示す。
【図2】図２は、分割ルシフェラーゼアッセイでMagRedの結合と解離の評価結果を示す。（a）分割ルシフェラーゼアッセイの模式図を示す。660nmの光を照射すると、MagRed（DrBphPとAff6_V18FΔN）と融合した分割ルシフェラーゼの両断片（fluc-N398及びfluc-C394）が互いに結合し、生物発光シグナルが増加する。800nmの光を照射すると、MagRedを融合した分割ルシフェラーゼの両断片が解離し、生物発光シグナルが減少する。（b）分割ルシフェラーゼアッセイで用いた融合タンパク質のドメイン構造の模式図を示す。（c）660nm（10 W/m2）での1分間の光照射と800 nm（50W/m2）での5分間の光照射を繰り返した際の、MagRedを融合した分割ルシフェラーゼの生物発光と全長体のルシフェラーゼ（fluc）の生物発光の変化のタイムコースを示す。生物発光シグナルは、各サンプル内の最小強度で正規化した。（d）660nmでの光照射（10 W/m2）を停止してから30分間の分割ルシフェラーゼからの生物発光のタイムコースを示す。生物発光シグナルは、各サンプル内の最小強度で正規化した。
【図3】図３は、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子発現の光操作システム（CPTS）におけるMagRedとRpBphP1-PpsR2/QPAS1の比較した結果を示す。（a）MagRedを導入したRed-CPTSの模式図を示す。dCas9はMS2-RNAアプタマーを導入したガイドRNA（sgRNA）と結合しゲノムDNAに結合する。MagRedを構成するタンパク質（DrBphPとAff6_V18FΔN）は、転写活性化ドメイン（p65-HSF1）とMS2タンパク質に融合した。660nmの光を照射すると、MagRedの働きによりp65-HSF1が標的遺伝子座にリクルートされ、標的遺伝子の転写が活性化される。（b,c, d）BphP又はその結合パートナーを転写活性化ドメイン（p65-HSF1）とMS2タンパク質のN末端又はC末端のいずれかに融合させたCPTSの包括的な構成を示す。テストしたMS2タンパク質と転写活性化ドメイン（p65-HSF1）に関する組み合わせを（b）に示した。テストしたすべての組み合わせについて、明状態の応答と暗状態の応答の比の平均値を（c）に実数スケールで、（d）にlog2スケールでヒートマップとして示した。これらの明状態の応答と暗状態の応答の比は、CPTSと生物発光レポータープラスミドを導入したHEK 293T細胞の生物発光強度に基づいて算出した。（e, f）実験条件は（c）、（d）と同じとした。RpBphP1のC20A変異体又はC20S変異体を用いたコントロールは（e）では赤色光条件下でRpBphP1の野生型（WT）と同等の高い発光強度を示したが、（f）ではDrBphPのC24A変異体又はC24S変異体は発光が完全に消失した。
【図4】図４は、MagRedを導入したCPTS（Red-CPTS）を用いて哺乳類細胞での遺伝子発現を光操作した結果を示す。（a）MagRedとCRISPR-Cas9を用いたRed-CPTSによる遺伝子発現の光操作の結果を示す。それぞれ異なる設計のRed-CPTSを作成し、HEK 293T細胞での評価を行った。各構成のデザイン（#1および#3）は、図3に示す。MagRedを構成するAff6_V18FΔNを2個以上数珠繋ぎにすることで、Red-CPTSの遺伝子発現活性を大幅に強化できることを示す。赤色光照射時の応答を右側のバーで示し、暗所での応答を左側のバーで示す。赤色光照射時の応答と暗所での応答の比（数値）を図の上部に示す。（b）HEK 293T細胞において、内在性遺伝子のASCL1、HBG1、IL1R2、MYOD1をそれぞれ標的としたガイドRNA（gRNA）の混合物を用いて、当該遺伝子を同時に赤色光で活性した結果を示す。
【図5】図５は、MagRedを用いた赤色光駆動型のDNA組換えシステムを示す。（a）RedPA-Creの模式図を示す。660nmの光を照射すると、MagRedの働きによりCreリコンビナーゼの分割体（split-Cre）の両断片が結合して活性化し、2つのloxP配列に挟まれたDNAの組換え反応が起こる。（b）Creリコンビナーゼの分割体（split-Cre）とBphP及びその結合パートナーとの融合に関する4つの構成を示す。これらの明状態の応答と暗状態の応答の比は、それぞれに設計したRedPA-Creと生物発光レポーターのプラスミドを導入したHEK 293T細胞の生物発光強度に基づいて算出した。（c, d）テストしたすべての組み合わせについて、明状態の応答と暗状態の応答の比の平均値を、（c）では実数スケールでプロットし、（d）ではlog2スケールでヒートマップとして示した。これらの明状態の応答と暗状態の応答の比は、RedPA-Creと生物発光レポータープラスミドを導入したHEK 293T細胞の生物発光強度に基づいて算出した。（e）黄色蛍光タンパク質（Venus, 蛍光顕微鏡のGFPチャンネルで検出）を連結したRedPA-Creの蛍光レポーター（mCherry, 蛍光顕微鏡のRFPチャンネルで検出）によるアッセイ結果を示す。Venus陽性細胞の中のmCherry陽性細胞の割合（mCh+/GFP+）は、3回の独立した実験の1000個以上の細胞から推定した。（f）RedPA-CreをコードするプラスミドとDNA組換え反応により生物発光を生起する生物発光レポータープラスミドをハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクション（hydrodynamic tail vein injection：HTVinjection）でマウスの肝臓に導入し、生体外から赤色LEDで非侵襲的に光照射した。暗所で飼育したマウスと赤色光を照射したマウスの生物発光画像の比較した結果を示す。生物発光レポータープラスミドからのルシフェラーゼの発現は、ハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクションから25時間後に、200 μLの100 mM D-ルシフェリンをマウスの腹腔内に導入して生物発光をイメージングすることで観察した。（g）暗所で飼育したマウスと赤色光を照射したマウスの生物発光強度の比較した結果を示す。灰色と赤のバーは平均±s.d.の生物発光強度を、黒のドットは各マウスの生物発光強度を表す。
【図6】リボソーム・ディスプレイによるスクリーニングで得られた10種類のアフィボディの解析結果を示す。10種類のアフィボディの塩基配列（表１）をVP16-NLSの塩基配列の上流側にそれぞれ導入してコンストラクトを作製した。これらのコンストラクトをtetR-DrBphP-PSMおよびSEAPレポーターのコンストラクトとともにHeLa細胞に導入し，生物発光強度を指標として10種類のアフィボディの比較を行った。Zdk1はDrBphP-PSMとは無関係なアフィボディ（ネガティブコントロール）である。３回のデータの平均値で示す。
【図7】Affi6のランダム化可能な13残基のうち12残基のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した場合の比較した結果を示す。図中のラベルは、アラニンで置換されたアミノ酸残基を示す。Aff6-VP16-NLSのコンストラクトのAff6の塩基配列をアラニンで置換されたAff6の塩基配列で置き換え、これをtetR-DrBphPおよび生物発光レポーターのコンストラクトとともにHeLa細胞に導入して、生物発光強度を指標として当該のアラニン置換体の比較を行った。３回のデータの平均値±標準偏差で示す。また、N.S.はP>0.05を示す（多重比較による双方向ANOVA）。
【図8】Aff6の18番目のアミノ酸（バリン，V）に部位特異的飽和変異を導入した場合の比較した結果を示す。図中のラベルは、Aff6_V18X変異体の18番目に導入されたアミノ酸（X）を表す。Aff6-VP16-NLSのコンストラクトのAff6の塩基配列をAff6_V18Xの塩基配列で置き換え、これをtetR-DrBphPおよび生物発光レポーターのコンストラクトとともにHeLa細胞に導入して、生物発光強度を指標としてAff6_V18X変異体の比較を行った。３回のデータの平均値±標準偏差で示す。また、****は、P<0.0001を示す（多重比較による双方向ANOVA）。
【図9】図９は、様々な細胞株におけるRed-CPTSの活性化を示す。HeLa細胞(a)とNeuro 2a細胞(b)にRed-CPTSと生物発光レポーターのコンストラクトを導入し、生物発光を指標としてRed-CPTSの活性化の評価を行った。赤色光（赤の棒グラフ）と暗所（グレーの棒グラフ）の条件下での平均生物発光強度の比を数値で示した。３回のデータの平均値で示す。
【図10】図１０は、RedPA-Creをレポーターアッセイでの評価結果を示す。（a）RedPA-Creを用いたレポーターアッセイを模式的に示す。ホタルルシフェラーゼ（fluc）の発現は、CMVプロモーターの下流にある転写停止シグナル（pA x3:polyadenylation transcriptional 'stop' signal tri-repeated sequence）により抑制された状態にある（このレポーターを「Floxed-STOP fluc レポーター」と呼ぶ）。660nmの光照射により、MagRedによって分割Cre断片の再結合が誘導され、そのDNA組換え反応によって2つのloxPサイトに挟まれた転写停止シグナル配列が削除されると、flucレポーターはプロモーターの働きによって発現するようになる。（b）黄色蛍光タンパク質（Venus）を連結したRedPA-Creによるレポーターアッセイの模式図（ここではRedPA-Creの働きにより、赤色蛍光タンパク質mCherryが発現する「Floxed-STOP mCherry レポーター」を用いる）。
【図11】図１１は、5種類の異なる赤色光スイッチタンパク質を用いてそれぞれ設計したRedPA-Creの性能の評価結果を示す。（a～e）赤色照射時の応答を右側のバーで示し，暗所での応答を左側のバーで示す。実験にはFloxed-STOP fluc レポーターを用いた。各構成のデザイン（#1-4）は，図5bに示す。赤色光照射時の応答と暗所での応答の比（数値）を図の上部に示した。なお、N.S. P > 0.05; *P <0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001を示す（two-tailed unpaired t-test）。
【図12】図１２は、RedPA-Creの活性に及ぼすビリベルジン（BV）添加の影響を評価した結果を示す。RedPA-CreとFloxed-STOP flucレポーターを導入したHEK 293T細胞における生物発光強度を示す。また、N.S.はP>0.05を示す（多重比較による双方向ANOVA）。
【図13】図１３は、様々な赤色光照射条件でのRedPA-Creの活性化の評価結果を示す。RedPA-CreとFloxed-STOP flucレポーターを導入したHEK 293T細胞を，様々な時間及び強度の赤色光で照射し、RedPA-CreのDNA組換え活性の評価を行った。アスタリスク（＊）の付いた領域は指定された強度での赤色光照射に相当し、その他の部分は暗所に相当する。それぞれの赤色光照射時の応答と暗所での応答の比をそれぞれの棒グラフの右に示す。また、****は、P<0.0001を示す（多重比較による一方向ANOVA）。
【図14】図１４は、2つの異なるタンパク質を1つのベクターで発現させるための3つのバイシストロニック・システム（P2A，IRES_1，IRES_2）をそれぞれRedPA-Creに導入して比較を行った結果を示す。赤色光照射時の応答を上側のバーで示し，暗所での応答を下側のバーで示す。実験にはFloxed-STOP fluc レポーターを用いた。赤色光照射時の応答と暗所での応答の比（数値）を棒グラフの右に示す。
【図15】図１５は、マウスの生体（in vivo）でRedPA-Creを用いた実験結果を示す。（a）マウスの肝臓でのRedPA-Creの活性化を評価するため実験である。ICRマウスに，IRES_2を導入したRedPA-CreとFloxed-STOP fluc レポーターを1：4のプラスミド比で導入し（合計50mg）、100W m-2の赤色光で16時間照射、もしくは暗所で飼育した。（b）赤色のLED光源を用いて、マウスの生体外から非侵襲的に赤色光照射照を行った。底に金網を敷いた透明なアクリルボックス（15 cm×15 cm）の中で，マウスに光照射を施した。
【図16】配列番号１のアミノ酸配列を示す。配列番号６１及び６２のアミノ酸配列を示す。配列番号１、６１及び６２は、それぞれ、図１で、Aff6、Aff6_V18F及びAff6_V18FΔNとして示す、アフィボディのアミノ酸配列に対応する。
【図18】Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ＤｒＢｐｈＰ（ＰＳＭ）を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。各配列において、各ドメインに関する部分に下線を付している。
【図19】Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－ＤｒＢｐｈＰを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図20】ｔｅｔＲ－ＤｒＢｐｈＰ（ＰＳＭ）を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。
【図21】ｔｅｔＲ－ＤｒＢｐｈＰのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図22】ｔｅｔＲ－ＤｒＢｐｈＰを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図23】３ｘＮＬＳ－ＭＳ２－ＤｒＢｐｈＰ－Ｖ５－Ｈｉｓを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。
【図24】３ｘＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＭＳ２を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。
【図25】３ｘＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１－ＤｒＢｐｈＰを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す。
【図26】３ｘＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１のアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。
【図27】３ｘＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す。
【図28】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ５９－ＤｒＢｐｈＰを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１２）を示す。
【図29】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ６０を合成した際に用いたＤＮＡ配列を（配列番号１３）示す。
【図30】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＮ５９を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１４）を示す。
【図31】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－ＤｒＢｐｈＰを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１５）を示す。
【図32】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ１０６のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図33】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ１０６を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１７）を示す。
【図34】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＮ１０４を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１８）を示す。
【図35】Ａｆｆ６－ＶＰ１６－ＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号１９）を示す。
【図36】Ａｆｆ６＿Ｖ１８Ｆ－ＶＰ１６－ＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２０）を示す。
【図37】Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ ＶＰ１６－ＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図38】Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ ＶＰ１６－ＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２２）を示す。
【図39】Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃｆｌｕｃを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す。
【図40】３ｘＮＬＳ－ＭＳ２－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－Ｖ５－Ｈｉｓを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２４）を示す。
【図41】Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＭＳ２－３ｘＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２５）を示す。
【図42】３ｘＮＬＳ－ｐ６５－ＨＳＦ１－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２６）を示す。
【図43】Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ｐ６５－ＨＳＦ１－３ｘＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２７）を示す。
【図44】３ｘＮＬＳ－ＭＳ２－２ｘＡｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２８）を示す。
【図45】２ｘＡｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＭＳ２－３ｘＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。
【図46】２ｘＡｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＭＳ２－３ｘＮＬＳを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号２９）を示す。
【図47】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ５９－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３０）を示す。
【図48】ＮＬＳ－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＣｒｅＣ６０を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３１）を示す。
【図49】ＮＬＳ－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＣｒｅＮ５９を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３２）を示す。
【図50】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。
【図51】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３４）を示す。
【図52】ＮＬＳ－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＣｒｅＣ１０６を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３５）を示す。
【図53】ＮＬＳ－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＣｒｅＮ１０４を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３６）を示す。
【図54】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－Ｖｅｎｕｓを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３７）を示す。
【図55】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－Ｐ２Ａ－ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ１０６を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３８）を示す。
【図56】ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮ－ＩＲＥＳ－ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ１０６を合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号３９）を示す。
【図57】ＮＬＳ－ＤｒＢｐｈＰ－ＣｒｅＣ１０６－ＩＲＥＳ－ＮＬＳ－ＣｒｅＮ１０４－Ａｆｆ６＿Ｖ１８ＦΔＮを合成した際に用いたＤＮＡ配列（配列番号４０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【0012】
本発明のアフィボディと光受容体タンパク質とのセットは、波長が６００～７５０ｎｍの光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する、セットである。
【0013】
本発明において用いられる光受容体タンパク質としては、原核生物が有する光受容体タンパク質であり、バクテリオフィトクロムとして知られている。本発明において、光受容体タンパク質は、ＢｐｈＰと略されることのあるタンパク質である。
光受容体タンパク質としては、異なる長波長域の光において構造を変化させることが知られている。
光受容体タンパク質は、アフィボディが赤色光で結合し、近赤外光で乖離するものであれば特に限定されるものではない。
光受容体タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、細菌（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来の赤色センサータンパク質として知られるＤｒＢｐｈＰが挙げられる。
ＤｒＢｐｈＰは、Ｎ末端側に光受容領域（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｏｒｙ ｍｏｄｕｌｅ：ＰＳＭ）を有しており、赤色光の照射により、ＤｒＢｐｈＰは、Ｐｒ（暗状態）からＰｆｒ（明状態）へと状態を遷移する。明状態において、ＤｒＢｐｈＰは、アフィボディと結合する。
また、ＤｒＢｐｈＰを例にして説明するが、ＤｒＢｐｈＰは、内在性の色素を補因子として結合すると共に、アフィボディとの複合体を形成する場合にも、当該補因子の要求される濃度は細胞内の存在濃度で十分なため、補因子の追加の添加を必要としない。加えて、本発明のアフィボディと光受容体タンパク質とのセットを用いる複合体形成においては、暗所で複合体を形成するということがなく、赤色光で特異的に結合するという利点を有している。実施例においても開示するように、本発明のアフィボディと光受容体タンパク質とのセットは、分割タンパク質の会合を赤色光のＯＮ／ＯＦＦで制御可能である。
光受容体タンパク質としては、異なる長波長域の光において構造を変化させることが知られている。
光受容体タンパク質は、アフィボディが赤色光で結合し、近赤外光で乖離するものであれば特に限定されるものではない。
光受容体タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、細菌（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来の赤色センサータンパク質として知られるＤｒＢｐｈＰが挙げられる。
ＤｒＢｐｈＰは、Ｎ末端側に光受容領域（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｏｒｙ ｍｏｄｕｌｅ：ＰＳＭ）を有しており、赤色光の照射により、ＤｒＢｐｈＰは、Ｐｒ（暗状態）からＰｆｒ（明状態）へと状態を遷移する。明状態において、ＤｒＢｐｈＰは、アフィボディと結合する。
また、ＤｒＢｐｈＰを例にして説明するが、ＤｒＢｐｈＰは、内在性の色素を補因子として結合すると共に、アフィボディとの複合体を形成する場合にも、当該補因子の要求される濃度は細胞内の存在濃度で十分なため、補因子の追加の添加を必要としない。加えて、本発明のアフィボディと光受容体タンパク質とのセットを用いる複合体形成においては、暗所で複合体を形成するということがなく、赤色光で特異的に結合するという利点を有している。実施例においても開示するように、本発明のアフィボディと光受容体タンパク質とのセットは、分割タンパク質の会合を赤色光のＯＮ／ＯＦＦで制御可能である。
【0014】
光受容体タンパク質は、ＤｒＢｐｈＰとして、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、ことが好ましい。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するか、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、ことが好ましい。
【0015】
本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」とは、特定の配列番号において変異が許容されることを意味する。
ここで、「８０％以上の相同性」とは、当該特定の配列番号で表されるアミノ酸配列との重複するアミノ酸が、当該配列番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸の総数に対して、少なくとも８０％において重複していることを意味する。
例えば、配列番号で表されるアミノ酸配列が１００個のアミノ酸からなるとき、８０％以上の相同性とは、８０個のアミノ酸が相同である８０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味し（相同性は８０％）、１００個のアミノ酸が相同である１２０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味する（相同性は１００％）。また、８０個のアミノ酸が相同である１００個のアミノ酸からなる配列であってもよい（相同性は８０％）。
本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合には、相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、１００％であることが好ましい。
「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合には、１００％の相同性を有する場合が含まれるので、特に限定されない限り、）「配列番号２で表されるアミノ酸配列」であってもよい。
「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合、当該配列番号で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が、付加、置換、又は欠失してもよい。
ここで、複数個という場合には、には、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であってよい。すなわち、配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個、１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、１～９個、１～１０個のアミノ酸が、付加、置換、又は欠失してもよい。
配列番号で表されるアミノ酸配列において、付加、置換、又は欠失していてもよいアミノ酸数の上限としては、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、の相同性を有する限り、当該相同性の範囲内で決定できる。
また、本明細書において、あるアミノ酸配列に付加、置換、又は欠失を含むという場合、その配列の末端又は非末端において、付加（挿入）、置換、又は欠失されていることを意味する。付加、置換、又は欠失されるアミノ酸の数は、結果として得られるポリペプチドが本発明における効果を奏する限り特に限定されない。また、付加、置換、又は欠失される部位は、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
ここで、「８０％以上の相同性」とは、当該特定の配列番号で表されるアミノ酸配列との重複するアミノ酸が、当該配列番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸の総数に対して、少なくとも８０％において重複していることを意味する。
例えば、配列番号で表されるアミノ酸配列が１００個のアミノ酸からなるとき、８０％以上の相同性とは、８０個のアミノ酸が相同である８０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味し（相同性は８０％）、１００個のアミノ酸が相同である１２０個のアミノ酸からなる配列であってもよいことを意味する（相同性は１００％）。また、８０個のアミノ酸が相同である１００個のアミノ酸からなる配列であってもよい（相同性は８０％）。
本明細書において、「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合には、相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、１００％であることが好ましい。
「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合には、１００％の相同性を有する場合が含まれるので、特に限定されない限り、）「配列番号２で表されるアミノ酸配列」であってもよい。
「配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する」場合、当該配列番号で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が、付加、置換、又は欠失してもよい。
ここで、複数個という場合には、には、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であってよい。すなわち、配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個、１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、１～９個、１～１０個のアミノ酸が、付加、置換、又は欠失してもよい。
配列番号で表されるアミノ酸配列において、付加、置換、又は欠失していてもよいアミノ酸数の上限としては、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、の相同性を有する限り、当該相同性の範囲内で決定できる。
また、本明細書において、あるアミノ酸配列に付加、置換、又は欠失を含むという場合、その配列の末端又は非末端において、付加（挿入）、置換、又は欠失されていることを意味する。付加、置換、又は欠失されるアミノ酸の数は、結果として得られるポリペプチドが本発明における効果を奏する限り特に限定されない。また、付加、置換、又は欠失される部位は、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【0016】
本明細書において、配列番号で表されるアミノ酸配列との重複する領域は、当業者に公知の方法で最もアミノ酸が一致するようにアライメントして、当該配列番号で表されるアミノ酸配列と重複するアミノ酸の割合を求めることができる。
【0017】
光受容体タンパク質がＤｒＢｐｈＰである場合、配列番号１におけるＮ末端から２４位のシステインは、補因子であるビリベルジンの共有結合部位であるため、ビリベルジンとの結合のため、変異していないことが好ましい。
また、ＤｒＢｐｈＰは、主として、４つのドメイン（ＰＡＳドメイン、ＧＡＦドメイン、ＰＨＹドメイン及びＨＫドメイン）からなることが知られている。ＰＡＳドメイン、ＧＡＦドメイン、ＰＨＹドメインは、「バクテリオフィトクロム」と総称されるタンパク質において、極めて共通性が高い一方、エフェクタードメインとも呼ばれるＨＫドメインは、バクテリオフィトクロムによって異なっている場合が多いことが知られている。これらの情報に基づいて、各ドメインにおいて変異を設けてもよい。
また、ＤｒＢｐｈＰは、主として、４つのドメイン（ＰＡＳドメイン、ＧＡＦドメイン、ＰＨＹドメイン及びＨＫドメイン）からなることが知られている。ＰＡＳドメイン、ＧＡＦドメイン、ＰＨＹドメインは、「バクテリオフィトクロム」と総称されるタンパク質において、極めて共通性が高い一方、エフェクタードメインとも呼ばれるＨＫドメインは、バクテリオフィトクロムによって異なっている場合が多いことが知られている。これらの情報に基づいて、各ドメインにおいて変異を設けてもよい。
【0018】
本発明において用いられるアフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＺドメインに基づいて設計された約５８アミノ酸からなるタンパク質に由来する一群のカテゴリーのタンパク質を意味する。アフィボディは、光受容体タンパク質との結合部位といえる可変領域と、アフィボディの構造を維持するために用いられる定常領域とを有する。
本発明において用いられるアフィボディは、その代表的なものとして、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
配列番号１において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸が、アフィボディのらせん状束において、アフィボディ表面に存在して、光受容体タンパク質との結合に関与する。すなわち、配列番号１において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸が、アフィボディの可変領域を構成する。
光受容体タンパク質との結合に関与するアフィボディにおけるアミノ酸は、光励起されてアフィボディと結合し得る状態となっている光受容体タンパク質との結合に関与すると考えられるアミノ酸であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸である。
これらアミノ酸は、配列番号１において保存されていることが好ましいが、一部のアミノ酸において他のアミノ酸で置換されているアフィボディであっても、光受容体タンパク質との複合体の形成能を有する。
すなわち、光受容体タンパク質との複合体の形成能を有する範囲において、配列番号１で表されるアミノ酸配列における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸は他のアミノ酸に変異されていてもよい。
本発明において用いられるアフィボディは、その代表的なものとして、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
配列番号１において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸が、アフィボディのらせん状束において、アフィボディ表面に存在して、光受容体タンパク質との結合に関与する。すなわち、配列番号１において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸が、アフィボディの可変領域を構成する。
光受容体タンパク質との結合に関与するアフィボディにおけるアミノ酸は、光励起されてアフィボディと結合し得る状態となっている光受容体タンパク質との結合に関与すると考えられるアミノ酸であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸である。
これらアミノ酸は、配列番号１において保存されていることが好ましいが、一部のアミノ酸において他のアミノ酸で置換されているアフィボディであっても、光受容体タンパク質との複合体の形成能を有する。
すなわち、光受容体タンパク質との複合体の形成能を有する範囲において、配列番号１で表されるアミノ酸配列における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位におけるアミノ酸は他のアミノ酸に変異されていてもよい。
【0019】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸以外のアミノ酸、すなわち、１から８位、１２位、１５位、１６位、１９～２３位、２６位、２９～３１位、３３位、３４位及び３６～５８位のアミノ酸は、アフィボディにおける定常領域のアミノ酸といえるものである。
９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸以外のアミノ酸については、定常領域のアミノ酸と考え得るアミノ酸であって、アフィボディの構造を維持するために用いられるアミノ酸である。よって、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が光受容体タンパク質との結合能を有するアミノ酸の組み合わせである限り、配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の位置のアミノ酸は、アフィボディの構造を維持する限りにおいて、置換又は欠失していてもよく、他のアミノ酸が付加されていてもよい。
アフィボディにおける欠失としては、例えば、アフィボディのＮ末端又はＣ末端におけるアミノ酸の欠失が挙げられる。
Ｎ末端又はＣ末端におけるアミノ酸の欠失としては、連続して、あるいは非連続で、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が欠失していてもよい。
例えば、Ｎ末端又はＣ末端における１～５個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～４個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～３個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～２個のアミノ酸が欠失していてもよく、１個のアミノ酸が欠失していてもよい。これらアミノ酸の欠失においては、それぞれ、末端のアミノ酸から連絡したアミノ酸の欠失であってよい。
配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の位置のアミノ酸のうち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が置換されていてもよい。
また、配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が、光受容体タンパク質への結合能を有する限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が付加されていてもよい。
アフィボディにおける、配列番号１に表されるアミノ酸配列において、置換、付加又は欠失しているアミノ酸の数は、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個であってよく、上限が、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であってもよく、１個であってもよい。
中でも、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が、その光受容体タンパク質との結合能を有するような構造を取り得る限り９位～３５位にあるアミノ酸のうち、１２位、１５位、１６位、１９～２３位、２６位、２９～３１位、３３位及び３４位のいずれかのアミノ酸が欠失していてもよい。
９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸以外のアミノ酸については、定常領域のアミノ酸と考え得るアミノ酸であって、アフィボディの構造を維持するために用いられるアミノ酸である。よって、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が光受容体タンパク質との結合能を有するアミノ酸の組み合わせである限り、配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の位置のアミノ酸は、アフィボディの構造を維持する限りにおいて、置換又は欠失していてもよく、他のアミノ酸が付加されていてもよい。
アフィボディにおける欠失としては、例えば、アフィボディのＮ末端又はＣ末端におけるアミノ酸の欠失が挙げられる。
Ｎ末端又はＣ末端におけるアミノ酸の欠失としては、連続して、あるいは非連続で、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が欠失していてもよい。
例えば、Ｎ末端又はＣ末端における１～５個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～４個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～３個のアミノ酸が欠失していてもよく、１～２個のアミノ酸が欠失していてもよく、１個のアミノ酸が欠失していてもよい。これらアミノ酸の欠失においては、それぞれ、末端のアミノ酸から連絡したアミノ酸の欠失であってよい。
配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の位置のアミノ酸のうち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が置換されていてもよい。
また、配列番号１における９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が、光受容体タンパク質への結合能を有する限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が付加されていてもよい。
アフィボディにおける、配列番号１に表されるアミノ酸配列において、置換、付加又は欠失しているアミノ酸の数は、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個であってよく、上限が、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下であってもよく、１個であってもよい。
中でも、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のアミノ酸が、その光受容体タンパク質との結合能を有するような構造を取り得る限り９位～３５位にあるアミノ酸のうち、１２位、１５位、１６位、１９～２３位、２６位、２９～３１位、３３位及び３４位のいずれかのアミノ酸が欠失していてもよい。
【0020】
本発明において用いられるアフィボディは、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
であってもよい。
また、本発明において用いられるアフィボディが、
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列
であってもよく、中でも、配列番号１のＮ末端及びＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列であってもよい。
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位のうち、１～５個の位置で、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、９～１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位、及び３５位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異されているアミノ酸配列
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位及び／又は２４位において、配列番号１の該当するアミノ酸が変異され、かつ、１８位及び２４位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有するアミノ酸配列、
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、１８位以外の部分のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
であってもよい。
また、本発明において用いられるアフィボディが、
（９）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１８位において、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びメチオニン（Ｍ）から選択されるいずれかのアミノ酸を有し、かつ、配列番号１のＮ末端又はＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列
であってもよく、中でも、配列番号１のＮ末端及びＣ末端の１～５個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列であってもよい。
【0021】
本発明における光受容体タンパク質とアフィボディのセットによれば、光の照射及び遮断という簡単な工程により、複合体形成及びその解離を精確に制御することができる。
光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する際に用いられる光の波長は、６００～７５０ｎｍの範囲内である。
光受容体タンパク質が、光を受け、アフィボディと結合する状態と、アフィボディと結合しない状態の存在状態から、好適な波長は設定されるが、光受容体タンパク質がアフィボディと結合する状態である、明状態となるには、上記波長の範囲内において、その下限値は、６２０ｎｍ以上、６３０ｎｍ以上、６４０ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、６６０ｎｍ以上、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上、６９５ｎｍ以上であってよく、その上限値は、７４０ｎｍ以下、７３０ｎｍ以下、７２０ｎｍ以下、７１０ｎｍ以下、７０５ｎｍ以下であってよい。
好ましくは、波長は、６４０～７２０ｎｍの範囲内である。
光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成する際に用いられる光の波長は、６００～７５０ｎｍの範囲内である。
光受容体タンパク質が、光を受け、アフィボディと結合する状態と、アフィボディと結合しない状態の存在状態から、好適な波長は設定されるが、光受容体タンパク質がアフィボディと結合する状態である、明状態となるには、上記波長の範囲内において、その下限値は、６２０ｎｍ以上、６３０ｎｍ以上、６４０ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、６６０ｎｍ以上、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上、６９５ｎｍ以上であってよく、その上限値は、７４０ｎｍ以下、７３０ｎｍ以下、７２０ｎｍ以下、７１０ｎｍ以下、７０５ｎｍ以下であってよい。
好ましくは、波長は、６４０～７２０ｎｍの範囲内である。
【0022】
本発明における光受容体タンパク質とアフィボディのセットは、光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成するが、光依存的に複合体の形成を可逆的にも解除可能である。
光受容体タンパク質が、光を受け、アフィボディと結合する状態と、アフィボディと結合しない状態の存在状態から、好適な波長は設定されるが、光受容体タンパク質がアフィボディと結合しない状態である、暗状態となるには、例えば、近赤外光である７５０ｎｍ以上の波長の光を照射するか、光受容体タンパク質とアフィボディのセットを暗所にするとよい。
当該波長の範囲内において、その下限値は、７６０ｎｍ以上、７７０ｎｍ以上、７８０ｎｍ以上、７９０ｎｍ以上であってよく、その上限値は、８２０ｎｍ以下、８１０ｎｍ以下であってよい。
光受容体タンパク質が、光を受け、アフィボディと結合する状態と、アフィボディと結合しない状態の存在状態から、好適な波長は設定されるが、光受容体タンパク質がアフィボディと結合しない状態である、暗状態となるには、例えば、近赤外光である７５０ｎｍ以上の波長の光を照射するか、光受容体タンパク質とアフィボディのセットを暗所にするとよい。
当該波長の範囲内において、その下限値は、７６０ｎｍ以上、７７０ｎｍ以上、７８０ｎｍ以上、７９０ｎｍ以上であってよく、その上限値は、８２０ｎｍ以下、８１０ｎｍ以下であってよい。
【0023】
本発明における光受容体タンパク質とアフィボディのセットは、特定波長に応じて、複合体を形成したり、解離したりする。本発明における光受容体タンパク質とアフィボディのセットは、赤色光の光依存的にアフィボディと光受容体タンパク質とが複合体を形成するため、赤色光で精密に制御して操作することが可能な技術を提供する。様々なタンパク質の光操作に応用できる本発明の光受容体タンパク質とアフィボディのセットを「ＭａｇＲｅｄ」と呼ぶ。
ＭａｇＲｅｄは、生命現象や疾患の治療に関するタンパク質を光で自在にコントロールする技術である。
また、ＭａｇＲｅｄでは、赤色光を光制御に用いることにより、哺乳類細胞の中で、補因子を添加することなく光制御可能な技術を提供することが可能である。
以下、本明細書において、アフィボディと光受容体タンパク質とのセットを「ＭａｇＲｅｄ」と記載して説明する。
ＭａｇＲｅｄは、生命現象や疾患の治療に関するタンパク質を光で自在にコントロールする技術である。
また、ＭａｇＲｅｄでは、赤色光を光制御に用いることにより、哺乳類細胞の中で、補因子を添加することなく光制御可能な技術を提供することが可能である。
以下、本明細書において、アフィボディと光受容体タンパク質とのセットを「ＭａｇＲｅｄ」と記載して説明する。
【0024】
ＭａｇＲｅｄは、光受容体タンパク質とアフィボディを有し、それぞれに、ドメインを結合させておくことにより、光の照射及び遮断によって、当該ドメインに基づいた作用のＯＮ／ＯＦＦを精確に制御することができる。
光受容体タンパク質とアフィボディのそれぞれに結合させるドメインとしては、特に限定されるものではなく、光制御してその作用を発揮させるドメインであればよい。
光受容体タンパク質とアフィボディの双方に、あるいは、一方に、光制御してその作用を発揮させるドメインを結合させてよい。
光受容体タンパク質とアフィボディのそれぞれに結合させるドメインとしては、特に限定されるものではなく、光制御してその作用を発揮させるドメインであればよい。
光受容体タンパク質とアフィボディの双方に、あるいは、一方に、光制御してその作用を発揮させるドメインを結合させてよい。
【0025】
光受容体タンパク質とアフィボディの双方に光制御してその作用を発揮させるドメインを結合させる場合、光制御により、光受容体タンパク質とアフィボディとが複合体を形成することにより、光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、近接して作用を発揮すればよい。光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとは、それぞれが別々の作用を有するドメイン同士であってもよく、光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが隣接することで、一の作用を発揮してもよい。
光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、それぞれが別の作用を有するドメイン同士である場合、２つのドメインが隣接することで作用を発揮してもよく、例えば、ヘテロ二量体が挙げられる。また、光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、ホモ二量体を形成してもよい。
あるいは、多量体を形成して作用を発揮するドメインの一部を光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとしてもよい。
光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、隣接することで、一の作用を発揮する場合、例えば、二分割された一のドメインが挙げられる。この場合、ある作用を有するタンパク質を二分割して、二分割した一方を、光受容体タンパク質に結合するドメインとして、二分割した他方を、アフィボディに結合するドメインとして、光受容体タンパク質とアフィボディとに結合することにより、光受容体タンパク質に結合するドメインとが光制御により結合体を形成した際に、二分割されたドメインは、さも元の分割前のドメインと同様の機能を発揮することが可能である。
光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、それぞれが別の作用を有するドメイン同士である場合、２つのドメインが隣接することで作用を発揮してもよく、例えば、ヘテロ二量体が挙げられる。また、光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、ホモ二量体を形成してもよい。
あるいは、多量体を形成して作用を発揮するドメインの一部を光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとしてもよい。
光受容体タンパク質に結合するドメインと、アフィボディに結合するドメインとが、隣接することで、一の作用を発揮する場合、例えば、二分割された一のドメインが挙げられる。この場合、ある作用を有するタンパク質を二分割して、二分割した一方を、光受容体タンパク質に結合するドメインとして、二分割した他方を、アフィボディに結合するドメインとして、光受容体タンパク質とアフィボディとに結合することにより、光受容体タンパク質に結合するドメインとが光制御により結合体を形成した際に、二分割されたドメインは、さも元の分割前のドメインと同様の機能を発揮することが可能である。
【0026】
光受容体タンパク質とアフィボディの一方に光制御してその作用を発揮させるドメインを結合させる場合、光制御してその作用を発揮させるドメインを結合させていない他方となる光受容体タンパク質又はアフィボディには、結合体を所望の場所へ配向させる認識ドメインを結合させてもよい。
光受容体タンパク質又はアフィボディの一方に、当該認識ドメインが結合していることにより、認識ドメインが結合する光受容体タンパク質又はアフィボディは、所望の場所へと配向させられる。
所望の場所へと配向させられた光受容体タンパク質又はアフィボディに対して、光制御により、光受容体タンパク質又はアフィボディの他方が結合することで、当該他方に結合するドメインがその作用を発揮してもよい。
結合体を所望の場所へ配向させる認識ドメインとしては、特に限定されるものではないが、核酸を認識するドメインが好適に用いられる。
核酸を認識するドメインを用いる場合、核酸を認識するドメインを通じて、ＭａｇＲｅｄが所定の位置に配向させられることで、光制御してその作用を発揮させるドメインも所定の場所に配向させられることとなり、その作用を発揮する。
光受容体タンパク質又はアフィボディの一方に、当該認識ドメインが結合していることにより、認識ドメインが結合する光受容体タンパク質又はアフィボディは、所望の場所へと配向させられる。
所望の場所へと配向させられた光受容体タンパク質又はアフィボディに対して、光制御により、光受容体タンパク質又はアフィボディの他方が結合することで、当該他方に結合するドメインがその作用を発揮してもよい。
結合体を所望の場所へ配向させる認識ドメインとしては、特に限定されるものではないが、核酸を認識するドメインが好適に用いられる。
核酸を認識するドメインを用いる場合、核酸を認識するドメインを通じて、ＭａｇＲｅｄが所定の位置に配向させられることで、光制御してその作用を発揮させるドメインも所定の場所に配向させられることとなり、その作用を発揮する。
【0027】
光受容体タンパク質とアフィボディのそれぞれに結合させるドメイン以外のドメインを、その作用を発揮するためには必要とする場合であってもよい。
例えば、光受容体タンパク質とアフィボディの双方に結合させるドメインが、光制御により近接して存在し、かつ、他のドメインも加わって、その作用を発揮してもよく、光受容体タンパク質とアフィボディの一方に結合させるドメインが、光受容体タンパク質とアフィボディには結合していない他のドメインも加わることで、その作用を発揮してもよい。
例えば、光受容体タンパク質とアフィボディの双方に結合させるドメインが、光制御により近接して存在し、かつ、他のドメインも加わって、その作用を発揮してもよく、光受容体タンパク質とアフィボディの一方に結合させるドメインが、光受容体タンパク質とアフィボディには結合していない他のドメインも加わることで、その作用を発揮してもよい。
【0028】
光受容体タンパク質とアフィボディと、その他のドメインとの結合は、特に限定されないが、共有結合であってよく、光受容体タンパク質とアフィボディと、その他のドメントの結合がリンカーを介した結合であってもよい。
また、光受容体タンパク質とアフィボディに対して、複数のドメインが結合していてもよく、複数のドメインが連結して、光受容体タンパク質とアフィボディに結合していてもよい。複数のドメインが連結する場合にも、ドメイン間の結合は、リンカーを介した結合であってもよい。
リンカーとしては、公知のリンカーを利用可能である。
リンカーとしては、例えば、グリシン及びセリンをその配列中に多く含むアミノ酸配列を有するリンカーが好適に用いられる。グリシンを主成分としているリンカーを用いてよく、親水性アミノ酸であるセリンやトレオニンを含むリンカーであることが好適である。リンカーは、特に限定されるものではないが、２～１６のアミノ酸で構成されていてよい。
その他のドメインとして、例えば、核局在化シグナル配列並びに２Ａペプチド配列やＩＲＥＳ配列等が結合されていてもよい。
また、光受容体タンパク質とアフィボディに対して、複数のドメインが結合していてもよく、複数のドメインが連結して、光受容体タンパク質とアフィボディに結合していてもよい。複数のドメインが連結する場合にも、ドメイン間の結合は、リンカーを介した結合であってもよい。
リンカーとしては、公知のリンカーを利用可能である。
リンカーとしては、例えば、グリシン及びセリンをその配列中に多く含むアミノ酸配列を有するリンカーが好適に用いられる。グリシンを主成分としているリンカーを用いてよく、親水性アミノ酸であるセリンやトレオニンを含むリンカーであることが好適である。リンカーは、特に限定されるものではないが、２～１６のアミノ酸で構成されていてよい。
その他のドメインとして、例えば、核局在化シグナル配列並びに２Ａペプチド配列やＩＲＥＳ配列等が結合されていてもよい。
【0029】
光制御によりその機能を発揮させるドメインとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、デアミナーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体及び抗体様分子、ニューロトキシン等が挙げられる。
【0030】
本発明においては、アフィボディに、遺伝子の転写活性に関連するドメインが結合し、
光受容体タンパク質に、核酸の認識ドメインが結合する、光受容体タンパク質とアフィボディのセットであってもよい。
本発明においては、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットとを、光照射してインキュベートする工程を含む、方法であってよい。
また、本発明においては、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、標的遺伝子と、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とを、光照射してインキュベートする工程を含む、方法であってよい。
本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方に、標的遺伝子の近傍の核酸を認識するドメインが結合していることにより、光照射により、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットが、結合体を形成し、それにより、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの他方に結合する遺伝子の転写活性に関連するドメインが作用して、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化することができる。
また、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を認識するドメイン、好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ２にＭＳ２アプタマーを含むガイドＲＮＡを用いることで、核酸の認識ドメインとしてのＭＳ２アプタマーが結合していることにより、ＭＳ２アプタマーが結合している本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質により認識された標的遺伝子の近傍に存在し、光照射により、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットが、結合体を形成し、それにより、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの他方に結合する遺伝子の転写活性に関連するドメインが作用して、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化することができる。
光受容体タンパク質に、核酸の認識ドメインが結合する、光受容体タンパク質とアフィボディのセットであってもよい。
本発明においては、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、
標的遺伝子と、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットとを、光照射してインキュベートする工程を含む、方法であってよい。
また、本発明においては、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化する方法であって、標的遺伝子と、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とを、光照射してインキュベートする工程を含む、方法であってよい。
本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方に、標的遺伝子の近傍の核酸を認識するドメインが結合していることにより、光照射により、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットが、結合体を形成し、それにより、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの他方に結合する遺伝子の転写活性に関連するドメインが作用して、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化することができる。
また、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を認識するドメイン、好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ２にＭＳ２アプタマーを含むガイドＲＮＡを用いることで、核酸の認識ドメインとしてのＭＳ２アプタマーが結合していることにより、ＭＳ２アプタマーが結合している本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの一方が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質により認識された標的遺伝子の近傍に存在し、光照射により、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットが、結合体を形成し、それにより、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットの他方に結合する遺伝子の転写活性に関連するドメインが作用して、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化することができる。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質としては、遺伝子編集に用いられる従来公知のタンパク質が用いられ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と共に、ガイドＲＮＡ等のその他の成分を含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質としては、例えば、ヌクレアーゼ活性及びニッカーゼ活性を欠失させたタンパク質が好ましく用いられる。ガイドＲＮＡを、標的遺伝子の近傍の遺伝子に対して相補的な配列とすることにより、本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットを標的遺伝子近傍に存在させ、標的遺伝子の発現を抑制又は活性化することができる。
【0032】
遺伝子の転写活性に関連するドメインとしての機能性ドメインとして、転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメインである場合、標的遺伝子の発現を活性化又は抑制する。
本明細書において「遺伝子の発現」は、ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡが合成される転写と、ＲＮＡ配列に基づいてポリペプチドが合成される翻訳の双方を含む概念として用いられる。
機能性ドメインとしては、ＶＰ６４、ＭＳ２、ｐ６５及びＨＳＦ１を用いてもよく、これらに相当する機能性ドメインとして、公知の転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることもできるが、例えば、Ｎａｔｕｒｅ （２０１５） ５１７， ５８３－５８８及びＮａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２） ７（１０）， １７９７－１８０７に開示されるような転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることができる。
本明細書において「遺伝子の発現」は、ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡが合成される転写と、ＲＮＡ配列に基づいてポリペプチドが合成される翻訳の双方を含む概念として用いられる。
機能性ドメインとしては、ＶＰ６４、ＭＳ２、ｐ６５及びＨＳＦ１を用いてもよく、これらに相当する機能性ドメインとして、公知の転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることもできるが、例えば、Ｎａｔｕｒｅ （２０１５） ５１７， ５８３－５８８及びＮａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２０１２） ７（１０）， １７９７－１８０７に開示されるような転写活性化ドメイン及びアプタマー結合タンパク質を用いることができる。
【0033】
本発明においては、アフィボディに、所定の作用を有するタンパク質の二分割した一方のフラグメントが結合し、
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、セットであってよい。
二分割したタンパク質としては、光受容体タンパク質とアフィボディが結合することで機能を発揮するタンパク質であれば特に限定されるものではない。
非限定的な例示ではあるが、二分割されるタンパク質としては、Ｃｒｅタンパク質が挙げられる。
当該二分割したＣｒｅタンパク質としては、従来公知のものを用いてよく、例えば、国際公開第２０１６／１６７３００号に記載されるようなタンパク質が挙げられる。
光受容体タンパク質に、所定の作用を有するタンパク質の二分割した他方のフラグメントが結合する、セットであってよい。
二分割したタンパク質としては、光受容体タンパク質とアフィボディが結合することで機能を発揮するタンパク質であれば特に限定されるものではない。
非限定的な例示ではあるが、二分割されるタンパク質としては、Ｃｒｅタンパク質が挙げられる。
当該二分割したＣｒｅタンパク質としては、従来公知のものを用いてよく、例えば、国際公開第２０１６／１６７３００号に記載されるようなタンパク質が挙げられる。
【0034】
二分割したＣｒｅタンパク質としては、光受容体タンパク質とアフィボディが結合することで機能を発揮し得る２つのフラグメントからなれば特に限定されるものではなく、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントにより構成される。
Ｃｒｅタンパク質の分割位置は適宜従来公知の分割位置を採用可能である。
本発明において、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントが、それぞれ、光受容体タンパク質とアフィボディに結合する、
本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットにおいては、光受容体タンパク質とアフィボディが、光照射により結合体を形成することにより、これらに結合するＣｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質として再構成されて、Ｃｒｅタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復する。よって、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質を結合させたＭａｇＲｅｄのセットとして、光依存的遺伝子組換えに用いることができる。
Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質を用いて遺伝子組換えに用いられる場合、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる遺伝子組換え技術であることが好ましい。
すなわち、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントが結合するＭａｇＲｅｄは、ｌｏｘＰ配列又はｌｏｘＰ変異体配列と組合せて用いることにより、光依存的に、遺伝子組換えを行うことができる。loxP変異体としては、lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17からなる群から選択される配列を有する核酸を用いることができる。
Ｃｒｅタンパク質の分割位置は適宜従来公知の分割位置を採用可能である。
本発明において、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントが、それぞれ、光受容体タンパク質とアフィボディに結合する、
本発明に係る光受容体タンパク質とアフィボディのセットにおいては、光受容体タンパク質とアフィボディが、光照射により結合体を形成することにより、これらに結合するＣｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質として再構成されて、Ｃｒｅタンパク質のレコンビナーゼ活性を回復する。よって、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質を結合させたＭａｇＲｅｄのセットとして、光依存的遺伝子組換えに用いることができる。
Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントがＣｒｅタンパク質を用いて遺伝子組換えに用いられる場合、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムによる遺伝子組換え技術であることが好ましい。
すなわち、Ｃｒｅタンパク質のＮ末端側フラグメントと、Ｃｒｅタンパク質のＣ末端側フラグメントが結合するＭａｇＲｅｄは、ｌｏｘＰ配列又はｌｏｘＰ変異体配列と組合せて用いることにより、光依存的に、遺伝子組換えを行うことができる。loxP変異体としては、lox2722、lox66、lox71、JT15、及びJTZ17からなる群から選択される配列を有する核酸を用いることができる。
【0035】
本発明においては、ＭａｇＲｅｄを有する動物をも提供する。
光操作に基づく医療技術を開発する場合に，光の生体組織透過性が重要になってくるが，ＭａｇＲｅｄは生体組織透過性が高い赤色光（～６６０ｎｍ）と近赤外光（～８００ｎｍ）でのコントロールが可能なため優位性が高い。
当該ＭａｇＲｅｄを有する動物は、ＭａｇＲｅｄに結合させたドメインを有していてもよく、ＭａｇＲｅｄに結合させたドメインに加え、当該ドメインと一緒になって機能する他のドメインを有していてもよい。
また、当該動物において、ＭａｇＲｅｄは、ＭａｇＲｅｄの組合せとして存在していてもよく、少なくともＭａｇＲｅｄをコードする核酸として存在していてもよく、ＭａｇＲｅｄを導入した少なくとも１つの発現ベクターとして存在していてもよい。
ＭａｇＲｅｄを有する動物は、赤色光により光制御可能であることから、生体においても遺伝子組換え活性を有し、赤色光により光制御可能なＭａｇＲｅｄを体内に組み込んだ動物に対して体外から光照射することでも、効率よく遺伝子組換えをコントロールすることができる。
すなわち、光照射をオン／オフすることで遺伝子組換えをin vitroだけでなくin vivoにおいてもＭａｇＲｅｄにより正確に制御することができる。
ＭａｇＲｅｄを組み込んだ動物としては、哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、実験動物としてのげっ歯類であることが好ましい。
本発明においては、ＭａｇＲｅｄが組み込まれていることにより、当該組み込んだ動物において、特に限定されるものではないが、例えば，光刺激で遺伝子の働きをノックアウトしたり，逆に変異型の遺伝子を光刺激で正常に戻してその影響を評価できるようにしたり，あるいは蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を光刺激で働かせて生体組織やそれを構成する細胞を標識することができる。
光操作に基づく医療技術を開発する場合に，光の生体組織透過性が重要になってくるが，ＭａｇＲｅｄは生体組織透過性が高い赤色光（～６６０ｎｍ）と近赤外光（～８００ｎｍ）でのコントロールが可能なため優位性が高い。
当該ＭａｇＲｅｄを有する動物は、ＭａｇＲｅｄに結合させたドメインを有していてもよく、ＭａｇＲｅｄに結合させたドメインに加え、当該ドメインと一緒になって機能する他のドメインを有していてもよい。
また、当該動物において、ＭａｇＲｅｄは、ＭａｇＲｅｄの組合せとして存在していてもよく、少なくともＭａｇＲｅｄをコードする核酸として存在していてもよく、ＭａｇＲｅｄを導入した少なくとも１つの発現ベクターとして存在していてもよい。
ＭａｇＲｅｄを有する動物は、赤色光により光制御可能であることから、生体においても遺伝子組換え活性を有し、赤色光により光制御可能なＭａｇＲｅｄを体内に組み込んだ動物に対して体外から光照射することでも、効率よく遺伝子組換えをコントロールすることができる。
すなわち、光照射をオン／オフすることで遺伝子組換えをin vitroだけでなくin vivoにおいてもＭａｇＲｅｄにより正確に制御することができる。
ＭａｇＲｅｄを組み込んだ動物としては、哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、実験動物としてのげっ歯類であることが好ましい。
本発明においては、ＭａｇＲｅｄが組み込まれていることにより、当該組み込んだ動物において、特に限定されるものではないが、例えば，光刺激で遺伝子の働きをノックアウトしたり，逆に変異型の遺伝子を光刺激で正常に戻してその影響を評価できるようにしたり，あるいは蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を光刺激で働かせて生体組織やそれを構成する細胞を標識することができる。
【0036】
動物や細胞において、ＭａｇＲｅｄを発現させる場合には、光受容体タンパク質と、アフィボディそれぞれに対応する核酸を選択し、光受容体タンパク質とアフィボディとに結合させるドメイン等に対応する核酸を選択し、光受容体タンパク質と所望のドメイン、アフィボディと所望のドメインが発現し得るように、それぞれの核酸を連結し、例えば、プラスミド等の発現ベクターに導入してよい。
本発明においては、光受容体タンパク質と所望のドメイン、アフィボディと所望のドメインを、それぞれ発現し得るように設計された核酸のセットをも提供する。
光受容体タンパク質と所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、アフィボディと所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、は、一の発現ベクター上に存在してもよく、また、それぞれの核酸が連結するように発現ベクター上に存在してもよく、別々に、発現が制御されるように発現ベクター上に存在していてもよい。また、光受容体タンパク質と所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、アフィボディと所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、は、別の発現ベクター上に存在していてもよい。光受容体タンパク質又はアフィボディと所望のドメインとが、リンカーを介しているように設計された核酸であってよい。
本発明においては、光受容体タンパク質と所望のドメイン、アフィボディと所望のドメインを、それぞれ発現し得るように設計された核酸のセットをも提供する。
光受容体タンパク質と所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、アフィボディと所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、は、一の発現ベクター上に存在してもよく、また、それぞれの核酸が連結するように発現ベクター上に存在してもよく、別々に、発現が制御されるように発現ベクター上に存在していてもよい。また、光受容体タンパク質と所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、アフィボディと所望のドメインを発現し得るように設計された核酸と、は、別の発現ベクター上に存在していてもよい。光受容体タンパク質又はアフィボディと所望のドメインとが、リンカーを介しているように設計された核酸であってよい。
【0037】
本発明において、核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加して、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。
発現ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
発現ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
【0038】
プロモーターは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモーター、CMV（cytomegalovirus）由来プロモーターを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター等を用いることができる。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込んでもよい。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込んでもよい。
【0039】
本発明において、発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。
宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いてもよい。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。
宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いてもよい。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。
【0040】
形質転換体の培養物からのタンパク質の精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS－PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS－PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
【実施例0041】
発現ベクターの作製
RedPA-Cre及びRed-CPTSを発現するすべてのコンストラクトは、pcDNA3.1又はpcDNA3.1/V5-Hisベクターにクローニングした。TetR-tetOシステムに関するすべてのコンストラクトは、pSV40ベクターにクローニングした。sgRNAをコードするすべてのコンストラクトは、U6プロモーターを持つpSPgRNAベクターにクローニングした（Addgene plasmid #47108）。コドンが最適化されたStreptococcus pyogenes Cas9をコードするcDNAは、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgene plasmid #42230）から増幅した。Cas9のヌクレアーゼ活性をなくすために、D10A及びH840A変異をCas9に導入した。MS2（N55K）変異体及びp65-HSF1をコードするcDNAをMS2-P65-HSF1_GFP（Addgene plasmid #61423）から増幅した。EGFP-Cre遺伝子は、pENN.AAV.hSyn.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40（Addgeneplasmid #105540）から増幅した。CreリコンビナーゼをコードするcDNAは、Invitrogenで合成した。DrBphP、RpBphP1、PpsR2をコードするcDNAは、GenScriptで合成した。Zdk1とLDB-14をコードするcDNA（nanoReD2）は、Eurofins Genomicsで合成した。VP16-NLS及びtetRをコードするcDNAは、tetR-VP16-NLS/pSV40から増幅した。
RedPA-Cre及びRed-CPTSを発現するすべてのコンストラクトは、pcDNA3.1又はpcDNA3.1/V5-Hisベクターにクローニングした。TetR-tetOシステムに関するすべてのコンストラクトは、pSV40ベクターにクローニングした。sgRNAをコードするすべてのコンストラクトは、U6プロモーターを持つpSPgRNAベクターにクローニングした（Addgene plasmid #47108）。コドンが最適化されたStreptococcus pyogenes Cas9をコードするcDNAは、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgene plasmid #42230）から増幅した。Cas9のヌクレアーゼ活性をなくすために、D10A及びH840A変異をCas9に導入した。MS2（N55K）変異体及びp65-HSF1をコードするcDNAをMS2-P65-HSF1_GFP（Addgene plasmid #61423）から増幅した。EGFP-Cre遺伝子は、pENN.AAV.hSyn.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40（Addgeneplasmid #105540）から増幅した。CreリコンビナーゼをコードするcDNAは、Invitrogenで合成した。DrBphP、RpBphP1、PpsR2をコードするcDNAは、GenScriptで合成した。Zdk1とLDB-14をコードするcDNA（nanoReD2）は、Eurofins Genomicsで合成した。VP16-NLS及びtetRをコードするcDNAは、tetR-VP16-NLS/pSV40から増幅した。
【0042】
アフィボディのリボソーム・ディスプレイ・ライブラリーの作製
アフィボディのライブラリーをコードする合成遺伝子は、3段階のPCR反応に続いて、リボソーム・ディスプレイに必要な配列要素とのライゲーションによって構築した。アフィボディの第1及び第2のヘリックスをコードするdsDNAは、相補的な3′末端を持つプライマーO1及びO2をアニーリングして酵素的に伸長することにより組み立てた。コドンNNK（N＝G, A, C, T；K＝G, T）を用いてランダム化された残基をコードした。次に、プライマーO3とO4を用いてオーバーラップ伸長PCRを行い、最初の反応生成物をテンプレートとして第3のヘリックスを付加した。3回目のPCRでは、結果として得られたアフィボディのライブラリーをコードするdsDNAを、プライマーO5とO6を用いたPCRでT7プロモーターを用いて増幅した。並行して、SecM伸長阻止配列（AKFSTPVWISQAQGIRAGPQRLT）を含む塩基配列を、pDgIIISecM-PURF1をテンプレートとして、プライマーO7とO8を用いたPCRで増幅した。この2つの断片をType IIS制限酵素BsmBI（NEB）で消化した後、各断片をライゲーションした。PCRでの過剰増幅やエラーを避けるため、KOD -Multi&Epi- DNAポリメラーゼ（東洋紡）を使用し、各PCRステップのサイクル数を5サイクル以下に設定した。各産物とライゲーション産物をゲル電気泳動で分離し、PureLinkPCR Purification Kit（Invitrogen社）で精製した後、以降の反応を行った。
アフィボディのライブラリーをコードする合成遺伝子は、3段階のPCR反応に続いて、リボソーム・ディスプレイに必要な配列要素とのライゲーションによって構築した。アフィボディの第1及び第2のヘリックスをコードするdsDNAは、相補的な3′末端を持つプライマーO1及びO2をアニーリングして酵素的に伸長することにより組み立てた。コドンNNK（N＝G, A, C, T；K＝G, T）を用いてランダム化された残基をコードした。次に、プライマーO3とO4を用いてオーバーラップ伸長PCRを行い、最初の反応生成物をテンプレートとして第3のヘリックスを付加した。3回目のPCRでは、結果として得られたアフィボディのライブラリーをコードするdsDNAを、プライマーO5とO6を用いたPCRでT7プロモーターを用いて増幅した。並行して、SecM伸長阻止配列（AKFSTPVWISQAQGIRAGPQRLT）を含む塩基配列を、pDgIIISecM-PURF1をテンプレートとして、プライマーO7とO8を用いたPCRで増幅した。この2つの断片をType IIS制限酵素BsmBI（NEB）で消化した後、各断片をライゲーションした。PCRでの過剰増幅やエラーを避けるため、KOD -Multi&Epi- DNAポリメラーゼ（東洋紡）を使用し、各PCRステップのサイクル数を5サイクル以下に設定した。各産物とライゲーション産物をゲル電気泳動で分離し、PureLinkPCR Purification Kit（Invitrogen社）で精製した後、以降の反応を行った。
【0043】
リボソーム・ディスプレイによるアフィボディの選抜
DrBphP-PSMをコードする配列を、N末端のHis6タグに続いてAviタグを含むpColdIベクター（タカラバイオ）にクローニングした。pKT270を保有する大腸菌C41(DE3)株（Lucigen, Wisconsin, USA）をpColdI-Avi-DrBphP-PSMで形質転換した。形質転換された細胞を、アンピシリン（100 mg/ml）及びクロラムフェニコール（30 mg/ml）を添加した30 mlのLB培地中で、OD590=0.45になるまで200 rpmで振とうしながら37 ℃で培養し、室温まで冷却した。次に、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG, 和光純薬）とビリベルジン（BV, Frontier Scientific Inc.）をそれぞれ最終濃度0.5 mMと100 μMで培養液に添加した。これを16℃の暗所で48時間培養し、タンパク質を発現させた。培養した細胞を遠心分離で回収し、0.2 mgのリゾチーム（和光純薬工業）、10 Units DNase I（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマアルドリッチ）を含む2 mlのB-PER試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、室温で10分間溶解させた。粗製の可溶性抽出液をHisTrap FFカラム（GEヘルスケア）を用いて精製した。DrBphP-PSMのビオチン化は、BirA酵素（BirA500, Avidity LLC）を用いて、製造者のプロトコールに従って行った。
アフィボディのリボソーム-タンパク質融合ライブラリーは、PUREシステムを用いて生成した。標準的なPURE翻訳混合物は、以前に記載されたように調製した。In vitro転写及び翻訳反応は、37℃で60分間行い、その後、100 μLのTBS-Mg2+緩衝液（50 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2 and 150 mM NaCl, pH 7.5）で反応を停止した。一方、30 μL容量のストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280Streptavidin, Invitrogen）を200 μLのTBS-Mg2+緩衝液で1回洗浄した。洗浄したビーズにビオチン化したDrBphP-PSMタンパク質を加え、穏やかに回転させながら4℃で30分間インキュベートした。その後、ビーズを200 mLのTBS-Mg2+緩衝液で1回洗浄し、続いて希釈した反応混合物を添加した。その後、混合液を660 nm又は760 nmの光条件下に置き、DrBphP-PSMがそれぞれ明状態（Pfr）フォーム又は暗状態（Pr）フォームをとるようにした。室温で緩やかに回転させながら45分間インキュベートした後、ビーズを200 μLのTBS-Mg2+緩衝液で2回洗浄した。濃縮されたリボソームとタンパク質の融合体を回収するために、200 μLの溶出緩衝液（TBS緩衝液＋50mM EDTA）をビーズに加え、穏やかに回転させながら室温で30分間インキュベートした。溶出液は、標準的なフェノール・クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿を行い、タンパク質成分を除去した。精製されたRNAは、SuperScript III（Thermo Fisher Scientific）を用いてプライマーO8を用いた逆転写を行い、濃縮されたcDNAライブラリーは、KOD -Multi&Epi- DNAポリメラーゼを用いてプライマーO5及びO8を用いたPCRにより再生された。選択を6回繰り返した後、濃縮されたDNAライブラリーをMiseq Reagent Kit v.3を用いてIllumina MiSeqマシンでシークエンスした（150サイクル, 130 bpと45bp, ペアードエンド）。結果を図６に示す。
6回の選択を行った代表的なアフィボディのアミノ酸配列（配列番号４１～５０）を表１に示す。なお、表１中、No.6のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一である。
DrBphP-PSMをコードする配列を、N末端のHis6タグに続いてAviタグを含むpColdIベクター（タカラバイオ）にクローニングした。pKT270を保有する大腸菌C41(DE3)株（Lucigen, Wisconsin, USA）をpColdI-Avi-DrBphP-PSMで形質転換した。形質転換された細胞を、アンピシリン（100 mg/ml）及びクロラムフェニコール（30 mg/ml）を添加した30 mlのLB培地中で、OD590=0.45になるまで200 rpmで振とうしながら37 ℃で培養し、室温まで冷却した。次に、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG, 和光純薬）とビリベルジン（BV, Frontier Scientific Inc.）をそれぞれ最終濃度0.5 mMと100 μMで培養液に添加した。これを16℃の暗所で48時間培養し、タンパク質を発現させた。培養した細胞を遠心分離で回収し、0.2 mgのリゾチーム（和光純薬工業）、10 Units DNase I（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及びプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマアルドリッチ）を含む2 mlのB-PER試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、室温で10分間溶解させた。粗製の可溶性抽出液をHisTrap FFカラム（GEヘルスケア）を用いて精製した。DrBphP-PSMのビオチン化は、BirA酵素（BirA500, Avidity LLC）を用いて、製造者のプロトコールに従って行った。
アフィボディのリボソーム-タンパク質融合ライブラリーは、PUREシステムを用いて生成した。標準的なPURE翻訳混合物は、以前に記載されたように調製した。In vitro転写及び翻訳反応は、37℃で60分間行い、その後、100 μLのTBS-Mg2+緩衝液（50 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2 and 150 mM NaCl, pH 7.5）で反応を停止した。一方、30 μL容量のストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280Streptavidin, Invitrogen）を200 μLのTBS-Mg2+緩衝液で1回洗浄した。洗浄したビーズにビオチン化したDrBphP-PSMタンパク質を加え、穏やかに回転させながら4℃で30分間インキュベートした。その後、ビーズを200 mLのTBS-Mg2+緩衝液で1回洗浄し、続いて希釈した反応混合物を添加した。その後、混合液を660 nm又は760 nmの光条件下に置き、DrBphP-PSMがそれぞれ明状態（Pfr）フォーム又は暗状態（Pr）フォームをとるようにした。室温で緩やかに回転させながら45分間インキュベートした後、ビーズを200 μLのTBS-Mg2+緩衝液で2回洗浄した。濃縮されたリボソームとタンパク質の融合体を回収するために、200 μLの溶出緩衝液（TBS緩衝液＋50mM EDTA）をビーズに加え、穏やかに回転させながら室温で30分間インキュベートした。溶出液は、標準的なフェノール・クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿を行い、タンパク質成分を除去した。精製されたRNAは、SuperScript III（Thermo Fisher Scientific）を用いてプライマーO8を用いた逆転写を行い、濃縮されたcDNAライブラリーは、KOD -Multi&Epi- DNAポリメラーゼを用いてプライマーO5及びO8を用いたPCRにより再生された。選択を6回繰り返した後、濃縮されたDNAライブラリーをMiseq Reagent Kit v.3を用いてIllumina MiSeqマシンでシークエンスした（150サイクル, 130 bpと45bp, ペアードエンド）。結果を図６に示す。
6回の選択を行った代表的なアフィボディのアミノ酸配列（配列番号４１～５０）を表１に示す。なお、表１中、No.6のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一である。
【0044】
【表1】
【0045】
次世代シーケンサーによる解析
ペアエンドリードのうち、R1リードのみがその後の解析対象となった。配列の解析は、カスタムのpythonスクリプトを用いて行った。さらなる品質評価のために、アフィボディの定数領域における2つの正確な配列を検索した。この2つの部位の間の長さがちょうど122ヌクレオチドを含んでいるかどうかを評価した。期待通りの長さの配列は、完全なアフィボディであると考えられた。最後に、660nmの波長で濃縮され、760nmの波長では検出されないアフィボディの配列を選抜した。
ペアエンドリードのうち、R1リードのみがその後の解析対象となった。配列の解析は、カスタムのpythonスクリプトを用いて行った。さらなる品質評価のために、アフィボディの定数領域における2つの正確な配列を検索した。この2つの部位の間の長さがちょうど122ヌクレオチドを含んでいるかどうかを評価した。期待通りの長さの配列は、完全なアフィボディであると考えられた。最後に、660nmの波長で濃縮され、760nmの波長では検出されないアフィボディの配列を選抜した。
【0046】
細胞の培養
HEK 293T細胞及びNeuro2a細胞（ATCC）は、10％ウシ胎児血清（FBS, HyClone）， 100 unit/mLペニシリン及び100 μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Sigma Aldrich）を用いて、5％CO2、37℃で培養した。HeLa細胞（ATCC）は、10％FBS、100 U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加した最小必須培地（Sigma Aldrich）を用いて、5％CO2、37℃で培養した。
HEK 293T細胞及びNeuro2a細胞（ATCC）は、10％ウシ胎児血清（FBS, HyClone）， 100 unit/mLペニシリン及び100 μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Sigma Aldrich）を用いて、5％CO2、37℃で培養した。HeLa細胞（ATCC）は、10％FBS、100 U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを添加した最小必須培地（Sigma Aldrich）を用いて、5％CO2、37℃で培養した。
【0047】
光源
分割ルシフェラーゼアッセイを除いて、光照射はCO2インキュベーター内で行った。細胞に光を照射するために、インキュベーターの底部に660 nmと760 nmのLEDアレイ（CCS）を設置し、そのLEDアレイの上に24ウェルと96ウェルのプレートを置いた。LEDの電流制御には、直流安定化電源（菊水電子株式会社）を用いた。時間的な照明パターンは、Arduino megaマイクロコントローラボードで作成した。
分割ルシフェラーゼアッセイを除いて、光照射はCO2インキュベーター内で行った。細胞に光を照射するために、インキュベーターの底部に660 nmと760 nmのLEDアレイ（CCS）を設置し、そのLEDアレイの上に24ウェルと96ウェルのプレートを置いた。LEDの電流制御には、直流安定化電源（菊水電子株式会社）を用いた。時間的な照明パターンは、Arduino megaマイクロコントローラボードで作成した。
【0048】
TetR-tetOシステムに基づく遺伝子発現システム
HeLa細胞は、25μMのBVの存在下で、96ウェルのマルチウェルプレート（Greiner）に1ウェルあたり1.0×104細胞でプレーティングし、37℃、5％CO2で24時間培養した。その後、Lipofectamine 3000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションを行った。VP16-NLS、tetR及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを、1：1：1の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgであった。コントロール条件（Aff6-VP16-NLS (-)）として、Aff6-VP16-NLSのAff6を無関係なアフィボディ（Zdk1）に置き換えた。トランスフェクションから24時間後、サンプルに100 μLの培地を加えた後、37℃、5％CO2の環境下で光照射を行った。赤色光サンプルは、1分間の光照射と4分間の消灯を繰り返す660nmのパルス光照明（1 W/m2）の条件下でインキュベーションした。暗所条件では、HeLa細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、5％CO2、37℃でインキュベーションした。24時間培養した後、培養液を基質として500 μMのD-ルシフェリン（和光純薬）を含む100 μLのHBSS（Gibco）に交換した。室温で30分後、発光プレートリーダー（Centro XS3 LB 960, Berthold Technologies）を用いて生物発光の測定を行った。SEAPレポータープラスミドを使用した場合は、光照射を施した細胞の上清をSEAPレポーター遺伝子アッセイ（Roche Diagnostics）で測定した。結果を図１、図７及び図８に示す。
HeLa細胞は、25μMのBVの存在下で、96ウェルのマルチウェルプレート（Greiner）に1ウェルあたり1.0×104細胞でプレーティングし、37℃、5％CO2で24時間培養した。その後、Lipofectamine 3000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションを行った。VP16-NLS、tetR及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを、1：1：1の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgであった。コントロール条件（Aff6-VP16-NLS (-)）として、Aff6-VP16-NLSのAff6を無関係なアフィボディ（Zdk1）に置き換えた。トランスフェクションから24時間後、サンプルに100 μLの培地を加えた後、37℃、5％CO2の環境下で光照射を行った。赤色光サンプルは、1分間の光照射と4分間の消灯を繰り返す660nmのパルス光照明（1 W/m2）の条件下でインキュベーションした。暗所条件では、HeLa細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、5％CO2、37℃でインキュベーションした。24時間培養した後、培養液を基質として500 μMのD-ルシフェリン（和光純薬）を含む100 μLのHBSS（Gibco）に交換した。室温で30分後、発光プレートリーダー（Centro XS3 LB 960, Berthold Technologies）を用いて生物発光の測定を行った。SEAPレポータープラスミドを使用した場合は、光照射を施した細胞の上清をSEAPレポーター遺伝子アッセイ（Roche Diagnostics）で測定した。結果を図１、図７及び図８に示す。
【0049】
MagRedの分割ルシフェラーゼアッセイ
HEK 293T細胞を、25 μM のビリベルジン（BV）を添加した存在下で、35 mm/ Tissue Culture Dish（IWAKI）に1ウェルあたり4.0 × 105 cellの細胞濃度で播種し、37℃で5% CO2の条件下で24時間培養した。Nfluc-DrBphPをコードするプラスミドと3xFLAG-Aff6_V18FΔN-Cflucをコードするプラスミドを1:1の比率でトランスフェクションした。DNAの総量はディッシュあたり2.5 μgであった。コントロールとして全長体のホタルルシフェラーゼ（fluc）をコードするプラスミドを用いた場合、生物発光強度のダイナミックレンジを揃えるために、DNA量はディッシュあたり0.025 μgとした。トランスフェクションから24時間後、培養液を200 μMのD-ルシフェリンを添加した2 mlのHBSSに交換した。室温で30分間インキュベーションした後、LEDアレイを用いて800 nmの光（50W/m2）を5分間照射し、DrBphPを明状態（Pfr）フォームから暗状態（Pr）フォームに光変換した。その後、GloMax 20/20 ルミノメーター（Promega）を用いて、室温で生物発光測定を行った。660 nmの光を細胞に照射するため、生物発光測定を中止し、サンプルディッシュをルミノメーターから外した。その後、660 nmのLEDアレイを用いて660nmの光（10 W/m2）を1分間照射し、直ちにサンプルディッシュをルミノメーターに戻して生物発光の測定を再開した。800 nmの光を細胞に照射する手順は、上述の手順と同じであった。結果を図２に示す。
HEK 293T細胞を、25 μM のビリベルジン（BV）を添加した存在下で、35 mm/ Tissue Culture Dish（IWAKI）に1ウェルあたり4.0 × 105 cellの細胞濃度で播種し、37℃で5% CO2の条件下で24時間培養した。Nfluc-DrBphPをコードするプラスミドと3xFLAG-Aff6_V18FΔN-Cflucをコードするプラスミドを1:1の比率でトランスフェクションした。DNAの総量はディッシュあたり2.5 μgであった。コントロールとして全長体のホタルルシフェラーゼ（fluc）をコードするプラスミドを用いた場合、生物発光強度のダイナミックレンジを揃えるために、DNA量はディッシュあたり0.025 μgとした。トランスフェクションから24時間後、培養液を200 μMのD-ルシフェリンを添加した2 mlのHBSSに交換した。室温で30分間インキュベーションした後、LEDアレイを用いて800 nmの光（50W/m2）を5分間照射し、DrBphPを明状態（Pfr）フォームから暗状態（Pr）フォームに光変換した。その後、GloMax 20/20 ルミノメーター（Promega）を用いて、室温で生物発光測定を行った。660 nmの光を細胞に照射するため、生物発光測定を中止し、サンプルディッシュをルミノメーターから外した。その後、660 nmのLEDアレイを用いて660nmの光（10 W/m2）を1分間照射し、直ちにサンプルディッシュをルミノメーターに戻して生物発光の測定を再開した。800 nmの光を細胞に照射する手順は、上述の手順と同じであった。結果を図２に示す。
【0050】
CPTSのルシフェラーゼレポーターアッセイ
96ウェルのマルチウェルプレートに、HEK 293T細胞とNeuro-2a細胞を2.0×104個、HeLa細胞を1.0×104個、それぞれ1ウェルずつプレーティングした。細胞は37℃、5％CO2で24時間培養した。NLS-dCas9-NLS、MS2、p65-HSF1、sgRNA及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを、1：1：1：1：1の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgとした。MagRedの光照射と生物発光の検出の手順は、上記の通り。RpBphP1-PpsR2/QPAS1システムについては、赤色光サンプルを10 W/m2の760nmパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。その他の手順は上記の通り。ビリベルジン（BV）を添加した条件下（BV（＋））では、25 μMのBVの存在下で細胞を播種し、トランスフェクションは上記の通りに実施した。トランスフェクションから24時間後、サンプルに25 μMのBVを添加した培地を100 μL加えた。残りの手順は上記の通り。結果を図９に示す。NLS-dCas9-NLSのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号５１及び５２で示す。sgRNAを配列番号５３～５７で示す。配列番号５８は、sgRNAのMS2アプタマー配列である。また、sgRNAにおいて、GTTTTAより5’末端側に記載する塩基配列が、標的配列である。
96ウェルのマルチウェルプレートに、HEK 293T細胞とNeuro-2a細胞を2.0×104個、HeLa細胞を1.0×104個、それぞれ1ウェルずつプレーティングした。細胞は37℃、5％CO2で24時間培養した。NLS-dCas9-NLS、MS2、p65-HSF1、sgRNA及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを、1：1：1：1：1の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgとした。MagRedの光照射と生物発光の検出の手順は、上記の通り。RpBphP1-PpsR2/QPAS1システムについては、赤色光サンプルを10 W/m2の760nmパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。その他の手順は上記の通り。ビリベルジン（BV）を添加した条件下（BV（＋））では、25 μMのBVの存在下で細胞を播種し、トランスフェクションは上記の通りに実施した。トランスフェクションから24時間後、サンプルに25 μMのBVを添加した培地を100 μL加えた。残りの手順は上記の通り。結果を図９に示す。NLS-dCas9-NLSのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号５１及び５２で示す。sgRNAを配列番号５３～５７で示す。配列番号５８は、sgRNAのMS2アプタマー配列である。また、sgRNAにおいて、GTTTTAより5’末端側に記載する塩基配列が、標的配列である。
【0051】
NLS-dCas9-NLSのアミノ酸配列（配列番号５１）は以下のとおりである。下線部の配列が、それぞれ、NLS及びdCas9の配列であることを示す。
MYPYDVPDYASPKKKRKVEASDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSPKKKRKVEAS
MYPYDVPDYASPKKKRKVEASDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSPKKKRKVEAS
【0052】
NLS-dCas9-NLSのアミノ酸配列（配列番号５２）は以下のとおりである。下線部の配列が、それぞれ、NLS及びdCas9をコードする塩基配列であることを示す。
ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACGCCATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAA
ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACGCCATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAA
【0053】
sgRNAの配列（配列番号５３～５７）は以下のとおりである。下線部の配列が、それぞれ、標的配列と、MS2アプタマー配列であることを示す。
P46 sgRNA_Gal4UAS（配列番号５３）
GAGTACTGTCCTCCGCGAATTCGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P47 sgRNA_MYOD1（配列番号５４）
GCCTGGGCTCCGGGGCGTTTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P48 sgRNA_HBG1（配列番号５５）
GGCTAGGGATGAAGAATAAAGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P49 sgRNA_IL1R2（配列番号５６）
GTCCTTGGCCACTTCCCCATCGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P50 sgRNA_ASCL1（配列番号５７）
GCAGCCGCTCGCTGCAGCAGGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P46 sgRNA_Gal4UAS（配列番号５３）
GAGTACTGTCCTCCGCGAATTCGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P47 sgRNA_MYOD1（配列番号５４）
GCCTGGGCTCCGGGGCGTTTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P48 sgRNA_HBG1（配列番号５５）
GGCTAGGGATGAAGAATAAAGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P49 sgRNA_IL1R2（配列番号５６）
GTCCTTGGCCACTTCCCCATCGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
P50 sgRNA_ASCL1（配列番号５７）
GCAGCCGCTCGCTGCAGCAGGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
【0054】
Red-CPTSによる内在性遺伝子の活性化
トランスフェクションの手順は、4つの内因性遺伝子を個別に標的としたsgRNAの混合物を使用し、ルシフェラーゼレポーターを省略した以外は、上記の通り。トランスフェクションから48時間後、CellAmp Direct RNA Prep Kit（Takara Bio）とPrimeScript Real-Time Master Mix（Takara Bio）を用いて、全RNAの抽出と逆転写PCRを行った。定量PCRは、StepOnePlusシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いて、TaqMan GeneExpression Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。TaqManプライマー及びプローブを用いて標的遺伝子の発現レベルを定量し、内因性コントロールとしてGAPDH遺伝子を測定した（Life Technologies. TaqMan GeneExpression Assay IDは以下の通り。ASCL1: Hs04187546_g1, IL1R2:Hs01030384_m1, HBG1: Hs00361131_g1, MYOD1: Hs02330075_g1, GAPDH: Hs99999905_m1)。空のベクターをトランスフェクションしたネガティブコントロールに対する各相対的なmRNAレベルを示すために、ΔΔCt法を適用した。
トランスフェクションの手順は、4つの内因性遺伝子を個別に標的としたsgRNAの混合物を使用し、ルシフェラーゼレポーターを省略した以外は、上記の通り。トランスフェクションから48時間後、CellAmp Direct RNA Prep Kit（Takara Bio）とPrimeScript Real-Time Master Mix（Takara Bio）を用いて、全RNAの抽出と逆転写PCRを行った。定量PCRは、StepOnePlusシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いて、TaqMan GeneExpression Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。TaqManプライマー及びプローブを用いて標的遺伝子の発現レベルを定量し、内因性コントロールとしてGAPDH遺伝子を測定した（Life Technologies. TaqMan GeneExpression Assay IDは以下の通り。ASCL1: Hs04187546_g1, IL1R2:Hs01030384_m1, HBG1: Hs00361131_g1, MYOD1: Hs02330075_g1, GAPDH: Hs99999905_m1)。空のベクターをトランスフェクションしたネガティブコントロールに対する各相対的なmRNAレベルを示すために、ΔΔCt法を適用した。
【0055】
RedPA-Creのルシフェラーゼレポーターアッセイ
HEK 293T細胞を25 μM BVの存在下で96ウェルのマルチウェルプレートに1ウェルあたり2.0×104細胞で播種し、37℃、5% CO2で24時間培養した。CreNを含む融合タンパク質、CreCを含む融合タンパク質、及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを1：1：8の比率でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgだった。トランスフェクションから6時間後、37℃、5％CO2の条件下で光照射を施した。MagRedシステムとnanoReD1/2システムでは、赤色光サンプルを1 W/m2の660 nmパルス照射（1分間光照射,4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。RpBphP1-PpsR2/QPAS1については、10 W/m2の760 nmのパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下で赤色光サンプルをインキュベーションした。暗所条件では、HEK 293T細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、37℃、5％CO2でインキュベーションした。18時間培養した後、培養液を、基質として200 μMのD-ルシフェリン（和光純薬）を含む100 μLのHBSS（Gibco）に交換した。室温で30分後、発光プレートリーダー（Centro XS3 LB 960, Berthold Technologies）を用いて生物発光の測定を行った。結果を図５及び図１０～図１４に示す。
HEK 293T細胞を25 μM BVの存在下で96ウェルのマルチウェルプレートに1ウェルあたり2.0×104細胞で播種し、37℃、5% CO2で24時間培養した。CreNを含む融合タンパク質、CreCを含む融合タンパク質、及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドを1：1：8の比率でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.1 μgだった。トランスフェクションから6時間後、37℃、5％CO2の条件下で光照射を施した。MagRedシステムとnanoReD1/2システムでは、赤色光サンプルを1 W/m2の660 nmパルス照射（1分間光照射,4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。RpBphP1-PpsR2/QPAS1については、10 W/m2の760 nmのパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下で赤色光サンプルをインキュベーションした。暗所条件では、HEK 293T細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、37℃、5％CO2でインキュベーションした。18時間培養した後、培養液を、基質として200 μMのD-ルシフェリン（和光純薬）を含む100 μLのHBSS（Gibco）に交換した。室温で30分後、発光プレートリーダー（Centro XS3 LB 960, Berthold Technologies）を用いて生物発光の測定を行った。結果を図５及び図１０～図１４に示す。
【0056】
RedPA-Creの蛍光レポーターアッセイ
HEK 293T細胞を24ウェルプレートに0.8×105個/ウェルでプレーティングし、37℃、5%CO2で24時間培養した。NLS-CreN104-Aff6_V18FΔN-Venus、NLS-DrBphP（FL）-CreC106及び蛍光レポーターをコードするプラスミドを、1：1：8の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.5 μgであった。トランスフェクションから6時間後、37℃で5%CO2の条件下でサンプルに光照射を施した。赤色光サンプルは、1 W/m2の660 nmのパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。暗所条件では、HEK 293T細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、5％CO2、37℃でインキュベーションした。24時間培養後、細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで15分間固定し、その後、ブロッキング溶液（5％BSA, 0.3％トリトン-X100を含むPBS）中で室温で1時間インキュベーションして、ブロッキングを行うと共に細胞膜の透過性を高めた。その後、マウス抗mCherry抗体（mCherry Monoclonal Antibodyconjugated with Alexa Fluor 594, Invitrogen, Cat#M11240, 1:1,000 dilution）を用いて、ブロッキング溶液中で、室温で1時間、穏やかに揺らしながら細胞を免疫染色した。PBSで3回洗浄した後、300 nM DAPI（Invitrogen）で15分間、室温で染色した。その後、10倍の対物レンズ（Leica HCX PL FLUOTAR 10x/0.30NA PH1）とEM-CCDカメラ（Cascade II:512, Photometrics, Arizona, USA）を装備した倒立顕微鏡（DMI6000B, Leica Microsystems）を用いて画像を取得した。DAPI、GFP、RFPチャンネルのイメージングは、A、L5、TX2フィルターキューブ（Leica Microsystems）を用いて行った。結果を図３及び図４に示す。
HEK 293T細胞を24ウェルプレートに0.8×105個/ウェルでプレーティングし、37℃、5%CO2で24時間培養した。NLS-CreN104-Aff6_V18FΔN-Venus、NLS-DrBphP（FL）-CreC106及び蛍光レポーターをコードするプラスミドを、1：1：8の割合でトランスフェクションした。DNAの総量は1ウェルあたり0.5 μgであった。トランスフェクションから6時間後、37℃で5%CO2の条件下でサンプルに光照射を施した。赤色光サンプルは、1 W/m2の660 nmのパルス照射（1分間光照射, 4分間消灯）の条件下でインキュベーションした。暗所条件では、HEK 293T細胞を培養したマルチウェルプレートをアルミホイルで包み、5％CO2、37℃でインキュベーションした。24時間培養後、細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで15分間固定し、その後、ブロッキング溶液（5％BSA, 0.3％トリトン-X100を含むPBS）中で室温で1時間インキュベーションして、ブロッキングを行うと共に細胞膜の透過性を高めた。その後、マウス抗mCherry抗体（mCherry Monoclonal Antibodyconjugated with Alexa Fluor 594, Invitrogen, Cat#M11240, 1:1,000 dilution）を用いて、ブロッキング溶液中で、室温で1時間、穏やかに揺らしながら細胞を免疫染色した。PBSで3回洗浄した後、300 nM DAPI（Invitrogen）で15分間、室温で染色した。その後、10倍の対物レンズ（Leica HCX PL FLUOTAR 10x/0.30NA PH1）とEM-CCDカメラ（Cascade II:512, Photometrics, Arizona, USA）を装備した倒立顕微鏡（DMI6000B, Leica Microsystems）を用いて画像を取得した。DAPI、GFP、RFPチャンネルのイメージングは、A、L5、TX2フィルターキューブ（Leica Microsystems）を用いて行った。結果を図３及び図４に示す。
【0057】
蛍光画像の処理
実験で得られた蛍光画像は、FIJI版のimageJとCellProfilerを用いて解析した。画像の背景は、ImageJに内蔵されているSubtract backgroundツールを用いて差し引いた。核は、DAPIチャネルにおいて、5～20ピクセル単位のオブジェクト径の閾値を用いて識別した。GFP陽性細胞（GFP+）及びmCherry陽性細胞（mCh+）の集団を決定するために、それぞれの細胞核におけるVenus及びmCherry蛍光の平均強度を測定した。蛍光強度の閾値は、コントロール条件ではmCh+細胞を検出しないように決定した。そして、mCh+細胞の数をGFP+細胞の数で割り、100を掛けて、mCh+/GFP+細胞の割合を求めた。
実験で得られた蛍光画像は、FIJI版のimageJとCellProfilerを用いて解析した。画像の背景は、ImageJに内蔵されているSubtract backgroundツールを用いて差し引いた。核は、DAPIチャネルにおいて、5～20ピクセル単位のオブジェクト径の閾値を用いて識別した。GFP陽性細胞（GFP+）及びmCherry陽性細胞（mCh+）の集団を決定するために、それぞれの細胞核におけるVenus及びmCherry蛍光の平均強度を測定した。蛍光強度の閾値は、コントロール条件ではmCh+細胞を検出しないように決定した。そして、mCh+細胞の数をGFP+細胞の数で割り、100を掛けて、mCh+/GFP+細胞の割合を求めた。
【0058】
マウス生体でのRedPA-Creの評価
TransIT-EE Hydrodynamic DeliverySolution（Mirus Bio LLC）中に10 μgのRedPA-Creプラスミドと40 μgの生物発光レポータープラスミドを混ぜて、ハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクション（hydrodynamic tail vein injection：HTVinjection）で4週齢の雌のICRマウス（三共ラボサービス）の肝臓に当該プラスミドを導入した。8時間後、脱毛クリームを用いてマウスの腹部表面の毛を取り除き、マウスを暗所群と赤色光での照射群に無作為に割り付けた。その後、赤色光での照射群のマウスには、LED光源（660nm；100 W/m2）を照射した。8時間ごとにマウスを一時的にホームケージに戻し、1時間給餌した。暗所群のマウスは光の当たらないホームケージに入れた。ハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクションの25時間後に生物発光イメージングを行った。生物発光イメージングの前に、100 mMのD-ルシフェリン200 mLをマウスの腹腔内に注射した。その後、マウスにイソフルラン（和光純薬）で麻酔をかけた。D-ルシフェリン注射の5分後に、EMCDカメラ（Evolve 512, Photometrics）を搭載した生物発光イメージャー（Lumazone,日本ローパー）を用いて、マウスの生物発光画像を取得した。結果を図５及び図１５に示す。
TransIT-EE Hydrodynamic DeliverySolution（Mirus Bio LLC）中に10 μgのRedPA-Creプラスミドと40 μgの生物発光レポータープラスミドを混ぜて、ハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクション（hydrodynamic tail vein injection：HTVinjection）で4週齢の雌のICRマウス（三共ラボサービス）の肝臓に当該プラスミドを導入した。8時間後、脱毛クリームを用いてマウスの腹部表面の毛を取り除き、マウスを暗所群と赤色光での照射群に無作為に割り付けた。その後、赤色光での照射群のマウスには、LED光源（660nm；100 W/m2）を照射した。8時間ごとにマウスを一時的にホームケージに戻し、1時間給餌した。暗所群のマウスは光の当たらないホームケージに入れた。ハイドロダイナミック・テイルベイン・インジェクションの25時間後に生物発光イメージングを行った。生物発光イメージングの前に、100 mMのD-ルシフェリン200 mLをマウスの腹腔内に注射した。その後、マウスにイソフルラン（和光純薬）で麻酔をかけた。D-ルシフェリン注射の5分後に、EMCDカメラ（Evolve 512, Photometrics）を搭載した生物発光イメージャー（Lumazone,日本ローパー）を用いて、マウスの生物発光画像を取得した。結果を図５及び図１５に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55-1】
【図55-2】
【図56-1】
【図56-2】
【図57-1】
【図57-2】
【配列表】